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1、(10)申请公布号 CN 102240315 A (43)申请公布日 2011.11.16 CN 102240315 A *CN102240315A* (21)申请号 201110116034.3 (22)申请日 2011.05.06 A61K 36/36(2006.01) A61P 43/00(2006.01) A61K 131/00(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号江南大学医药学院 (72)发明人 金坚 邱丽颖 冯磊 陈旭红 李倩 (54) 发明名称 王不留行抗新生血管有效部位的纯化与应用 (57) 摘要 本发明涉及王不留行。
2、抗新生血管有效部位皂 苷的纯化与应用。通过提取王不留行中的抗新生 血管有效部位粗皂苷， 然后将粗皂苷经大孔树脂 柱， 不同浓度乙醇洗脱， 再用细胞活性评价得到最 高活性组分， 最后将这最高活性组分经硅胶柱层 析， 氯仿-甲醇体系洗脱得到较纯皂苷。 本发明以 细胞活性评价为指标， 以薄层 - 分光光度法测定 皂苷含量， 得到了一条王不留行抗新生血管有效 部位皂苷的纯化工艺路线。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 CN 102240318 A1/1 页 2 1. 权利要求用石油醚将王不留行种子脱脂， 乙醇回流提取。
3、得到总苷， 再用二氯甲烷、 乙 酸乙酯、 水饱和正丁醇依次萃取得到抗新生血管有效部位粗皂苷。 2. 权利要求将权利要求 1 所述的有效部位粗皂苷用大孔吸附树脂法经不同浓度乙醇 洗脱， 将各洗脱液进行细胞活性评价， 并用薄层 - 分光光度法测定含量。 3. 权利要求将权利要求 2 所述的细胞活性最高的洗脱组分进行硅胶柱层析， 以氯 仿 - 甲醇体系作为洗脱剂梯度洗脱， 用 TLC 法鉴别并合并所需组分， 进行细胞活性评价， 并 用薄层 - 分光光度法测定含量。 4. 权利要求在权利要求 1 所述的路线基础上改进后成为相类似路线， 而得到的抗新生 血管有效部位粗皂苷。 5. 权利要求在权利要求 2。
4、 所述的路线基础上改进后成为相类似路线， 而得到的细胞活 性最高的洗脱组分。 6. 权利要求在权利要求 3 所述的路线基础上改进后成为相类似路线， 而得到的较纯有 效部位皂苷。 7. 权利要求通过权利要求 1、 2、 3 路线得到的有效组分皂苷用于与抗新生血管生成有 关的其它疾病的预防与治疗， 制成的不同的产品都属于本发明的权利要求范围。 8. 权利要求 7 的特征是所用于的疾病有肿瘤、 糖尿病、 视网膜病、 血管瘤、 牛皮癬、 类风 湿性关节炎、 月经失调等血管异常增生的疾病 ； 冠心病、 心机梗死后、 脑梗塞后、 血管闭塞性 血栓性脉管炎等血管新生抑制的疾病。产品形式包括药物制剂、 营养品。
5、、 保健品、 化妆品。 权 利 要 求 书 CN 102240315 A CN 102240318 A1/3 页 3 王不留行抗新生血管有效部位的纯化与应用 技术领域 0001 本发明涉及从王不留行种子里提取到粗皂苷， 以细胞活性评价为指标， 以薄 层 - 分光光度法测定皂苷含量， 采用大孔吸附树脂法和硅胶柱层析法纯化精制粗皂苷， 得 到有较高活性和较纯的抗新生血管有效部位皂苷组分。 背景技术 0002 大孔树脂(macroporous resin)又称全多孔树脂聚合物吸附剂， 是一种不溶于酸、 碱及各种有机溶剂的高分子聚合物。以吸附为特点， 对有机物具有浓缩、 分离作用。大孔 树脂的孔径与比。
6、表面积都比较大， 在树脂内部具有三维空间立体孔结构， 具有物理化学稳 定性高、 比表面积大、 吸附容量大、 选择性好、 吸附速度快、 解吸条件温和、 再生处理方便、 使 用周期长、 宜于构成闭路循环、 节省费用等诸多优点。本研究使用的 D101 大孔吸附树脂具 有良好的网状结构和很高的比表面积， 可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物 质， 从而达到分离提纯的目的， 且具有快速、 高效、 方便、 灵敏、 选择性好等优点。目前， D101 大孔吸附树脂在中药的分离纯化中应用广泛。 0003 硅胶柱层析法 (Silica gel column chromatography) 是根据物质在硅胶。
7、上的吸 附力不同而得到分离， 一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附， 极性较弱的物质不易被 硅胶吸附， 整个层析过程即是吸附、 解吸、 再吸附、 再解吸过程。目前， 硅胶柱层析法已应用 于很多中药的单体分离。 0004 王不留行Vaccaria segetalis(neck.)Garcke为双子叶植物石竹科麦蓝菜的干 燥成熟种子。 对行血通经， 催生下乳， 消肿敛疮 ； 妇女闭经， 乳汁不通， 难产， 血淋， 痈肿， 金疮 出血等有很大效用。主要含有三萜皂苷， 黄酮苷， 环肽， 类脂和脂肪酸， 单糖等。研究表明 ： 王不留行水提取具有较强抑制血管生成的作用 1、 花慧， 冯磊， 张小平， 张连。
8、芬， 金坚 . 王不 留行抑制血管生成的活性物质研究 . 时珍国医国药 .2009， 20(3) ： 698-700.， 在此研究基 础上， 夏明星等人把王不留行水煎剂用大孔吸附树脂法乙醇洗脱等纯化方法得到了抑制人 微血管内皮细胞增殖的单一组分群 2、 夏明星， 冯磊， 张莲芬， 李英， 储敏， 金坚 . 王不留行 中抗人微血管内皮细胞增殖的有效组分的分离和纯化 . 生物技术通报 .2009， 2 ： 93-97.， 并且高越颖通过不同路线提取的皂苷经毒理学和药效学研究表明王不留行经乙醇提取正 丁醇萃取得到的皂苷是抑制内皮细胞增殖的有效部位 3、 高越颖， 蒋秋龙， 冯磊， 邱丽颖， 金 坚 。
9、. 王不留行不同提取部位抑制新生血管作用的研究 . 海峡药学 .2010， 22(12) ： 34-37.， 因此本研究以细胞活性评价为指标， 薄层 - 分光光度法测定皂苷含量， 采用大孔吸附树脂 法和硅胶柱层析对王不留行粗皂苷进行纯化精制。 发明内容 0005 本发明的目的是以细胞活性评价为指标， 以薄层 - 分光光度法测定皂苷含量， 将 王不留行抗新生血管有效部位皂苷进行纯化。 0006 本发明的技术方案 ： 说 明 书 CN 102240315 A CN 102240318 A2/3 页 4 0007 所述王不留行皂苷的制备方法， 取王不留行种子， 粉碎， 石油醚浸泡脱脂， 晾干， 加 。
10、乙醇溶液加热回流， 冷却过滤， 旋转蒸发至干， 去离子水复溶， 依次用二氯甲烷、 乙酸乙酯、 水饱和正丁醇萃取， 旋干， 加水复溶， 真空干燥得粗皂苷。 0008 所述大孔吸附树脂法纯化粗皂苷， 装柱， 95乙醇洗至洗脱液溶于水不浑浊， 再用 去离子水洗至无醇味， 粗皂苷溶于水后上样吸附， 去离子水洗至无糖， 再依次用 30、 50、 75、 95浓度乙醇洗脱， 收集各洗脱液， 旋干， 加水复溶， 真空干燥。 0009 所述细胞活性评价各洗脱组分， 将 -80冰箱中的人微血管内皮细胞复苏， 正常培 养后用2培养液饥饿， 24h后加到96孔板里培养， 48h后加药即各洗脱液和粗皂苷， 继续培 养。
11、， 加药 48h 后 SRB 法染色， 用酶标仪在 540nm 波长下测 OD 值。 0010 所述硅胶柱层析法纯化大孔树脂洗脱组分， 以氯仿 - 甲醇体系为洗脱剂梯度洗 脱， 控制一定的流速和每管体积。将各收集管的溶液用 TLC 法进行鉴别， 以正丁醇 - 乙酸乙 酯 - 水为展开剂， 10硫酸乙醇为显色剂， 合并有皂苷物质的组分。 0011 所述细胞活性评价硅胶柱得到的组分， 用上述方法将硅胶柱洗脱组分与大孔树脂 洗脱组分、 粗皂苷进行活性比较。 0012 所述薄层-分光光度法测定皂苷含量， 以人参皂苷Re为对照品， 作一条标准曲线， 在线性范围内测定粗皂苷、 大孔树脂洗脱液、 硅胶柱层析。
12、洗脱液的皂苷含量。 0013 本发明的有益效果 ： 0014 本发明得到了王不留行粗皂苷的一条纯化工艺路线， 在细胞活性评价中也证实了 对人微血管内皮细胞有较好的细胞活性， 有利于后期的实验研究， 从硅胶柱层析中得到的 较纯组分进一步分离得到细胞活性有效的单体化合物。 具体实施方式 0015 实施例 1 ： 王不留行粗皂苷的提取工艺 0016 100g 王不留行种子用 600mL75乙醇回流两次， 每次 2.5h， 冷却后， 过滤， 旋转蒸 发至干， 去离子水复溶至 400ml， 等体积二氯甲烷萃取 4 次， 得到的水相用等体积乙酸乙酯 萃取4次， 再次得到的水相用等体积水饱和正丁醇萃取4次，。
13、 合并正丁醇相。 旋转蒸发至干， 加水复溶， 真空干燥， 得干粉， 备用。 0017 实施例 2 ： 粗皂苷初步纯化工艺 0018 用大孔吸附树脂法纯化粗皂苷， 采用 D101 型号树脂， 层析柱型号规格为 20300mm， 上样量 300mg， 溶于 30ml 去离子水中， 用 400ml 去离子水洗至 Molish 反应呈阴 性， 再依次用 30、 50、 75、 95浓度乙醇洗脱各收集 300ml， 旋转蒸发至干， 加水复溶， 真空干燥， 得干粉， 备用。 0019 实施例 3 ： 硅胶柱层析的纯化工艺 0020 将初步纯化的50乙醇洗脱组分用硅胶柱层析进一步纯化。 洗脱剂氯仿-甲醇体 。
14、系梯度洗脱， 流速为5ml/min， 每根试管收集10ml， 其中氯仿甲醇为102.5收集250ml， 10 3.5 收集 350ml， 10 4 收集 350ml， 10 5 收集 450ml， TLC 法鉴别皂苷， 第 35 根试 管开始出现皂苷， 直至第 126 根试管， 合并第 35-126 根试管的溶液。旋转蒸发至干， 加水复 溶， 真空干燥， 得干粉， 备用。 0021 TLC 法展开剂为正丁醇 - 乙酸乙酯 - 水 (4 1 5)， 显色剂为 10硫酸乙醇， 人 说 明 书 CN 102240315 A CN 102240318 A3/3 页 5 参皂苷 Re 为对照品， 95烘。
15、箱显色 10min。 0022 实施例 4 ： 细胞活性评价 0023 将 -80冰箱中的人微血管内皮细胞 (HMEC-1) 复苏， 先用 20培养液培养， 第二 天起用 10培养液培养， 待细胞正常生长后用 2培养液饥饿， 24h 后加到 96 孔板里培养， 每孔 8000 个细胞， 48h 后加药即各洗脱组分和粗皂苷， 继续培养， 加药 48h 后 SRB 法染色， 用酶标仪在 540mn 波长下测 OD 值。结果如下 ： 粗皂苷 IC50为 12.62g/ml， 30乙醇洗脱 组分IC50为39.07g/ml， 50乙醇洗脱组分IC50为6.33g/ml， 75乙醇洗脱组分IC50为 2。
16、5.37g/ml， 硅胶柱洗脱组分 IC50为 5.58g/ml。 0024 实施例 5 ： 薄层 - 分光光度法测定皂苷含量 0025 把人参皂苷 Re 标准溶液配制成 1.0mg/ml， 准确量取标准液 0.1ml、 0.4ml、 0.8ml、 1.2ml、 1.5ml、 1.8ml， 水浴蒸干后， 各加入 200l 甲醇稀释， 取 100l 在硅胶 G 板上点样， 在层析缸中展开。展开后取出， 挥干溶剂， 喷上显色剂， 95烘箱中显色。刮下相对应的红 紫色条带， 水浴提取， 提取液于 80蒸干， 加入 0.2ml5香草醛 - 冰醋酸和 0.8ml 高氯酸。 混匀密塞， 60水浴 15mi。
17、n。冷至室温加冰醋酸 4.0ml， 摇匀后于 560nm 波长下测定吸光值。 以吸光度 OD560为纵坐标， 人参皂苷含量 C(g/ml) 为横坐标， 绘制标准曲线。 0026 配制粗皂苷、 50乙醇洗脱组分、 硅胶柱洗脱组分浓度都为 1.0mg/ml， 按上述方法 测定样品的吸光度 OD 值， 分别为 0.176， 0.274， 0.342。 0027 本发明是结合最佳实施例进行描述的， 然而在阅读了本发明的上述内容后， 本领 域技术人员能领会在公开的实施例中作许多改变也可获得相同或类似的结果， 而不超出本 发明的构思、 精神和范围。 更具体地说， 显然有些化学和生理性的相关试剂可替代本文所公 开的试剂而得到相同或类似的结果。所有类似的取代和修饰对本领域技术人员来说， 显然 都认为是本发明的精神、 范围和构思及权利要求范围内的， 即所有上述这些等价形式都同 样落于本发明的权利要求书所限定的范围。 说 明 书 CN 102240315 A 。