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1、(10)申请公布号 CN 103977399 A (43)申请公布日 2014.08.13 CN 103977399 A (21)申请号 201410217004.5 (22)申请日 2014.05.22 A61K 39/02(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 孙翰昌 地址 402160 重庆市永川区红河大道 319 号 重庆文理学院林学院 (72)发明人 孙翰昌 张先进 丁诗华 徐敬明 (54) 发明名称 一种大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗制备方法 (57) 摘要 本发明公开了大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗制 备方法， 按照以下步骤进行 ： 将嗜水气单胞菌接 种于。
2、LB培养基中， 28培养48h ； 以灭菌生理盐水 将菌液浓度调至 1108cfu/ml， 置于 70恒温水 浴灭活 3h， 将灭活后的菌液置于高速离心机中， 用 3000r/min 离心机离心 35min， 分离出上清液 ； 向分离出的每 10ml 上清液中添加 7500-8500U 的 青霉素和福尔马林溶液摇匀 ； 使用平皿法证实嗜 水气单胞菌已被彻底灭活后， 用灭菌生理盐水清 洗 3 次， 调浓度至 1108cfu/ml， 制成福尔马林 灭活的菌苗液， 即为大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗 ； 将稀释后的灭活菌苗液分装后， 置于 4冰箱中 保存备用。本发明的有益效果是疫苗对大鲵烂腿 病免疫率高。。
3、 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103977399 A CN 103977399 A 1/1 页 2 1. 一种大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗的制备方法， 其特征在于按照以下步骤进行 ： 步骤 1 ： 将嗜水气单胞菌接种于 LB 培养基中， 28培养 48h ； 步骤 2 ： 离心法集菌， 以灭菌生理盐水将菌液浓度调至 1108cfu/ml， 置于 70恒温水 浴灭活 3h， 将灭活后的菌液置于高速离心机中， 用 3000r/min 。
4、离心机离心 35min， 分离出上 清液 ； 步骤 3 ： 向分离出的每 10ml 上清液中添加 7500-8500U 的青霉素和福尔马林溶液摇匀 ； 步骤 4 ： 使用平皿法证实嗜水气单胞菌已被彻底灭活后， 用灭菌生理盐水清洗 3 次， 调 浓度至 1108cfu/ml， 制成福尔马林灭活的菌苗液， 即为大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗 ； 步骤 5 ： 将稀释后的灭活菌苗液分装后， 置于 4冰箱中保存备用。 2. 按照权利要求 1 所述一种大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗的制备方法， 其特征在于 ： 所 述嗜水气单胞菌编号为 WL3-X2 ； 所述嗜水气单胞菌为分离自患烂腿病大鲵肝脏组织的病 原菌。 3.。
5、 按照权利要求 1 所述一种大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗的制备方法， 其特征在于 ： 所 述步骤 3 中， 福尔马林最终与在溶液里的含量为 0.5。 权 利 要 求 书 CN 103977399 A 2 1/5 页 3 一种大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗制备方法 技术领域 0001 本发明属于烂腿病防治技术领域， 涉及一种大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗制备方 法。 背景技术 0002 大鲵 (Andrias davidianus(Blarchand)， 也称娃娃鱼， 是我国特有的珍稀有尾两 栖动物， 国家二级保护动物， 其经济价值高， 具有广泛开发利用的前景1。 近年来随着大鲵 养殖规模不断扩大， 人工养殖大。
6、鲵经常暴发各种疾病， 给广大养殖户造成惨重的经济损失。 烂腿病即为人工饲养大鲵的常见疾病之一， 其主要病原菌为嗜水气单胞菌 2。 0003 嗜水气单胞菌是一种人兽鱼共患的病原菌， 该菌的致病性与其产生的多种毒力因 子如黏附素、 毒素胞外蛋白酶等密切相关 3。在大鲵中， 已知嗜水气单胞菌还可导致细菌 性败血症病 4、 腐皮病 5、 腹水病 6、 细菌性感染综合症 7 等疾病发生， 引起大批死 亡。本研究以大鲵及中华鳖为试验对象， 研究大鲵烂腿病病原菌嗜水气单胞菌灭活疫苗的 免疫保护效果， 旨在为相关疾病的防治提供参考依据。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗制备及免。
7、疫效应， 解决了目前 大鲵烂腿病发病率高、 治愈率的技术难的问题。 0005 本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行 ： 0006 步骤 1 ： 将嗜水气单胞菌接种于 LB 培养基中， 28培养 48h ； 0007 步骤 2 ： 离心法集菌， 以灭菌生理盐水将菌液浓度调至 1108cfu/ml， 置于 70恒 温水浴灭活 3h， 将灭活后的菌液置于高速离心机中， 用 3000r/min 离心机离心 35min， 分离 出上清液 ； 0008 步骤 3 ： 向分离出的每 10ml 上清液中添加 7500-8500U 的青霉素和福尔马林溶液 摇匀 ； 0009 步骤 4 ： 使用平皿法证实嗜水。
8、气单胞菌已被彻底灭活后， 用灭菌生理盐水清洗 3 次， 调浓度至 1108cfu/ml， 制成福尔马林灭活的菌苗液， 即为大鲵烂腿病病原菌灭活疫 苗 ； 0010 步骤 5 ： 将稀释后的灭活菌苗液分装后， 置于 4冰箱中保存备用。 0011 进一步， 所述嗜水气单胞菌编号为 WL3-X2 ； 所述嗜水气单胞菌为分离自患烂腿病 大鲵肝脏组织的病原菌。 0012 进一步， 所述步骤 3 中， 福尔马林最终与在溶液里的含量为 0.5 0013 本发明的有益效果是疫苗对大鲵烂腿病免疫率高。 附图说明 0014 图 1 是本发明注射免疫后大鲵血清抗体滴度示意图 ； 说 明 书 CN 103977399。
9、 A 3 2/5 页 4 0015 图 2 是本发明注射免疫后大鲵血清溶菌酶活性示意图 ； 0016 图 3 是本发明注射免疫后大鲵血清补体 C3 含量示意图 ； 0017 图 4 是本发明攻毒后试验动物的存活情况示意图。 具体实施方式 0018 下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。 0019 本发明一种大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗制备方法按照以下步骤进行 ： 0020 步骤 1 ： 将嗜水气单胞菌接种于 LB 培养基中， 28培养 48h( 小时 ) ； 0021 步骤 2 ： 离心法集菌， 以灭菌生理盐水将菌液浓度调至 1108cfu/ml， 置于 70恒 温水浴灭活 3h， 将灭。
10、活后的菌液置于高速离心机中， 用 3000r/min 离心机离心 35min， 分离 出上清液 ； 0022 步骤 3 ： 向分离出的每 10ml 上清液中添加 7500-8500U 的青霉素和福尔马林溶液 摇匀 ； 0023 步骤 4 ： 使用平皿法证实嗜水气单胞菌已被彻底灭活后， 用灭菌生理盐水清洗 3 次， 调浓度至 1108cfu/ml， 制成福尔马林灭活的菌苗液， 即为大鲵烂腿病病原菌灭活疫 苗 ； 0024 步骤 5 ： 将稀释后的灭活菌苗液分装后， 置于 4冰箱中保存备用。 0025 进一步， 所述嗜水气单胞菌编号为 WL3-X2 ； 所述嗜水气单胞菌为分离自患烂腿病 大鲵肝脏组。
11、织的病原菌。 0026 进一步， 所述步骤 3 中， 福尔马林最终与在溶液里的含量为 0.5。 0027 下面对上述制备的疫苗进行实验 ： 0028 1)1.1 试验动物 ： 0029 试验大鲵优选来自重庆某中国大鲵繁育基地人工的养殖大鲵子二代， 体重规格 为 (16356.5)g， 体质健壮， 活力能力强， 摄食正 常。将试验大鲵饲养在规格一致养殖池 (150cm100cm45cm) 中， 每池放养大鲵密度为 10 尾。养殖室内温度用空调调控， 常年温 度为 20。养殖用水为山泉水， 通过管道自流供水， 达到生活饮用水标准。饵料为鲜活草 鱼、 白鲢以及虾蟹等， 投喂前严格检查饵料的品质状况，。
12、 并经盐水浸泡消毒后进行投喂。2d 换水 1 次， 每隔 7d 对养殖池进行消毒 1 次。 0030 试验中华鳖购自重庆某中华鳖养殖场， 体重规格为 (598.3)g， 体质健壮， 活力能 力强， 摄食正常， 饲养在规格一致养殖池 (150cm100cm45cm) 中， 每池放养大鲵密度为 30 尾， 暂养期间投喂新鲜白鲢苗， 1 周后进行试验。 0031 1.2 菌株毒力测定 ： 0032 取 60 尾健康中华鳖 (Trionyx sinensis)， 体重约 (28667.1)g， 随机分为 6 组， 除对照组腹腔注射生理盐水外， 其余 5 组分别腹腔注射 1105、 1106、 1107。
13、、 1108、 1109cfu/g嗜水气单胞菌， 每组设3个平行组， 观察3周， 实验期间的水温为(281.5)。 另外， 按照上述分组及剂量感染大鲵， 每组 10 尾健康大鲵， 不设平行组。记录注射菌量， 统 计大鲵与鳖的死亡率， 并通过病理检验确定死亡为嗜水气单胞菌感染所致。按 Karber 统计 法计算 LD50。 0033 1.3 注射免疫 ： 说 明 书 CN 103977399 A 4 3/5 页 5 0034 随机将健康的大鲵分为2组， 即灭活全菌免疫组及对照组， 每组15尾， 试验组注射 0.2ml 灭活菌苗， 对照组注射同体积生理盐水， 各组试验动物均注射 2 次， 时间间隔。
14、为 2 周， 每次注射前停饲 6h。 分别于注射前 (0d) 和注射后第 7、 14、 21、 28、 35d 随机在每组取 3 尾 大鲵， 采集动脉血液， 于 -40保存。 0035 1.4 抗体滴度检测及溶菌酶、 补体 C3 测定 ： 0036 抗体滴度检测参照孙翰昌等 8 方法进行进行， 溶菌酶及补体 C3 参照孙金辉等 9 的方法进行测定。 0037 1.5 免疫保护率测定 ： 0038 注射免疫 4 周后取试验大鲵和对照大鲵各 15 尾， 肌肉注射 0.2ml 浓度为 1.0108 的菌液攻毒， 观察 5 周。记录死亡个数， 并进行病理检验， 计算相对存活率。按下列公式计 算免疫保护。
15、力 (RPS) ： 0039 免疫保护力 ( ) ( 对照组死亡率 - 试验组死亡率 )/ 对照组死亡率 100。 0040 1.6 统计学处理 ： 0041 实验数据结果以 “平均数 标准差” 表示。统计分析采用 SPSS11.0 软 件处理， 组间差异显著性分析采用 t 检验法， P 0.05 是差异显著， P 0.01 表示差异极显 著。 0042 2) 结果分析 ： 0043 2.1 致病菌的毒力测定 ： 0044 采用从患病大鲵组织分离所得的致病菌嗜水气单胞菌(编号为WL3-X2)进行毒力 测定， 分别感染健康大鲵及健康中华鳖。 结果显示， 其对健康鳖的LD50为106.8cfu/g。
16、， 而对健 康大鲵的 LD50为 107.3cfu/g。实验过程中， 细菌攻毒后大鲵和中华鳖的死亡状况如表 1， 经 病理检验所有死亡试验动物均为嗜水气单胞菌感染致死。 0045 表 1 病原菌 CQWL2-18 对大鲵、 中华鳖的 LD50 测定 0046 0047 2.2 试验疫苗质量检测 0048 将制备好的疫苗涂布于 LB 固体培养基上， 28条件下培养 48h 后未发现细菌生 长 ； 在均匀度检测方面， 将实验疫苗疫苗在以3000r/min的转速离心15min后没有出现分层 现象 ； 将制备的疫苗腹腔注射大鲵的安全性测试， 观察到试验都存活， 且无异常行为。上述 三方面检测结果表明，。
17、 疫苗已完全灭活、 各项检测指标均正常、 安全性良好。 0049 2.3 血清的抗体应答 ： 0050 如图1所示， 图柱中标不同小写英文字母表示各组间差异显著(p0.05)， 研究结 说 明 书 CN 103977399 A 5 4/5 页 6 果显示， 注射疫苗组大鲵血清抗体滴度随着时间的延长， 呈现先升后降变化趋势， 在第 2 次 加强免疫 2 周后 ( 即初种后第 42d)， 血清抗体达到最高水平。而对照组的血清经 ELISA 检 测， 其 A490与阴性对照的 A490比值均小于 2， 说明对照组不会诱导大鲵产生抵抗菌嗜水气单 胞菌的抗体。提示此注射疫苗微粒可诱导大鲵产生血清抗体应答。
18、。 0051 2.4 血清溶菌酶活性 ： 0052 如图2所示， 图柱中标不同小写英文字母表示各组间差异显著(p0.05)， 注射免 疫 7d 后大鲵血清溶菌酶活性均高于对照组。在初次免疫 2 周后， 血清血清溶菌酶活性与对 照组有显著差异 (P 0.05)， 第 21d 达到最高峰值水平。 0053 2.5 补体 C3 含量 ： 0054 如图3所示， 图柱中标不同小写英文字母表示各组间差异显著(p0.05)， 注射免 疫后大鲵血清补体 C3 含量均高于与对照组， 14d 后显著上升 (P 0.05)， 第 21d 达到峰值， 随后缓慢下降， 第 35d 回到对照组水平。 0055 2.6 。
19、疫苗免疫保护效应 ： 0056 如图 4 所示， 各试验组大鲵经注射灭活疫苗免疫后， 肌肉注射 0.2ml 浓度为 1.0108的嗜水气单胞菌菌液， 攻毒后试验动物的存活情况如图 4。攻毒后第 2d， 每组大鲵 都有部分出现感染症状， 但未出现死亡， 大鲵死亡的时间主要集中在第 3d 至第 5d。注射疫 苗组和对照组的存活率分别为60、 13.3。 根据试验组大鲵的存活率、 存活时间进行分析 显示， 本研究所得灭活疫苗对大鲵具有保护效应， 免疫保护率为53.8(表2)， 与对照组相 比有显著性差异 (P 0.05)。 0057 表 2 注射免疫对大鲵的保护效应 0058 0059 根据以上实验。
20、可以看出， 本发明攻克了大鲵烂腿病制备过程中保护率低的难关。 根据试验组大鲵的存活率、 存活时间进行分析显示， 本研究所得灭活疫苗对大鲵具有保护 效应， 免疫保护率为 53.8 0060 以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已， 并非对本发明作任何形式上的限 制， 凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改， 等同变化与修饰， 均属 于本发明技术方案的范围内。 0061 相关资料索引 ： 0062 1 叶昌嫒， 费梁， 胡淑琴 . 中国珍稀及经济两栖动物 J. 成都 ： 四川科学技出版 社， 1993 ： 64-69。 0063 2 孙翰昌， 杨帆， 丁诗华， 等 . 大鲵烂腿病防。
21、治技术研究 J. 黑龙江畜牧兽医， 2012(9) ： 103-104。 0064 3 胡萌， 潘子豪， 陆承平， 等。嗜水气单胞菌流行菌株的生物学特性 J. 中国兽 医科学， 2013， 43(05) ： 441-445。 0065 4 余波， 徐景峨， 谭诗文， 等 . 大鲵细菌性败血症病原的分离鉴定与药敏特性 说 明 书 CN 103977399 A 6 5/5 页 7 J. 中国兽医杂志， 2011， 47(1) ： 30-31。 0066 5 王旭， 颜其贵， 雷燕， 等 . 中国大鲵腐皮病病原菌的分离与鉴定 J. 中国人兽 共患病学报， 2010， 26(10) ： 945-948。
22、。 0067 6 孟彦， 曾令兵， 杨焱清， 等 . 大鲵腹水病病原菌的分离与鉴定研究 J. 西北农 林科技大学学报 ( 自然科学版 )， 2009， 37(3) ： 77-81。 0068 7 于喆， 江辉， 钟蕾， 等 . 大鲵细菌性感染综合症的病原分离与药敏试验分析 J. 湖南师范大学自然科学学报， 2012， 35(6) ： 74-79。 0069 8 孙翰昌， 耿晓修， 丁诗华， 等 . 肠型点状产气单胞菌口服疫苗对草鱼的免疫保 护效应研究 J. 西南大学 ( 自然科学版 )， 2007， 29(9) ： 115-118 0070 9 孙金辉， 王庆奎， 陈成勋， 等 . 嗜水气单胞菌灭活疫苗对虹鳟免疫力和抗病力 的影响 J. 淡水渔业， 2013， 43(1) ： 44-48 。 说 明 书 CN 103977399 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103977399 A 8 2/2 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103977399 A 9 。