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1、10申请公布号CN104160040A43申请公布日20141119CN104160040A21申请号201380012596022申请日2013030661/607,41820120306USC12Q1/6820060171申请人伊鲁米纳剑桥有限公司地址英国艾塞克斯72发明人尼尔安东尼葛姆雷路易斯弗雷泽保拉科克冈萨雷斯74专利代理机构北京安信方达知识产权代理有限公司11262代理人王思琪郑霞54发明名称核酸测序的改进方法57摘要本文提供一种使用转座来改进RNA分子测序方法的方法。本文提供了一种将核酸双链体，如DNARNA双链体或DNADNA双链体加标签的方法。该方法包括以下步骤提供转座酶和转。
2、座子组合物，提供固定在支持物上的一个或更多个核酸双链体，并使所述转座酶和转座子组合物与一个或更多个核酸双链体在其中一个或更多个核酸双链体与转座子组合物进行转座反应的条件下接触，以产生一个或更多个加标签的核酸双链体，其中所述转座子组合物包含包含转移链和非转移链的双链核酸分子。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014090486PCT国际申请的申请数据PCT/EP2013/0545172013030687PCT国际申请的公布数据WO2013/131962EN2013091251INTCL权利要求书2页说明书24页序列表2页附图9页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要。
3、求书2页说明书24页序列表2页附图9页10申请公布号CN104160040ACN104160040A1/2页21一种将核酸双链体加标签的方法，包括以下步骤A提供转座酶和转座子组合物；B提供固定在支持物上的一种或更多种核酸双链体；和C使所述转座酶和转座子组合物与所述一种或更多种核酸双链体在其中所述一种或更多种核酸双链体与所述转座子组合物进行转座反应的条件下接触，以产生一种或更多种加标签的核酸双链体，其中所述转座子组合物包含包含转移链和非转移链的双链核酸分子。2如权利要求1所述的方法，其中所述一种或更多种核酸双链体是DNARNA双链体，并且其中所述DNARNA双链体在RNA链的5末端上被加标签。3。
4、如权利要求1所述的方法，其中所述核酸双链体是DNADNA双链体，并且其中所述DNADNA双链体的一条链在该DNA链的5末端被加标签。4如权利要求1至3中所述的方法，其中所述支持物包含多个固定的引物。5如权利要求4所述的方法，其中所述一种或更多种DNARNA双链体的所述RNA链或所述DNADNA双链体的所述DNA链包括与所述固定的引物中的一种或更多种的至少一部分互补的序列。6如权利要求4或5所述的方法，其中所述DNARNA双链体或所述DNADNA双链体通过以下提供使一种或更多种RNA分子或单链DNA分子与所述支持物上所述固定的引物杂交，并利用所述RNA分子或单链DNA分子作为模板使杂交到所述RN。
5、A分子或单链DNA分子上的引物延伸，以产生所述一种或更多种DNARNA双链体或DNADNA双链体。7如权利要求4或5所述的方法，其中多个DNARNA双链体或DNADNA双链体通过以下提供使多个RNA分子或单链DNA分子与所述支持物上所述固定的引物杂交，并利用所述RNA分子或单链DNA分子作为模板使杂交到所述RNA分子或单链DNA分子上的引物延伸，以产生所述多个DNARNA双链体或DNADNA分子。8如权利要求47中任一项所述的方法，其中所述固定的引物包含POLYT序列。9如权利要求4所述的方法，其中所述多个固定的引物包含第一序列的第一引物子集和第二序列的第二引物子集。10如权利要求9所述的方法。
6、，其中所述第一引物子集包含POLYT序列。11如权利要求4所述的方法，其中所述多个固定的引物包含能够与所述多个RNA分子中的一种或更多种RNA分子杂交的靶标特异性引物。12如权利要求4所述的方法，还包括将3衔接子添加到所述多个RNA分子或单链DNA分子上，所述3衔接子包含与所述多个固定的引物或其子集互补的序列；并且使3衔接子连接的RNA分子或单链DNA分子与所述固定的引物杂交。13如权利要求112中任一项所述的方法，其中所述转座反应产生5加标签的RNA链或5加标签的DNA链，所述5加标签的RNA链或5加标签的DNA链包含所述转座子组合物的转移链和互补DNA链的3末端与所述转座子组合物的非转移链。
7、之间的缺口。14如权利要求13所述的方法，还包括使所述一个或更多个加标签的DNARNA双链体或DNADNA双链体与核酸修饰酶在使所述DNA链的3末端延伸的条件下接触，以将所述RNA链复制到其5末端或将所述单链DNA链复制到其5末端。15如权利要求14所述的方法，其中所述核酸修饰酶置换所述转座子组合物的非转移权利要求书CN104160040A2/2页3链。16如权利要求14所述的方法，还包括从所述DNARNA双链体除去RNA链。17如权利要求16所述的方法，还包括对所述DNA链的至少一部分进行测序。18如权利要求16或17所述的方法，还包括复制所述DNA链的至少一部分以产生与所述DNARNA双链。
8、体的DNA链互补的第二DNA链。19如权利要求18所述的方法，还包括对所述第二互补DNA链进行测序。20如权利要求19所述的方法，其中所述DNARNA双链体的DNA链在对所述第二互补DNA链进行测序之前被除去。21如权利要求16所述的方法，还包括扩增所述DNA链以产生多个包括第一扩增链和第二扩增链的双链DNA分子。22如权利要求21所述的方法，还包括除去所述第一扩增链。23如权利要求22所述的方法，还包括对所述第二扩增链的至少一部分进行测序。24如权利要求23所述的方法，还包括复制所述第二扩增链的至少一部分以再生所述第一扩增链。25如权利要求24所述的方法，还包括除去所述第二扩增链。26如权利。
9、要求25所述的方法，还包括对所述第一扩增链的至少一部分进行测序。27如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述支持物是珠或多个珠。28如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述支持物是平面支持物。29如权利要求27所述的方法，其中多个双链体被提供，每个双链体位于单个珠上。30如权利要求21所述的方法，其中所述扩增产生扩增子的簇。31如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述转移链包括标签以保留链信息。权利要求书CN104160040A1/24页4核酸测序的改进方法0001本申请要求2012年3月6日提交的美国临时专利申请序列号61/607,418的优先权，其通过引用全文并入本文。0002背景0003。
10、已经开发出对核酸包括RNA进行测序的测序技术。测序技术包括，例如，合成测序。合成测序或循环测序可以通过逐步加入含有例如可裂解或可光漂白的染料标记的核苷酸来实现，如在例如，美国专利号7,427,673；美国专利号7,414,116；WO04/018497；WO91/06678；WO07/123744和美国专利号7,057,026中描述的，其公开内容通过引用全文并入本文。可选地，焦磷酸测序技术可以被采用。焦磷酸测序法检测特定的核苷酸被掺入到新生链时无机焦磷酸PPI的释放RONAGHI等,1996“REALTIMEDNASEQUENCINGUSINGDETECTIONOFPYROPHOSPHATER。
11、ELEASE”ANALYTICALBIOCHEMISTRY2421,849；RONAGHI,M2001“PYROSEQUENCINGSHEDSLIGHTONDNASEQUENCING”GENOMERES111,311；RONAGHI,M,UHLEN,MANDNYREN,P1998“ASEQUENCINGMETHODBASEDONREALTIMEPYROPHOSPHATE”SCIENCE2815375,363；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568和美国专利号6,274,320，其公开内容通过引用全文并入本文。在焦磷酸测序中，释放的PPI可以通过立即被ATP硫酸化酶转化为三磷。
12、酸腺苷ATP来检测，产生的ATP水平通过萤光素酶产生的光子被检测到。0004测序技术还包括连接测序技术。这种技术使用DNA连接酶掺入寡核苷酸并鉴定此类寡核苷酸的掺入，描述在美国专利号6,969,488；美国专利号6,172,218和美国专利号6,306,597中，其公开内容通过引用全文并入本文。其它测序技术包括，例如，荧光原位测序FISSEQ，和大规模平行信号测序MASSIVELYPARALLELSIGNATURESEQUENCING,MPSS。0005制备测序用的DNA样品可以是相对简单的，包括使用转座反应来片段化，并向DNA片段添加衔接子ADAPTOR序列，这简化样品制备过程。见，例如，国。
13、际公布号WO2010/048605，其通过引用全文并入本文。相比之下，目前用于对RNA样品进行测序的方法采用在测序前将样品中的RNA转化成双链CDNA形式的样品制备方法。因此，制备测序用的RNA样品是更加劳动密集型的。此外，当前的方法在保留链特异性信息方面绝非最佳。更具体地，大多数方法在转化成双链CDNA后不能够保留有关原始单链RNA分子的方向的链信息。保存链特异性信息对于注释新基因和确定基因表达水平非常重要。某些方法试图通过在单链RNA分子的末端连接衔接子以保留链特异性信息。该衔接子可具有对从RNA分子产生的双链CDNA的两端提供可区分的信息的序列。然而，这种方法也有缺点。例如，如果所述RN。
14、A分子是片段，片段化后分子的内部部分失去其方向即，链特异性信息。0006概述0007本文提供将DNARNA双链体加标签的方法。该方法包括以下步骤提供转座酶和转座子组合物，提供固定在支持物上的一种或更多种DNARNA双链体，并且使转座酶和转座子组合物与一种或更多种DNARNA双链体在其中一种或更多种DNARNA双链体和转座子组合物进行转座反应的条件下接触，以产生一种或更多种加标签的DNARNA双链体，其中所述转座子组合物包含包含转移链和非转移链的双链核酸分子。本方法还可用于将被固定说明书CN104160040A2/24页5在固体支持物上的DNADNA双链体加标签。0008一个或更多个实施方案的细。
15、节阐述于附图和以下描述中。其他特征、目的和优点，从说明书和附图，以及从权利要求书，将是明显的。附图说明0009图1是展示本文所提供的示例性方法的示意图。加POLYA尾的MRNA通过与偶联到支持物表面上的POLYTDNA捕获探针或引物杂交而被捕获到支持物上。接着该PLOYT链被逆转录酶聚合酶延伸，产生包含DNARNA双链体的双链分子。接着，转座体复合物例如，TN5转座酶与镶嵌末端MOSAICEND，ME序列和与表面扩增引物互补的序列结合被加入到支持物上，其进行与双链体的转座反应并给双链体加标签，连接DNA衔接子寡核苷酸到RNA链的5末端。然后链置换聚合酶例如，BST聚合酶可以被用来延伸DNA链的。
16、3末端，取代转座体复合物的非转移链，并且将RNA链复制到其5DNA的嵌合端CHIMERICEND。然后双链分子可以被扩增例如，簇扩增CLUSTERAMPLICATION，通过测序引物进行测序。引物部分地包含ME序列和上游衔接子序列。可选地，在合成测序SBS化学循环开始前，分子的另一端POLYT端可以通过在POLYT序列上游退火的引物被测序，并且通过天然DATP核苷酸延伸。0010图2是展示本文所提供的示例性方法的示意图。RNA被片段化并用磷酸酶处理。单链衔接子分子连接到包括表面结合的引物的互补序列的每个RNA片段的3末端。该片段然后被加入到支持物上，并通过杂交被捕获。杂交的RNA分子被逆转录酶。
17、聚合酶转化为DNARNA双链体。转座体复合物或含有转座酶和ME与P5的衔接子双链体即转座子的组合物用于给双链体加标签。用链置换聚合酶将DNA链延伸到末端后，分子可以被扩增例如，簇扩增和测序。0011图3是展示本文所提供的示例性方法的示意图。使用支持物，其包含两种表面接枝引物标准接枝引物例如，P5和修饰的接枝引物例如，P7，修饰的接枝引物在其下游3侧具有靶标特异性捕获序列。靶标特异性序列的例子是与逆转录病毒逆转录酶如HIV聚合酶互补的寡核苷酸序列。纯化的病毒RNA被添加到支持物上，通过杂交被捕获，通过逆转录酶复制并被加标签。测序可以通过退火到加标签的衔接子上的引物，或在另一端退火到捕获探针来实现。
18、。0012图4是展示本文所提供的示例性方法的示意图。从含有绿色荧光蛋白GFP转录本序列和与表面结合引物互补的序列例如，P7序列的质粒产生RNA转录本。将转录本与包含引物包括例如P7序列的支持物杂交。杂交的RNA分子被逆转录酶聚合酶转化为DNARNA双链体。转座体复合物被用来使双链体加标签。通过链置换聚合酶将DNA链延伸到末端和除去RNA链后，分子可以被扩增例如，簇扩增和测序。0013图5是一张凝胶照片，显示从含有绿色荧光蛋白GFP的质粒产生，并任选地，用DNA酶处理除去DNA即质粒的RNA转录本。用DNA酶处理RNA转录本后，无可见的残留DNA即质粒。0014图6显示用SYBRGREEN染色的。
19、簇的照片。泳道14含有PHIXDNA和泳道58含有GFP的RNA。泳道5和6中包含用DNA酶预处理以除去DNA的RNA。泳道7和8含有DNA酶预处理、和RNA酶处理作为另外的对照的RNA。第一延伸使用禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶说明书CN104160040A3/24页6AMVRT泳道2、4、6和8或PHUSIONDNA聚合酶泳道1、3、5和7进行。泳道38用P5衔接子加标签。等温簇扩增标准地进行，用SYBRGREEN对簇进行染色。0015图7A和7B显示来自如图6中所描述的泳道18的测序的比对测序数据的覆盖图的图表。0016图8是展示本文所提供的用于DNADNA双链体加标签的示例性方法的示意图。单。
20、链DNASSDNA被片段化，片段被末端脱氧核苷酸转移酶用多核苷酸标记。该片段然后加到支持物上并通过POLYT尾与固定在固体支持物上的其互补序列杂交被捕获。杂交的SSDNA分子被DNA聚合酶转化为DNADNA双链体。转座体复合物或包括转座酶和P5SEQ序列的衔接子双链体即转座子的组合物被用来对双链体加标签。通过链置换聚合酶将DNA链延伸到末端后，分子可以被扩增例如，簇扩增和测序。0017图9显示了SYBRGREEN染色的簇的照片，其来自设计为使用全MRNA转录本样品产生数据的实验。泳道1是PHIX标准文库，其中没有加标签。泳道2是阴性对照，其中没有进行加尾，且泳道8是DSDNA阴性对照。泳道3和。
21、4是相同的实验，除了泳道4的引物被稀释。泳道5和6是相同的实验，除了泳道6的引物被稀释。泳道7使用随机RNA六聚体代替随机DNA六聚体。0018图10显示按图1的方法，比对的测序读数对GAPDH的覆盖度图片。上部3捕获证明来自对照POLYA加尾的MRNA样品的捕获、加标签、簇和序列比对。底部全转录本证明，从复杂的UHR总RNA样品富集、酶促片段化和聚腺苷酸化的MRNA样品的MRNA比对，证明使用本公开内容的方法的全MRNA转录本覆盖度。0019详述0020目前对RNA样品测序的实验方案都采用在测序前将样品中的RNA转化成双链CDNA形式的样品制备。本文提供了用于RNA样品测序的方法，避免双链C。
22、DNA中间体的溶液相制备。所提供的方法还导致在测序过程中保留链型信息。然而，本文描述的方法也可用于DNA标记和测序。0021本文提供了将DNARNA双链体加标签的方法。该方法包括以下步骤提供转座酶和转座子组合物，提供固定在支持物上的一种或更多种DNARNA双链体，并且使转座酶和转座子组合物与一种或更多种DNARNA双链体在其中一种或更多种DNARNA双链体与转座子组合物进行转座反应的条件下接触，产生一种或更多种加标签的DNARNA双链体。转座子组合物包含包含转移链和非转移链的双链核酸分子。虽然以下的实施例可使用DNARNA双链体示例，它们在适当情况下也可适用于DNADNA双链体参见图8。002。
23、2任选地，所述一种或更多种DNARNA双链体在RNA链的5末端被加标签。任选地，转移链包含保留链信息的标签。转座反应产生5加标签的RNA链，所述5加标签的RNA链包含转座子组合物的转移链和DNA链的3末端与转座子组合物的非转移链之间的缺口。任选地，所述方法还包括使一种或更多种加标签的DNARNA双链体与核酸修饰酶在延伸DNA链的3末端的条件下接触以复制RNA链到它们的5末端。核酸修饰酶可置换转座子组合物的非转移链。0023图1是显示本文所提供的示例性方法的示意图。简言之，加POLYA尾的MRNA通过与偶联到支持物表面的POLYTDNA捕获探针或引物杂交而被捕获在支持物例如，流动池FLOWCEL。
24、L上。然后该POLYT链被逆转录酶聚合酶延伸，以产生包含DNARNA双链说明书CN104160040A4/24页7体的双链分子。然后，转座体复合物例如，TN5与转座子例如，镶嵌末端ME序列以及与表面扩增引物互补的序列结合被加入到支持物上，将双链体“加标签”，连接DNA衔接子寡核苷酸到RNA链的5末端。然后链置换聚合酶例如，BST聚合酶可被用来延伸DNA链的3末端，取代转座体的“非转移链”和复制RNA链到5DNA的嵌合端。然后双链分子可以被扩增例如，簇扩增和用部分包含ME序列和上游衔接子序列的测序引物测序。可选地，所述分子的另一端POLYT端可以使用与POLYT序列上游退火的引物被测序，并且在S。
25、BS化学反应周期开始前利用自然的DATP核苷酸延伸。通过该方法也能够双端测序。0024当提供SSDNA用于测序时，可以采用类似的方法。例如，单链DNA多核苷酸的3末端可以通过使用末端脱氧核苷酸转移酶TDT和任何DNTP如DATP或DTTP添加核苷酸。在SSDNA分子的末端添加一串核苷酸的任何方法可以使用。图8是一个例子，其中含有POLYA的捕获探针被固定在支持物的表面，POLYT加尾的SSDNA分子被捕获。可以使用任何捕获序列，包括SSDNA末端的捕获序列，只要支持物上的捕获探针和SSDNA上的核苷酸提供互补序列，使得可以发生杂交。捕获探针被DNA聚合酶延伸产生DSDNA，产生DNADNA双链。
26、体，可进行如前所述的衔接子寡核苷酸的转座连接和链置换扩增，以提供双链分子用于簇生成。双链分子可以然后被扩增例如，簇扩增和测序。0025通过另一个举例的方式图2，RNA总的或POLYA富集的被片段化，用磷酸酶处理，然后单链衔接子分子被连接到包括P7表面结合引物的互补序列的每个片段的3末端。该片段然后被加入到支持物例如，流动池并通过杂交被捕获。杂交的RNA分子被逆转录酶聚合酶转化为DNARNA双链体。包括转座酶和ME序列的衔接子双链体如转座子及P5引物序列的转座体复合物，可以用来将双链体加标签。利用链置换聚合酶延伸DNA链到末端后，该分子可被扩增和测序。0026通过进一步举例的方式图3，使用一种特。
27、殊支持物例如，流动池，其包含两个表面接枝引物标准的接枝引物例如，P5和修饰的接枝引物例如，P7，其下游3侧具有靶标特异性捕获探针。靶标特异性探针的例子是与逆转录病毒逆转录酶如HIV聚合酶互补的寡核苷酸序列。纯化的病毒RNA被添加到支持物上，通过杂交捕获，通过逆转录酶复制和加标签。可利用与加标签的衔接子退火或在另一端与捕获探针退火的引物来实现测序。任选地，所述特殊支持物包含多个不同的靶标特异性捕获探针，使得能够同时捕获许多不同的RNA靶标。0027采用体外转座反应来对靶标DNADNA或DNARNA双链体加标签以产生加标签的DNADNA或DNARNA双链体涉及转座酶、转座子序列组合物、以及合适的反。
28、应条件。0028如通篇使用的，术语转座子是指包含与在体外转座反应中有功能的转座酶或整合酶形成复合物所必需的核苷酸序列的双链DNA。转座子形成复合物或联会复合物SYNAPTICCOMPLEX或转座体复合物。转座子还可以与识别并结合到转座子序列的转座酶或整合酶形成转座体组合物，该复合物能够将转座子插入或转置到在体外转座反应中与其一同孵育的靶标DNA中。转座子呈现为由转移转座子序列或转移链和非转移链或非转移链组成的两个互补序列。例如，与超活性的TN5转座酶如EZTN5TM转座酶，EPICENTREBIOTECHNOLOGIES,MADISON,WI,USA形成在体外转座反应中有活性的复合物的转座子，。
29、包括呈现为转移的转座子序列5AGATGTGTATAAGAGACAG3SEQIDNO1的转移链，和呈现为非转移的转座子序列5CTGTCTCTTATACACATCT3SEQIDNO2的非转移链。转移链的说明书CN104160040A5/24页83末端在体外转座反应中被接合或转移到靶标核酸。非转移链，其呈现为与转移的转座子末端序列互补的转座子末端序列，在体外转座反应中不被接合或转移到靶标核酸。如本文所使用的转座子组合物，是指包含转座子即能够与转座酶作用进行转座反应的最小双链DNA区段的组合物，任选地包括另外的序列。例如，转座子组合物包含两个转座子寡核苷酸，两个转座子寡核苷酸包括转移的转座子寡核苷酸或。
30、转移链和非转移链寡核苷酸，或者非转移链，其组合呈现转座子的序列。一条或两条链可包含另外的序列。转座子可包括天然存在的和/或非天然存在的核苷酸和天然或非天然的主链键合。任选地，转座子还可包括连接到构成转座子的一个或更多个核苷酸的一个或更多个部分。例如，转座子的一条或两条链可以被生物素化，或包含标记，例如荧光标记。0029术语转移的转座子寡核苷酸TRANSFERREDTRANSPOSONOLIGONUCLEOTIDE和转移链TRANSFERREDSTRAND可互换使用，是指转座子和转座子组合物二者的转移部分，也就是，与转座子末端是否连接到标签或其它序列或部分无关。类似地，术语非转移转座子寡核苷酸和。
31、非转移链可互换使用，是指转座子和转座子组合物二者的非转移部分。0030在一些实施方案中，转座子组合物包含或者由具有除转座子序列外的一种或更多种其它核苷酸序列的至少一种转座子组成。因此，在一些实施方案中，转座子组合物包含在转移转座子序列的5具有一种或更多种其他核苷酸序列，例如，标签序列的转移链。除了转移转座子序列，标签可具有一个或更多个其他标签部分或标签结构域。0031如本文中所使用的，“标签”是指一种核酸成分，通常是DNA，它提供一种鉴定或寻址与它接合的核酸片段的手段。例如，标签包括允许鉴定、识别、和/或分子或生物化学操作连接至标签粘贴的DNA的核苷酸序列例如，通过提供与寡核苷酸退火的位点，例。
32、如用于通过DNA聚合酶延伸的引物，通过提供用于捕获或连接反应的寡核苷酸，或通过提供核苷酸来源于特定来源的鉴定，以及类似。向核酸分子加入标签的方法有时在本文中称为“加标签”，且经受加标签或含有标签的核酸被称为“加标签的”例如，“加标签的RNA”。0032如通篇使用的，术语链型或链特异性信息指的是关于原始单链分子的方向的知识的保留。这在所提供的方法中被保存，因为已知DNA链与DNARNA双链体中的RNA链互补。因此，当测序DNA链时，该序列将是保留链特异性信息的RNA链的序列，并允许正确鉴定RNA分子和/或其表达水平。保留链特异性信息的方法也于WO2011/003630中描述，其通过引用全文并入本。
33、文。然而，在WO2011/003630中描述的方法仍然需要将RNA分子转化成双链CDNA分子，其如本文中所描述的，没有本申请中提供的方法有效。此外，在WO2011/003630描述的方法需要标签来保留链的信息。在本文提供的方法中，不需要标签来保留链特异性信息或链型。在其中DNARNA双链体的DNA链即，第一DNA链被扩增用于产生第一和第二扩增DNA链的实施方案中，链型的保持是通过以下知识第一DNA链与原始RNA链互补，且第二DNA链是与原始RNA链相同的序列除了序列中的T代替U。因此，尽管标签例如，标签序列可被包括在转座子的转移链中可用于保留链型，它不是必需的。0033如本文使用的，标签部分或。
34、标签结构域是指标签的呈现用于期望的预期目的或应用的序列的部分或结构域。一个标签部分或标签结构域是转座子结构域，该标签部分或标签结构域呈现转移转座子序列。在其中转移链还呈现一种或更多种其它核苷酸序列的一些实施方案中，标签还具有一个或更多个其他标签结构域，其中每个标签结构域为了任何期望的目的提供。举例来说，转座子组合物可包括I转移链，其呈现一种或更多种另外的说明书CN104160040A6/24页9序列除了转座子序列，可包含选自以下一种或更多种的标签结构域限制性位点标签结构域、捕获标签结构域、测序标签结构域、扩增标签结构域、检测标签结构域、地址标签结构域、和转录启动子结构域；和II非转移链，其呈现。
35、非转移转座子序列。0034如果对标签结构域使用描述，不同标签结构域的名称和描述是为了方便，例如以使更易于理解和讨论不同实施方案中标签的不同部分或结构域的预期用途和应用。但是，这些名称和描述不预期以任何方式限制标签或其标签结构域的任一种的用途或应用。因此，任何特定的标签或标签结构域可以用于除了或代替预期或主要的目的或应用的任何目的。同样的，一种标签结构域可包含两种或更多种其他标签结构域例如，测序标签结构域可包含捕获标签结构域和扩增标签结构域二者，或者一种标签结构域可提供两种或更多种不同标签结构域的功能或目的或应用例如，对于特定应用，捕获标签结构域还可提供测序标签结构域和/或扩增标签结构域的功能或。
36、目的。更进一步地，为了任何特定目的或应用或功能使用，标签不必以一种或更多种不同的结构域来描述。0035如通篇使用的，术语转座酶是指一种酶，其能够与含有转座子的组合物例如，转座子、转座子组合物形成功能性复合物，和在体外转座反应中催化含有转座子的组合物插入或转座到与其一起孵育的双链靶标核酸中。所提供的方法的转座酶还包括来自逆转录转座子和逆转录病毒的整合酶。在所提供的方法中可使用的示例性转座酶包括TN5转座酶和MUA转座酶的野生型或突变体形式。0036“转座反应”是一种反应，其中一种或更多种转座子在随机位点或几乎随机位点插入靶标核酸。转座反应中的必要组分是转座酶和呈现转座子核苷酸序列的DNA寡核苷酸。
37、，转座子核苷酸序列包括转移的转座子序列及其互补序列即，非转移转座子末端序列，以及形成有功能的转座或转座体复合物所需要的其他组件。本发明的方法通过采用由超活性的TN5转座酶和TN5型转座子末端或由MUA或HYPERMU转座酶和包括R1和R2末端序列的MU转座子末端形成的转座复合物来示例见如GORYSHIN,I和REZNIKOFF,WS,JBIOLCHEM,2737367,1998；和MIZUUCHI,K,CELL,35785,1983；SAVILAHTI,H,等,EMBOJ,144893,1995；其通过引用全文并入本文。然而，能够为了预期目的以随机的或几乎随机的方式以足够的效率插入转座子末端来。
38、将靶标核酸加标签的任何转座系统，都可用于所提供的方法中。可用于所提供的方法中的已知的转座系统的其他例子，包括但不限于金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUSTN552、TY1、转座子TN7、TN/O和IS10、MARINER转座酶、TC1、P元件、TN3、细菌插入序列、逆转录病毒和酵母逆转录转座子参见，例如，COLEGIOOR等,JBACTERIOL,18323848,2001；KIRBYC等,MOLMICROBIOL,4317386,2002；DEVINESE,和BOEKEJD,NUCLEICACIDSRES,22376572,1994；国际专利申请号WO95/23875；CR。
39、AIG,NL,SCIENCE2711512,1996；CRAIG,NL,REVIEWINCURRTOPMICROBIOLIMMUNOL,2042748,1996；KLECKNERN,等,CURRTOPMICROBIOLIMMUNOL,2044982,1996；LAMPEDJ,等,EMBOJ,1554709,1996；PLASTERKRH,CURRTOPMICROBIOLIMMUNOL,20412543,1996；GLOOR,GB,METHODSMOLBIOL,26097114,2004；ICHIKAWAH,和OHTSUBOE,JBIOLCHEM2651882932,1990；OHTSUBO,F。
40、和SEKINE,Y,CURRTOPMICROBIOLIMMUNOL204126,1996；BROWNPO,等,PROCNATLACADSCIUSA,8625259,1989；BOEKEJD和CORCESVG,ANNUREVMICROBIOL4340334,1989；其通过引用全文并入本文。说明书CN104160040A7/24页100037将转座子插入靶标序列的方法可以使用任何合适的转座子系统体外实现，对其合适的体外转座子系统是可用的，或者可以基于本领域的知识开发出来。在一般情况下，用于本发明的方法的合适的体外转座子系统至少要求，具有足够纯度、足够浓度和足够的体外转座活性的转座酶，和与转座酶形。
41、成有功能的复合物的转座子，且相应的转座酶能够催化转座反应。可用于本发明的合适的转座酶转座子序列，包括但不限于与选自转座酶的野生型、衍生型或突变型的转座酶形成复合物的野生型、衍生型或突变型转座子序列。0038在所提供的方法中，DNARNA双链体可以以多种方式来提供。通过示例的方式，支持物可包括多个引物，且DNARNA双链体通过以下来提供将一种或更多种RNA分子与支持物上固定的引物杂交，并以RNA分子为模板延伸杂交到RNA分子上的引物，以产生一种或更多种DNARNA双链体。任选地，多个DNARNA双链体通过以下来提供将多个RNA分子与支持物上固定的引物杂交，并使用RNA分子作为模板延伸杂交到RNA。
42、分子上的引物，以产生多个DNARNA双链体。0039如上所述，该方法可包括提供具有多个引物的支持物；引物或其子集包含能够结合到一种或更多种RNA分子的序列。例如，固定的引物可包括POLYT序列且RNA可包括能够与POLYT序列杂交的POLYA序列。可选地或另外地，所述多个固定的引物可包括能够与多个RNA分子中的一个或更多个RNA分子杂交的靶标特异性引物。因此，所述一个或更多个DNARNA双链体的RNA链包括与一个或更多个固定的引物的至少一部分互补的序列。任选地，所述多个固定的引物包括第一序列的第一引物子集和第二序列的第二引物子集。所述第一或第二引物子集可包括POLYT序列。0040任选地，3衔。
43、接子可以被添加到多个RNA分子，所述3衔接子包括与多个固定的引物或其子集互补的序列。这种3衔接子连接的RNA分子然后可以杂交到固定的引物上。0041因此，固定的引物或其子集可包括POLYT序列、RNA靶标特异性序列或与连接至RNA分子的衔接子互补的序列。任选地，所述多个引物包括至少两个子集的引物，所述第一子集包括POLYT序列、RNA靶标特异性序列或与连接至RNA分子的衔接子互补的序列，第二引物子集包括能够与DNARNA双链体的DNA链上的序列结合的序列。这样的序列可以是，例如，与转座子的转移链序列相同的序列。如全文所述，转座后，在DNA链的末端和转座子的非转移链之间会有缺口。然后DNA链可被。
44、延伸，以复制RNA链。复制将包括复制转座子的转移链序列。然后DNA链将包括与转座子转移链序列互补的序列，且因此包括支持物表面上的引物或其子集。换句话说，如果一条或更多条引物包括与转座子的转移链相同或相似的序列，则DNARNA双链体中的DNA链将能够与引物杂交，因为DNA链含有与引物互补的序列。0042能够延伸DNA链的3末端以复制RNA链到其5末端并置换转座子的非转移链的合适的核酸修饰酶是已知的。简单地说，一些DNA聚合酶能够随着该聚合酶合成一条新的DNA链，置换模板链的互补链。这个过程被称为链置换，且具有这种活性的DNA聚合酶在本文中称为链置换DNA聚合酶。在一般情况下，所提供的方法中使用的。
45、DNA模板特异性DNA聚合酶为预期的目的有效地合成合适长度的DNA而不脱离模板或终止合成DNA，这被称为酶的持续合成能力PROCESSIVITY。DNA聚合酶进行链置换的能力可以利用聚合酶在滚环复制分析中容易地确定，如FIRE和XU所描述PROCNATLACADSCIUSA9246414645,1995，其通过引用全文并入本文。链置换和DNA聚合酶的持续合成能力还说明书CN104160040A108/24页11可使用在KONG等人描述的方法进行测定JBIOLCHEM26819651975,1993，其通过引用全文并入本文。末端转移酶在本文也被定义为DNA聚合酶，所述DNA聚合酶在所提供的方法的。
46、一些实施方案中作为组合物使用。末端转移酶可以使用，因为它催化DNTP向DNA的3羟基末端的不依赖模板的加入。0043在本文提供的方法中，该方法可还包括测序DNA链的一部分和/或扩增DNA链的至少一部分。任选地，DNARNA双链体的RNA链可以在测序和/或扩增之前除去。通过示例的方式，所述方法还包括从该DNARNA双链体除去RNA链和测序至少一部分DNA链即，第一DNA链。该方法还可包括复制至少一部分DNA链以产生与DNARNA双链体的DNA链即，第一DNA链互补的第二DNA链。如果需要，第二互补DNA链然后可以被测序。任选地，所述DNARNA双链体的第一DNA链可以在第二互补DNA链测序之前除。
47、去。0044在所提供的方法中，任选地，从DNARNA双链体除去RNA链后，DNA链可以被扩增以产生多个包括第一和第二扩增链的双链DNA分子。任选地，所述扩增产生簇，在下文中更详细地描述。0045在一些实施方案中，当DNA链已被扩增以产生多个双链DNA分子，一个或两个链可以被测序。通过示例的方式，该方法可包括除去第一扩增链后对第二扩增链的至少一部分进行测序。任选地，所述第一扩增链可通过复制第二扩增链的至少一部分被再生。第二扩增链然后可以被除去，以对第一扩增链的至少一部分测序。任选地，可以进行第一和第二扩增链的一部分或全部的序列读取而不除去任一链的全部或部分。0046多种实验方案可以被用于产生扩增。
48、的核酸，例如，在支持物上扩增的核酸。例如，核酸可以通过乳液PCR或桥式PCR扩增MITRACHURCHNUCLEICACIDSRES27,E341999；DRESSMAN等PROCNATLACADSCIUSA100,881788222003；ADESSI,C等NUCLEICACIDSRES28,E872000；FEDURCO等NUCLEICACIDSRES34,E222006，其每一篇通过引用并入本文。0047在使用乳液PCR的实施方案中，核酸可以在水包油乳液中被PCR扩增。在一个实施方案中，使用单个引物对。一条PCR引物被拴系在支持物例如，微米级的珠的表面5连接，另一条引物在溶液中。任选地，。
49、所述支持物包含多于一种序列的引物，该引物为能够杂交到一种或更多种靶标RNA分子的靶标特异性引物，溶液中的引物具有相同的序列例如，与通过复制加标签的RNA链到DNA链的5末端添加到DNA链上的序列互补的序列。通常，低模板浓度导致大多数含珠的区室具有零个或一个模板分子。在生产性乳液区室其中存在珠和模板分子中，RNA分子可以被捕获和/或RNA分子相应的DNA互补序列在珠表面被扩增。破坏乳液后，携带扩增产物的珠可被选择性地富集。每个克隆扩增的珠在其表面上携带对应于模板库中的单个分子的扩增的PCR产物。有用的乳液PCR方法的各种实施方案列在美国专利申请公布号2005/0042648A1；2005/0079510A1和2005/0130173A1和WO05/010145中，其每一个通过引用并入本文。0048在使用桥式PCR，也被称为簇生成的实施方案中，来自模板库的核酸可使用涂敷在支持物表面的引物被扩增。引物可在其5末端被柔性连接体连接。源自模板库中的任何给定成员的扩增产物保持局部拴系在接近来源的点。在PCR结束时，每个克隆簇包含模板库的单个成员的多个拷贝。在所提供的方法中，每一个DNARNA双链体形成克隆簇的来源。除去RNA链后，DNA链可使用附着于支持物上的引物进行复制，产生DNA链的扩增拷贝并产。