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1、10申请公布号CN104195172A43申请公布日20141210CN104195172A21申请号201410375803522申请日20140801C12N15/85200601C12N15/65200601C12Q1/68200601A61B6/0020060171申请人广东药学院地址510006广东省广州市大学城外环东路280号72发明人张巨峰罗霞74专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司44102代理人陈卫54发明名称一种监测治疗基因体内表达情况和范围的方法57摘要发明属于分子标记技术领域，具体公开了一种监测治疗基因体内表达情况和范围的方法。本发明通过将治疗基因与标记基因HSV1。
2、TK融合，可以利用对HSV1TK成像的方法来间接反映治疗基因表达情况和体内分布情况，经济而有效。另外，标记基因HSV1TK本身也是治疗基因，与其它肿瘤治疗基因融合后，能起到协同杀伤肿瘤作用。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图3页10申请公布号CN104195172ACN104195172A1/1页21一种监测治疗基因体内表达情况和范围的方法，其特征在于，将治疗基因与标记基因HSV1TK融合，构建融合基因载体后，转染治疗受体，利用对HSV1TK体内分子成像的方法来间接反映治疗基因在治疗受体内的表达情况和体内分。
3、布情况。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述治疗基因为CD基因、P53基因或RB基因。3根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述治疗基因为CD基因。4根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体内分子成像的方法为GAMMA相机成像或SPECT成像。5根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记基因HSV1TK以FIAU为标记底物，且FIAU的集聚水平与HSV1TK基因表达水平成正比。权利要求书CN104195172A1/4页3一种监测治疗基因体内表达情况和范围的方法技术领域0001本发明涉及分子标记技术领域，更具体地，涉及一种监测治疗基因体内表达情况和范围的方法。背景技术0002随。
4、着肿瘤分子生物学和生物技术的发展，基因治疗在未来有可能成为肿瘤治疗的另外一种常规手段。建立一种监测治疗基因体内分布和表达情况方法，有利于评估治疗的有效性和安全性。目前是通过活检用免疫组化方法来检测组织中基因表达情况，但这种方法存在着明显的缺点（1）对机体造成损伤，也不能进行重复连续观察。（2）不能方便获得治疗基因在体内分布和表达情况的信息。而分子成像方法可以非侵入的观察和评估治疗基因在体内的位置、数量和持续表达时间。而这些信息对基因治疗应用于临床具有重要价值。临床分子成像的前提是需要合适的“标记基因”和“标记底物”相结合。HSV1TK是一个被广泛研究的基因。不仅可用来对多种肿瘤的基因治疗。同时。
5、HSV1TK也是应用于分子成像较为成熟的“标记基因”。HSV1TK酶的三个常用“标记底物”是IUDR、GCV和FIAU，放射性标记底物可用于非侵入的分子成像。FIAU做为一个潜在的“标记底物”，是因为它是典型的2氟代核苷类似物，放射性标记的碘（I）或碳（C）能掺入分子中，可用GAMMA相机和SPECT成像。已有的研究表明，FIAU经放射性标记后，分子成像的稳定性优于IUDR或GCV。基于此，以HSV1TK基因做为“标记基因”，FIAU做为“标记底物”来进行体内分子成像。0003但对于许多其它的治疗基因没有办法来进行GAMMA相机和SPECT方法的体内分子成像。针对每个治疗基因来开发新的探针或放。
6、射性标记方法代价非常昂贵，周期也会较长。发明内容0004本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种监测治疗基因体内表达情况和范围的方法。所述方法能够实现非侵入和实时监测治疗基因表达和分布情况。0005为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的。0006一种监测治疗基因体内表达情况和范围的方法，包括如下步骤将治疗基因与标记基因HSV1TK融合，构建融合基因载体后，转染治疗受体，利用对HSV1TK体内分子成像的方法来间接反映治疗基因在治疗受体内的表达情况和体内分布情况。0007优选地，所述治疗基因为CD基因、P53基因、RB基因等。0008更优选地，所述治疗基因为CD基因。0009把“报告基。
7、因”与“治疗基因”融合，由于“报告基因”与“治疗基因”受同一启动子的驱动，因此“报告基因”与“治疗基因”可在体内同时表达，而且表达产物是严格等量的，获得产物是各自蛋白的单一杂合体融合蛋白，从“报告基因”分子成像中获得的信息就能间接反映与之融合的“治疗基因”表达情况，即“治疗基因”的“非直接成像”。这样，在研究其它基因对肿瘤治疗时，就可以选择与现有成熟的报告基因（如HSV1TK）进行融合，这对观察众多的治疗基因体内分布和表达情况具有重要的意义。说明书CN104195172A2/4页40010优选地，所述体内分子成像的方法为GAMMA相机成像或SPECT成像。0011优选地，所述标记基因HSV1T。
8、K以FIAU为标记底物，且FIAU的集聚水平与HSV1TK基因表达水平成正比。0012与现有技术相比，本发明具有以下有益效果本发明通过将治疗基因与标记基因HSV1TK融合，可以利用对HSV1TK成像的方法来间接反映治疗基因表达情况和体内分布情况，经济而有效。另外，标记基因HSV1TK本身也是治疗基因，与其它肿瘤治疗基因融合后，能起到协同杀伤肿瘤作用。附图说明0013图1在NCIH460TK细胞株中，检测HSV1TKMRNA表达、前药GCV敏感性和FIAU集聚水平三者间的关系；（A）HSV1TKMRNA表达与前药GCV敏感性关系；（B）HSV1TKMRNA表达与FIAU集聚水平的关系；（C）FI。
9、AU集聚水平与前药GCV的关系。0014图2GAMMA相机体内成像方法监测HSV1TK基因的表达，其中，图A中箭头所示为NCIH460TK所成肿瘤，对侧为野生型NCIH460所成肿瘤；图B为静脉注射214CFIAU24小时后GAMMA相机成像；图C为静脉注射214CFIAU36小时后GAMMA相机成像。0015图3融合基因表达载体的构建。0016图4PCDNA31TK、PCDNA31CD和PDNA31TKGLYCD转染HEK293细胞，检测HSV1TK，CD和TKGLYCD表达情况；其中1为PCDNA31；2为PCDNA31TK；3为PCDNA31CD；4为PCDNA31TKGLYCD。001。
10、7图5PCDNA31TKGLYCD对肿瘤细胞NCIH460的杀伤作用PCDNA31CD，PCDNA31TK，PCDNA31/HAMYCHISZTKGLYCD和空质粒PCDNA31转染NCIH460细胞后，分别给予前药5FC和GCV后细胞增殖情况。0018图6标记基因HSV1TK表达情况和治疗基因表达情况成线性关系。具体实施方式0019下面结合说明书附图和具体实施例来详细解释本发明，下列实施例并不能用于限定本发明所保护的范围。其中关于重组载体的构建、载体瞬时转染细胞等分子生物学方法均为本领域常规的方法，另外实施例中没有详细描述的分子生物学方法都参考本领域分子生物学的常规操作来执行。0020实施例。
11、1本发明监测方法建立的依据一、细胞水平研究FIAU的集聚水平与HSV1TK基因表达水平成正比。00211、制备稳定转染HSV1TK基因的NCIH460细胞株转染前24H接种NCIH460细胞到6孔板中，转染当天当细胞密度达到6080时，用PCDNA31TK（携带HSV1TK基因的真核表达载体）转染NCIH460，转染方法按照转染试剂LIPOFECTAMINE2000操作方法进行。转染48H后用G418抗生素进行筛选，以1014天细胞全部死亡的G418浓度为最佳筛选浓度。用含维持浓度G418培养基维持细胞生长，直至筛选可见克隆为止。分离克隆放大培养并获得一定细胞数量后，用RTPCR和WESTER。
12、N方法鉴定，鉴定成功的细胞即是稳定转染了HSVTK基因的NCIH460细胞系。00222、筛选出稳定转染HSV1TK基因的NCIH460细胞株，命名为NCIH460TK。然后，评说明书CN104195172A3/4页5价在NCIH460TK中是否FIAU集聚水平与HSV1TK基因表达水平成正比，评价过程为为了评价在NCIH460TK中是否FIAU集聚水平与HSV1TK基因表达水平成正比，从两方面做了检测1NCIH460TK对前药GCV的敏感性；2NCIH460TK中HSV1TK的MRNA表达水平。结果如图1所示，FIAU的集聚水平与HSV1TK基因表达水平以及对前药GCV的敏感性具有高度的一致。
13、性。说明在体外实验中，用HSV1TK做为“标记基因”，放射性标记的FIAU做为“标记底物”，能成功的反映出细胞中所转染的HSV1TK基因表达水平。体外实验为HSV1TK做为“标记基因”和FIAU做为“标记底物”的体内分子成像可行性奠定了良好的基础。0023二、小鼠动物体内研究标记基因的体内表达情况。0024GAMMA相机方法体内成像监测HSV1TK基因的表达将步骤一的NCIH460TK细胞株接种裸鼠一侧皮下成瘤，对侧用野生型NCIH460成瘤做为对照。待肿瘤生长到直径为3206CM时，静脉注射50CI214CFIAU，用GAMMA相机分别于24、36小时后进行成像，显示出裸鼠体内分布和代谢示踪。
14、剂（图2）。结果表明，在静脉注射214CFIAU24小时和36小时后，用NCIH460TK所成肿瘤区域有高水平的214CFIAU来源的放射活性。而野生型NCIH460所成肿瘤和鼠的其它器官没有显示大量放射活性。0025三、HSV1TK和CD融合基因的构建和功能鉴定。00261、利用INSIGHTII软件，计算由不同LINKER序列连接蛋白之间能量的情况,做结构模拟图观察两个蛋白的折叠是否受到影响。00272、根据所预测的LINKER序列（LINKER序列为GSGGGGGGGGG），构建CD基因和HSV1TK融合基因的表达载体，重组载体结构如图3所示，具体构建步骤如下以PNGVLTK质粒为模板，。
15、PCR方法扩增HSV1TK基因序列，上游引物序列是5CCGGAATTCACCATGGCTTCGTACCCC3，下游引物序列是5CGCGGATCCGTTAGCCTCCCCCATCTC3。0028PCR反应条件预变性942分钟，变性9415秒，退火5230秒，延伸721分钟，共30个循环，最后72延伸7分钟。0029PCR产物经ECORI和BAMHI双酶切，酶切产物与同样经过ECORI和BAMHI双酶切的PCDNA31载体连接，构建PCDNA31TK重组质粒。以实验室构建的CD质粒为模板，PCR方法扩增CD基因，上游引物为5CCGGAATTCACCATGGGGAGGCTAACAGTGTC3，下游引。
16、物序列为5CGCGGATCCACGTTTGTAATCGATGGCTTC3，PCR反应条件与上述一样。CD基因PCR产物经ECORI和BAMHI双酶切后克隆到同样酶切的PCDNA31质粒上，构建PCDNA31CD重组质粒。0030构建HSV1TKGLYCD融合基因表达载体PCR扩增LINKER和CD基因序列，上游引物是5CGCGATCCGGCGGGGGCGGTGGAGGAGGGGGTGGGAGGCTAACAGTGTC3，下游引物是5CGCGGATCCACGTTTGTAATCGATGGCTTC3。0031PCR反应条件与上述一样，PCR产物大小是1310BP，PCR产物经BAMHI酶切后，连接到P。
17、CDNA31TK中，构建PCDNA31TKGLYCD重组质粒PSTI鉴定CD基因的方向。阳性的重组质粒经PSTI酶切后大小为442，782，2662，4045BP。PCDNA31TKGLYCD重组质粒再经测序验证正确。说明书CN104195172A4/4页600323、检测融合基因表达将步骤2构建得到的融合基因表达载体PCDNA31TKGLYCD转染HEK293细胞，用WESTERNBLOT方法检测HSV1TK和CD融合基因表达情况。检测结果如图4所示。由图4WESTERNBLOT检测结果可知，融合蛋白完整表达，且大小与预期一致。00334、肿瘤细胞NCIH460的杀伤作用，来评价融合基因的功。
18、能将步骤2制备得到的质粒载体转染肿瘤细胞NCIH460，24小时后单独或联合给予相应的前药（5FC和GCV）共培养，96小时后用WST1方法检测细胞增殖情况。WST1检测结果如（图5），细胞增殖情况一样。说明融合基因保留了各自基因功能，所表达蛋白的功能未受影响。0034实施例2一种监测治疗基因（CD基因）体内表达情况和范围的方法，具体包括如下步骤1、将标记基因HSV1TK和治疗基因（CD基因）通过LINKER序列（LINKER序列为GSGGGGGGGGG），连接构建得到得到融合基因的表达载体，具体步骤参加实施例1的步骤三。00352、将融合基因表达载体PCDNA31TKGLYCD转染肿瘤细胞N。
19、CIH460；3、在裸鼠两前上肢和一侧后下肢接种野生型肿瘤细胞，另一侧后下肢接种稳转TKGLYCD基因的肿瘤细胞NCIH460作为阳性对照。待肿瘤生长直径达到306CM时。从静脉给予214CFIAU。并于给予214CFIAU后的4、24、36和48小时用GAMMA相机和SPECT成像，优化成像时间。最后一次体内成像后杀死裸鼠，并迅速剥取肿瘤，组织冷冻切片，组织切片用定量放射自显影成像。REALTIMEPCR测定组织中CD融合基因表达量和范围，并同时和GAMMA相机和SPECT成像进行比较。（结果见图6）图6结果显示CD基因体内表达情况和分布与GAMMA相机方法体内成像HSV1TK基因信号强弱成正相关。说明书CN104195172A1/3页7图1图2图3说明书附图CN104195172A2/3页8图4图5说明书附图CN104195172A3/3页9图6说明书附图CN104195172A。