技术领域
本发明属于药物载体材料技术领域，具体涉及碳酸钙/透明质酸复合药物载体及其制备方法。
背景技术
糖尿病(Diabetes)是世界范围内的一个公共健康问题，严重威胁着人类的健康与生命，2015年全世界约有4.15亿成年人患有不同程度的糖尿病，而且还保持着快速增长的趋势，而中国成人糖尿病患者数量已经达到1.09亿人，约占全球糖尿病患者的26.3％。糖尿病作为一种血液中葡萄糖容易堆积过多的慢性疾病，临床上以“高血糖”为主要特征，血糖的控制伴随糖尿病患者的终生，由于血液中胰岛素分泌不足或存在胰岛素抗体，导致胰岛素相对或绝对缺乏，对于糖尿病患者血糖水平的控制，最直接、有效的给药方式是皮下或静脉注射胰岛素。但这种给药方式存在诸多不足，如：由于胰岛素在血液中的半衰期短(3～5分钟)，经人体血液循环后只有少部分胰岛素能进入肝脏发挥降血糖作用。为了确保降血糖的效果，需长期、频繁注射胰岛素，从而给患者造成身体、精神和经济上的多重压力。
口服胰岛素可以很好地避免胰岛素注射造成的痛苦，药物口服递送需经胃肠道运输、黏膜粘附和肠细胞转运三个过程，而胰岛素的口服递送必须同时克服胃酸极端pH、消化酶降解、肠蠕动清除和肠上皮吸收等多重载运屏障。胰岛素是一种蛋白质，很容易被胃里的蛋白酶溶解，因此，当务之急需要开发一种药物载体用于的胰岛素负载，帮助其克服这些载运屏障达到载运递送的目的是实现口服胰岛素的关键。
申请号为201210460333.3的中国发明专利本发明公开了一种具有协同抗肿瘤效应的生物兼容纳米药物复合载体、药物及其制备方法。本发明所提供的由核芯、包覆所述核芯的连接层以及包覆所述连接层的壳层组成；所述核芯为吸附了抗癌药物的可降解多孔无机纳米粒子，所述连接层由聚电解质组成，所述壳层由蛋白质和聚电解质层层交替组装构成，所述蛋白质选自肿瘤坏死因子超家族成员之一。该药物载体存在结构复杂、胰岛素负载不牢靠等不足。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种碳酸钙/透明质酸复合药物载体及其制备方法。
为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种碳酸钙/透明质酸复合药物载体，所述药物载体由内核和包覆层组成，所述内核为负载胰岛素药物的多孔纳米碳酸钙粒子，所述包覆层为叶酸修饰的透明质酸。
优选的，所述纳米碳酸钙粒子的粒径为80～180nm，利于复合药物载体在肠上皮黏膜内的吸附、渗透及在肠上皮细胞中的转运。
优选的，所述包覆层的厚度为15～35nm。
一种碳酸钙/透明质酸复合药物载体的制备方法，包括以下步骤：1)室温下，将胰岛素药物溶于水，配制浓度为0.01～0.1mol/L的胰岛素药物水溶液，然后将胰岛素药物水溶液分散于含有表面活性剂的油相中，搅拌30min后，制得W/O型乳液；2)室温下，将水溶性钙盐溶于去离子水，配制钙离子浓度为0.01～0.5mol/L的水溶液；将水溶性碳酸盐溶于去离子水，配制碳酸根离子浓度为0.01～0.5mol/L的水溶液；3)将钙离子和碳酸根离子的水溶液分别缓慢地滴入所述W/O型乳液，控制钙离子微量过量，搅拌30min；4)配制透明质酸水溶液，将透明质酸水溶液缓慢地滴入步骤3)制得的乳液，搅拌30min后，离心分离，即得到碳酸钙/透明质酸复合药物载体。
优选的，所述表面活性剂是W/O型，所述表面活性剂在油相中的浓度为0.05～2.0wt％，所述表面活性剂选用失水山梨糖醇脂肪酸酯、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯或柠檬酸脂肪酸甘油酯中的一种或多种。
优选的，所述水溶性钙盐选用葡萄糖酸钙、乳酸钙、氯化钙或醋酸钙中的一种或多种。
优选的，所述水溶性碳酸盐选用碳酸钠、碳酸钾或碳酸铵的一种或多种。
优选的，所述透明质酸水溶液的浓度为0.05～2.0wt％。
优选的，所述透明质酸为叶酸修饰的透明质酸。
本发明与现有技术相比，有益效果是：本发明的碳酸钙/透明酸复合药物载体，以多孔无机纳米碳酸钙为主体材料，用于胰岛素药物的负载；而后在钙离子作用下使具有叶酸等诱导转运功能基修饰的透明质酸在钙基纳米载体表面交联，形成保护层，延缓在口服过程中胃酸、胃蛋白酶进入载体而破坏药物的生物活性；在叶酸诱导转运功能基的刺激作用下，能激发传输机制，促进复合药物载体在肠上皮黏膜内的吸附、渗透及在肠上皮细胞中的转运。相对胰岛素注射给药，具有减少创伤、提升药效、简化治疗流程、减轻患者痛苦等方面的优势。本发明的碳酸钙/透明酸复合药物载体的制备方法简单，容易实现规模化生产。
附图说明
图1为本发明叶酸修饰透明质酸的合成示意图。
图2为本发明实施例1碳酸钙纳米粒子的扫描电镜图。
图3为本发明实施例1碳酸钙纳米粒子的投射电镜图。
图4为本发明实施例1叶酸改性透明质酸包覆碳酸钙纳米粒子的投射电镜图。
图5为本发明实施例1碳酸钙纳米粒子、碳酸钙/透明酸复合药物载体的激光粒度分布图。
图6为本发明实施例1碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体在小鼠体内降血糖作用效果图。
图7为本发明实施例3胰岛素负载在不同药物载体情况下抗胃蛋白酶效果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述说明。
图1为叶酸修饰透明质酸的合成示意图：首先，以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂，1.0mmol叶酸(FA)在催化剂二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的作用下活化，与10.0mmol乙二胺生成氨基化叶酸(FA-NH2)；然后，1.0mmol的透明质酸(HA)与0.30mmol氨基化叶酸(FA-NH2)在DCC/NHS催化作用下进行酰氨化反应，制备得到叶酸修饰的透明质酸(FA-HA)，改性后的透明质酸具有诱导转运功能。
实施例1：
本实施例的碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将碳酸钠溶于去离子水中，配制得到碳酸根离子浓度为0.1mol/L的碳酸钠溶液；将氯化钙溶于去离子水中，配制得到钙离子浓度为0.12mol/L的氯化钙溶液，配制完成后备用；
(2)将叶酸修饰的透明质酸溶于去离子水中，配制得到质量百分比为1％的透明质酸溶液，配制完成后备用；
(3)将胰岛素溶解在pH＝2.0的缓冲水溶液中，配制浓度为0.01mol/L的胰岛素溶液，而后通过缓冲液调节胰岛素溶液的pH至8.0；
(4)配制含表面活性剂的油相，将表面活性剂失水山梨糖醇脂肪酸酯(Span-80)分散于食用花生油中，得到质量百分比为1％的失水山梨糖醇脂肪酸酯(Span-80)的油相；室温下，1mL步骤(3)得到的胰岛素溶液加入20mL含表面活性剂的油相中，搅拌形成W/O型乳液；
(5)室温下，将0.50mL碳酸钠溶液和0.50mL氯化钙溶液同时缓慢滴入上述(4)的W/O型乳液中，在滴加过程中不断搅拌；
(6)室温下，将1mL步骤(2)叶酸修饰的透明质酸溶液缓慢滴入步骤(5)的乳液中，在滴加过程中不断搅拌，滴加完成后继续搅拌30min，然后离心分离即得碳酸钙/透明酸复合胰岛素药物纳米载体。
如图2-5所示，本实施例的碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体由内核和包覆层组成，内核为负载胰岛素的多孔纳米碳酸钙粒子，包覆层为透明质酸。图2和图3分别是负载胰岛素的碳酸钙纳米粒子的扫描电镜图和透射电镜图，可以看出碳酸钙纳米粒子的大小分布均匀，粒径分布在80～180nm之间；图4和图5分别为碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体的透射电镜图及激光粒度分布图，可知在无机碳酸钙纳米粒子包覆一层有机层，有机层的厚度为15～35nm，载体粒径进一步增大。
图6为碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物纳米载体通过口服或者注射的方式在小鼠体内降血糖作用的效果比较图，可知相对于直接口服胰岛素和皮下注射胰岛素，碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物纳米载体能有效提高胰岛素的降血糖作用效果，能达到与皮下注射方式相当的降血糖效果。
实施例2：
本实施例的碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将碳酸钠溶于去离子水中，配制得到碳酸根离子浓度为0.1mol/L的碳酸钠溶液；将氯化钙溶于去离子水中，配制得到钙离子浓度为0.12mol/L的氯化钙溶液，配制完成后备用；
(2)将叶酸修饰的透明质酸溶于去离子水中，配制得到质量百分比为2％的透明质酸溶液，配制完成后备用；
(3)将胰岛素溶解在pH＝2.0的缓冲水溶液中，配制浓度为0.01mol/L的胰岛素溶液，而后通过缓冲液调节胰岛素溶液的pH至8.0；
(4)配制含表面活性剂的油相，将表面活性剂失水山梨糖醇脂肪酸酯(Span-80)分散于食用花生油中，得到质量百分比为1％的失水山梨糖醇脂肪酸酯(Span-80)的油相；室温下，1mL步骤(3)得到的胰岛素溶液加入20mL含表面活性剂的油相中，搅拌形成W/O型乳液；
(5)室温下，将0.50mL碳酸钠溶液和0.50mL氯化钙溶液同时缓慢滴入上述(4)的W/O型乳液中，在滴加过程中不断搅拌；
(6)室温下，将1mL步骤(2)叶酸修饰的透明质酸溶液缓慢滴入步骤(5)的乳液中，在滴加过程中不断搅拌，滴加完成后继续搅拌30min，然后离心分离即得碳酸钙/透明酸复合胰岛素药物纳米载体。
本实施例的碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体由内核和包覆层组成，内核为负载胰岛素的多孔纳米碳酸钙粒子，粒径分布在80～180nm之间，包覆层为透明质酸，包覆层的厚度为20～35nm。
实施例3：
对实施例1、实施例2制得的碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体、单纯的胰岛素、胰岛素负载在碳酸钙纳米粒子上进行胃液内的模拟实验，以上四种材料中的胰岛素等量，胰岛素的负载量为0.3μg，将四种材料与3mL pH＝1.2的模拟胃酸溶液混合，模拟胃酸溶液中含质量浓度为3g/L的胃蛋白酶，在37℃培养30min后，加入0.2mL的0.1mol/L NaOH终止胃蛋白酶的活性。图7为胰岛素在不同情况下抗胃蛋白酶作用保留效果图，单纯的胰岛素完全被胃蛋白酶溶解，胰岛素负载在碳酸钙纳米粒子能提高抗胃蛋白酶的作用效果；在碳酸钙纳米载体外包覆透明质酸能延缓消化酶、胃酸等对载体和药物分子的破坏，且透明质酸的浓度越高，包覆层越厚，药物载体的抗胃蛋白酶效果越好。
实施例4：
本实施例的碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将碳酸钠、碳酸钾和碳酸铵溶于去离子水中，配制得到碳酸根离子浓度为0.5mol/L的碳酸盐混合溶液；将葡萄糖酸钙、乳酸钙、氯化钙和醋酸钙溶于去离子水中，配制得到钙离子浓度为0.5mol/L的钙盐混合溶液，配制完成后备用；
(2)将叶酸修饰的透明质酸溶于去离子水中，配制得到质量百分比为0.05％的透明质酸溶液，配制完成后备用；
(3)将胰岛素溶解在pH为2.0的去离子水中，配制浓度为0.1mol/L的胰岛素溶液，而后通过缓冲液调节胰岛素溶液的pH至8.0；
(4)配制含表面活性剂的油相，将表面活性剂单硬脂酸甘油酯分散于食用大豆油中，得到质量百分比为0.5％的单硬脂酸甘油酯的油相；室温下，1mL步骤(3)得到的pH为8.0的胰岛素溶液加入20mL含表面活性剂的油相中，搅拌形成W/O型乳液；
(5)室温下，将0.25mL碳酸盐混合溶液和0.3mL钙盐混合溶液同时缓慢滴入上述(4)的W/O型乳液中，在滴加过程中不断搅拌；
(6)室温下，将1mL步骤(2)得到的透明质酸溶液缓慢滴入步骤(5)的乳液中，在滴加过程中不断搅拌，滴加完成后继续搅拌30min，然后离心分离即得碳酸钙/透明酸复合胰岛素药物纳米载体。
本实施例的碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体由内核和包覆层组成，内核为负载胰岛素的多孔纳米碳酸钙粒子，粒径分布在100～160nm之间，包覆层为透明质酸，包覆层的厚度为15～20nm。
实施例5：
本实施例的碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将碳酸铵溶于去离子水中，配制得到碳酸根离子浓度为0.2mol/L的碳酸铵溶液；将葡萄糖酸钙溶于去离子水中，配制得到钙离子浓度为0.2mol/L的葡萄糖酸钙溶液，配制完成后备用；
(2)将叶酸修饰的透明质酸溶于去离子水中，配制得到质量百分比为1.5％的透明质酸溶液，配制完成后备用；
(3)将胰岛素溶解在pH为2.0的去离子水中，配制浓度为0.1mol/L的胰岛素溶液，而后通过缓冲液调节胰岛素溶液的pH至8.0；
(4)配制含表面活性剂的油相，将表面活性剂山梨糖醇酐单硬脂酸酯(Span-60)分散于食用玉米油中，得到质量百分比为1.5％的山梨糖醇酐单硬脂酸酯(Span-60)的油相；室温下，1mL步骤(3)得到的pH为8.0的胰岛素溶液加入25mL含表面活性剂的油相中，搅拌形成W/O型乳液；
(5)室温下，将0.5mL碳酸铵溶液和0.7mL葡萄糖酸钙溶液同时缓慢滴入上述(4)的W/O型乳液中，在滴加过程中不断搅拌；
(6)室温下，将0.8mL步骤(2)得到的透明质酸溶液缓慢滴入步骤(5)的乳液中，在滴加过程中不断搅拌，滴加完成后继续搅拌30min，然后离心分离即得碳酸钙/透明酸复合胰岛素药物纳米载体。
本实施例的碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体由内核和包覆层组成，内核为负载胰岛素的多孔纳米碳酸钙粒子，粒径分布在80～160nm之间，包覆层为叶酸改性的透明质酸，包覆层的厚度为15～30nm。
实施例6：
本实施例的碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将碳酸铵、碳酸钾溶于去离子水中，配制得到碳酸根离子浓度为0.01mol/L的碳酸铵和碳酸钾混合溶液；将葡萄糖酸钙和乳酸钙溶于去离子水中，配制得到浓度为0.01mol/L的葡萄糖酸钙和乳酸钙混合溶液，配制完成后备用；
(2)将叶酸修饰的透明质酸溶于去离子水中，配制得到质量百分比为0.05％的透明质酸溶液，配制完成后备用；
(3)将胰岛素溶解在pH为2.0的去离子水中，配制浓度为0.05mol/L的胰岛素溶液，而后通过缓冲液调节胰岛素溶液的pH至8.0；
(4)配制含表面活性剂的油相，将表面活性剂柠檬酸脂肪酸甘油酯和单硬脂酸甘油酯分散于食用玉米油中，得到质量百分比为0.05％的柠檬酸脂肪酸甘油酯和单硬脂酸甘油酯的油相；室温下，1.2mL步骤(3)得到的pH为8.0的胰岛素溶液加入25mL含表面活性剂的油相中，搅拌形成W/O型乳液；
(5)室温下，将0.7mL碳酸铵和碳酸钾混合溶液和0.9mL葡萄糖酸钙和乳酸钙混合溶液同时缓慢滴入上述(4)的W/O型乳液中，在滴加过程中不断搅拌；
(6)室温下，将1.2mL步骤(2)得到的透明质酸溶液缓慢滴入步骤(5)的乳液中，在滴加过程中不断搅拌，滴加完成后继续搅拌30min，然后离心分离即得碳酸钙/透明酸复合胰岛素药物纳米载体。
本实施例的碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体由内核和包覆层组成，内核为负载胰岛素的多孔纳米碳酸钙粒子，粒径分布在100～180nm之间，包覆层为叶酸改性的透明质酸，包覆层的厚度为15～25nm。
实施例7：
本实施例的碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将碳酸钾溶于去离子水中，配制得到碳酸根离子浓度为0.01mol/L的碳酸钾溶液；将醋酸钙溶于去离子水中，配制得到浓度为0.02mol/L的醋酸钙溶液，配制完成后备用；
(2)将叶酸修饰的透明质酸溶于去离子水中，配制得到质量百分比为1.3％的透明质酸溶液，配制完成后备用；
(3)将胰岛素溶解在pH为2.0的去离子水中，配制浓度为0.1mol/L的胰岛素溶液，而后通过缓冲液调节胰岛素溶液的pH至8.0；
(4)配制含表面活性剂的油相，将表面活性剂柠檬酸脂肪酸甘油酯分散于食用玉米油中，得到质量百分比为2％的柠檬酸脂肪酸甘油酯的油相；室温下，1.5mL步骤(3)得到的pH为8.0的胰岛素溶液加入35mL含表面活性剂的油相中，搅拌形成W/O型乳液；
(5)室温下，将0.6mL碳酸钾溶液和0.5mL醋酸钙溶液同时缓慢滴入上述(4)的W/O型乳液中，在滴加过程中不断搅拌；
(6)室温下，将1.0mL步骤(2)得到的透明质酸溶液缓慢滴入步骤(5)的乳液中，在滴加过程中不断搅拌，滴加完成后继续搅拌30min，然后离心分离即得碳酸钙/透明酸复合胰岛素药物纳米载体。
本实施例的碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体由内核和包覆层组成，内核为负载胰岛素的多孔纳米碳酸钙粒子，粒径分布在90～180nm之间，包覆层为叶酸改性的透明质酸，包覆层的厚度为20～30nm。
实施例8：
本实施例的碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)选用葡萄糖酸钙、乳酸钙、氯化钙、醋酸钙中的一种或多种溶于去离子水，配制碳酸根离子浓度为0.01mol/L的碳酸盐混合溶液；选用葡萄糖酸钙、乳酸钙、氯化钙或醋酸钙中的一种或多种溶于去离子水，配制钙离子浓度为0.02mol/L的钙盐混合溶液，配制完成后备用；
(2)将叶酸修饰的透明质酸溶于去离子水中，配制得到质量百分比为1.8％的透明质酸溶液，配制完成后备用；
(3)将胰岛素溶解在pH为2.0的去离子水中，配制浓度为0.08mol/L的胰岛素溶液，而后通过缓冲液调节胰岛素溶液的pH至8.0；
(4)配制含表面活性剂的油相，表面活性剂选用失水山梨糖醇脂肪酸酯、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯或柠檬酸脂肪酸甘油酯中的一种或多种，将表面活性剂分散于食用大豆油中，得到含质量百分比为0.8％的表面活性剂的油相；室温下，1.0mL步骤(3)得到的pH为8.0的胰岛素溶液加入30mL含表面活性剂的油相中，搅拌形成W/O型乳液；
(5)室温下，将0.6mL碳酸盐混合溶液和0.5mL钙盐混合溶液同时缓慢滴入上述(4)的W/O型乳液中，在滴加过程中不断搅拌；
(6)室温下，将1.0mL步骤(2)得到的透明质酸溶液缓慢滴入步骤(5)的乳液中，在滴加过程中不断搅拌，滴加完成后继续搅拌30min，然后离心分离即得碳酸钙/透明酸复合胰岛素药物纳米载体。
本实施例的碳酸钙/透明质酸复合胰岛素药物载体由内核和包覆层组成，内核为负载胰岛素的多孔纳米碳酸钙粒子，粒径分布在80～140nm之间，包覆层为叶酸改性的透明质酸，包覆层的厚度为20～35nm。
如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
以上对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。