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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510828267.4 (22)申请日 2015.11.24 A61K 31/506(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 31/436(2006.01) (71)申请人 中国科学院大连化学物理研究所 地址 116023 辽宁省大连市中山路 457 号 (72)发明人 刘扬 何牮 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 马驰 (54) 发明名称 一种 mTOR 激酶抑制剂与 MAPK 激酶抑制剂的 组合物的应用 (57) 摘要 本 发 明 涉 及 一 种 mTOR 激 。
2、酶 抑 制 剂 与 MAPK 激 酶 抑 制 剂 的 组 合 物 在 制 备 治 疗 Rheb-Y35N 突 变 的 肿 瘤 的 药 物 中 的 应 用。其特征在于 ： 该组合物是化合物和化 合 物 按 1:5 至 1:20( 质 量 比 ) 混 合 而 成。 化 合 物和化合物均具有抑制 Rheb-Y35N 突变的细 胞的增殖、 克隆形成以及抑制细胞存活率的效果 ； 联合使用两者上述检测指标的抑制效果显著提 高， 因此该组合物可以用于制备治疗 Rheb-Y35N 突变的肿瘤的药物。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页。
3、 附图2页 CN 106333951 A 2017.01.18 CN 106333951 A 1/1 页 2 1.一种mTOR激酶抑制剂与MAPK激酶抑制剂的组合物在制备治疗Rheb-Y35N突变的肿 瘤的药物中的应用， 其特征在于 ： 所述化合物为 mTOR 激酶抑制剂 Rapamycin， 其结构式为 式 ( ) ； 化合物为 MAPK 激酶抑制剂， SCH772984， 其结构式为式 ( )。 2.根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 组合物中化合物与化合物的质量比 为 1:5 至 1:20。 3.根据权利要求 1 或 2 所述的应用， 其特征在于 ： 包括该组合物药物学上可接。
4、受的载 体或赋形剂在制备治疗 Rheb-Y35N 突变的肿瘤的药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 106333951 A 2 1/4 页 3 一种 mTOR 激酶抑制剂与 MAPK 激酶抑制剂的组合物的应用 技术领域 0001 本发明涉及用本申请描述的 mTOR 激酶抑制剂与 ERK 激酶抑制剂的组合和它们药 学上可接受的成盐化合物治疗携带有 Rheb-Y35N 突变的肿瘤癌患者的方法， 属于医药技术 领域。 背景技术 0002 癌症现阶段已成为全球健康的首要杀手， 大量研究表明基因突变与癌症有着密不 可分的关系。基因的突变不但导致翻译及蛋白合成的改变还会导致致癌代谢物的产生， 而 这些。
5、蛋白或者代谢物等物质在原本正常细胞中是没有或者极少量的。 上述物质的改变势必 也伴随着细胞内信号通路的改变。所以大量的抗肿瘤药物也是以信号通路作为靶点， 通过 对相应的信号通路的调节从而起到抑癌的作用。 0003 目前发现 PI3K/AKT/mTOR 信号通路在很多种肿瘤疾病中都有异常的活化。该信号 通路中的多个分子， 在很多癌症中都有高频率的突变。如 PI3KCA,AKT1,TSC1/2,mTOR， PTEN 等。这些激酶突变的结果导致该信号通路的激活， 从而激活了下游肿瘤细胞增殖和分裂必 需的基因的转录和翻译并促进肿瘤细胞的形成和增殖。根据这些激酶的突变， 很多种针对 不同激酶的抑制剂在基。
6、础研究和临床上都在被应用。一些抑制剂取得了一下较好的疗效。 Rheb(Ras homolog enriched in brain)是PI3K/AKT/mTOR信号通路一个重要的介导分子， 它是是小 G 蛋白 Ras 的同源蛋白， 具有 GTP 酶的活性。Rheb 在体内有两种存在方式， 与 GDP 结合的方式 (GDP-Rheb) 和与 GTP 结合的方式 (GTP-Rheb)， 后者具有相应的生物学活性， 通 过激活下游 mTOR 复合物， 再磷酸化 pS6K/pS6/4E-BP-1， 从而促进了蛋白的翻译过程。最近 的研究发现 Rheb 基因在肿瘤患者中有高频率的激活突变。如表 1 所示，。
7、 Rheb 突变在不同 肿瘤中发生的频率。可以看出在肾癌和子宫内膜癌中 Rheb 发生突变的频率较高 , 且多以 Rheb-Y35N 型突变为主。资料来源 (TCGA&Cbioportal datasets)。 0004 表 1 Rheb 突变在不同肿瘤中发生的频率 0005 说 明 书 CN 106333951 A 3 2/4 页 4 0006 该突变可以自发的导致下游 mTOR 蛋白复合物的磷酸化， 加速了肿瘤细胞的增殖 和分裂。经证明在有 Rheb 突变的细胞中， mTOR 信号通路被自发性的激活， 导致下游基因转 录及细胞异常增殖和分裂。而且 Rheb 突变的细胞还可以抑制 AMPK 。
8、及激活 MAPK 信号通路。 但是在没有 Rheb 突变的癌细胞中 mTOR 和 MAPK 信号通路并没有被激活。 0007 MAPK(mitogen-activated protein kinase)， 丝裂原活化蛋白激酶， 作为另外一 条支持肿瘤细胞形成和增殖的信号通路亦是在很多种肿瘤中都发现有异常激活。 通过上有 的络氨酸激酶受体磷酸化 , 激活细胞内 Ras-GTP/Ras, 从而磷酸化 BRAF/CRAF 复合物， 再磷 酸化 MEK/ERK， ERK 磷酸化后进入细胞核参与下游基因的转录并刺激细胞增殖， 存活率， 转 移等行为。在该信号通路上， KRAS 与 BRAF 的突变在肿瘤。
9、中最为常见， 在人肺癌， 黑色素瘤， 胰腺癌等很多种癌症中， 都发现有高频率的突变。 0008 由于 Rheb 突变主要涉及上述两个信号通路的激活， 所以使用 mTOR 抑制剂及 MAPK 抑制剂在有 Rheb-Y35N 突变的细胞中可以有效的抑制肿瘤细胞增殖， 肿瘤细胞克隆形成及 抑制细胞存活率， 但是在没有 Rheb-Y35N 突变的癌细胞中效果并不明显。因此， 联合使用这 两种抑制剂在有 Rheb-Y35N 突变的肿瘤中有很大的临床应用前景。这为运用精准医学对不 同分子病理分型的癌症进行靶向治疗提供新思路。 0009 目前关于本发明中提到的组合物在治疗 Rheb-Y35N 突变的肿瘤 的。
10、药物中的应用 尚未报道。 发明内容 0010 本发明涉及治疗 Rheb 突变的肿瘤的药物的发现， 目的之一是提供具有 mTOR 激酶 与 MAPK 激酶抑制作用的组合物， 用于治疗 Rheb-Y35N 突变导致的肿瘤 ； 目的之二是建立一 种新的 Rheb 突变导致的肿瘤的治疗方法。 0011 所述化合物为mTOR激酶抑制剂Rapamycin， 为式()所示的 ； 化合物为MAPK 说 明 书 CN 106333951 A 4 3/4 页 5 激酶抑制剂， SCH772984， 为式()所示 ； 组合物中化合物与化合物的质量比为1:5至 1:20。 0012 0013 包括但不局限 ： 该组合。
11、物药物学上可接受的载体或赋形剂在制备治疗 Rheb-Y35N 突变的肿瘤的药物中的应用。 0014 实验表明， 本发明中所述的组合物相对于单独使用化合物或者化合物， 能够 显著抑制 Rheb-Y35N 突变的细胞的增殖、 克隆形成以及抑制细胞的存活率， 因此可以用于 制备治疗 Rheb-Y35N 突变的肿瘤的药物。 附图说明 0015 图 1.Rapamycin 联合 SCH772984 对转染了 Rheb-Y35N 突变体的 293 细胞增殖的抑 制作用。 0016 图 2.Rapamycin 联合 SCH772984 对 Rheb-Y35N 突变的 NIH3T3 细胞存活的抑制作 用。a 。
12、细胞活力分析 b 细胞克隆数拍照及数量分析 0017 图 3. 为用 rapamycin 联合 SCH772984 抑制小鼠体内携带有 Rheb-Y35N 突变的肿 瘤生长的抑制作用。a 肿瘤体积比较 b 瘤体照片 c 肿瘤重量比较 d 小鼠体重变化比较。 具体实施方式 0018 现结合实例， 对本发明做进一步说明。 实例仅限于说明本发明， 而非对本发明的限 定。 0019 实施例 1 mTOR 激酶抑制剂与 MAPK 激酶抑制剂的溶液制备。Rapamycin 和 SCH772984 分别用 DMSO 溶解制备成储存液浓度为 20mM。Rapamycin 加培养液稀释至 20nM， SCH77。
13、2984 加培养液稀释至 200nM 作为工作浓度。 0020 实施例 2 Rapamycin 联合 SCH772984 对转染了 Rheb-Y35N 突变体的 293 细胞增殖 的抑制作用。 0021 将野生型与突变型的Rheb-Y35N基因转染293细胞， 培养于含10FBS的DMEM培 养液中， 添加 2mM 谷氨酰胺， 置于 5 CO2， 37的培养箱中。在 2ug/mL 的 Puromycin 筛选 下， 建立表达 Rheb-Y35N 突变型和野生型的稳定细胞株。在 20nM 的 Rapamycin 及 200nM 的 SCH772984 联合处理细胞 48 小时， 用 cell T。
14、iter Glo 方法进行细胞毒性分析， 然后进行显 著性 (T-TEST) 分析。其结果如图 1 所示， 单独加 Rapamycin 和单独加 SCH772984 的突变组 相对于同样加药的野生型对照组， 细胞活力均有所降低， Rapamycin 和 SCH772984 联合用药 说 明 书 CN 106333951 A 5 4/4 页 6 组， 相对于对照组以及两组单独用药组细胞活力显著降低。 0022 实施例 3 Rapamycin 联合 SCH772984 对携带有 Rheb-Y35N 突变的 NIH3T3 细胞存 活的抑制作用。 0023 NIH3T3细胞培养条件如上所述， 在20n。
15、M的Rapamycin联合200nM的SCH772984处 理细胞48小时， 用cell Titer Glo方法及用克隆形成实验进行细胞毒性分析， 检测然后进 行显著性(T-TEST)分析。 其结果如图2所示， 转染突变体的细胞和转染野生型的细胞系， 单 独 Rapamycin 和单独 SCH772984 处理组相对于对照组， 克隆形成数量均有降低， Rapamycin 和 SCH772984 联合用药组， 相对于对照组以及两组单独用药组克隆形成数量显著降低。 0024 实施例 4 Rapamycin 联合 SCH772984 对小鼠体内携带有 Rheb-Y35N 突变的肿瘤生 长的抑制作用。。
16、 0025 收取转染有 Rheb-Y35N 突变的肿瘤细胞用 PBS 缓冲盐溶液重悬， 计数， 将转染有 Rheb 突变的肿瘤细胞以皮下注射的方式种植到裸鼠上 (5106个 / 只小鼠， 以 100LPBS 重悬 )， 小鼠分为四组 (n 54)， 无药组， 单独给 Rapamycin 组 ( 根据小鼠体重计算， 给 药量为 3mg/kg)， 可单独给 SCH772984(25mg/kg) 组以及联合给药组。肿瘤种植小鼠皮下 后， 待肿瘤大小长至 300mm3开始进行给药处理， 每三天一次， 注射给药， 小鼠体内肿瘤大小 的测量于 2-3 天测一次， 总共持续 21 天。肿瘤体积按下列公式计算。
17、 ： (LW2)/2. 同时对 小鼠肿瘤拍照记录并重量进行称量， 每三天监测小鼠体重变化。通过对比对照组来评估联 合药物处理对肿瘤生长的抑制效果， 最后进行显著性 (T-TEST) 分析。其结果如图 3 所示， 单独 Rapamycin 和单独 SCH772984 处理组相对于对照组， 瘤体体积和瘤体重量均有降低， Rapamycin 和 SCH772984 联合用药组， 相对于对照组以及两组单独用药组上述两个指标均 显著降低， 而小鼠体重没有明显差异。 0026 通过上述实验表明， 使用 mTOR 抑制剂及 MAPK 抑制剂在有 Rheb-Y35N 突变的细胞 中可以有效的抑制肿瘤细胞增殖， 肿瘤细胞克隆形成及抑制细胞存活率。 因此， 这两种抑制 剂的联合使用为抗癌药物的开发提供了候选方案， 在有 Rheb-Y35N 突变的肿瘤中有很大的 临床应用前景。 说 明 书 CN 106333951 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 106333951 A 7 2/2 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 106333951 A 8 。