技术领域
本发明属于生物技术和医药领域，涉及靶向性给药的纳米载体及其制备方法和应用技术，具体涉及组织因子靶向性蛋白纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
随着生物学技术的提高和对疾病分子水平发病机制的进一步认识，医学界开始了针对细胞受体、关键基因和调控分子为靶点的诊疗，即“靶向治疗”。组织因子(tissue factor，TF)是一种分子量为47kD的跨膜糖蛋白，作为血浆凝血因子VII(FVII)的受体启动外源性凝血过程(参见：Nigel Mackman.Roleof tissue factor in hemostasis，thrombosis，and vascular development.Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology2004；24(2)：1015-1022.)。研究表明，TF除了在正常止血方面的作用外，其异常表达与脑血栓、动脉粥样硬化、急性冠脉综合症、深静脉血栓、弥散性血管内凝血、炎症及肿瘤等密切相关，日益受到广泛关注(参见：Julian N.Tissue-factor-endowed leukocytes do cause thrombosis.Blood2005；106(5)：1506-1507.Levi M，van der Poll T，Büller HR.Bidirectionalrelation between inflammation and coagulation.Circulation2004；109(22)：2698-2704.)。有关靶向TF的研究，在血栓的诊疗领域前景十分看好。目前有关TF及其配体的抗体研究已经在血栓的诊疗中取得了重要进展，如David等研制的作为抗凝剂的靶向组织因子的血栓调节蛋白融合蛋白能结合于损伤部位并阻止血栓形成的启动，可用于治疗多种血栓性病变(参见：Haubitz M，Brunkhorst R. Influence of a novel rapamycin analogon SDZRAD on endothelial tissue factor and adhesion moleculeexp
纳米技术是靶向制剂研究中的热门之一，在药剂学中纳米粒载体通常系指粒径在10-1000nm，特别是500nm以下的胶体体系，通过物理或化学作用包封或吸附药物，可将药物送至身体特定部位，以恰当速度和剂量释放，实现精确给药，提高药效，降低药物的毒副作用。纳米粒作为药物的递送载体，存在诸多的优点，如对药物的缓控释作用，能够冻干并长期保存，更好的物理和化学稳定性，因此它可作为小分子化学药物或DNA的理想载体。在纳米材料方面，可生物降解高分子材料主要包括聚酸酐(PAH)、聚氰基丙烯酸酯(PACA)、聚膦嗪(PP)和聚酯等，因其生物相容性好、可生物降解、能人工调控其结构和性能等优点成为制备纳米药物载体的最好选择，其中PACA和属于聚酯类的聚乳酸(PLA)是研究的热点(参见：Davis S S.Drug delivery systems.Interdiscipl Sci Rev 2000；25(3)：175-183.)。PACA曾一度广泛用于药物载体的研究，但PACA纳米粒在制备过程中采用的是乳液聚合法，需使用大量表面活性剂，其LD50只有20mg/kg，毒性问题未能解决(参见：Kreuter J.Nanoparticulate systems for brain delivery of drugs.Adv Drug Deliv Rev2001；47：65-81.)。针对上述问题，我们选用了PLA作为制备纳米粒的基材。PLA是典型的可生物降解聚酯，在体内先降解为小分子片段，再进一步分解为乳酸，后者进入体内的三羧酸循环，最终代谢为CO2和H2O(参见：Nicholasa AP，McInnisa C，Guptaa K B，et al.The fate of biodegradable microspheresinjected into rat brain.Neurosci Lett 2002；323：85-88.)，故毒副作用极低，还具有结构和种类多、有一定机械强度和临床研究及应用的时间长等优点。此外，纳米粒子粒表面经聚乙二醇(PEG)修饰，可避免单核巨噬系统(MPS)的吞噬，显著延长在血浆中的半衰期，提高血浆药时曲线下面积(AUC)，具有隐形作用。同时，PEG与PLA都是经FDA批准可用于临床的少数几种药物辅料，因子该发明的纳米载体具有良好生物安全性[参见：Adams ML，Lavasanifar A，Kwon GS.Amphiphilic block copolymers for drug Delivery.J Pharm Sci 2003；92：1343-55.]。
另一方面，有关TF表达调控的基础研究发现核转录因子κB(NF-κB)作为启动TF表达的关键因子，成为TF表达的调控点(参见：Matsushita H，Morishita R，Nata T，et al.Hypoxia-induced endothelial apoptosisthrough nuclear factor-KappaB(NF-kappaB).mediated bcl-2suppression：in vivo evidence of the importance of NF-kappaB in endothelial cellregulatiou.Cirt Res 200012；86(9)：97451)。诱骗寡核苷酸技术(decoy ODNs)是近年来发展起来的一种基因治疗策略(参见：Gambari R.New trends in thedevelopment of transcription factor decoy pharmacotherapy.Curr DrugTargets 2004；5：419-30.)。TF NF-κB decoy ODNs(组织因子核转录因子κB诱骗寡核苷酸)是含有与TF启动子顺式作用元件κB结合位点序列(5’CGGAGTTTCC 3’)相同序列的双链核苷酸片段(参见：RyuichiMorishita，Jitsuo Higaki，Naruya Tomita，et al.Application oftranscription factor“decoy”strategy as means of gene therapy andstudy of gene expression in cardiovascular disease.Circ Res.1998，82：1023-8.)，若将该NF-κB decoy ODNs转染至细胞后，能竞争性的与NF-κB结合，封闭其结合位点，而阻止其转录启动作用，抑制TF表达。由于常用基因转染方法在病毒载体的安全性、脂质体靶向性和转染率上存在缺陷(参见：Entaro Kogure，Hidetaka Akita，Hideyoshi Harashima.Multifunctional envelope-type nano device for non-viral gene delivery：Concept and application of Programmed Packaging.Journal of ControlledRelease 2007；122：246-251.)。因此，寻找安全有效的靶向转染载体，实现定向干预是当前研究的关键。
发明内容
本发明的任务是提供一种具有组织因子靶向性蛋白纳米粒及其制备方法和在制备用于预防血栓形成的药物中的应用。
实现本发明的具体方案是：
本发明提供的这种具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒，是凝血因子类表皮生长因子I区多肽(EGF1)或增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与凝血因子类表皮生长因子I区肽(EGF1)融合蛋白(EGFP-EGF1)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒(EGF1-PEG-PLA-NP或EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP)，凝血因子类表皮生长因子I区多肽(EGF1)具有序列表中序列1所示的氨基酸序列。
本发明提供的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒凝血因子类表皮生长因子I区多肽(EGF1)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒(EGF1-PEG-PLA-NP)是按以下方法制备的：
(1)制备凝血因子类表皮生长因子I区多肽(EGF1)；
(2)将EGF1多肽进行巯基化修饰；
(3)制备Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒(PEG-PLA-NP)；
(4)将巯基化EGF1多肽与PEG-PLA-NP按照巯基与马来酰亚胺基的摩尔比为1∶1的比例混合均匀，磁力搅拌过夜后，过Sepharose CL-4B柱，收集得到乳白色EGF1-PEG-PLA-NP溶液，经真空冻干后得到白色粉末即为EGF1-PEG-PLA-NP，置于-20℃保存。
以上步骤(2)所述的将EGF1多肽进行巯基化修饰的具体方法是：采用Traut试剂，按照EGF1∶2-亚氨氢氯化硫醇摩尔比为1∶40混合，室温搅拌1小时，经Sephadex G-100凝胶层析柱分离除去2-亚氨氢氯化硫醇，用0.01mol/L磷酸盐氯化钠缓冲液(pH 7.0)作为洗脱液进行洗脱，即得巯基化EGF1多肽；
以上步骤(3)所述的制备Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒(PEG-PLA-NP)的具体方法是：分别将马来酰亚胺封端的聚乙二醇(Maleimide-PEG)和单甲氧基聚乙二醇(MePEG)与D，L-乳酸进行开环聚合反应，得到Maleimide-PEG-PLA和MePEG-PLA二嵌段共聚物，再将这两种共聚物按质量比为1∶20比例混合，采用复乳/溶媒蒸发法制得Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒(PEG-PLA-NP)。
本发明提供的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与凝血因子类表皮生长因子I区肽(EGF1)的融合蛋白(EGFP-EGF1)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒(EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP)的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过基因工程技术从大鼠血浆凝血因子VII(FVII)克隆出类表皮生长因子I区片段，通过与增强型绿色荧光蛋白重组，在大肠杆菌中表达纯化出强型绿色荧光蛋白与凝血因子类表皮生长因子I区肽融合蛋白(EGFP-EGF1)；
(2)将EGFP-EGF1进行巯基化修饰；
(3)制备Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒(PEG-PLA-NP)；
(4)将巯基化EGFP-EGF1蛋白与PEG-PLA-NP按照巯基：马来酰亚胺基摩尔比为1∶1混合均匀，磁力搅拌过夜后，过Sepharose CL-4B柱，收集得到淡黄色溶液，经真空冻干后得到的淡黄色粉末即为EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP，置于-20℃保存。
以上步骤(2)所述的将EGFP-EGF1进行巯基化修饰的具体方法是：采用Traut试剂，按照EGFP-EGF1蛋白∶2-亚氨氢氯化硫醇摩尔比为1∶40混合，室温搅拌1小时，经Sephadex G-100凝胶层析柱分离除去2-亚氨氢氯化硫醇，用0.01mol/L磷酸盐氯化钠缓冲液(pH 7.0)作为洗脱液进行洗脱，即得巯基化EGFP-EGF1蛋白；
以上步骤(3)所述的制备Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒(PEG-PLA-NP)的具体方法是：分别将马来酰亚胺封端的聚乙二醇(Maleimide-PEG)和单甲氧基聚乙二醇(MePEG)与D，L-乳酸进行开环聚合反应，得到Maleimide-PEG-PLA和MePEG-PLA二嵌段共聚物，再将这两种共聚物按质量比为1∶20比例混合，采用复乳/溶媒蒸发法制得Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒(PEG-PLA-NP)；
本发明提供的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒可用来制备针对组织因子的靶向性药物，可用于制备预防血栓形成的药物，例如，可用于制备预防脑血栓形成的药物。
本发明专利申请实施例部分对本发明提供的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒----凝血因子类表皮生长因子I区多肽(EGF1)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒(EGF1-PEG-PLA-NP)和增强型绿色荧光蛋白与凝血因子类表皮生长因子I区肽融合蛋白(EGFP-EGF1)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒(EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP)的制备作了详细说明。
实验资料
实验内容：验证本发明提供的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒的靶向功能、生物安全性及其载TF NF-kB decoyODNs后靶向干预组织因子表达及抑制脑血栓形成的作用。
1.主要材料、试剂及设备：
脂多糖、2，3，5-氯化三苯四唑(TTC)、玫瑰红B染料均购自Sigma公司(美国)；、大鼠血管内皮细胞系购自Cellapplications公司(美国)；、兔抗TF单克隆抗体购自SantaCruz公司(美国)；近红外荧光染料Dir(1，1’-dioctadecyl-3，3，3’，3’-tetramethyl indotricarbocyanine Iodide)购自Biotium公司(美国)；Cell counting kit-8(CCK-8)购自Dojindo公司(日本)；TF NF-K B decoy ODNs(5-GTCCCGGAGTTTCCTACCGGG-3，3-CAGGGCCTCAAAGGATGGCCC-5)TF mRNA 引物(F：5-GTGCACTGAGCAATGGAAGA-3，R：5-AGGCCATGAAGGGAGTCTTT-3)由Invitrogen公司(中国)合成。成年雄性SD大鼠，体重200-250g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心；其他常用基本试剂均为国内商业公司购买。其他常用基本试剂均为国内商业公司购买。
所涉仪器主要包括：纳米粒子制备及表征设备同前；荧光显微镜(奥林巴斯，日本)；流式细胞仪(Beckman，美国)；大鼠动物脑立体定位仪(Stoelting，美国)；颅脑照射光源(Oriel Scientific，美国)；多模式活体成像系统FX(Carestream Health，美国)。
2.载Dir/ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP制备及理化性质表征
2.1.1制备载Dir EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP，方法如下：
1)取100ul Dir(5mg/ml)作为内水相加入到1ml二氯甲烷中；
2)取MePEG-PLA(0.0228g)及Malemide-PEG-PLA(0.0012g)溶解于上述二氯甲烷中；
3)将上述溶液连续超声30秒(160W)制备出水/油初乳；
4)将超声后初乳加入到2ml 1％表面活性剂胆酸钠水溶液中；
5)将步骤4溶液再次超声30秒(160W)制备出水/油/水复乳；
6)将复乳溶液加入到38ml 0.5％胆酸钠水溶液中，使复乳分散；
7)磁力搅拌5min；
8)40℃旋转蒸发至无气泡除去溶液中二氯甲烷；
9)将步骤8中溶液在4℃下14000rpm离心45min，后弃去上清液，即制得载Dir PEG-PLA-NP。
10)取5ml 0.01mol/L PBS，加入到步骤9中载Dir PEG-PLA-NP中，用移液器吹打分散，混匀后转移入小烧杯中；
11)按计算量加入巯基化EGFP-EGF1至上述溶液中；
12)磁力搅拌过夜；
13)将搅拌后的溶液在4℃下14000rpm离心45min，除去上清；
14)加入1.5ml 0.01mol/L PBS，吹打分散使混匀；
15)将上述步骤14所得溶液过Sepharose CL-4B柱，收集得到淡黄色溶液即为载Dir EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP溶液；
16)将载Dir EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP溶液经真空冻干后为淡黄色粉末，置于-20℃保存。
2.1.2制备载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP，方法如下：
1)取50ul ODNs(1mg/mL)作为内水相加入到1ml二氯甲烷中；
2)取MePEG-PLA(0.0228g)及Malemide-PEG-PLA(0.0012g)溶解于上述二氯甲烷中；
3)将上述溶液连续超声30秒(160W)制备出水/油初乳；
4)将超声后初乳加入到2ml 1％表面活性剂胆酸钠水溶液中；
5)将步骤4溶液再次超声30秒(160W)制备出水/油/水复乳；
6)将复乳溶液加入到38ml 0.5％胆酸钠水溶液中，使复乳分散；
7)磁力搅拌5min；
8)40℃旋转蒸发至无气泡除去溶液中二氯甲烷；
9)将步骤8中溶液在4℃下14000rpm离心45min，后弃去上清液，即制得载ODNs PEG-PLA-NP。
10)取5ml 0.01mol/L PBS，加入到步骤9中载ODNs PEG-PLA-NP中，用移液器吹打分散，混匀后转移入小烧杯中；
11)按计算量加入巯基化EGFP-EGF1至上述溶液中；
12)磁力搅拌过夜；
13)将搅拌后的溶液在4℃下14000rpm离心45min，除去上清；
14)加入1.5ml 0.01mol/L PBS，吹打分散使混匀；
15)将上述步骤14所得溶液过Sepharose CL-4B柱，收集得到淡黄色溶液即为载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP溶液；
16)将载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP溶液经真空冻干后为淡黄色粉末，置于-20℃保存。
按照下列公式计算Dir/ODNs的载药率：
其中，溶液中Dir浓度可通过分光光度计(700nm)测定，溶液中ODNs浓度可通过荧光分光光度计(350nm)测定。结果显示，Dir/ODNs的载药率分别为2.113±0.066％、0.16125±0.01375％。同时，通过透射电镜下观察，载药后纳米粒大小均匀、外观圆整，粒径在100nm左右(图7)。粒度/zeta电位测定示粒径与空纳米粒无显著性差异(表3)。
表3载药后纳米粒粒径和Zeta电位的测定
2.2Dir/ODNs体外释放率检测
将载有Dir/ODNs的10μg/mL EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP置于不同pH值PBS中(pH7.4和pH 4.0)，同时恒温摇床(37℃)，保持速度为100rpm，在不同时间点分别取样，检测持续96小时内药物释放率。不同时间点样品采用离心法(20000rpm，30min)处理，分别通过分光光度计或荧光分光光度计检测上清中所释放出的Dir/ODNs。结果显示(图8)，ODNs在pH 4.0PBS中，48h至96h释放率为40.60±4.05％至45.99±4.71％，pH 7.4PBS中，48h至96h释放率为30.15±2.47％至37.02±2.97％。此结果表明，载ODNsEGFP-EGF1-PEG-PLA-NP具有明显缓释效应。同时，Dir在pH 4.0PBS中，1h至4h释放率仅为0.9±0.20％至1.6±0.20％，pH 7.4PBS中，1h至4h释放率为0.96±0.30％至1.56±0.50％。基本无释放或泄漏，因此载DirEGFP-EGF1-PEG-PLA-NP可作为示踪剂使用。
2.3EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP细胞毒性检测
通过CCK-8法检测EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP对大鼠血管内皮细胞增殖活性的影响。将大鼠血管内皮细胞传代培养至第3代，取100ul细胞悬液，以5000/孔浓度种板于96孔板中，培养24h后，按浓度梯度在各孔分别加入10uL 0-10mg/mL的EGFP-EGF1，NP，EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP和载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP，共培养4小时后，各孔加入10uL CCK-8，共培养1小时后，通过分光光度计(450nm)检测细胞增殖活力。结果显示(图9)，小于5mg/mL浓度纳米粒对细胞增殖无明显影响，当ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP浓度达到10mg/mL时，细胞增殖活性受到影响，因此在一定浓度下，EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP对细胞增殖无影响，后续实验可选取5mg/mL纳米粒作为体内外生物学实验浓度。
3.EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP与高表达TF细胞结合能力。
建立高表达TF细胞模型：将大鼠血管内皮细胞传代培养至第3代，加入终浓度为1ug/mL LPS在37℃，5％CO2条件下培养4小时。通过免疫组化及Western blot鉴定TF表达情况(图10)，随后，将高表达TF细胞种板于6孔板中(5000/孔)。
荧光显微镜及流式细胞仪检测EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP及不同纳米粒与细胞膜表面TF结合：将2.5mg/mL EGFP-EGF1-PEG-PLA-NPs，EGF1-PEG-PLA-NPs(装载6-香豆素作为荧光标记)和NPs分别加入各模型细胞组中在37℃，5％CO2条件下培养1小时。无血清培养基充分洗涤后置于荧光显微镜观察并照相，进一步，搜集各模型组中细胞，PBS洗涤后通过流式细胞仪分析5000～10000个细胞的平均荧光强度。荧光显微镜观察(图11)，EGFP-EGF1-PEG-PLA纳米粒组和EGF1-PEG-PLA纳米粒组可在表达TF细胞膜表面出现荧光，而PEG-PLA纳米粒对照组中没有出现，说明该EGF1在介导纳米粒与表达TF的大鼠血管内皮细胞结合过程中起重要作用。进一步FCM结果表明(图12)，随着EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP浓度增高(0.3125，0.625，1.25，2.5，5mg/mL)，TF细胞膜表面荧光强度逐渐增高，同普通纳米粒相比，与细胞膜TF结合能力显著增强。
4.载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP体外抑制内皮细胞表达TF。
将大鼠血管内皮细胞传代培养至第3代，加入1μg/mL LPS及ODNs(10ug/mL)，NPs(5mg/mL)，EGFP-EGF1-PEG-PLA-NPs(5mg/mL)，ODNs loadedEGFP-EGF1-PEG-PLA-NP(5mg/mL EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP+10ug/mL-1ODNs)，共培养4小时后，搜集各组细胞通过RT-PCR及Western blot检测各组细胞表达TF量。结果显示，ODNs loaded EGFP-EGF1-PEG-PLA-NPs组TF mRNA及蛋白表达水平最低(图13)。
5.EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP靶向大鼠脑血栓病灶部位能力。
建立大鼠脑血栓模型：6％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.5ml/100g)后，颅脑定位仪固定大鼠头部，消毒，正中纵向切开头皮，暴露右侧颅骨，小心分离骨膜以免损伤颅骨表面影响其透光性，定位前囟后约1.8mm，中线旁右侧2.5mm；从鼠尾静脉缓慢推注2％玫瑰红B(1mL/kg)；将大鼠固定于立体定位仪上，光化学冷光源探头紧贴暴露的颅骨，以定位点为中心，2mm为半径，照射强度3000kb，照射时间5min。对照组除不光照外，余步骤同上。4小时后，对处死的大鼠脑组织采用TTC染色及冷冻切片后免疫组化及HE染色鉴定造模效果，结果显示(图14)，大体解剖观，梗塞灶呈碗状，由软脑膜延至皮质深层，病灶中心微血管内血栓形成及瘀血；免疫组化示病症部位TF表达明显增强；HE染色示脑血管内形成的血栓显著增多。
大鼠脑血栓模型建立成功后，从鼠尾静脉注射载DirEGFP-EGF1-PEG-PLA-NP(80mg/kg)及对照EGFP-PEG-PLA-NP(80mg/kg)，4小时后将大鼠麻醉置于多模式活体成像系统FX中采集荧光染料分布图像(激发光为748nm，发射光为780nm)，随后处死各组大鼠，取脑、心、肝、脾、肺、肾及血液等脏器组织，PBS清洗后置于活体成像系统中采集各脏器荧光染料浓集图像。结果显示(见图15)，大脑血栓病灶部位荧光染料浓集程度最强，肝、脾有部分浓集，心、肺、肾未见荧光染料滞留。由此证实该载DirEGFP-EGF1-PEG-PLA-NP可靶向显影大鼠脑血栓病灶。
6.载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP抑制脑血栓形成
大鼠脑血栓模型建立方法同前，当鼠尾静脉注射时，需同时注射2％玫瑰红B 1 mL/kg玫瑰红B及载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP(50mg/kg)，照射部位及照射时间同前。4小时后，处死各组大鼠，取大脑组织作切片行HE染色观察，见图16，结果显示，注射载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP后大鼠脑血管内形成的血栓明显减少，达到抑制血栓形成目的。
本发明制备的组织因子靶向性蛋白纳米粒-EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP经透射电镜、免疫胶体金等试验，结果显示，EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP粒径在90nm左右、形态规则、大小一致，粒子表面均匀包裹EGFP-EGF1蛋白。同时对EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP载药释放率和细胞毒性进行了试验，结果表明其载药具有缓释性及载示踪剂功能，当EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP浓度小于5mg/mL时，对正常细胞无毒性。在体外通过荧光显微镜、流式细胞仪分析，证实EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP具有靶向细胞膜上组织因子功能；在体内通过活体成像检测，证实EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP可靶向高表达组织因子的脑血栓；同时，使用EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP运载载针对组织因子的诱骗寡核苷酸片段，在体外能明显抑制组织因子表达，在体内能预防脑血栓形成。本发明提供的载ODNsEGFP-EGF1-PEG-PLA-NP作为新的组织因子靶向性抗栓药物，通过EGFP-EGF1蛋白靶向性结合到血栓部位表达的组织因子上，通过受体介导性的内吞效应将NF-KB decoy转运到细胞核内。再通过与TF启动子的κB位点顺式作用元件竞争性结合转录因子NF-κB，从而下调了TF mRNA的水平，继而使TF的表达下降，导致凝血瀑布无法激活，从而达到抑制血栓形成目的。
附图说明
图1：EGFP-EGF1-PEG-PLA纳米粒结构模式图。
图2：本发明克隆出的EGF1片段鉴定图，采用琼脂糖凝胶电泳法带M为Marker；带1为EGF1，114bp；带2为β-actin。结果表明：成功克隆出EGF1区基因序列。
图3：构建的pET28a-EGFP-EGF1表达载体示意图。
图4：pET28a-EGFP-EGF1表达载体鉴定图，采用琼脂糖凝胶电泳法双酶切鉴定：带M为DNA Marker；带1为质粒pET28a-EGFP，6.1kb；带2为质粒pET28a-EGFP-EGF1，6.2kb；带3为质粒pET28a-EGFP-EGF/EcoR I+HindIII；带4为EGF1。结果表明：pET28a-EGFP-EGF1表达载体构建成功。
图5：本发明制备的EGFP-EGF1融合蛋白表达、纯化鉴定图，(A)SDS-PAGE电泳法M：Marker；带1为诱导后工程菌BL21；带2为未诱导菌；带3，4为纯化后洗脱液；(B)Western blot法带1为EGFP-EGF1蛋白组，一抗为EGFP单抗；带2为对照组EGFP蛋白，一抗为EGFP单抗；带3为EGFP-EGF1蛋白组，一抗为EGF单抗；带4为对照组EGFP蛋白，一抗为EGF单抗。结果表明：EGFP-EGF1融合蛋白在BL21中大量表达，并成功纯化。
图6：透射电镜观测所制备EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP纳米粒形态及结构图，采用免疫胶体金法透射电镜检测：(A)EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP纳米粒组，使用anti-EGF一抗及10nm胶体金标记的兔抗羊IgG检测；(B)NP纳米粒组，使用anti-EGF一抗及10nm胶体金标记的兔抗羊IgG检测；(C)EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP纳米粒组，使用10nm胶体金标记的兔抗羊IgG检测。结果表明：EGFP-EGF1蛋白成功结合到PEG-PLA-NP纳米粒表面。
图7：透射电镜观测所制备EGFP-EGF1-PEG-PLA纳米粒载药后形态图，(A)载Dir EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP；(B)载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP。结果表明：载药后EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP纳米粒形态规则，大小均匀。
图8：载ODNS/Dir EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP体外释放曲线(0.1M PBS)图，结果表明：载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP具有明显缓释效应，同时，载DirEGFP-EGF1-PEG-PLA-NP基本无Di r释放。
图9：本发明制备的纳米粒体外毒性检测图，采用CCK8法检测细胞A450值，结果表明：10mg/mL EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP组A450值明显低于其他组，而其余组浓度对细胞增殖活性无影响。
图10：体外TF表达细胞模型鉴定图，采用细胞免疫组化法及Western blot法半定量分析(A)未诱导表达TF组；(B)诱导后高表达TF组；(C)诱导前后TF表达。结果表明：成功建立了体外TF表达细胞模型。
图11：荧光显微镜观察所制备纳米粒与细胞膜表面TF结合能力图(A)EGFP-EGF1-PEG-PLA-NPs组；(B)EGF1-PEG-PLA-NPs组(装载6-香豆素作为纳米粒的荧光探针)；(C)NPs组；(D)阴性对照。结果表明：EGFP-EGF1-PEG-PLA-NPs及EGF1-PEG-PLA-NPs均可同细胞膜表明TF结合。
图12：所制备纳米粒与细胞膜表面TF结合能力图，采用流式细胞仪检测细胞膜表面荧光蛋白强度，反应纳米粒与TF结合能力，结果表明：EGFP-EGF1-PEG-PLA-NPs与TF结合能力明显高于普通纳米粒。
图13：载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP干预细胞膜TF表达图，(A)RT-PCR检测：带1为阴性对照；带2为载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP组；带3为ODNs组；带4为EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP组；带5为NP组；带6为阳性对照；(B)Western blot检测：带1为阴性对照；带2为载ODNsEGFP-EGF1-PEG-PLA-NP组；带3为ODNs组；带4为EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP组；带5为NP组；带6为阳性对照。结果表明：载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP能明显下调细胞TF mRNA及蛋白表达。
图14：大鼠脑血栓模型鉴定图，(A)脑大体解剖观；(B)HE染色鉴定；(C)免疫组化鉴定。结果表明：成功建立大鼠脑血栓模型。
图15：载Dir EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP体内分布活体成像图，(I)脑部浓集图：A，E为生理盐水组；B，F为阴性对照组；C，G为Dir-loadedEGFP-EGF1-PEG-PLA-NPs组；D，H为Dir-loaded NPs组；(II)脏器分布图：A为生理盐水组；B为阴性对照组；C为Dir-loaded EGFP-EGF1-PEG-PLA-NPs组；D为为Dir-loaded NPs组。结果表明：EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP能靶向血栓形成部位。
图16：HE染色观察载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP体内抑制血栓形成图，采用HE染色法，Pro-软件分析红色面积(A)为未注射载ODNsEGFP-EGF1-PEG-PLA-NP组；(B)为注射载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP组；(C)为血栓形成面积比较。结果表明：载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP能明显抑制大鼠脑血栓形成。
具体实施方式
实施例：制备本发明提供的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒----凝血因子类表皮生长因子I区多肽(EGF1)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒(EGF1-PEG-PLA-NP)和增强型绿色荧光蛋白与凝血因子类表皮生长因子I区肽融合蛋白(EGFP-EGF1)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒(EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP)。
为了增加该纳米载体针对组织因子的靶向性及载药能力，本发明以PEG-PLA嵌段共聚物作为聚合物材料制备纳米粒，以EGFP-EGF1蛋白、EGF1多肽作为靶头，与之共价连接制备新型纳米粒EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP或EGF1-PEG-PLA-NP，其结构模式图见(图1)。
1.主要材料、试剂及设备：大肠杆菌DH5α、BL21和pET-28a-EGFP质粒为本实验室保存；RT-PCR试剂盒、Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶购自Toyobo公司(日本)；质粒提取试剂盒购自Omega公司(美国)；DNA回收试剂盒购自Axygen公司(公司)；引物合成、DNA序列分析由Invitrogen公司(上海)完成；层析Ni柱及介质为购自Novogen公司(美国)；羊抗兔IgG胶体金、IPTG购自Sigma公司(美国)；兔抗鼠EGF单克隆抗体及鼠抗EGFP单克隆抗体均购自SantaCruz公司(美国)；重组增强型绿色荧光蛋白(EGFP)购自R&D公司(美国)；单甲氧基聚乙二醇(Methoxypolyethyleneglycol(MePEG)，MW 3000Da)购自NOF公司(日本)；马来酰亚胺基聚乙二醇(Maleimide-PEG，MW 3400Da)购自Nektar公司(美国)；D，L-乳酸(D，L-lactide，purity：99.5％)购自PURAC公司(荷兰)；Ellman’s试剂购自Acros公司(比利时)；成年雄性SD大鼠，体重200-250g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心；其他常用试剂均为国内商业公司购买。
2.所涉仪器主要包括：电子分析天平AE200(Mettler公司，瑞士)；漩涡混合器XW-80A(上医仪器厂，中国)；超声波细胞粉碎机JY92-II(宁波新芝生物科技股份有限公司，中国)；循环水式多用真空泵SHB-III(郑州长城仪器厂，中国)；台式离心机TGL-16C(上海安亭科学仪器厂，中国)；低温高速冷冻离心机TJ-25(Beckman Coulter，美国)；旋转蒸发仪R-200(Buchi，德国)；恒温水浴B-490(Buchi，德国)；恒温磁力搅拌仪S23-2(上海司乐仪器厂，中国)；层析柱(上海锦华层析设备厂，中国)；电热恒温鼓风干燥箱101-1-B(上海跃进医疗器械厂，中国)；紫外分光光度仪UV-2401PC(Shimadzu，日本)；RF-540荧光分光光度计(岛津公司，日本)；粒度/zeta电位测定仪NICOMPTM 380ZLS(NICOMP，美国)；冷冻干燥仪Alpha2-4(Martin Christ，德国)；透射电镜H-600(Hitachi，日本)。
3.EGFP-EGF1重组蛋白制备及EGF1多肽合成
3.1扩增EGF1片段：根据EGF1区基因(GenBank：AF532184，150-243位)上、下游序列设计一对引物：上游引物：5’-GCCGAATTCTGTGCCTCGAATCCATGTCA-3’；下游引物：5’-GCCAAGCTTACAGTTCCGGCCCTCAAAG-3’。从健康SD大鼠肝脏中提取总mRNA，按Trizol试剂配套说明书推荐步骤进行。提取的mRNA以OligodT为引物，用M-MLV逆转录酶在37℃条件下合成cDNA。以该cDNA为模板，用上述一对引物进行PCR扩增，PCR反应参数为：94℃5min；94℃30s，55℃40s，72℃1min，共30个循环；72℃7min；4℃保存；琼脂糖凝胶电泳鉴定(图2)，结果表明成功扩增出114bp的EGF1片段。
3.2构建pET28a-EGFP-EGF1融合蛋白表达载体：采用ECOR I/HindIII双酶切法，将扩增后的EGF1片段插入pET28a-EGFP质粒中(图3)，转化入感受态菌DH5α，卡那抗性平板筛选阳性克隆，PCR及酶切鉴定阳性克隆，同时由上海Invitrogen公司完成DNA测序，PCR及双酶切法凝胶电泳鉴定结果(图4)，分子量大小与设计基本一致。同时，挑选的阳性克隆经测序分析后序列与设计一致，pET28a-EGFP-EGF1表达载体构建成功。
3.3EGFP-EGF1蛋白的表达、纯化及鉴定：由菌DH5α中提取pET28a-EGFP-EGF1质粒转化入大肠感受态菌BL21中。含有该重组质粒的BL21菌株在含有100mg/L卡那的LB培养基中37℃，250rpm培养至A600约0.5，加入IPTG至1mmol/L，23℃220rpm诱导表达6h。在4℃下，BL21菌液6000rpm离心5min收集沉淀；用原菌液0.1体积PBS缓冲液重悬菌体，置冰浴中彻底超声裂菌，4℃下，10000rpm 10min离心收集上清。首先用0.22UM无菌膜过滤，再用Ni Sepharose柱纯化。按介质说明，用结合缓冲液平衡柱，将样品上清上柱，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液。将收集到的液体分装进分子量截留值为30KD透析袋中用PBS及三蒸水梯度透析脱盐、纯化。纯化前后样品进行SDS-PAGE电泳及Western blot分析鉴定，结果显示，经过诱导表达后，E.Coli B21菌能高表达EGFP-EGF1蛋白，蛋白分子量约为36kD左右(图5)，通过Brandford法定量蛋白表达量约为1.2-1.6g/L，同时以EGFP、EGF单抗对蛋白进行鉴定，EGFP蛋白作对照，结果显示EGFP-EGF1重组蛋白成功表达。
3.4化学合成法制备类表皮生长因子I区多肽(EGF1)：EGF1多肽(纯度：95％)由西安华辰生物科技有限公司合成。序列为：Cys-Ala-Ser-Asn-Pro-Cys-Gln-Asn-Gly-Gly-Thr-Cys-Gln-Asp-His-Leu-Lys-Ser-Tyr-Val-Cys-Leu-Cys-Pro-Leu-Asp-Phe-Glu-Gly-Arg-Asn-Cys(分子结构图见PDB库ID：1f7e)。冻干EGF1多肽保存于-20℃下，使用时可溶于PBS缓冲液中(pH＝7.4)，由于细菌能降解多肽，因此贮存及使用前必须过滤除菌。同时，注意防止被氧化。
3.5EGFP-EGF1蛋白及EGF1多肽巯基化修饰：将获取的EGFP-EGF1蛋白及EGF1多肽溶于含有50％甘油的HBS缓冲液中。采用2-亚氨氢氯化硫醇(2-iminothiolane，Traut’s试剂)按下列反应式巯基化反应。
加入EGFP-EGF1/EGF1∶2-iminothiolane摩尔比为1∶40，室温搅拌1h，经Sephadex G-100凝胶层析柱分离除去2-iminothiolane，洗脱液为0.01mol/L磷酸盐氯化钠缓冲液(pH 7.0)，即得巯基化EGFP-EGF1/巯基化EGF1。
采用5，5’-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB，Ellmann’s试剂)测定蛋白质的巯基化程度。基本原理：DTNB在pH 8.0条件下与蛋白质巯基的S-反应，形成产物2-硝基-5-硫代苯甲酸离子(TNB)，其在420nm处显黄色，摩尔吸光系数为13600mol·L-1·cm-1，反应过程如下图。
①Ellman’s试剂的配制：取39.6mg DTNB，溶解于10ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，即得。
②测定方法：分别取样品和对照溶液，按下表1制作样品管与对照管。
表1样品及对照管体积比例
样品管和对照管中分别加入20μl Ellman’s试剂，立即开始计时，漩涡混匀，读取2min时刻412nm处的吸光值A412(先以对照管调零)。
③巯基化程度及巯基化蛋白用量的计算：
巯基化后蛋白溶液中巯基的浓度：根据反应中马来酰亚胺基∶巯基＝1∶1，含有B g Maleimide-PEG-PLA的NP中马来酰亚胺基的摩尔数等于应加入的EGFP-EGF1或EGF1巯基摩尔数，即因此，含有B g Maleimide-PEG-PLA的NP中应加入巯基化EGFP-EGF1溶液的体积为：C0(mol/L)-巯基化EGFP-EGF1或EGF1中巯基的摩尔浓度，A412-显色反应2min后，显色产物TNB在412nm处的吸光值，B(g)-纳米粒溶液中Maleimide-PEG-PLA的投料量，Mn-Maleimide-PEG-PLA的数均分子量，V(L)-应加入巯基化EGFP-EGF1或EGF1溶液的体积。
4.PEG化纳米粒(NP)的制备：分别将马来酰亚胺封端的聚乙二醇(Maleimide-PEG)和单甲氧基聚乙二醇(MePEG)与D，L-乳酸进行开环聚合反应，得到Maleimide-PEG-PLA和MePEG-PLA二嵌段共聚物，再将这两种共聚物按质量比为1∶20比例混合，采用复乳/溶媒蒸发法制得Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒(PEG-PLA-NP)。其具体方法为：
1)取50μl去离子水作为内水相加入到1ml二氯甲烷中；
2)取MePEG-PLA(0.0228g)及Maiemide-PEG-PLA(0.0012g)溶解于上述二氯甲烷中；
3)将上述溶液连续超声30秒(160W)制备出水/油初乳；
4)将超声后初乳加入到2ml 1％表面活性剂胆酸钠水溶液中；
5)将步骤4溶液再次超声30秒(160W)制备出水/油/水复乳；
6)将复乳溶液加入到38ml 0.5％胆酸钠水溶液中，使复乳分散；
7)磁力搅拌5min；
8)40℃旋转蒸发至无气泡除去溶液中二氯甲烷；
9)将步骤8中溶液在4℃下14000rpm离心45min，后弃去上清液，即制得PEG-PLA-NP。
5.EGFP-EGF1-PEG-PLA、EGF1-PEG-PLA纳米粒的制备：将巯基化EGF1多肽与PEG-PLA-NP按照巯基∶马来酰亚胺基摩尔比为1∶1混合均匀，磁力搅拌过夜后，过Sepharose CL-4B柱，收集得到乳白色溶液，即为EGF1-PEG-PLA-NP，经真空冻干后为白色粉末，置于-20℃保存。其具体方法为：
1)取5ml 0.01mol/L PBS，加入离心后的PEG-PLA-NP中，用移液器吹打分散，混匀后转移入小烧杯中；
2)按计算量加入巯基化EGFP-EGF1或巯基化EGF1至上述溶液中；
3)磁力搅拌过夜；
4)将搅拌后的溶液在4℃下14000rpm离心45min，除去上清；
5)加入1.5ml 0.01mol/L PBS，吹打分散使混匀；
6)将步骤5所得溶液过Sepharose CL-4B柱，收集得到EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP、EGF1-PEG-PLA-NP溶液；
7)将EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP、EGF1-PEG-PLA-NP溶液经真空冻干后为淡黄色或白色粉末，置于-20℃保存。
6.纳米粒理化性质的表征：采用粒度/zeta电位测定仪，测定NP、EGF1-PEG-PLA-NP、EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP光散射粒径及电位分别如下表2所示：
表2不同纳米粒粒径和Zeta电位的测定
NP、EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP经1-2％(w/v，pH 7.0)磷钨酸负染色后，通过免疫胶体金法，透射电镜下观察纳米粒的形态及纳米粒表面EGFP-EGF1蛋白结合情况，其中一抗为20μL 1ug/mL兔抗EGF单抗，二抗为10nm胶体金标记的兔抗羊IgG，结果显示，在含有兔抗EGF单抗及胶体金标记的兔抗羊IgG的EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP组，纳米粒子表面可见散在分布黑色胶体金颗粒(图6)，由此证实EGFP-EGF1-PEG-PLA纳米粒制备成功。
以下为本发明涉及的氨基酸序列和核苷酸序列表，其中
序列1为：凝血因子类表皮生长因子I区多肽(EGF1)；
序列2为：根据EGF1区基因上游序列设计的上游引物序列；
序列3为：根据EGF1区基因下游序列设计的下游引物序列；
序列4为：组织因子核转录因子κB诱骗单链寡核苷酸序列；
序列5为：组织因子mRNA上游引物；
序列6为：组织因子mRNA下游引物。
序列表
<110>华中科技大学同济医学院附属协和医院
<120>一种组织因子靶向性蛋白纳米粒及其制备方法和应用
<160>6
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>32
<212>PRT
<213>大鼠
<400>1
Cys Ala Ser Asn Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Gln Asp His Leu
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Val Cys Leu Cys Pro Leu Asp Phe Glu Gly Arg Asn Cys
20 25 30
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gccgaattct gtgcctcgaa tccatgtca 29
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gccaagctta cagttccggc cctcaaag 28
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gtcccggagt ttcctaccgg g 21
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gtgcactgag caatggaaga 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
aggccatgaa gggagtcttt 20