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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610519528.9 (22)申请日 2016.07.05 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106038571 A (43)申请公布日 2016.10.26 (73)专利权人 福州大学 地址 350108 福建省福州市闽侯县上街镇 大学城学园路2号福州大学新区 (72)发明人 邵敬伟 郑桂容 江凯 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (51)Int.Cl. A61K 31/56(2006.01) A61K 31。
2、/5377(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 CN 106075387 A,2016.11.09, CN 101991579 A,2011.03.30, CN 103705939 A,2014.04.09, US 2012064135 A1,2012.03.15, 审查员 陈振中 (54)发明名称 一种含小分子靶向药物吉非替尼的药物组 合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用 (57)摘要 本发明提供一种药物组合物， 其特征在于包 含以下活性成分： 熊果酸与吉非替尼。 当物质的 量比为10-20:1-25熊果酸与吉非替尼联用时， 可 以起到协调抗癌细胞的增殖。。
3、 通过将表皮生长因 子受体酪氨酸激酶(EGFR-TK)抑制剂吉非替尼与 高效低毒的抗肿瘤天然产物熊果酸进行联合用 药， 可以起到靶向抑制肿瘤细胞， 提起到协调抗 癌细胞的增殖的疗效， 从而降低药物的毒副作 用， 最终提高治疗癌症的效果， 可应用于制备抗 肿瘤的药物领域。 权利要求书1页 说明书7页 附图5页 CN 106038571 B 2018.08.17 CN 106038571 B 1.一种具有抗肺癌活性的药物组合物在制备抗肺癌药物中的应用， 其特征在于该药物 组合物包含物质的量比为1： 1的熊果酸与吉非替尼。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106038571 B 2 一种含。
4、小分子靶向药物吉非替尼的药物组合物及其在制备抗 肿瘤药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于抗肿瘤药物领域， 具体地， 本发明涉及一种具有抗癌活性的药物组合 物。 背景技术 0002 熊果酸即3 -羟基-熊果-12-烯-28-酸(3 -hydroxy-urs-12-en-28-oic acid， 简 称UA)， 又名乌索酸、 属于a-香树脂醇(a-amyrin)型五环三萜类化合物， 其相对分子量为 456.68， 分子式为C30H48O3， 结果如式 所示， 是自然界中分布较广的天然活性化合物， 主要以 游离或糖苷的形式存在其广泛分布于枇杷叶、 熊果、 山楂、 白花蛇舌草等多种天然植物中，。
5、 也是许多传统中药的主要活性成分之一， 具有广泛的药理作用， 如抗癌、 保肝、 抗炎、 抗病 毒、 抗氧化等其中以抗癌活性最为显著， 不仅对多种致癌物有抵抗作用， 而且对多种肿瘤细 胞在体内、 外均有抑制作用。 因其副作用小， 毒性低， 显示出较大的临床应用潜力。 近年来国 内外对UA的抗肿瘤研究日趋深入， 并发现其在肿瘤预防、 治疗以及防止晚期复发转移等方 面有着独特的优势及潜在的应用前景。 专利N201510097801.9公开了一种含有熊果酸和环 磷酰胺的药物组合物， 所述组合物既可以增强单组分的抗肿瘤药效， 也能降低其对正常组 织的毒性， 从而提高肿瘤治疗的效果， 在肿瘤治疗领域具有很。
6、大的应用前景。 专利 N03150714.X公开了熊果酸对人肝癌细胞、 人乳腺癌细胞、 人淋巴瘤细胞、 人成淋巴细胞白 血病和人急性成淋巴细胞白血病、 人急性早幼粒白血病及人慢性髓性白血病都有细胞毒效 应。 0003 0004 吉非替尼 （化学名： N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉丙氧基) 喹唑啉-4- 胺） ， 英文名： Gifitinid， 结构如式所示,吉非替尼是一种有效的表皮生长因子受体酪氨 酸激酶选择性抑制剂,国外已批准用于治疗局部晚期或转移性的非小细胞肺癌(non- small-cell lung cancer,NSCLC)。 吉非替尼为难溶性药物， 其在水溶。
7、液中的溶解性呈pH依 赖性， 即在pH越低的水溶液中溶解度越大， 在pH值7左右的水中几乎不溶； 吉非替尼对部分 EGFR存在突变的患者具有一定的治疗作用， 但是应用吉非替尼1年后大部分NSCLC患者产生 耐药， 病情发生明显进展， 随后研究发现耐药的主要原因是由于部分患者产生新的突变而 说 明 书 1/7 页 3 CN 106038571 B 3 对吉非替尼产生耐药,因此即使使用吉非替尼 （酪氨酸激酶抑制剂） 治疗仍然不能提高非小 细胞肺癌患者的五年总生存期。 目前针对这种继发耐药性的患者无有效的治疗方案， 各自 方法均处于实验阶段。 专利N201210566665.X公开了一种含有吉非替尼。
8、的片剂， 它其能持 续、 平稳释放有效成分、 对既往接受过化学治疗的局部晚期肺癌或转移性非小细胞肺癌达 到良好的治疗效果。 0005 0006 本发明以不同癌细胞系作为研究对象， 通过熊果酸和吉非替尼进行联合用药， 对 不同癌细胞系进行体外抗癌活性测试， 结果表明， 熊果酸和吉非替尼的联合使用对癌细胞 特别是非小细胞肺癌的具有显著的抑制作用。 发明内容 0007 本发明的目的就是提供一种药物组合物， 通过将表皮生长因子受体酪氨酸激酶 (EGFR-TK)抑制剂吉非替尼与高效低毒的抗肿瘤天然产物熊果酸进行联合用药， 研究发现， 由于吉非替尼和熊果酸这两类药物作用机制的不同， 两者联用可以提高疗效，。
9、 增强吉非替 尼对原发及继发耐药的NSCLC的疗效， 从而降低药物的毒副作用， 最终提高治疗癌症的效 果， 可应用于制备抗肿瘤的药物领域。 0008 一种具有抗癌活性的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。 其特征在于该 药物组合物包含物质的量比为10-20:1-25的熊果酸与吉非替尼。 附图说明 0009 图1.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用24h后对A549细胞增殖的抑制结果； 0010 图2.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用48h后对A549细胞增殖的抑制结果； 0011 图3.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用72h后对A549细胞增殖的抑制结果； 0012 图4.熊果酸和吉非。
10、替尼单独使用及联合使用24h后对H1975细胞增殖的抑制结果； 0013 图5.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用48h后对H1975细胞增殖的抑制结果； 0014 图6.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用72h后对H1975细胞增殖的抑制结果； 0015 图7.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用24h后对H1650细胞增殖的抑制结果； 0016 图8.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用48h后对H1650细胞增殖的抑制结果； 0017 图9.熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用72h后对H1650细胞增殖的抑制结果； 具体实施方式 说 明 书 2/7 页 4 CN 106038571 B 4 。
11、0018 为了使本发明所述的内容更加便于理解， 下面结合具体实施方式对本发明所述的 技术方案做进一步的说明， 但是本发明不仅限于此。 0019 实施例 1 0020 熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用24、 48、 72 h对A549细胞的增殖抑制作用： 采用标准MTT比色法测定了熊果酸和吉非替尼不同联合比例对A549细胞株的增殖抑制活 性。 0021 将对数期的细胞， 用胰酶消化后， 细胞计数， 配成8104/ml的细胞浓度， 将制得的 细胞悬液， 每孔100 l接种到96孔板， 放于37、 5% CO2培养箱中； 弃掉旧的培养基， 每孔加 入100 l含有不同药物浓度梯度的培养基。 置于3。
12、7、 5% CO2培养箱中培养24、 48和72 h， 弃掉含药培养基， 每孔加入100 l含有MTT （0.5 mg/ml） 的无血清无酚红培养基， 继续孵育4 h;小心吸取各孔中的上清液， 每孔加入DMSO 150 L， 摇床中振荡摇匀10 min， 使蓝紫色结 晶全部溶解， 酶标仪 （570 nm） 测定各孔光吸收值 （OD值） ， 并计算细胞的存活率， 结果如图1- 3所示。 0022 0023 如图1所示， 当药物作用24 h之后， 熊果酸在10 M的条件下对A549细胞增殖抑制 的效果不明显； 吉非替尼在25 M的条件下， 能明显的抑制A549细胞的增殖； UA和吉非替 尼 （10。
13、 M） 联合给药组作用24 h就能很明显的抑制A549细胞的增殖， 随着吉非替尼药物浓 度的增大， 抑制效果越明显， 两者联用可以起到联合增效抑制A549细胞增殖的作用； 如图2 所示， 当药物作用48 h之后， 熊果酸在10 M的条件下能明显的抑制抑制A549细胞的增殖； 吉非替尼在10 M的条件下， 能有效的抑制A549细胞的增殖； 但联合给药的时候， 当吉非 替尼浓度5 M的条件下就能够明显的抑制细胞的增殖； 如图3所示， 当药物作用72 h之 后， 熊果酸在10 M的条件下细胞死伤达一半； 吉非替尼5 M的条件下能够抑制A549细胞 的增殖； 而UA （10 M） 和吉非替尼 （1, 。
14、5, 10, 20 M） 联合作用72 h之后均能够显著抑制细 胞的增殖， 且该增值抑制效果呈剂量依赖性。 综上结果可以发现， UA和吉非替尼联用能够明 显降低吉非替尼的给药剂量， 从而降低药物的毒副作用， 并可以协同增效的抑制A549细胞 的增殖， 该效果呈浓度依赖性和时间依赖性。 0024 实施例2 0025 采用金氏修正式计算熊果酸和吉非替尼两者联合给药在不同配比下作用24、 48、 72 h对A549细胞的协同作用， 筛选出最佳的药物配比， 结果如表1-3所示。 计算出UA=10 M 的条件下对A549细胞的抑制率为EA， 计算出不同吉非替尼浓度对A549细胞的抑制率为EB1、 EB2。
15、、 EB3等, 再计算出两者联合给药在不同配比下对A549细胞的抑制率分别为EC1、 EC2、 EC3等， 通过以下公式计算联合用药指数q值， q=EC/(EB+EA-EB*EA)， 当q值1.15为协同效 应， 0.85q1.15为相加效应， q0.85为拮抗效应。 通过上述联合用药指数的计算进一步判 断两种药物联合用药的最终药效。 说 明 书 3/7 页 5 CN 106038571 B 5 0026 0027 0028 如表1-3所示， 熊果酸和吉非替尼两者联合给药在不同配比下作用24、 48、 72 h对 A549细胞,当吉非替尼在低浓度的条件下两者联药效基本为相加效应； 当吉非替尼在。
16、高浓 度的条件下两者联药效基本为协同效应， 可以协同的抑制A549细胞的增殖， 药物浓度越大， 抑制越明显。 0029 实施例3 0030 熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用24、 48、 72 h对H1975细胞的增殖抑制作 用， 步骤同实施例1， 结果如图4-6所示。 0031 如图4所示， 当药物作用24 h之后， UA在10 M的条件下抑制H1975细胞增殖的效果 不明显； 吉非替尼在25 M的条件下， 能表现出明显的抑制H1975细胞的增殖； 当两者联合 给药时吉非替尼5 M时就能表现出明显抑制H1975细胞的增殖， 且随着浓度的增大抑制 细胞的增殖更明显， 联合给药可以起到协同抑制。
17、肿瘤细胞的增殖； 如图5所示， 当药物作用 48 h之后， UA在10 M的条件下可以明显的抑制细胞的增殖； 吉非替尼在10 M的条件下， 能有效的抑制H1975细胞的增殖； 但联合给药的时候， 当吉非替尼浓度1 M的条件下就能 够表现出明显的抑制细胞的增殖； 吉非替尼浓度在5 M的条件， 细胞存活率大约为40%， 与 单用吉非替尼相比能明显的抑制细胞的增殖； 如图6所示， 当药物作用72 h之后， 熊果酸在 10 M的条件下细胞存活率大约为50%； 吉非替尼5 M的条件下能够有效的抑制H1975细 说 明 书 4/7 页 6 CN 106038571 B 6 胞的增殖； 但联合给药时， 吉非。
18、替尼在1 M的条件下细胞存活率大约为50%。 综上结果可 以发现， UA和吉非替尼联用能够明显降低吉非替尼的给药剂量， 且呈浓度依赖性和时间依 赖性的抑制H1975细胞的增殖， 随着吉非替尼药物浓度的增大， 抑制细胞的增殖更明显， 两 者联用可以起到协同抑制H1975细胞的增殖。 0032 实施例4 0033 采用金氏修正式计算UA和吉非替尼两者联合给药在不同配比下作用24、 48、 72 h 对H1975细胞的协同作用， 筛选出最佳的药物配比， 方法同实施例2， 结果如表4-6所示。 0034 0035 如表4-6所示， 熊果酸和吉非替尼两者联合给药在不同配比下作用24、 48、 72 h对。
19、 H1975细胞,当吉非替尼在低浓度的条件下两者联药效基本为相加效应； 当吉非替尼在高浓 度的条件下两者联药效基本为协同效应， 可以协同的抑制H1975细胞的增殖， 药物浓度越 大， 抑制越明显。 0036 实施例5 0037 熊果酸和吉非替尼单独使用及联合使用24、 48、 72 h对H1650细胞的增殖抑制作 用， 步骤同实施例1， 结果如图7-9所示。 说 明 书 5/7 页 7 CN 106038571 B 7 0038 如图7所示， 当药物作用24 h之后， UA在10 M的条件下抑制H1650细胞增殖的效果 不明显； 吉非替尼在10 M的条件下， 能表现出明显的抑制H1650细胞的。
20、增殖； 当两者联合 给药时吉非替尼10 M的条件下抑制细胞的增殖比单用吉非替尼来得明显， 且随着浓度 的增大抑制细胞的增殖更明显， 联合给药可以起到协同抑制肿瘤细胞的增殖； 如图8所示， 当药物作用48 h之后， UA在10 M的条件下可以明显的抑制细胞的增殖； 吉非替尼在10 M的条件下， 能有效的抑制H1650细胞的增殖； 但联合给药的时候， 当吉非替尼浓度2 M的 条件下就能够表现出明显的抑制细胞的增殖； 吉非替尼浓度在5 M的条件， 细胞存活率大 约为40%， 与单用吉非替尼相比能明显的抑制细胞的增殖； 如图9所示， 当药物作用72 h之 后， 熊果酸在10 M的条件细胞存活率大约为5。
21、0%； 吉非替尼5 M的条件下能够有效的抑 制H1650细胞的增殖； 但联合给药时， 吉非替尼在1 M的条件就能够表现抑制H1650细胞 的增殖。 综上结果可以发现， UA和吉非替尼联用能够明显降低吉非替尼的给药剂量， 且呈浓 度依赖性和时间依赖性的抑制H1650细胞的增殖， 随着吉非替尼药物浓度的增大， 抑制细胞 的增殖更明显， 两者联用可以起到协同抑制H1650细胞的增殖。 0039 实施例6 0040 采用金氏修正式计算UA和吉非替尼两者联合给药在不同配比下作用24、 48、 72 h 对H1650细胞的协同作用， 筛选出最佳的药物配比， 方法同实施例2， 结果如表7-9所示。 0041。
22、 说 明 书 6/7 页 8 CN 106038571 B 8 0042 如表7-9所示， 熊果酸和吉非替尼两者联合给药在不同配比下作用24、 48、 72 h对 H1650细胞,当吉非替尼在低浓度的条件下两者联药效基本为相加效应； 当吉非替尼在高浓 度的条件下两者联药效基本为协同效应， 可以协同的抑制H1650细胞的增殖， 药物浓度越 大， 抑制越明显。 说 明 书 7/7 页 9 CN 106038571 B 9 图1 图2 说 明 书 附 图 1/5 页 10 CN 106038571 B 10 图3 图4 说 明 书 附 图 2/5 页 11 CN 106038571 B 11 图5 图6 说 明 书 附 图 3/5 页 12 CN 106038571 B 12 图7 图8 说 明 书 附 图 4/5 页 13 CN 106038571 B 13 图9 说 明 书 附 图 5/5 页 14 CN 106038571 B 14 。