一种三螺旋竹荪多糖的提取方法.pdf

本发明是一种三螺旋竹荪多糖的提取方法，具体是：先将粉碎后的天然竹荪用有机溶剂在索氏提取器中脱脂，然后将残渣依次在20～80℃梯度温度下水提，过滤得滤液，重复进行三次，离心取上清液，得提取液；该提取液经Sevage法脱蛋白和用H2O2氧化法脱色后，分别用清水和二次蒸馏水透析以除去小分子，并经DEAE柱除去酸性多糖后，溶液冷冻干燥，得到形态为絮状白色的三螺旋竹荪多糖。本发明容易实施，所得到的产品纯度高，为首次发现并验证了竹荪多糖的三螺旋结构。在医药及材料方面有广泛的应用前景。

1.  一种三螺旋竹荪多糖的提取方法，其特征是：先将粉碎后的天然竹荪用有机溶剂在索氏提取器中脱脂，然后将残渣依次在20～80℃梯度温度下水提，过滤得滤液，重复进行三次，离心取上清液，得提取液；该提取液经Sevage法脱蛋白和用H₂O₂氧化法脱色后，分别用清水和二次蒸馏水透析以除去小分子，并经DEAE柱除去酸性多糖后，溶液冷冻干燥，得到形态为絮状白色的三螺旋竹荪多糖。

2.  根据权利要求1所述的三螺旋竹荪多糖的提取方法，其特征是：三螺旋竹荪多糖具有三股螺旋有序结构，其单糖组成为葡萄糖，其主链为β-(1→3)连接，支链为β-(1→6)连接结构，支化度为10～20％。

3.  根据权利要求1或2所述的三螺旋竹荪多糖的提取方法，其特征是：三螺旋竹荪多糖的分子量为30～100万，其在水溶液中粘度为540～1550cm³/g，流体力学半径为70～150nm。

4.  根据权利要求1所述的三螺旋竹荪多糖的提取方法，其特征是：天然竹荪用组织粉碎机粉碎，其大小为过60目筛。

5.  根据权利要求1所述的三螺旋竹荪多糖的提取方法，其特征是：索氏提取器中脱脂所用的有机溶剂为：乙醇、乙酸乙酯和丙酮，它们浓度规格均是分析纯。

6.  根据权利要求1所述的三螺旋竹荪多糖的提取方法，其特征是：在20～80℃梯度温度水提过程中，所用的温度依次为20℃、40℃、60℃、80℃。

7.  根据权利要求1所述的三螺旋竹荪多糖的提取方法，其特征是：水提的时间为2～6小时。

一种三螺旋竹荪多糖的提取方法
技术领域
本发明涉及生物高分子学和药物化学领域，特别是涉及一种竹荪多糖衍生物的制备方法及其结构的鉴定与在生物活性药理作用。
背景技术
近年来的研究发现，竹荪含有多种氨基酸、维生素、多糖和多种无机盐等。除其营养价值外，同时还具有一定的防病保健作用。多糖是竹荪子实体中重要组成成分之一，多糖生理活性和功能已有许多报道，竹荪所具有的多种生物活性是否与其所含有多糖有关尚未见报道。曾有人报道采用热水萃取、有机溶剂沉淀和凝胶层析等方法，从竹荪子实体中分离得到竹荪多糖，并利用薄板层析方法，确定了该多糖的单糖组成，为进一步研究竹荪多糖的化学结构和生物活性提供依据。
现在大多数研究多糖的学者对多糖的研究只是停止在多糖的提取，纯化，得到相对纯度较高的糖，并对其进行比如像单糖组成、糖苷键连结方式的确定等，对于分子内部结构认识比较模糊。这也是取决于糖分子结构的复杂性及多样性。所以就目前的研究水平，想要研究多糖内部结构，就要先从高度有序的具有螺旋结构的多糖进行入手，发现并寻找具有这样结构的多糖也就非常有价值。
目前发现和研究的多糖分子大多是分子量较小或者是分子链结构比较柔顺，刚性不明显，从目前研究结果来看具有刚性较强的、有序螺旋结构的多糖分子大多具有较强的生理活性，比如目前应用广泛的香菇多糖。同时也因为具有螺旋结构的多糖其分子结构的有序性，也是众多研究糖科学及高分子等学科的研究热点。限于现在发现的有序多糖分子种类还比较少，不能进行系统有研究，所以，发现新的尤其是具有三股螺旋结构的多糖是一件非常有意义的事情。对于糖科学和高分子化学都是很有价值的，对发现新药也是具有新的价值所在。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种方法，以便从天然的竹荪中提取一种高度有序的具有三股螺旋结构的生物大分子-多糖，并测得其分子量等基本的相关参数。
本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：先将粉碎后的天然竹荪用有机溶剂在索氏提取器中脱脂，然后将残渣依次在20～80℃梯度温度下水提，过滤得滤液，重复进行三次，离心取上清液，得提取液；该提取液经Sevage法脱蛋白和用H₂O₂氧化法脱色后，分别用清水和二次蒸馏水透析以除去小分子，并经DEAE柱除去酸性多糖后，溶液冷冻干燥，得到形态为絮状白色的三螺旋竹荪多糖。
本发明与现有技术相比主要有以下的优点：
1.首次从天然的竹荪中，用非有机溶剂提取了一种高度有序的具有三股螺旋结构的生物大分子-三螺旋竹荪多糖，并测得其分子量等基本的相关参数。因所得的生物大分子，多糖具有较高的分子有序性，所以其生物活性和分子结构都有很大的研究价值。
2.容易实施，并且能够得到纯度高、组成单一和结构明确的三螺旋竹荪多糖，对其分子进行单糖组成分析，葡聚糖含量达96％。
总之，本发明所得到的产品纯度高，为首次发现并验证了竹荪多糖的三螺旋结构。在医药及材料方面有广泛的应用前景。
附图说明
图1为ZS-3、ZS-4降解后单糖组成分析气相图谱。
图2为ZS-3、ZS-4进行FTIR测试图谱。
图3为三螺旋竹荪多糖的结构模型示意图。
图4为ZS-3、ZS-4的¹³CNMR图谱。
图5为ZS-3、ZS-4原子力显微镜的结果图。
具体实施方式
本发明提供的三螺旋竹荪多糖的提取方法，具体是：先将粉碎后过60目筛的天然竹荪用有机溶剂在索氏提取器中脱脂，然后将残渣依次在20～80℃梯度温度下水提2～6小时，过滤得滤液，重复进行三次，离心取上清液，得提取液；该提取液经Sevage法脱蛋白和用H₂O₂氧化法脱色后，分别用清水和二次蒸馏水透析以除去小分子，并经DEAE柱除去酸性多糖后，溶液冷冻干燥，得到形态为絮状白色的三螺旋竹荪多糖。
所述的三螺旋竹荪多糖，其结构如图3所示：具有三股螺旋有序结构，其单糖组成为葡萄糖，其主链为β-(1→3)连接，支链为β-(1→6)连接结构，支化度为10～20％。该多糖的分子量为30～100万，其在水溶液中粘度为540～1550cm³/g，流体力学半径为70～150nm。图3中，n为重复单元数，一般为8000～12000。
所述的有机溶剂为：乙醇、乙酸乙酯和丙酮，它们浓度规格均是分析纯。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
将竹荪实体在组织粉碎机中粉碎，依次用乙醇、乙酸乙酯和丙酮在索氏提取器中脱脂，然后分别在20℃、40℃、60℃、80℃下水提三小时，得四种多糖溶液，分别加以处理如下，离心得提取液。用Sevage法脱蛋白后，H₂O₂氧化法脱色，分别用清水和二次蒸馏水透析，浓缩，用乙醇分级沉淀，冷冻干燥得到三螺旋竹荪多糖ZS-1、ZS-2、ZS-3和ZS-4。冻干得到多糖纯品。
实施例2
将竹荪实体在组织粉碎机中粉碎，依次用乙醇、乙酸乙酯和丙酮在索氏提取器中脱脂，然后分别在20℃、40℃、60℃、80℃下水提三小时，得四种多糖溶液，分别加以处理如下，离心得提取液。用Sevage法脱蛋白后，H₂O₂氧化法脱色，分别用清水和二次蒸馏水透析，浓缩，经超滤后，冷冻干燥得到三螺旋竹荪多糖ZS-1、ZS-2、ZS-3和ZS-4。冻干得到多糖纯品。
上述两个实施例所得到的ZS-1、ZS-2、ZS-3和ZS-4四种多糖，其产率分别为0.444％、0.364％、0.243％、0.388％。
本发明对得到的四种产物分别用GC测得其单糖组成，发现ZS-1、ZS-2为杂多糖，而ZS-3、ZS-4为单一葡萄糖组成。重点对ZS-3，ZS-4多糖进行分析，用FTIR及NMR的方法确定了ZS-3、ZS-4多糖的结构为主链为β-(1→3)，支链为β-(1→6)连接的葡聚糖。用光散射的方法测得ZS-3和ZS-4多糖重均分子量分别为60万，80万，ZS-3和ZS-4两种多糖在化学组成上是一样的，只是在分子量大小不同。流体力学半径为70-150nm。测得ZS-1、ZS-2、ZS-3和ZS-4四种糖的黏度为540～1550cm³g^-1(见表1)，并且ZS-3和ZS-4多糖有粘度高达1500cm³g^-1以上，是具有很强的刚性多糖。并且用刚果红实验、AFM实验的结果证实，该多糖为三螺旋多糖。
下面是对得到的四种产物进行检测的实施例。
实施例3：测各糖的单糖组成
用2M的硫酸对多糖进行水解封，封管100℃下反应六小时，水解液用碳酸钡中和多余的酸，离心得到上清液，冷冻干燥，用糖腈乙酸酯衍生物方法对样品进行处理后用气相测定单糖组成。
衍生化方法：取10mg固体糖样、10mg盐酸羟胺和7mg内标，加入0.5ml吡啶放入90℃水浴中加热反反应30分钟，取出后冷室温，加入醋酸酐0.5ml，在90℃下继续反应30分钟进行乙酰化，反应产生直接进行气相色谱分析。气相色谤仪的型号为Agilent GC6890N(安杰伦)。操作条件如下：
气流速度：N₂为20ml/min，H₂为30ml/min，O₂为50ml/min。
温度：进样口250℃，检测器280℃，HP-5柱温度采用程序升温，起始温度140℃，停留3分钟，7℃每分钟升至240℃，保留10分钟。
经检测，ZS-3和ZS-4均为单一葡萄糖组成，并纯度较高。参见图1。
实施例4：测各种多糖的粘度
利用乌氏黏度计在25℃下进行粘度测定。用做图法得到多糖的特性粘度。在水溶液中得到的结果，请见表1。
实施例5：光散射测试
对ZS-3和ZS-4多糖样品在溶液中的散射光强用多角度激光散射仪测量。激光光源为He-Ne激光，波长633nm，通过计算得到ZS-3和ZS-4分子量分别为80万和60万，流体力学半径分别为150nm和70nm。
实施例6：FTIR分析
对ZS-3和ZS-4进行FTIR分析，用KBr压片法在5000-500cm^-1范围内用红外测定其多糖的构型，确定该糖是α型还是β型。通过实验数据，红外光谱有3500-3300cm^-1(糖环上OH的O-H伸缩振动)；2920-2800^-1(糖环上C-H变角振动)；1100-1000^-1(糖环上C-O伸缩振动)；890^-1(β构型的异头碳特征吸收)，等四个特征吸收峰，确定样品为为β构型糖链(图2)。
实施例7：NMR测试分析
用D₂O作溶剂，探针温度为60℃，样品浓度为10mg/ml，¹³C核磁共振光谱具103.836ppm(β-(1→3)葡聚糖的C-1信号)；87.054ppm(C-3信号)；76.836ppm(C-5信号)；75.359ppm(C-2信号)；68.738ppm(C-4信号)；61.300(C-6信号)，可推出ZS-3，ZS-4糖的主链结构为β-(1→3)葡聚糖连接，具有支链为β-(1→6)连接结构。¹³CNMR图谱见图4。
通过以上实施例3、实施例6和实施例7，得到竹荪多糖的结构式见图3，其中支化度大约在10％-20％。
实施例8：刚果红实验
刚果红与具有螺旋构象的多糖可形成络合物，此络合物的最大吸收波长较多糖红移向长波，由此可基本推测多糖分子内有螺旋结构。产品经刚果红反应，然后紫外测定，发现在480-495nm处呈最大吸收峰。中和后再测紫外，其最大吸收收位移移至505-520nm，该反应紫外吸收的两个范围为β-(1→3)葡聚糖所特有，最大吸收波长明显发生红移，证明该分子内存在三螺旋结构。
实施例9：原子力显微镜测试
将溶液涂在云母片上进行测试，比结果可以看到，分子呈现直链形态(图5)。表现为较强的刚性。
上述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
上述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
附表
表1  各种多糖在水溶液中的粘度