技术领域
本发明属于肿瘤预防技术方法领域，具体涉及一种由肿瘤微环境诱导的肿瘤化的人脐静脉内皮细胞疫苗及其在抗结肠癌肿瘤血管生成中的应用的专利申请。
背景技术
结肠癌是世界范围内第二大导致死亡的癌症，每年有超过120万名新诊断的病人和每年有60多万人死于该病。在中国，它的发病率和死亡率分别排在第三位和第五位。针对该疾病的常规治疗方法中，主要包括根治性的手术方法和辅助性治疗方法，如常用的化疗和放射治疗已被广泛应用于结肠癌的治疗中。但总体而言，结肠癌的5年生存率仍然较低，因此迫切需要制定新的策略来治疗结肠癌。新的治疗策略中，肿瘤免疫治疗方法主要通过激发和增强机体免疫功能，进而达到控制和杀灭肿瘤细胞的目的，近年得到了较快发展，被认为是继手术、化疗、放疗以后的第四种肿瘤治疗模式。
已有研究认为，肿瘤的生长和转移依赖新生血管的生成，因此通过抗新生血管生成来抑制肿瘤进展成为目前研究的热点之一。过去几年的临床试验表明，血管靶向药物抗肿瘤能带来一定的临床获益，然而由于血管生成方式的多样性，参与信号通路的复杂性，致使针对单一靶点或单药治疗效果较差，并且面临原发或继发耐药的问题。另一方面，肿瘤血管生成的复杂机制对其生物标志物的筛选也造成一定困难。因此，需要迫切找到新的更有效的抗血管生成疗法。
近年来的部分研究表明，以血管相关抗原为靶点的疫苗可以引发机体产生特异性细胞或体液免疫反应，进而抑制血管生成，从而起到阻止肿瘤细胞生长和转移的作用，因此针对肿瘤血管生成的疫苗治疗已成为国内外研究的热点。其中，以人脐静脉内皮细胞( human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)作为抗原制备的全细胞疫苗得到了较多研究。但相关临床实验研究发现，该疫苗在治疗性免疫中虽然能够引起一定程度的免疫应答，但相关效果仍然较为有限，因此需要对相关治疗方案进行进一步的优化。
发明内容
本申请目的在于提供一种肿瘤化的HUVEC（人脐静脉内皮细胞，human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）疫苗及其制备方法，所制备的HUVEC疫苗高表达肿瘤血管内皮细胞Markers，同时具有较好特异性，从而可以在肿瘤血管内皮细胞杀伤方面表现出较好的应用效果，进而为抗肿瘤血管生成的免疫治疗奠定基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种肿瘤化的人脐静脉内皮细胞疫苗（HUVEC疫苗），通过如下步骤制备获得：
（1）收CT26细胞的上清，
对CT26细胞进行常规培养，在CT26细胞长到占据培养容器80%左右面积时，将培养基更换为含10% 体积分数G16血清的1640培养基（不加双抗），培养24h后，3000r/min离心5min，收集上清，弃去沉淀，-20℃保存备用；
（2）制备肿瘤化的HUVEC疫苗，
用条件培养基对HUVEC进行培养，制备肿瘤化的HUVEC疫苗；
所述条件培养基为：60%体积比的CT26细胞上清（即步骤（1）所制备）+40%体积比的ECM培养基(培养基内含2%体积份数FBS，不含因子和双抗)；
具体培养方法为：
用10cm培养皿对HUVEC进行常规培养，待HUVEC长到占据培养皿60%左右面积时，加入条件培养基（在超净台中，把培养皿中的培养基用真空泵抽干净后，用10ml灭过菌的提前放至室温的PBS洗2遍，用真空泵抽干净，然后加入上述条件培养基，加入量10ml/dish，用10ml条件培养基诱导1.2×106个HUVEC），放入37℃、5%CO2的培养箱中继续培养48h，即为肿瘤化的HUVEC细胞；
培养48h后，将HUVEC用胰酶消化1~2min，然后用完全1640培养基终止消化，随后2000r/min离心5min，弃上清以去除完全1640培养基、胰酶和浮在上面的死细胞碎片；
在上述去除完全1640培养基后的细胞沉淀中加入0.025%戊二醛（体积分数）1~2ml，混匀后4℃固定20min（中间摇晃几下以确保固定效果），然后2000r/min离心5min，去除上清（即去除戊二醛），再用PBS清洗不少于2遍，以彻底洗掉戊二醛，最后用PBS重悬并利用计数板调整浓度（例如调整为2.5×107个/ml），直接注射使用或-80℃保存备用。
所述肿瘤化HUVEC疫苗在制备结肠癌疫苗中的应用，通过抑制血管生成用于结肠癌的预防和治疗。
总体而言，本申请的主要技术优势体现在如下几个方面：
第一、肿瘤化HUVEC表达血管内皮细胞增殖相关抗原，迁移能力和侵袭能力增强，与肿瘤血管内皮细胞特性相近，用其制备疫苗可解决肿瘤血管内皮细胞不易获得的难题；
第二、肿瘤血管内皮细胞基因组稳定，表达的靶抗原不易丢失，受肿瘤耐药性影响小；
第三、血管内皮细胞存在于管腔表面，药物易于到达，易产生治疗效果；
第四、实体肿瘤血管内皮细胞之间差异较小，针对肿瘤血管内皮细胞的药物对不同肿瘤均有效；
第五、抗血管生成治疗可提高肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感性；
第六、抗血管生成治疗对生长缓慢的肿瘤细胞同样有疗效；
第七、主动免疫治疗维持的时间较长，无需频繁给药且免疫反应副作用较小，价格低，来源方便，易于实施。
总之，本申请将肿瘤血管内皮细胞作为肿瘤免疫治疗中的靶点，属于主动免疫治疗中的一种。本申请通过体外模拟肿瘤微环境，诱导制备了肿瘤化的HUVEC疫苗。初步实验结果表明，所制备的肿瘤化HUVEC疫苗，能够产生更有效的抑制肿瘤血管生成的作用，进而发挥抗结肠癌肿瘤生长的作用，表现出了较好的应用效果，同时也为基于抗肿瘤血管生成治疗方法的应用提供了新的可能。
附图说明
图1为不同比例的肿瘤上清诱导48h的HUVEC形态图；
图2为用60%CT26细胞诱导HUVEC时不同时间形态图；
图3为不同浓度、不同时间肿瘤上清诱导内皮细胞迁移图，其中a图为形态观察图，b图为数据统计结果；
图4为不同浓度肿瘤上清诱导内皮细胞侵袭图；其中a图为形态观察图，b图为数据统计结果；
图5为对内皮细胞相关抗原表达检测；其中a图为电泳图，b图为数据统计结果；
图6为肿瘤生长曲线图，其结果表明：与空白对照组相比，内皮细胞组（P＜0.01）和肿瘤化内皮细胞组（P<0.001）小鼠能显著抑制肿瘤生长；肿瘤化内皮细胞组（P＜0.05）比内皮细胞组抑制肿瘤生长的作用更强；
图7为小鼠结肠癌肿瘤组织体积图（a）和小鼠结肠癌肿瘤组织重量统计结果（b），结果表明：肿瘤的平均重量与肿瘤体积有相符的结果，内皮细胞组和肿瘤化内皮细胞组（P<0.001）肿瘤平均重量低于空白对照组，同时肿瘤化内皮细胞组（P＜0.05）比内皮细胞组的肿瘤平均重量还低；
图8为肿瘤生存曲线图，结果表明：与空白对照组相比，内皮细胞组和肿瘤化内皮细胞组能延长小鼠的生存期，肿瘤化内皮细胞组的小鼠生存期最长；
图9为免疫组织化学检测 CD31 表达情况（比例尺50μm）（a）和免疫组织化学中 CD31 阳性率的统计（b），结果表明：与空白对照组相比，内皮细胞组（P＜0.001）和肿瘤化内皮细胞组（P<0.001）小鼠能显著抑制肿瘤新生血管生成；肿瘤化内皮细胞组（P＜0.001）抑制肿瘤新生血管生成的效果比内皮细胞组好；
图10为血红蛋白含量图，结果表明：血红蛋白实验得到与免疫组化相似的结果，内皮细胞组和肿瘤化内皮细胞组（P<0.001）的血红蛋白含量低于空白对照组，同时肿瘤化内皮细胞组（P＜0.001）比内皮细胞组的血红蛋白含量还低；
图11为肿瘤血管生成相关抗原的表达情况，其中：(a)Western blot检测组织中TEM1, TEM8和 VEGFR2的蛋白表达情况；(b)Western blot检测组织中TEM1, TEM8和VEGFR2的蛋白表达的统计；结果表明：空白对照组血管生成相关抗原TEM1, TEM8和VEGFR2蛋白的表达量比内皮细胞组和肿瘤化内皮细胞组都高(P＜0.01，P＜0.001)，同样内皮细胞组血管生成相关抗原TEM1, TEM8和VEGFR2蛋白的表达量比肿瘤化内皮细胞组都高(P＜0.01，P＜0.001)，这些结果表明肿瘤化HUVEC疫苗组中的血管生成最少；
图12为检测小鼠血清中抗肿瘤血管生成相关抗体表达情况，结果表明：与空白对照组相比，内皮细胞组（P＜0.01）和肿瘤化内皮细胞组（P<0.001）的免疫小鼠血清中HUVEC抗体的含量明显增高，肿瘤化内皮细胞组（P＜0.01）比内皮细胞组的免疫小鼠血清中HUVEC抗体的含量还高；
上述各图中，*P＜0.05，**P＜0.01，***P ＜0.001。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
生物材料：
CT26细胞，由第二军医大学免疫学教研室曹雪涛博士惠赠，常规传代培养；
HUVEC细胞，由发明人自行提取纯化获得（制备过程中通过倒置显微镜观察形态、免疫细胞化学测血管内皮标志物、Western Blot和RT-PCR鉴定血管内皮标志物含量等方式，综合确定所制备细胞为HUVEC），具体方法见《简便高效的原代HUVECs培养》（路静等，基础医学与临床，2009，29(1)：78-81）、《原代脐静脉内皮细胞与脐静脉内皮细胞株的生物学特性比较》（路静等，第四军医大学学报，2008，29(20)：1888-1891）；
BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物有限公司；
实验试剂：
1640培养基、DMEM培养基，以色列 Biological Industries 公司产品；
G16血清、胎牛血清，美国 GIBCO 公司产品；
ECM培养基，美国 Sciencell 公司产品；
TEM1抗体、VEGFR2抗体、β-Actin抗体，为美国Santa Cruz公司产品；
CD31抗体、TEM8抗体，美国Abcam 公司产品；
β-Tubulin抗体，天津Sungene公司产品；
胰蛋白酶，上海碧云天生物科技有限公司产品；
BSA、PBS、Tween-20等，北京索莱宝科技有限公司产品；
DAB显色液，北京中杉金桥生物技术有限公司产品；
TEMED，上海碧云天生物科技有限公司产品；
DMSO，美国 Sigma 公司产品。
实施例
本实施例所提供的肿瘤化的HUVEC疫苗，具体通过如下步骤制备获得：
（1）收CT26细胞的上清，
10cm的培养皿里，加8ml完全DMEM培养基（10%BI血清+90%DMEM）对CT26细胞进行常规培养，在CT26细胞长到占据培养容器80%左右面积时（大约需要2天时间，细胞在80%时，细胞生长属于指数生长期，细胞活力最强，数目最多，此时便于确保后续实验效果），把培养皿中的培养基用真空泵抽干净后，用10ml灭过菌的提前放室温的PBS洗1遍，用真空泵抽干净，然后加入5ml/dish含10% 体积分数G16血清的1640培养基，（一个10cm的培养皿加5ml的G16培养基）；
培养24h后，将培养液收集到15ml或50ml规格离心管中，3000r/min离心5min，弃去沉淀，将上清收集至新的15ml规格离心管中，-20℃保存备用。
（2）制备肿瘤化的HUVEC疫苗，
用条件培养基对HUVEC细胞进行培养，制备肿瘤化的HUVEC疫苗；
为确定条件培养基较佳配比条件，设计不同配比方案如下：
80%CT26细胞：即80%体积比的CT26细胞上清（即步骤（1）所制备）+20%体积比的ECM培养基(培养基内含2%体积份数FBS，不含因子和双抗)；
60%CT26细胞：即60%体积比的CT26细胞上清（即步骤（1）所制备）+40%体积比的ECM培养基(培养基内含2%体积份数FBS，不含因子和双抗)；
40%CT26细胞：即40%体积比的CT26细胞上清（即步骤（1）所制备）+60%体积比的ECM培养基(培养基内含2%体积份数FBS，不含因子和双抗)；
0%CT26细胞：即ECM培养基(培养基内含2%体积份数FBS，不含因子和双抗)。
具体培养方法为：
在细胞间超净台内，10cm的培养皿内加8ml完全ECM培养基对HUVEC细胞放入37℃、5%CO2的培养箱中进行常规培养，待HUVEC长到占据培养皿60%左右面积时（大约需要2天时间，细胞在60%时，细胞生长进入指数生长期，此期的细胞活力最强，肿瘤上清诱导效果最好），加入条件培养基（在超净台中，把培养皿中的培养基用真空泵抽干净后，用10ml灭过菌的提前放至室温的PBS洗2遍，用真空泵抽干净，然后加入上述不同配比的条件培养基，加入量10ml/dish，一个10cm的培养皿中加10ml条件培养基，用10ml条件培养基诱导1.2×106个HUVEC），放入37℃、5%CO2的培养箱中继续培养48h，即为肿瘤化的HUVEC细胞。
培养48h后，将HUVEC用胰酶消化2min左右，然后用完全1640培养基终止消化，随后2000r/min离心5min，弃上清以去除完全1640培养基、胰酶和浮在上面的死细胞碎片；
在上述去除完全1640培养基后的细胞沉淀中加入0.025%戊二醛（质量分数）2ml左右，混匀后4℃避光固定20min（中间摇晃几下以确保固定效果），然后2000r/min离心5min，去除上清（即去除戊二醛），再用30ml的PBS清洗2遍，以彻底洗掉戊二醛，最后用PBS重悬，利用牛鲍计数板计数，调整浓度至2.5×107个/ml后，-80℃保存备用。
对条件培养基培养（肿瘤上清诱导）48h后细胞进行形态观察，结果如图1所示。从图1可以看出：
用ECM培养基培养原代HUVEC，细胞多呈小三角形、短梭形，细胞边界清楚，胞质丰富，胞核呈圆形或椭圆形，偶见双核，密集处呈铺路石状镶嵌排列，稀疏处为短梭形，传代培养的细胞形态饱满，伸展呈长梭形，漩涡状排列生长，细胞贴壁牢固；
而80%CT26细胞诱导48h后，与其它组相比，死细胞较多，但存活下来的细胞形态变大，细胞贴壁不牢固；
对60%CT26细胞诱导组不同诱导时长的细胞形态进行观察，结果如图2所示；可以看出，48h时，细胞已经长满，细胞形态饱满，伸展呈长梭形，漩涡状排列生长，细胞贴壁牢固，细胞活力强；
将60%CT26细胞诱导组与0%CT26细胞和40%CT26细胞组相比，细胞体积微大，与80%CT26细胞相比，体积微小，比其它所有组细胞数量增多，细胞贴壁牢固，细胞活力增强；因此们选择用60%体积比的CT26细胞上清诱导HUVEC作为后续实验应用。
进一步地，进行划痕实验，以观察不同诱导浓度、不同诱导时间时肿瘤上清诱导内皮细胞迁移情况，结果如图3所示。
分析可以看出，与空白对照组相比，40%CT26细胞和60%CT26细胞组（P＜0.001)的内皮细胞迁移数明显较多。而随着时间的延长，内皮细胞迁移数也明显增加。在不同的时间段，60%CT26细胞组（P＜0.001）的内皮细胞迁移数同样比40%CT26细胞组多，在24h时，80%CT26细胞组（P＜0.001）的内皮细胞迁移数比空白对照组多，在48h时，80%CT26细胞组（P＞0.05）的内皮细胞迁移数与空白对照组相一致，并且有大量的HUVEC死亡，细胞贴壁也不牢固。因此，60%体积比的肿瘤上清诱导HUVEC 48h是所有组中迁移细胞数最多的。
更进一步地，进行侵袭实验，以观察不同诱导浓度下内皮细胞侵袭数量情况，结果如图4所示。
分析可以看出，与空白对照组相比，40%CT26细胞和60%CT26细胞组（P＜0.001)的内皮细胞侵袭数明显较多。60%CT26细胞组（P＜0.001）的内皮细胞侵袭数比40%CT26细胞组多，说明60%体积比的CT26细胞上清诱导HUVEC效果比40%CT26细胞效果好。由于80%的肿瘤上清对HUVEC伤亡影响很大，死细胞多，所以没有具体进行80%CT26细胞组的侵袭实验。
综合上述结果可以看出，诱导时，肿瘤上清用量不是越多越好，可能原因是由于肿瘤上清中存在肿瘤细胞分泌的某些对细胞有害的因子。同时这也进一步说明在这些分组中60%体积比的肿瘤上清诱导HUVEC是最为适宜的。
进一步地，对60%肿瘤上清诱导HUVEC组（P＜0.001)的内皮细胞相关抗原（特异性标志物TEM1、TEM8、VEGFR2）表达量进行检测，结果如图5所示。
分析可以看出，与空白对照组相比，60%肿瘤上清诱导的HUVEC组（P＜0.001)的内皮细胞特异性标志物TEM1、TEM8、VEGFR2表达明显增高，进一步说明60%体积比的肿瘤上清诱导HUVEC是有效的，肿瘤微环境诱导后的内皮细胞均高表达肿瘤血管内皮细胞Markers，与肿瘤内皮细胞特性相近。
对照例
按照现有技术，发明人同时制备了HUVEC疫苗作为对照，具体方法为：
在细胞间超净台内，在10cm的培养皿中加8ml完全ECM培养基对HUVEC细胞进行常规培养，然后放入37℃，5%CO2的培养箱中，等HUVEC细胞长到占据培养皿80%左右面积时，结束培养；
将HUVEC细胞用胰酶消化2min左右，然后用完全1640培养基终止消化，随后1000r/min离心5min（平时传细胞时，细胞都是1000r/min 离心5min，收集诱导的HUVEC却是2000r/min 离心5min，转速高细胞沉淀多），弃上清以去除完全1640培养基、胰酶和浮在上面的死细胞碎片；
在上述去除完全1640培养基后的细胞沉淀中加入0.025%戊二醛（质量分数）2ml左右，混匀后4℃固定20min（中间摇晃几下以确保固定效果），然后2000r/min离心5min，去除上清（即去除戊二醛），再用30ml的PBS清洗2遍，以彻底洗掉戊二醛，最后用PBS重悬，利用牛鲍计数板计数，调整浓度至2.5×107个/ml后，置于EP管中直接注射使用或-80℃保存备用。
实验例
为检验上述实施例所制备肿瘤化HUVEC疫苗和现有HUVEC疫苗在肿瘤抗血管生成方面的效果差异，发明人进一步进行了动物实验，简要介绍如下。
（1）实验分组：
将4～6周龄、雌性BALB/c小鼠（20～22g左右）饲养于屏障系统中，随机分成空白对照组、内皮细胞组和肿瘤化内皮细胞组，每组7只；
饲养环境条件为：温度为20±2℃；相对湿度为50±10%；光照周期为12h白天/黑夜，经高压灭菌的SPF级动物饲料、垫料以及单蒸水，实验期间小鼠自由饮食；实验开始前，小鼠预饲养一周，以适应环境；
（2）实验过程：
实验开始后，在小鼠腋窝淋巴结附近皮下注射对应疫苗，具体而言：
PBS 组，每只每次注射0.2ml的PBS作为空白对照；每周注射1次，共注射5次（即注射5周）；
内皮细胞组，每只每次注射0.2ml所制备肿瘤化的HUVEC疫苗（相当于5×106个/只•次），每周注射1次，共注射5次（即注射5周）；
肿瘤化内皮细胞组，每只每次注射0.2ml所制备HUVEC疫苗（相当于5×106个/只•次），每周注射1次，共注射5次（即注射5周）。
提前在培养箱中养足量的CT26细胞，确保打完最后一次疫苗后的第7天（即第六周的同一时间段），收集对数生长期CT26细胞，用PBS重悬后，调整浓度为1×106个/ml，对上述各组小鼠进行皮下注射，注射剂量为100μL（即每只注射1×105个CT26细胞）。
在皮下肿瘤可触及后（注射CT26细胞后约第11天），每隔一天用游标卡尺测量瘤体的长径和短径并观察瘤体生长及小鼠存活情况；在3个处理组有明显差异时（注射CT26细胞后约为第24天），眼眶取血后用脱颈椎法处处死，测量肿瘤体积和重量。
需要说明的是，实验过程中，如小鼠瘤体有破溃时，按死亡记数，同时记录各组小鼠的死亡时间。肿瘤体积按下列公式计算：
肿瘤体积（mm3）=0.5×（肿瘤长径）×（肿瘤短径）2。
（3）实验结果：
经过上述先行疫苗免疫（每周一次，共 5 周），并皮下接种肿瘤处理后（第6周），最后对小鼠处死后，对小鼠血液分离血清，并对相关肿瘤组织进行测量及常规石蜡包埋、HE染色处理等操作，相关结果简要介绍如下。
（3.1）保护性免疫（主动性免疫）抗肿瘤效果的形态学观察
对饲养过程中小鼠皮下肿瘤体积进行测量后，绘制生长曲线图如图6所示；对肿瘤拍照称重并记录如图7a、7b所示，同时记录各组小鼠的生存率结果如图8所示。
结合饲养过程中小鼠状态对相关结果简要分析总结如下：
总体效果方面，与空白对照组相比，内皮细胞组和肿瘤化内皮细胞组小鼠均能显著抑制肿瘤生长；而与内皮细胞组相比，肿瘤化内皮细胞组抑制肿瘤生长的作用更强；
肿瘤重量方面，与空白对照组相比，内皮细胞组和肿瘤化内皮细胞组小鼠肿瘤组织的平均重量明显要低；而与内皮细胞组相比，肿瘤化内皮细胞组肿瘤组织的平均重量更低；
小鼠存活率方面，与空白对照组相比，内皮细胞组和肿瘤化内皮细胞组小鼠生存率均得到明显提高，肿瘤化内皮细胞组的生存率最高；提示肿瘤化内皮细胞疫苗可以提高荷瘤小鼠的24天生存率。
综上结果可以看出，肿瘤化HUVEC疫苗抑瘤效果最好，并且能更好提高荷瘤小鼠的生存率，同时在治疗过程中也未出现严重的不良反应。
（3.2）HUVEC疫苗抑制肿瘤的机制
为进一步清晰HUVEC疫苗的抗肿瘤机制，发明人进一步通过免疫组化和Western blot技术检测了肿瘤组织的血管生成状态。
具体检测项目包括：
将多聚甲醛固定过的肿瘤组织做成石蜡切片，孵育抗体 CD31后用DAB显色液染色，检查肿瘤组织中CD31的表达，判定肿瘤组织新生血管的生成情况(结果如图 9a、9b所示)；
取部分肿瘤组织进行血红蛋白实验，利用Drabkin’s 试剂（(美国Sigma–Aldrich公司）在用酶标仪 (美国Thermo scientific 公司)在540nm处检测肿瘤组织研磨物上清中血红蛋白的浓度，间接检测肿瘤微血管的密度(结果如图10所示)；
取部分肿瘤组织进行Western blot实验，检测肿瘤血管内皮细胞的Markers（TEM1，TEM8和VEGFR2），判定肿瘤组织中血管生成情况(结果如图11a、11b所示)。
综合分析可以看出：
与空白对照组相比，内皮细胞组（P＜0.001）和肿瘤化内皮细胞组（P<0.001）小鼠均能显著抑制肿瘤新生血管生成；而肿瘤化内皮细胞组（P＜0.001）抑制肿瘤新生血管生成的效果比内皮细胞组更好；
血红蛋白实验也得到相似的结果，内皮细胞组和肿瘤化内皮细胞组（P<0.001）的血红蛋白含量均低于空白对照组，同时肿瘤化内皮细胞组（P＜0.001）比内皮细胞组的血红蛋白含量还低；
在蛋白水平上，空白对照组血管生成相关抗原（TEM1, TEM8和VEGFR2蛋白）的表达量比 内皮细胞组和肿瘤化内皮细胞组都高(P＜0.01，P＜0.001)，同样内皮细胞组血管生成相关抗原（TEM1, TEM8和VEGFR2蛋白）的表达量比肿瘤化内皮细胞组都高(P＜0.01，P＜0.001)；
综合这些结果可以看出，肿瘤化HUVEC疫苗的抗肿瘤血管生成效果最好，而肿瘤化HUVEC疫苗通过抑制肿瘤血管生成抑制肿瘤生长。
（3.3）小鼠体内抗体的测定
在上述结果基础上，进一步地，发明人对各组小鼠的外周血进行了取样并分离了血清，利用ELISA方法，将血清作用于HUVEC细胞膜蛋白以判定各组小鼠血清中抗体产生的情况（结果如图12所示）。
结果表明，与空白对照组相比，内皮细胞组（P＜0.01）和肿瘤化内皮细胞组（P<0.001）的免疫小鼠血清中HUVEC抗体的含量明显增高，肿瘤化内皮细胞组（P＜0.01）比内皮细胞组的免疫小鼠血清中HUVEC抗体的含量还高；
这一结果表明，肿瘤化HUVEC疫苗免疫小鼠后，小鼠体内会针对HUVEC诱导产生特异性抗HUVEC抗体；综合而言，肿瘤化内皮细胞组的抗HUVEC抗体的含量最高，抗肿瘤血管生成效果也最好。