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1、10申请公布号CN104127767A43申请公布日20141105CN104127767A21申请号201410380809122申请日20140804A61K36/90200601A61K36/8994200601A61P13/1220060171申请人江苏省中医院地址210029江苏省南京市汉中路155号72发明人吴坚邹玺张星星刘沈林陈敏74专利代理机构南京苏高专利商标事务所普通合伙32204代理人王云54发明名称健脾养正消症方在制备化疗后肾功能保护药物中的应用57摘要本发明公开了一种健脾养正消症方在制备化疗后肾功能保护药物中的应用。尤其是在制备顺铂化疗后肾功能保护药物中的应用。本发明采。
2、用健脾养正消症方和化疗药物的联用，通过健脾养正消症方激活PI3K/AKT通路，增加PI3K、AKT的磷酸化水平，减少肾小管上皮细胞凋亡，从而起到在顺铂化疗后对肾功能保护的作用的。51INTCL权利要求书1页说明书6页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图3页10申请公布号CN104127767ACN104127767A1/1页21健脾养正消症方在制备化疗后肾功能保护药物中的应用。2根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述健脾养正消症方制备顺铂化疗后肾功能保护药物中的应用。3根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述健脾养正消症方用于激活顺铂化疗后。
3、的PI3K/AKT通路。权利要求书CN104127767A1/6页3健脾养正消症方在制备化疗后肾功能保护药物中的应用技术领域0001本发明属于复方组合中药的新应用，具体涉及一种健脾养正消症方在制备化疗后肾功能保护药物中的应用。背景技术0002顺铂是临床常用化疗药，对多种恶性肿瘤有较好的疗效，在一定范围内其疗效与剂量成正比，而顺铂的毒性很大程度限制了其应用。由于顺铂进入人体后主要通过肾排泄，所以其肾毒性尤为明显。顺铂在大剂量或连续使用时，使肾小管表现为不可逆的损伤，严重者导致肾衰竭甚至死亡。现代研究证实，顺铂引起肾损害的发病机制主要与包括细胞凋亡，氧化应激、炎症反应、肾脏血流学改变等因素有关。其。
4、中，又以顺铂诱导肾小管上皮细胞凋亡作用较为明显。因此，临床急需能够减轻铂类对肾功能损害的药物。发明内容0003为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种健脾养正消症方在制备化疗后肾功能保护药物中的应用。0004为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为0005健脾养正消症方在制备化疗后肾功能保护药物中的应用。0006作为本发明的进一步改进，所述健脾养正消症方制备顺铂化疗后肾功能保护药物中的应用。0007作为本发明更进一步的改进，所述健脾养正消症方用于激活顺铂化疗后的PI3K/AKT通路。0008本发明中所采用的健脾养正消症方是江苏省名中医刘沈林教授的经验方。本方以党参，炒白术，茯苓，。
5、淮山药，生薏苡仁，炙甘草益气健脾，补肾涩精，淡渗利湿；气虚之证常兼气滞，谓之“虚气留滞”，方用陈皮，木香行气化滞，斡旋气机；当归，白芍养血活血；菝葜，石打穿解毒抗癌，消癥化积。诸药合用，补其中气，养其肾精，行其气滞，和其营血，解其癌毒，恢复脾胃受纳与健运之职，共凑健脾益气，补肾藏精，解毒消癥的作用，对肿瘤病人放化疗后，有良好的缓解症状、延长生存期的效果。为进一步了解该方对化疗后肾功能的保护作用，我们进行了此次研究。0009有益效果本发明采用健脾养正消症方和化疗药物的联用，通过健脾养正消症方激活PI3K/AKT通路，增加PI3K、AKT的磷酸化水平，减少肾小管上皮细胞凋亡，从而起到在顺铂化疗后对。
6、肾功能保护的作用的。附图说明0010图1为本发明各组小鼠肾脏病理组织学结果图；其中，A荷瘤对照组100；BCP组100；CJPYZXZF组100；DCPJPYZXZF组100；E荷瘤对照组400；FCP组400；GJPYZXZF组400；HCPJPYZXZF组400；说明书CN104127767A2/6页40011图2为本发明肾脏病理学变化图；0012图3为本发明各组小鼠肾脏细胞凋亡情况图；其中，A荷瘤对照组400；BCP组400；CJPYZXZF组400；DCPJPYZXZF组400；0013图4为蛋白免疫印迹检测对肾脏细胞中PI3K/AKT通路的影响。具体实施方式0014下面结合附图和实验。
7、例对本发明作进一步的详细说明。0015健脾养正消症方在制备化疗后肾功能保护药物中的应用。下面通过实验例来进一步阐述健脾养正消症方如何激活顺铂化疗后的PI3K/AKT通路的。0016实验例00171材料与仪器001811动物及饲养环境0019BALB/C小鼠，40只，雌雄各半，1012周龄，体重1822G；SPF级环境饲养，室内定期进行紫外线照射，鼠笼、垫料、饮水均严格消毒。002012药品及试剂0021健脾养正消症方由党参15G，炒白术10G，茯苓10G，生薏仁20G，当归10G，淮山药15G，木香10G，白芍10G，陈皮6G，菝葜30G，石见穿30G，炙甘草3G组成，药物由江苏省中医院提供。。
8、将上述药物加10倍双蒸水浸泡30MIN后，煮至沸腾后小火煮30MIN，倒出药液后，加5倍的双蒸水，小火煮30MIN。将两次的药液合并，水浴浓缩至25GML1，4保存。0022RPMI1640培养液凯基公司，胎牛血清四季青公司，顺铂齐鲁制药有限公司，TUNEL试剂盒德国ROCHE，鼠抗人ACTIN单抗美国SIGMA公司，AKT、PAKT、PI3K、PPI3K、CASEPASE3单抗美国CELLSIGNALING公司，鼠抗人二抗、兔抗人二抗北京中杉生物技术公司。002313仪器0024CO2培养箱美国FORMA公司；细胞培养超净台苏州净化设备厂；全自动酶标仪BIOTEK公司；倒置显微镜日本OLYM。
9、PS；低温离心机德国EPPENDORF公司；超纯水机LABCONCO。00252研究方法002621造模及处理0027取H22腹水瘤种鼠腹水，以冰生理盐水13稀释后，调整细胞浓度为5107个/ML，BALB/C小鼠右腋下接种02ML，建立荷瘤小鼠模型。接种次日随机分为4组，荷瘤对照组，顺铂CP组，健脾养正消症方JPYZXZF组，顺铂健脾养正消症方CPJPYZXZF组，每组10只。具体给药方法如表1。实验第11天，眼眶取血处死小鼠。0028表1实验动物分组及给药0029说明书CN104127767A3/6页5003022标本采集与测定0031221一般情况观察0032观察小鼠的饮食、活动、体重及。
10、排便情况。0033222肾脏系数0034实验第11天，处死小鼠后取出双侧肾脏，去包膜后称重并计算肾脏指数。肾脏指数RI双侧肾脏重G/体重G100。0035223血样采集与检测0036实验第11天，眼眶取血处死小鼠。将血4放置1H，3000R/MIN离心取上清，检测血清尿素氮和肌酐含量。0037224组织形态学观察0038实验第11天，肉眼观察肾脏的大致情况。并将部分肾脏放入4多聚甲醛，制备石蜡切片，常规行HE染色，光镜下观察病理变化，并进行评分。评分标准每张切片100倍镜下取15个视野，取受损肾小管占视野的百分比。0分正常；1分受损肾小管5；2分受损肾小管525；3分受损肾小管2575；4分受。
11、损肾小管75，作半定量分析并计算其均值，作为肾小管坏死的评分指数。0039225TUNEL检测肾脏细胞凋亡0040冰浴状态下剖腹取双侧肾脏，制备石蜡切片。切片常规脱蜡至水。柠檬酸缓冲液12000微波中档修复8MIN。PBS洗5MIN/次3次。吸干组织周围水分，滴加蛋白酶K50L，消化15MIN，PBS洗5MIN/次3次。PBS洗5MIN/次3次，滴加01曲拉通X100,室温8MIN，PBS洗5MIN/次3次。吸干组织周围水分，滴加酶溶液核苷酸反应液，PBS替代一抗作阴性对照切片置于湿盒内，37，1H，PBS洗5MIN/次3次。吸干组织周围水分，滴加碱性磷酸酶标记的抗荧光抗体，切片置于湿盒内，3。
12、7恒温箱30MIN，PBS洗5MIN/次3次。BCIP/NBT显色10MIN，镜下观察，蒸馏水冲洗，适时终止反应。切片晾干，显微镜观察。镜下深蓝紫色颗粒为凋亡细胞。载玻片封片，拍照，每个标本随机取5个视野，计算凋亡率。凋亡率凋亡细胞/总细胞数1000041226WESTERNBLOT检测AKT、PAKT、PI3K、PPI3K、CASEPASE3蛋白表达改变0042将组织研磨成匀浆状，PIPA中4裂解30MIN。4，12000G,离心15MIN，上清即为细胞总蛋白。吸取上清，蛋白定量后分装，BRADFORD法测蛋白浓度，每个样品取20G上样量进行WESTERNBOLT试验。经SDSPAGE分离后。
13、转到PVDF膜上，5脱脂奶粉溶液封闭1H，一抗4过夜，次日二抗室温孵育后，经PBST漂洗，使用ECL液进行发光和条带分析。004323统计处理0044实验数据均以表示，采用SPSS130统计软件进行统计学处理，方差齐性检说明书CN104127767A4/6页6验后，组间比较用T检验。以P005，见表3。0052表3各组小鼠肾脏系数、BUN、SCR的水平00530054与荷瘤对照组相比，P005；与CP组相比，P005005533肾脏的病理变化0056光镜下HE染色显示，与荷瘤对照组比较，CP组可见肾小管上皮细胞肿胀，细胞核局部裸露，局部坏死脱落，大量管型形成，肾小管损伤明显；CPJPYZXZF。
14、组上述改变明显减轻。JPYZXZF组及荷瘤对照组未见明显损伤。见图1。0057半定量分析显示CP组损伤评分为271分，肾小管受损明显；CPJPYZXZF量组肾损伤评分为143分，与CP组相比损伤明显减轻，差异显著P005。荷瘤对照组、PYZXZF组无明显肾损伤，评分均为0分。见图2。005834TUNEL检测肾脏细胞凋亡0059CP组可见肾脏细胞大量凋亡，而CPJPYZXZF组凋亡细胞明显减少，PYZXZF组及荷瘤对照组见少量凋亡细胞。见图3，表4。说明书CN104127767A5/6页70060表4各组小鼠肾脏细胞凋亡率00610062与荷瘤对照组相比，P005；与CP组相比，P005006。
15、335蛋白免疫印迹检测对肾脏细胞中PI3K/AKT通路的影响0064蛋白免疫印迹显示，与荷瘤对照组相比，CP组的PPI3K，PAKT表达下调，CASPASE3表达上调。与CP组相比，CPJPYZXZF组的PPI3K，PAKT的表达上调，CASPASE3表达明显减少。见图4。00654、结论通过一次性腹腔注射20MGKG1顺铂的方法建立荷瘤小鼠肾损伤动物模型。CP组小鼠RI、BUN、CR水平明显升高；病理切片显示CP组小鼠肾小管严重损害，证明造模成功。0066实验结果表明，CP组一般情况较差，进食、活动减少，体重减轻明显，而联用健脾养正消症方可减轻顺铂引起的小鼠体重下降，增加进食及活动度。说明健。
16、脾养正消症方可以减轻顺铂的毒性反应，改善小鼠的一般状况。0067CP组的RI指数明显高于荷瘤对照组，而CPJPYZXZF组RI指数与CP组相比，明显降低P005。原因为1肾小管上皮细胞刷状缘微绒毛脱落，抑制胞膜NA泵活性，使肾小管重吸收下降，引起水钠潴留；2肾小管管型使管内压力增高，减少了肾小球滤过，加重肾水肿；3肾小管上皮细胞线粒体损伤，使ATP生成下降，NAKATP酶活性降低；4CP组小鼠的体重减轻，使肾脏系数增高。0068CP组的SCR和BUN水平明显高于荷瘤对照组，而联用健脾养正消症方后，SCR、BUN水平明显降低P005。光镜下HE染色显示，CP组可见肾小管上皮细胞肿胀，细胞核裸露，。
17、坏死脱落，大量管型形成，肾小管损伤明显；而CPJPYZXZF组上述改变明显减轻。这表明，健脾养正消症方有良好的减轻顺铂肾毒性，改善肾功能的作用。0069TUNEL法证实，CP组肾小管上皮细胞凋亡、坏死数明显增加，这与既往报道一致，提示细胞凋亡在顺铂诱导的急性肾损害中起着重要作用910。其原因可能由于顺铂在肾内的浓度显著高于其他器官，尤其是近端小管S3段，因而容易引起肾小管中毒性损害而诱导AKI。而联用健脾养正消症方后，凋亡细胞数明显下降，提示该方抑制顺铂对肾脏细胞的凋亡作用的药效明确。0070PI3K/AKT是细胞内重要的信号传导通路，参与调控细胞生长、细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移等过程。PI。
18、3K可以磷酸化PIP2的3OH位点，使之成为PIP3。PIP3又通过PDK1促进AKT磷酸化，从而间接或直接抑制促凋亡因子的表达。有研究表明，在顺铂诱导的肾小说明书CN104127767A6/6页8管细胞HKC凋亡中，PI3K、AKT蛋白磷酸化程度下降，表明在细胞凋亡中PI3K/AKT通路被抑制。本实验通过免疫蛋白印迹法测定PI3K、AKT、PPI3K、PAKT、CASPASE3的蛋白表达，结果表明，CP组与荷瘤对照组相比，PPI3K、PAKT水平明显减少，CASPASE3表达增多。这与既往报道相同，证实了PI3K/AKT是顺铂损伤肾脏细胞的信号通路之一。而联用健脾养正消症方后，PPI3K、PAKT表达明显增高，CASPASE3表达减少。这提示，健脾养正消症方可能是通过激活PI3K/AKT通路，增加PI3K、AKT的磷酸化水平，减少肾小管上皮细胞凋亡，从而起到在顺铂化疗后对肾功能保护的作用的。说明书CN104127767A1/3页9图1说明书附图CN104127767A2/3页10图2图3说明书附图CN104127767A103/3页11图4说明书附图CN104127767A11。