《一种EGCG的提纯方法及获得的EGCG和药物组合物.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种EGCG的提纯方法及获得的EGCG和药物组合物.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104130232A43申请公布日20141105CN104130232A21申请号201410393252522申请日20140812C07D311/62200601A61K31/4748200601A61P25/28200601A61K31/35320060171申请人四川天予植物药业有限公司地址636350四川省达州市万源县太平镇河街南路综贸东巷40号72发明人李威李选民张雄修54发明名称一种EGCG的提纯方法及获得的EGCG和药物组合物57摘要本发明属于天然产物化学提纯技术领域及药物领域中药物组合物的应用，尤其涉及一种EGCG的提纯方法及获得的EGCG和药物组合物。该。
2、方法是以低含量EGCG的茶多酚为原料，装柱后原料经溶解、洗脱、收集、浓缩、结晶、干燥而得；获得的EGCG与汉防己甲素组成药物组合物制备治疗老年痴呆症药物的应用。本发明的EGCG提纯方法操作简便，耗能低，溶解剂和洗脱液用量低，起到成本低、环保的效果，得到的EGCG纯度99，收率90，有利于大规模的推广和应用；EGCG药物组合物，不但可以延缓老年痴呆症的发生进程，更体现出显著的治疗效果，增强患者的记忆恢复能力，无副作用，药效明显的组合物，具有广阔的医药前景。51INTCL权利要求书1页说明书7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页10申请公布号CN1041302。
3、32ACN104130232A1/1页21一种EGCG的提纯方法，该方法以低含量EGCG的茶多酚为原料，其特征在于，包括以下步骤（1）装柱采用干法将硅胶装于直径为5CM，高为80CM的玻璃层析柱中；（2）溶解用70的乙醇浸泡低含量EGCG的茶多酚后倒入硅胶柱中进行层析；（3）洗脱接着加入洗脱剂进行洗脱；（4）收集使用薄层层析收集各洗脱段液的EGCG洗脱段液；（5）浓缩将EGCG收集液合并后浓缩，得到EGCG浸膏；（6）结晶将EGCG浸膏置于锥形瓶中，加入75乙醇，然后置于65水浴加热，边加热边搅拌，溶解1H，放置过夜结晶，过滤，收集晶体；（7）干燥将晶体置于70条件下减压干燥，干燥后即可得到E。
4、GCG粉末。2根据权利要求1所述的EGCG的提纯方法，其特征在于，步骤（1）中乙醇的添加量与低含量EGCG的茶多酚的添加量的重量比为341。3根据权利要求1所述的EGCG的提纯方法，其特征在于，层析硅胶是采用7090目层析硅胶，硅胶的添加量与低含量EGCG的茶多酚的添加量的重量比为1517。4根据权利要求1所述的EGCG的提纯方法，其特征在于，步骤（3）中洗脱剂是乙酸乙酯与石油醚的体积比为3557的混合溶剂。5根据权利要求1所述的EGCG的提纯方法，其特征在于，步骤（6）中的乙醇的添加量与低含量EGCG的茶多酚的添加量的重量比为179。6根据权利要求15任一所述的提纯方法获得的EGCG。7一种。
5、治疗老年痴呆症的药物组合物,其特征在于，它含有如权利要求6所述的EGCG和汉方己甲素。8根据权利要求7的治疗老年痴呆症的药物组合物,其特征在于，EGCG和汉方己甲素的重量份数比为1515，其中EGCG和汉方己甲素的重量份数比优选为32。权利要求书CN104130232A1/7页3一种EGCG的提纯方法及获得的EGCG和药物组合物技术领域0001本发明属于天然产物化学提纯技术领域及其药物领域中药物组合物的应用，尤其涉及一种EGCG的提纯方法及获得的EGCG和药物组合物。背景技术0002EGCG，即表没食子儿茶素没食子酸酯,是从绿茶中提取精制而得。绿茶茶多酚的主要成分是儿茶素。其中又包括表儿茶素（。
6、EC）/表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）等，而EGCG约占儿茶素总量的50。研究表明EGCG具有较强的抗氧化性和预防癌症及心血管疾病的功能，并可以提高癌细胞对化疗的敏感性，同时降低化疗对心脏的毒性。同时EGCG具有抗自由基DNA损害，抗辐射和紫外线，阻止油脂过氧化，减少血清中低密度胆固醇、超低密度胆固醇和甘油三酯的含量，干扰癌细胞生存所需的信号传递，抑制饮食中的致癌物质，与肠、肝、和肺中的其他酶和抗氧化剂作用共同阻止某些致癌物质的活力，清除自由基，抵御污染、日晒和吸烟的影响，防治皮肤老化和起皱等作用。绿茶中的多酚类化合物EGCG与老年痴呆症相关性研究（中国药理。
7、通讯2007年第二十四卷第二期）已证实绿茶中的一种多酚类化合物EGCG能防止A淀粉样斑积聚，通过日常饮食补充，将是防治早老年性痴呆症的有效方法。同时据文献资料显示，EGCG在治疗癌症，修复DNA、抗肿瘤等方面有较强的药理作用，能够增强免疫系统的功能，抑制肝脂和胆固醇的增长，抑制肿瘤的生长，对痢疾伤害、金黄色葡萄球菌也有极强的抑制作用。目前EGCG主要应用于食品添加剂、保健品等产品。0003由于从绿茶中提取出来的多酚类物质其化学结构与性质都极其相似，都具有强极性，一般的分离方法都很难将其分开。目前从茶多酚中直接提取表没食子儿茶素没食子酸酯单体的方法主要有柱层析法、高速逆流分配色谱法、离子反应法，。
8、乙酰化法等。中国专利申请CN1136024C公开了一种单体儿茶素的逆流色谱分离制备方法，该分离方法是先配制以乙酸乙酯乙醇水构成固定相、流动相的溶剂体系进行表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯得分离，得到的提纯物的纯度可到98，但是目前逆流色谱技术一次分离样品的量小，分离周期长，难以应用于工业生产。中国专利CN102311419A公开了一种高含量EGCG的精制提纯方法，该提纯方法主要是利用乙酸乙酯与石油醚按11混合液溶解样品，用乙酸乙酯石油醚乙酸按比例混合作为洗脱液，原料经上柱、洗脱、浓缩、析晶、干燥而得，得到的产品含量大于98，收率大于80，但是该方法配制溶解液和洗脱液操作繁琐，得。
9、到的产品的含量和收率效果没有达到最大化。0004汉防己甲素又名粉防己碱来源于防己科植物粉防己STEPHANIATETRANDRASMOORE的根，已有研究发现汉防己甲素为一良好的慢通道阻滞剂。临床主要用于治疗早期轻度高血压。金满文等报道汉防己甲素对动物的乳头肌，免心房及主动脉系等心血管方面均呈现不同的药理作用。0005老年痴呆症，又称阿尔茨海默病ALZHIMERSDISEASE，AD，是一种中枢神经系统的退行性疾病，其临床表现为认知和记忆能力的不断恶化，日常生活能力进行性减退以说明书CN104130232A2/7页4及出现各种精神分裂症状和行为障碍。随着疾病的发展，患者会逐渐丧失生活自理能力，。
10、给患者的个人家庭和社会带来沉重的负担。老年痴呆症的发病机制目前仍不明确，关于老年痴呆症发病机制的主流学说是淀粉样蛋白级联假说。该假说认为淀粉样蛋白样前体APP异常降解生成过量的A蛋白，并在脑内沉积形成老年斑的核心，其可激活小胶质细胞，引起炎症反应，损伤线粒体引起能量代谢障碍，生成过多氧自由，导致机体的氧化应激损害，激活细胞凋亡途径。另一方面，A还能激活蛋白激酶，促使TAU蛋白异常磷酸化，损伤胆碱能神经元，引起中枢胆碱能系统的病变。这些病理变化又促进A的生成和异常堆积，产生正反馈的级联放大效应，最终导致神经元的减少和递质释放异常。在研究EGCG对老年痴呆症治疗的实验中，申请人意外的发现，EGCG。
11、与汉防己甲素组成的药物组合物用于治疗老年痴呆症时效果明显，EGCG和汉防己甲素联合用于老年痴呆症的治疗时，两种药物可以体现显著的协同作用既可以延缓老年痴呆症的发生进程，同时显现出显著的治疗效果，增强患者的记忆恢复能力，减缓老年痴呆症患者的痛苦。发明内容0006为了解决现有技术中EGCG提纯含量低，收率低存在的缺陷和为了克服目前老年痴呆症治疗药物药效不明确、药物毒副作用大的缺陷。本发明的第一个目的在于提供一种EGCG的提纯方法，该方法以低含量EGCG的茶多酚为原料（低含量EGCG是指EGCG的含量为4050），其步骤如下（1）装柱采用干法将硅胶装于直径为5CM，高为80CM的玻璃层析柱中；（2）。
12、溶解用70的乙醇浸泡低含量EGCG的茶多酚后倒入硅胶柱中进行层析；（3）洗脱接着加入洗脱剂进行洗脱；（4）收集使用薄层层析收集各洗脱段液的EGCG洗脱段液；（5）浓缩将EGCG收集液合并后浓缩，得到EGCG浸膏；（6）结晶将EGCG浸膏置于锥形瓶中，加入75乙醇，然后在65水浴加热，边加热边搅拌，溶解1H，放置过夜结晶，过滤，收集晶体；（7）干燥将晶体置于70条件下减压干燥，干燥后即可得到EGCG粉末。0007经发明人不断的研究，发现茶多酚和EGCG的最佳浸提溶剂为70的乙醇，乙醇的添加量与低含量EGCG的茶多酚的添加量的重量比为341时，其浸提量达到最大化。其中层析硅胶是采用7090目层析硅。
13、胶，发明人经过大量的实验发现，硅胶的添加量与低含量EGCG的茶多酚的添加量的重量比为1517时，其分离效果最好；所述的洗脱剂是乙酸乙酯与石油醚的体积比为3557混合溶剂；骤（6）中的乙醇的添加量与低含量EGCG的茶多酚的添加量的重量比为179时，其结晶效果最佳。0008与现有技术相比，本发明的优点在于本发明的EGCG的提纯方法操作简单、减压干燥温度低，达到节能的效果、溶解剂和洗脱液用量低，起到成本低、环保的效果；而且本发明得到的EGCG粉末收率高、纯度高，收率90，纯度99。0009本发明的第二个目的在于提供一种治疗老年痴呆症的药物组合物，根据上述的纯方法获得的EGCG用来制备预防或治疗老年痴。
14、呆症药物药物组合物，该药物组合物包含EGCG和汉防己甲素，EGCG和汉方己甲素的重量份数比为1515，其中EGCG和汉方己甲素的重量份数比优选为32。本发明所述的药物组合物对老年痴呆症的治疗作用主要是由于说明书CN104130232A3/7页5其对A的聚集的抑制作用，其与其他采用不同治疗机制的老年痴呆症药物联用可以取得意想不到的治疗或预防效果。实验证明，药物联用不仅可以增强药物的治疗效果，而且可以降低药物不良反应以及机体对药物的耐药性。基于此，本发明提供一种治疗老年痴呆症的含有EGCG和汉防己甲素的药物组合物。申请人发现，该药物组合物用于老年痴呆症的治疗时，两种药物可以体现显著的协同作用（参见。
15、本发明实施例7和实施例8），不但可以延缓老年痴呆症的发生进程，更体现出显著的治疗效果，增强患者的记忆恢复能力，可以减轻老年痴呆症患者的痛苦。具体实施方式0010下面采用具体实施例进一步说明本发明的内容以下内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。0011实施例1、本发明的EGCG提纯工艺如下（1）装柱采用干法将100G的70目硅胶装于直径为5CM，高为80CM的玻璃层析柱中；（2）溶解加入60ML的70的乙。
16、醇浸泡20G茶多酚后倒入硅胶柱中进行层析；（3）洗脱接着加入体积比为35的乙酸乙酯石油醚混合溶剂进行洗脱；（4）收集使用薄层层析收集各洗脱段液的EGCG洗脱段液；（5）浓缩将EGCG收集液合并后浓缩，得到EGCG浸膏；（6）结晶将EGCG浸膏置于的锥形瓶中，加入75乙醇140ML，然后在65水浴加热，边加热边搅拌，溶解1H，放置过夜结晶，过滤，收集晶体；（7）干燥将晶体置于70条件下减压干燥，干燥后即可得到184GEGCG粉末，收率达92，经HPLC检测其纯度达993。0012实施例2、本发明的EGCG提纯工艺如下（1）装柱采用干法将120G的70目硅胶装于直径为5CM，高为80CM的玻璃层析。
17、柱中；（2）溶解加入70ML的70的乙醇浸泡20G茶多酚后倒入硅胶柱中进行层析；（3）洗脱接着加入体积比为46的乙酸乙酯石油醚混合溶剂进行洗脱；（4）收集使用薄层层析收集各洗脱段液的EGCG洗脱段液；（5）浓缩将EGCG收集液合并后浓缩，得到EGCG浸膏；（6）结晶将EGCG浸膏置于的锥形瓶中，加入75乙醇160ML，然后在65水浴加热，边加热边搅拌，溶解1H，放置过夜结晶，过滤，收集晶体；（7）干燥将晶体置于70条件下减压干燥，干燥后即可得到19GEGCG粉末，收率达95，经HPLC检测其纯度达996。0013实施例3、本发明的EGCG提纯工艺如下（1）装柱采用干法将140G的70目硅胶装于。
18、直径为5CM，高为80CM的玻璃层析柱中；（2）溶解加入80ML的70的乙醇浸泡20G茶多酚后倒入硅胶柱中进行层析；（3）洗脱接着加入体积比为57的乙酸乙酯石油醚混合溶剂进行洗脱；（4）收集使用薄层层析收集各洗脱段液的EGCG洗脱段液；说明书CN104130232A4/7页6（5）浓缩将EGCG收集液合并后浓缩，得到EGCG浸膏；（6）结晶将EGCG浸膏置于的锥形瓶中，加入75乙醇180ML，然后在65水浴加热，边加热边搅拌，溶解1H，放置过夜结晶，过滤，收集晶体；（7）干燥将晶体置于70条件下减压干燥，干燥后即可得到186GEGCG粉末，收率达93，经HPLC检测其纯度达994。0014对比。
19、实验例一、一种高含量EGCG精制提纯工艺对比实验例一同中国专利CN102311419A的实施例一至实施例五。0015由本发明的实施例13与中国专利CN102311419A的实施例一至五可以得出，本发明的EGCG提纯方法得出的EGCG粉末,收率和纯度都比中国专利CN102311419A的收率和纯度高，而且本发明的EGCG的提纯方法操作简单、减压干燥温度低，达到节能的效果、溶解剂和洗脱液用量低，成本低，环保；收率大于90，纯度大于99，有利于工业化的生产。0016实施例4、一种治疗老年痴呆症的药物组合物制备工艺称取处方量的EGCG、汉防己甲素、糊精和低取代羟丙基纤维素混合均匀。另取适宜量的60乙醇。
20、，加入于混合粉末中，混合均匀后制软材，通过18目筛制粒，60以下干燥。干燥后完成后用22目筛进行整粒，筛出干粒中的细粉，与过筛的硬脂酸镁混匀，然后再与干颗粒混和均匀，压片，即得。0017实施例5、一种治疗老年痴呆症的EGCG药物制备工艺同实施例4。0018实施例6、一种治疗老年痴呆症的汉防己甲素药物说明书CN104130232A5/7页7制备工艺同实施例4。实施例7、本发明EGCG药物组合物对A2535所致大鼠老年痴呆模型的治疗作用目前还没有发现AD独特的、公认的、理想的动物模型。现有的AD动物模型有2类损伤性动物模型和转基因动物模型。损伤性动物模型主要包括物理、化学、有机物损伤和自身免疫损伤。
21、模型。转基因动物模型主要指与AD有关的前体样蛋白APP、载脂蛋白APOE4、早老蛋白1PSI、早老蛋白2PSII等有关基因的单转基因或多转基因动物模型。转基因模型是目前研究的热点，但造模过程复杂，费用昂贵，传代缺乏稳定性。AD患者主要的神经病理学特征之一是老年斑SP沉积，而A是老年斑中的主要成分。体内、外试验都己证实A的神经毒性作用，能导致神经元损伤和认知功能衰退，是AD形成和发展的关键因素，而海马注射A建立的AD大鼠模型却观察到神经元损伤、A沉积、TAU蛋白的异常磷酸化即神经纤维缠结等多种病理改变。00191材料和方法11实验材料实验动物为雄性SD大鼠，鼠龄912周，体重260280G，由第。
22、二军医大学实验动物中心提供。A2535购自美国SIGMA公司，MORRIS水迷宫购自上海吉量公司。002012大鼠老年痴呆模型的建立及评价121脑室内注射用A2535溶液的配制将A2535溶于无菌生理盐水，使A浓度为10MMOLL，置37恒温箱内孵育3D进行老化。0021122动物模型的制作标准环境下饲养，随机分为2组对照组和模型组，每组10只。2组在鼠龄和体重上无显著性差异。动物予适应性喂养1周后，将大鼠用2戊巴比妥钠腹腔麻醉4050MGKG体质量，固定于脑立体定向仪上，剪去头顶部毛发，碘酊消毒后切开皮肤，参照大鼠脑立体定位图选择右侧侧脑室为注射靶区，于前囟向后10MM，中线旁开17MM处，。
23、用三棱针钻开颅骨，暴露硬脑膜，再用微量注射器以15M/S的速度自脑表面垂直进针40MM，将10MMOLLA2535溶液5L缓慢注入，留针2MIN后缓慢撤针，缝合切口。对照组注入等体积无菌生理盐水。0022123MORRIS水迷宫行为学测定2组大鼠分别于术后第10天开始进行MORRIS水迷宫测试。测试程序为定位航行试验历时5D，前2D为训练适应期，后3D记录成绩，如果大鼠在1MIN内找到平台，记录其实际逃避潜伏期；如果在1MIN内仍未找到平台，则由实验者将其引上平台并停留20S，逃避潜伏期记录为1MIN。0023124动物模型的评价由下表可以看出，模型组的逃避潜伏期从实验记录的第1天开始对照组就。
24、明显延长（P005或P001），而模型组3天之间的逃避潜伏期以及对照组3天之间逃避潜伏期无明显差异，表明采用该方法建立的老年痴呆模型可靠准确，可以用于老年痴呆症治疗药物说明书CN104130232A6/7页8的药效评价。00242动物造模及分组给药按照上述造模方法造模，并设置对照组、正常组，每组20只，标准环境下饲养。各组给药方式如下所述正常组灌胃给予相同体积的生理盐水；对照组灌胃给予相同体积的生理盐水；模型组灌胃给予相同体积的生理盐水；EGCG组灌胃给予相同体积含15MG/KGEGCG的生理盐水；汉防己甲素组灌胃给予相同体积含05MG/KG汉防己甲素的生理盐水；复方组灌胃给予相同体积含15M。
25、G/KGEGCG和05MG/KG汉防己甲素药物组合物的生理盐水；上述给药组分别于造模后10天之后给药，第11天记录为第1天，每天给药一次，每天观察动物饮水与饮食情况，分别于给药第1天，给药第5天，给药第10天，给药第15天，给药20天用MORRIS水迷宫行为学测定方法测定大鼠的逃避潜伏期。最后一次测定完成后处死大鼠。各组大鼠MORRIS水迷宫行为学测定结果如下表所示。0025表1各给药组对A2535所致大鼠老年痴呆模型的治疗效果由表1可以看出各给药组第1天的逃避潜伏期物显著性差异，但随着给药时间的延长，各给药组大鼠的逃避潜伏期差异加大，其中EGCG以及复方组均具有积极的治疗作用。具体表现为1E。
26、GCG组的大鼠逃避潜伏期与模型组相比具有显著性差异，均显著缩短大鼠的逃避潜伏期，其中药物治疗15天后，其逃避潜伏期与阳性药物的逃避潜伏期具有显著性差异。00262复方组的大鼠逃避潜伏期与模型组相比具有显著性差异，且其大鼠的逃避潜伏期均明显缩短，其中复方药物治疗15天后，其逃避潜伏期与单药治疗组逃避潜伏期相比具有显著性差异。这表明EGCG对A2535所致大鼠老年痴呆模型的治疗作用与汉防己甲素说明书CN104130232A7/7页9对其治疗作用并不排斥，两种药物对老年痴呆大鼠模型存在协同作用。00273复方各组无论与其对应的单药组相比具有显著性差异，这表明本发明所述EGCG可以与汉防己甲素的组合存在显著的协同作用，不但在药物治疗效果上显著增强，更能改善老年痴呆症患者的运动机能，而且作用迅速，加速患者的痊愈过程。0028本发明实施例7或表明EGCG作用于老年性痴呆的机制与其他药物作用于老年痴呆症的药物并不冲突，其可以联合使用，并能够取得治疗上的协同作用。说明书CN104130232A。