技术领域
本发明属于中药和天然药物技术领域，具体涉及一种预防及治疗慢性肾衰竭及其他慢性肾病的单方中药制剂及其制备方法和应用。
背景技术
慢性肾功能衰竭(CRF)是慢性肾脏疾病及累及肾脏系统性疾病所引起的慢性肾功能减退，以及由此而产生的各种临床症状及代谢紊乱所组成的综合症。CRF是一种严重危害患者身体健康，甚至威胁生命的疑难病症。大量临床及实验研究证实，不同病因的慢性肾病在肾脏遭受一定程度的破坏之后，尽管其基础病变已经停止，但肾功能仍会持续减退。因此，如何对CRF进行早期防治，并延缓CRF的病情进展，降低尿毒症的发病率就显得尤为重要。
近年来研究发现，天然药用虫生真菌蝉花具有减少细胞外基质的合成，延缓肾小球硬化，改善肾功能的作用，但天然蝉花面临着资源稀缺，价格昂贵，生产周期长，产量低的问题。研究人员发现，蝉花的人工培育物不仅与天然蝉花具有相似的成分和功效，尤其是在治疗慢性肾衰竭上，同样具有降低血清肌酐和尿素氮水平，改善肾功能，抑制系膜细胞增生和基质增多，延缓肾小球的硬化进展，同时也可以解决天然蝉花的资源稀缺，产量低，质量不稳定等问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种单方中药制剂。该中药制剂对慢性肾衰竭及其他慢性肾病的发生与发展具有明显的治疗和预防作用，能降低血清黄嘌呤氧化酶活性。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种单方中药制剂，该单方中药制剂中含有蝉花人工培养产物。
较佳的，所述蝉花人工培养产物由如下方法制得：
1)菌种制备：包括斜面种制备和一级种制备过程；
其中，斜面种制备包括如下步骤：将单胞分离后的蝉拟青霉菌株移植到PSA培养基斜面试管中，在22℃～25℃下培养5～7天，挑选长势好的种保存备用；
一级种制备包括如下步骤：将斜面种接入马铃薯蔗糖培养液中，在22℃～25℃，振荡频率为130～150r/min的条件下培养3～7天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后作为一级种备用；
2)接种：将步骤1)中制得的一级种接入到固体培养基中；
3)发酵：接种后的培养盒移至培养室内，在20℃～25℃，相对湿度60％～80％的条件下培养30天～50天；
4)孢梗束的采收：当培养物的孢梗束高度达9cm左右、表面有少量分生孢子出现时即可采收。
优选的，步骤1)中，所述PSA培养基中含有如下组分(每1000ml培养基中含有)：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g，其制备方法为：将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000ml，煮沸20min～30min，过滤，加入蔗糖与琼脂，补足水至1000ml，加热溶解，然后分装至试管内，装量为试管长的1/5～1/4，塞上棉塞，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，趁热将试管摆放在斜面板上冷却。
优选的，步骤1)中，所述马铃薯蔗糖培养液中含有如下组分(每1000ml培养液中含有)：马铃薯200g、蔗糖20g；其制备方法为：将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000ml，煮沸15min～30min，过滤，加入蔗糖，补足水至1000ml，加热溶解，然后分装至锥形瓶内，装量为锥形瓶容量的20％～30％，塞上棉塞，再用牛皮纸包裹，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，取出冷却至20℃以下。
较佳的，步骤2)中，所述接种的步骤为：当培养盒中的固体培养基的温度冷却至20℃以下后，在无菌条件下接种，按照3～5％的接种量将一级种接入培养盒中。
较佳的，步骤2)中，所述固体培养基的原料组分包括：
基质 42～46重量份；
甘蔗渣 2～10重量份；
贝壳粉 0.1～0.5重量份；
蚕蛹粉 2～5重量份；
硝酸钾 0.1～0.5重量份；
水 44～56重量份；
其中，所述基质选自如下组合中的一种：玉米粉、麸皮和蔗糖的混合物；小麦；大麦；粟和蔗糖的混合物；大米和蔗糖的混合物；高粱和蔗糖的混合物。
优选的，所述玉米粉、麸皮和蔗糖的混合物中，以所述玉米粉、麸皮和蔗糖的混合物的总重量计，玉米粉、麸皮和蔗糖的重量百分比分别为：玉米粉43％～55％、麸皮44％～55％、蔗糖1％～2％。
优选的，所述粟和蔗糖的混合物中，以所述粟和蔗糖的混合物的总重量计，粟和蔗糖的重量百分比分别为：粟98％～99％、蔗糖1％～2％。
优选的，所述大米和蔗糖的混合物中，以所述大米和蔗糖的混合物的总重量计，大米和蔗糖的重量百分比分别为：大米98％～99％、蔗糖1％～2％。
优选的，所述高粱和蔗糖的混合物中，以所述高粱和蔗糖的混合物的总重量计，高粱和蔗糖的重量百分比分别为：高粱98％～99％、蔗糖1％～2％。
优选的，所述固体培养基的制备方法为：先将玉米粉、麸皮或小麦、大麦、粟、大米、高粱煮熟，将蔗糖、硝酸钾在水中溶解，再与甘蔗渣、贝壳粉，蚕蛹粉按照比例混合均匀。
优选的，所述固体培养基中还含有蛋白胨(鱼粉)，且所述蛋白胨(鱼粉)的重量份为0.5重量份。
优选的，步骤2)中，所述固体培养基的碳氮比为80～98。
优选的，步骤3)中，在固体发酵后期孢梗束生长阶段要求采光，温度较菌丝体生长温度略低2℃，培养过程中需保持空气流通。
优选的，步骤4)中，所述采收的具体步骤为：去掉透气封口膜，用工具将培养物取出分离孢梗束，烘干分级，干燥后用薄膜袋真空包装，菌质置于-20℃贮存。
本发明中所述的蝉花人工培养产物由孢梗束、分生孢子、菌丝体与培养基剩余物质的混合物。
进一步优选的，所述蝉花人工培养产物是指采用蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453 [Paecilomyces cicadae]经上述固体培养后得到的人工培养产物，该菌株已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏，保藏号为CGMCC No.3453。
本发明还提供了所述单方中药制剂的制备方法，所述制备方法选自如下三种中的一种：
1)粉碎：将蝉花人工培养产物干燥后直接粉碎，过120目筛制得；
2)溶剂提取；
3)将所述蝉花人工培育物加水煎煮(所用水量为蝉花人工培育物重量的3-6倍)，过滤，浓缩至适量，干燥即得干燥粉。
较佳的，所述溶剂提取为采用有机溶剂提取，或为水提，或为有机溶剂和水的混合溶液提取，进一步优选为水提。
优选的，所述有机溶剂选自乙醇、丙酮和石油醚中的一种或多种的混合物；所述有机溶剂和水的混合溶液为乙醇水溶液的提取物。
较佳地，所述蝉花人工培育物加水煎煮的制备方法中，所述煎煮次数为2～3次，每次煎煮时间为0.5～1小时。
优选地，所述蝉花人工培育物加水煎煮的制备方法中，所述煎煮后得到的煎液先过80目筛，抽滤除杂。
优选地，所述蝉花人工培育物加水煎煮的制备方法中，所述浓缩为减压薄膜浓缩，所述干燥为喷雾干燥。
本发明的第三个方面，提供了一种中药组合物，该中药组合物含有安全有效量的上述单方中药及药学上可接受的载体，所述单方中药的重量百分含量为50％-99％，优选为62％-80％。
药学上可接受的载体为各种药学上常用的辅料和/或赋形剂，包括(但不限于)糖类(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)，淀粉(如玉米淀粉和土豆淀粉)，纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素)，黄蓍胶粉末，麦芽，明胶，滑石，固体润滑剂(如硬脂酸和硬脂酸镁)，硫酸钙，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油，多元醇(如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇)，海藻酸，乳化剂(如Tween)， 润湿剂(如月桂基硫酸钠)，着色剂，调味剂，压片剂、稳定剂，抗氧化剂，防腐剂，无热原水，等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等；这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明的单方中药制剂可以按照药剂学上的通用方法制成任何常规的制剂形式，包括口服制剂。优选的是片剂、粉剂剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、糖浆剂，最优选为粉剂。
本发明的单方中药制剂粉剂，较佳的服用剂量为2-15g/天，最优的剂量为5-10g/天。
本发明的第四个方面，提供了上述单方中药制剂的用途，即该单方中药用于制备治疗及预防慢性肾衰竭及其他慢性肾病的药物。所述其他慢性肾病是指以肾小管-间质损害为主的肾病，包括尿酸性肾病、慢性肾盂肾炎、药物性肾损害等。
本发明的第五个方面，提供了上述单方中药制剂的用途，即该单方中药用于制备治疗及预防能降低血清肌酐和尿素氮的药物。
术语说明：本发明中所述的蝉花人工培育物即蝉拟青霉，拉丁名为Paecilomycescicadae。
动物实验表明，本发明提供的单方中药能够改善肾功能、提高血红蛋白、减少ECM的沉积、减少系膜细胞增生、减轻肾组织损伤、延缓肾间质纤维化；其药效活性与天然蝉花作用相比相似或更好，安全无明显毒副作用。
本发明中，所述的单方中药制剂由所述原料制成，是指由所述原料直接粉碎或提取制成
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1单方中药制剂的人工培育
挑取蝉拟青霉菌种接入PSA培养液中，22℃-25℃，140rpm的条件下培养3-5天后备用；将种子按照3-5％比例接入固体培养基中，20℃-25℃，空气相对湿度60％-80％下培养30d-50d即可，后期孢梗束生长阶段要求采光，温度较菌丝体生长阶段略低2℃，每天需适 时开窗通气，保持培养室内空气新鲜。
本实施方式采用的PSA培养基配比为每1000ml培养基：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g。
本实施方式所述的固体培养基配比为基质46重量份，甘蔗渣5重量份，贝壳粉0.4重量份，蚕蛹粉2.5重量份，硝酸钾0.1重量份，水为44重量份；其中基质为小麦。其制备方法为：先将小麦煮熟，将蔗糖、硝酸钾在水中溶解，再与甘蔗渣、贝壳粉，蚕蛹粉按照比例混合均匀。
实施例2单方中药制剂的制备方法之一
将采收的新鲜蝉花人工培育物，70℃干燥10h，通过粉碎机粉碎，过120目筛网，即得干燥粉。
实施例3单方中药制剂的制备方法之二
将所述蝉花人工培育物加水共煎煮2次，每次0.5小时，煎液采用真空抽滤，除去杂质，得滤液，减压薄膜浓缩至适量，喷雾干燥即得干燥粉。
实施例4实施例2的单方中药制剂对5/6肾切除大鼠模型的肾功能影响
本实施例数据引自：朱戎、陈以平、邓跃毅、王琳.固体培养蝉花菌丝延缓肾小球硬化作用及其机制的实验研究，中国中西医结合肾病杂志，2005，6(2)：70-74
受试物：
实施例2的单方中药制剂。
阳性对照药：科素亚，杭州默沙东制药有限公司生产；天然蝉花，产地为浙江。
实验动物：
SPF级雄性SD大鼠70只，2月龄，体重200±10g，由上海中医药大学实验动物中心提供。
分组与造模：
SD大鼠适应性喂养1周后，随机分成2组：空白组(假手术组)8只和实验组(手术组)62只。采用5/6肾大部分切除方法建立实验大鼠模型：第1次手术，手术组大鼠左肾 总切除肾皮质重量占左肾重量的2/3；7d后进行第2次手术，右肾全切。两次手术供切除两肾总重量的5/6。假手术组SD大鼠采用同样步骤暴露肾脏，分离肾包膜，但不予肾切除。手术组动物存活54只，假手术组全部存活8只。于第2次手术后2周，所有动物行目内眦动静脉丛采血，进行血肌酐(Scr)检测。并将54只手术组大鼠，根据Scr分层随机分成5组：模型对照组(模型组)12只，科素亚组10只，天然蝉花组11只，人工蝉花大剂量组(A组)10只，人工蝉花小剂量组(B组)11只。科素亚组，天然蝉花组，人工蝉花大剂量组(A组)，人工蝉花小剂量组(B组)大鼠在第2次手术后4周开始喂药，治疗时间为42d。实验结束时大鼠存活44只，假手术组、人工蝉花大剂量组(A组)各8只，模型组、科素亚组、天然蝉花组、人工蝉花小剂量组(B组)各7只。
给药剂量：
天然蝉花组、人工蝉花大剂量组(A组)大鼠按4g·kg-1·d-1用量，人工蝉花小剂量组(B组)按2g·kg-1·d-1用量，加入饲料中给药，并每日用生理盐水灌胃1次；科素亚组大鼠采用灌胃法，按30mg·kg-1·d-1用量，溶于生理盐水中，每日灌胃1次。所有大鼠分组分笼饲养，每笼4-5只大鼠，实验期间全部大鼠自由饮水，进食市售块状颗粒普通饲料。
测试仪器及方法：
实验结束时检测所有大鼠的Scr、尿素氮(BUN)、白蛋白(Alb)；收集24h尿液，测定尿蛋白定量。以上指标采用日立7170型自动生化分析仪测定。
以HE染色和PAS染色肾组织病理片检查肾小球硬化，其中，肾小球硬化定义为毛细血管腔塌陷和/或玻璃样变。采用Rajj等的半定量方法只评估肾小球硬化程度。在光镜(×200)视野下，每张切片至少观察40个肾小球，根据肾小球硬化灶所占肾小球比例分为0-++++，0表示肾小球无硬化，+表示1个肾小球的25％受损，++表示26％-50％受损，+++表示51％-75％受损，++++表示76％-100％受损。然后计算肾小球硬化指数(GSI)。
采用SPSS Version 11.0 for Windows进行数据统计，以均数±标准差 表示，组间比较采用One-Way ANOVA分析，统计显著性水平为P＜0.05。
试验结果：
结果发现，大鼠的Scr、BUN值，各治疗组较模型组显著降低(P＜0.05)，人工蝉花各组(大剂量组、小剂量组)与天然蝉花相比无统计学差异(P＞0.05)，大鼠的血白蛋白值， 假手术组、科素亚组、天然蝉花组、人工蝉花大剂量组(A组)显著升高(P＜0.05)，而人工蝉花大剂量组(A组)与天然蝉花组及假手术组相比无统计学差异(P＞0.05)；大鼠的24h尿蛋白量，各组与假手术组相比，均明显增加(P＜0.05)，但科素亚组、天然蝉花组、人工蝉花大剂量组(A组)与模型组相比较，则有明显减少(P＜0.05)。见表1。
表1模型大鼠血液学及尿液检测结果比较
注：与假手术组比较，ΔP＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；与天然蝉花组比较，#P＜0.05
常规HE及PAS染色，光镜下观察肾组织病理学变化：假手术组大鼠肾小球血管开放，结构清晰，PAS染色后肾小球胶原呈细线状分布；模型组大鼠肾小球系膜区基质中重度增多伴系膜细胞中重度增生，部分毛细血管襻受压闭塞，玻璃样病变，并伴间质淋巴细胞浸润，部分肾小管内见蛋白管型。各治疗组肾小球硬化程度比模型组明显减轻(P＜0.05)，依次为B组＞A组＞科素亚组＞天然蝉花组，A组、B组和天然蝉花组相比无统计学差异(P＞0.05)。见表2
表2各组肾小球硬化指数及基质阳性面积比值比较
注：与假手术组比较，ΔP＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；与天然蝉花组比较，#P＜0.05
实施例5实施例2的单方中药制剂和虫草菌丝体对肾功能影响的比较
本实施例数据引自：金周慧、陈以平、邓跃毅.蝉花菌丝延缓肾小球硬化的作用机制研究，中国中西医结合肾病杂志，2005，6(3)：132-136
受试物：
实施例2的单方中药制剂。
阳性对照药：科素亚，杭州默沙东制药有限公司生产；虫草菌丝购自江西省金水宝制药有限公司。
实验动物：
清洁级级雄性SD大鼠56只，体重195.93±20.43g，由上海中医药大学实验动物中心提供。
分组与造模：
所有大鼠适应性喂养1周后，随机分成假手术组8只和造模组48只。造模方法：造模组大鼠首次左肾总切除肾皮质重量占左肾重量的2/3；2周后进行第2次手术，行右肾全切。两次手术供切除两肾总重量的5/6。假手术组SD大鼠采用同样步骤暴露肾脏，分离肾包膜，但不予肾切除。将造模组大鼠随机分成模型对照组、蝉花菌丝组，科素亚组，虫草菌丝组，每组各12只。科素亚组，蝉花菌丝组，虫草菌丝组大鼠在第2次手术后4周开始喂药，治疗时间为6周。
给药剂量：
蝉花菌丝组和虫草菌丝组大鼠按30g·kg-1·d-1用药量做入饲料中给药，并每日用生理盐水灌胃1次，记录大鼠的饮食量；科素亚组大鼠采用灌胃法，按10mg·kg-1·d-1用量，溶于生理盐水中，每日1次灌胃。给药过程中模型组大鼠死亡4只，科素亚大鼠死亡2只，其余各组大鼠未发生死亡。
测试仪器及方法：
全部实验动物在治疗6周后，处死前1d全部大鼠空腹，次日采血，检测所有大鼠的红细胞计数(RBC)，血色素(Hb)，红细胞压积(HCT)，肾功能(BUN、Scr)，血脂(TG、TC)，白蛋白(Alb)检查。以上指标采用日立7170型自动生化分析仪测定。
实验动物抽血完毕后，迅速取出左肾，行HE染色。采用医学病理图像处理系统对肾小 球的病理损害程度进行分析。每张切片在高倍镜下连续随机选取面积相似的25个肾小球摄取图像，输入计算机图像分析系统内，在系统屏幕上，计算每个肾小球病变累及面积和选取的肾小球总面积的比值，取其均值作为每张切片的肾小球病理损害程度的比较值。
采用SPSS Version 11.0 for Windows进行数据统计，以均数±标准差 表示，组间比较采用One-Way ANOVA分析，统计显著性水平为P＜0.05。
试验结果：
结果发现，蝉花菌丝组、虫草菌丝组和科素亚组红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积均高于模型组大鼠，其有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01)；虫草菌丝组和科素亚组大鼠红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积低于蝉花菌丝组大鼠(P＜0.05)。模型组大鼠BUN、Scr明显高于蝉花菌丝组(P＜0.01)、虫草菌丝组和科素亚组Scr均高于蝉花菌丝组(P＜0.05)、科素亚组BUN高于蝉花菌丝组(P＜0.05)。蝉花菌丝组大鼠血浆白蛋白明显高于模型组大鼠(P＜0.01)。蝉花菌丝组大鼠血浆胆固醇低于模型组大鼠，其有统计学差异(P＜0.05)。见表3和表4。
表3模型大鼠血生化检测指标结果比较
注：与模型组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；与蝉花菌丝组比较，#P＜0.05
表4模型大鼠血生化检测指标结果比较
注：与模型组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；与蝉花菌丝组比较，#P＜0.05
模型组大鼠病理损伤较蝉花菌丝组、虫草菌丝组合科素亚组严重、系膜细胞增殖明显，系膜增宽，部分肾小球出现节段硬化，甚至毛玻璃样病变和全球硬化，其有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01)；蝉花菌丝组同虫草菌丝组合科素亚组大鼠相比，肾组织病理损伤减轻明显，其有统计学差异(P＜0.01)，见表5
表5各组大鼠肾组织病理损伤比较
注：与模型组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；与蝉花菌丝组比较，##P＜0.01
实施例6急性经口毒性试验
本试验由上海市疾病预防控制中心提供检测报告。
A.样品名称：蝉拟青霉
B.样品配制：称取样品10000mg，加蒸馏水至40ml，充分混匀后作为受试样品。
C.实验动物：昆明种小鼠20只，雌雄各半，体重19-22克，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。生产许可证号：SCXK(沪)2007-0005。饲养室温度20-25℃，相对湿度：40-70％。实验室动物使用许可证号：SYXK(沪)2007-0008。小鼠饲料由苏州双狮实验动物饲料科技服务有限公司提供，登记证号：苏E饲生字(2002)006。
D.实验方法：
1.动物禁食(不禁水)16小时后，按体重要求选用雌、雄小鼠各10只，分放于两鼠笼内，同性别小鼠之间体重差不超过3g。
2.将受试样品采用最大耐受剂量法对实验动物染毒，小鼠逐只称重，灌胃容量按每次0.4ml/20g体重计，在24小时内二次对小鼠灌胃，灌胃间隔时间为6小时。
3.染毒后，观察动物的一般状态、体重变化、中毒症状和死亡情况等。观察期为一周。
4.实验末再次对动物称重。对死亡动物及到期处死的动物进行尸体解剖，肉眼观察大体病 理改变情况。
5.实验全过程及观察内容均做详细记录，按最大耐受剂量法试验结果，求得小鼠急性经口MTD。
E.结果：
表6雌雄小鼠急性经口毒性试验结果
动物性别 剂量(mg/kg) 动物数 (只) 死亡数 (只) 死亡率 (％) 雌性小鼠 10000 10 0 0 雄性小鼠 10000 10 0 0
1.主要体征表现：
试验期间各组动物活动正常，毛色光泽度好，未见任何中毒体征和死亡；到期处死动物，大体解剖肉眼观察各脏器情况，未见异常。
2.雌性小鼠：MTD＞10000mg/kg
雄性小鼠：MTD＞10000mg/kg
F.结论：
样品对雌雄小鼠急性经口毒性试验的最大耐受剂量MTD均大于10000mg/kg。属于实际无毒级。