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1、10申请公布号CN104073557A43申请公布日20141001CN104073557A21申请号201410257711722申请日20140611C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人中国科学院海洋研究所地址266071山东省青岛市南海路7号72发明人黄宝玉张琳琳李莉张国范74专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司21002代理人周秀梅刘阳54发明名称长牡蛎POLYIC应激实验荧光定量的内参基因及其引物和应用57摘要本发明为长牡蛎POLYIC应激实验荧光定量的内参基因及其引物和应用，涉及分子生物学领域，具体地说是长牡蛎聚肌苷酸聚胞苷酸应激实验荧光定量内参。
2、基因的筛选。本发明筛选出的ACTIN、GAPDH和RS18是POLYIC应激实验中，牡蛎血细胞内表达最稳定的3个内参基因。这3个内参基因在POLYIC应激实验中，表达的稳定性优于候选的另外的七个内参基因包括常用的28SRRNA和ELONGATIONFACTOR1，因此可以同时使用做为荧光定量内参基因，能为长牡蛎POLYIC应激实验中获得功能基因表达的精确定量数据提供有力支持。51INTCL权利要求书1页说明书8页序列表10页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页序列表10页附图1页10申请公布号CN104073557ACN104073557A1/1页2。
3、1长牡蛎POLYIC应激实验荧光定量内参基因，其特征在于内参基因为ACTIN、GAPDH和RS18；其中内参基因ACTIN具有序列表SEQIDNO1中碱基序列，内参基因GAPDH具有序列表SEQIDNO2中碱基序列，内参基因RS18具有序列表SEQIDNO3中碱基序列。2一种权利要求1所述的应用，其特征在于长牡蛎POLYIC应激实验中采用内参基因定量，采用所述长牡蛎基因ACTIN，GAPDH和RS18能够在相对定量法实时荧光定量PCR中作为内参基因。3一种权利要求1所述ACTIN、GAPDH和RS18内参基因的特异性引物，其特征在于所用内参基因ACTIN的特异性引物为ACTINF5GTGCTA。
4、CGTTGCCCTGGACTT3ACTINR5TCGCTCGTTGCCAATGGTGAT3；所用内参基因GAPDH的特异性引物为GAPDHF5TTCTCTTGCCCCTCTTGC3GAPDHR5CGCCCAATCCTTGTTGCTT3；所用内参基因RS18的特异性引物为RS18F5GCCATCAAGGGTATCGGTAGAC3RS18R5CTGCCTGTTAAGGAACCAGTCAG3。权利要求书CN104073557A1/8页3长牡蛎POLYIC应激实验荧光定量的内参基因及其引物和应用技术领域0001本发明涉及分子生物学领域，具体地说是长牡蛎聚肌苷酸聚胞苷酸简称聚肌胞，POLYINOSINI。
5、CPOLYCYTIDYLICACID，POLYIC应激实验中进行功能基因表达分析的内参基因的筛选。背景技术0002长牡蛎CRASSOSTREAGIGAS，也称太平洋牡蛎PACICOYSTER，属于瓣鳃纲BIVALVIA，珍珠贝目PTERIOIDA，牡蛎科，是冠轮动物LOPHOTROCHOZOA中软体动物门MOLLUSCA内的重要分支。其肉质肥嫩，鲜美可口，营养丰富，具有很高的经济价值，是世界上重要的水产养殖对象。自然分布于日本、中国和韩国，为世界性广布种。太平洋牡蛎作为贝类的“模式种”，一直受到科学家们的广泛重视，尤其是近来长牡蛎基因组序列的破译引起更广泛的关注。0003长牡蛎天然免疫系统一直。
6、是科学家们感兴趣的领域。牡蛎开放的循环系统，每天都要面对潮间带各种病原菌的挑战，而牡蛎却能应付自如，其体内必然存在完备精细的天然免疫系统。病原菌及相关病原分子应激实验是近年来研究免疫基因对病原菌或相关分子响应机制的重要手段，研究者通过对牡蛎成体进行病原菌或其类似物刺激，利用荧光实时定量PCR技术研究免疫基因随时间对病原菌或其类似物的响应。0004POLYIC是一种人工合成的双链RNA的类似物，由肌苷酸与胞苷酸多聚而成，是一种免疫增强剂。由于POLYIC与一些病毒的双链RNA在结构上相似，它的钠盐可以用来模拟病毒感染，启动抗病毒的免疫反应。因此，POLYIC经常被用做刺激源进行免疫学研究，以探索。
7、生物个体对病毒的响应机制。0005荧光实时定量PCRQRTPCR具有操作简单，成本较低，灵敏度高的优势，经常被用来研究目的基因的表达。一些对宿主对病原菌应激反应的研究，其转录水平的研究常常基于QRTPCR实验。而相对荧光定量实验需要表达稳定的管家基因作为内参。管家基因是典型的组成性基因，在稳态或是病原应激的细胞中，管家基因都能相对较稳定表达。但是在不同的实验条件下，管家基因的表达量还是有差异的。因此确定稳定表达的管家内参基因对获得准确的QRTPCR实验结果是非常重要的。发明内容0006本发明的目的是筛选长牡蛎CRASSOSTREAGIGASPOLYIC应激实验荧光定量的内参基因。即，基于荧光定。
8、量PCR中的相对定量法在长牡蛎POLYIC应激实验中对免疫基因及其他功能基因进行定量分析所用的基因荧光定量内参基因及其引物。0007为实现上述目的，本发明采用的技术方案为0008筛选出长牡蛎POLYIC应激实验荧光定量的内参基因长牡蛎POLYIC应激实验中三个内参基因为ACTIN,具有序列表SEQIDNO1中碱基序列和GAPDH具有序列说明书CN104073557A2/8页4表SEQIDNO2中碱基序列，RS18内参基因具有序列表SEQIDNO3中碱基序列。0009长牡蛎POLYIC应激实验荧光定量的内参基因的应用，所述贝类基因ACTIN，GAPDH与RS18在长牡蛎POLYIC应激实验样品中。
9、稳定表达即，表达量变化小，能够在相对定量法实时荧光定量PCR中作为内参基因。0010所述长牡蛎POLYIC应激实验荧光定量的内参基因的应用，同时使用三个稳定表达的管家基因作为基因内参；三个基因内参的表达量CT值为各基因在应激实验样品中的表达量CT值的算术平均数；通过该三基因内参校正上样过程中的实验误差，能够提高实验的准确性。0011ACTIN的特异性引物为0012ACTINF5GTGCTACGTTGCCCTGGACTT30013ACTINR5TCGCTCGTTGCCAATGGTGAT3；0014GAPDH的特异性引物为0015GAPDHF5TTCTCTTGCCCCTCTTGC30016GAPD。
10、HR5CGCCCAATCCTTGTTGCTT3；0017RS18的特异性引物为0018RS18F5GCCATCAAGGGTATCGGTAGAC30019RS18R5CTGCCTGTTAAGGAACCAGTCAG3。0020具体步骤为0021A候选内参基因序列的获得选取长牡蛎荧光定量PCR常用5个的内参基因ELONGATIONFACTOR1,ACTIN,18SRRNA,28SRRNA和GLYCERALDEHYDE3PHOSPHATEDEHYDROGENASEGAPDH，以及在牡蛎幼虫发育过程中表达稳定的内参RIBOSOMALPROTEIN18RS18和RIBOSOMALPROTEINL7RL7，。
11、另外3个从牡蛎基因组中获得的人的管家基因的同源基因SPHASEKINASEASSOCIATEDPROTEIN1SKP1，HETEROGENEOUSNUCLEARRIBONUCLEOPROTEINQHNRQP和UBIQUITINCONJUGATINGENZYMEE2D2UBCD1共10个基因作为内参基因的候选基因。0022B引物设计根据获得的候选基因序列设计该基因相应的特异引物扩增产物单一，具体为溶解曲线峰单一，3的琼脂糖胶检测条带单一。0023CPCR模板的准备收集样品后，用TRIZOL试剂，市购于LIFETECHNOLOGIES公司提取总RNA，用PRIMESCRIPTTMRTREAGENT。
12、KITWITHGDNAERASERPERFECTREALTIME试剂盒，市购于TAKARA公司按照说明书反转成双链CDNA。作为荧光定量PCR的模板。0024D荧光定量PCR反应以反转的CDNA为模版，用内参基因相应的特异引物在ABI7500FASTREALTIMEPCR仪中进行扩增。获得各个基因的表达数据CT值。0025E根据所得CT值通过GENORMV34软件计算，筛选出表达最稳定的内参管家基因并确定最优内参基因数目。0026本发明具有如下优点00271本发明首次从多达十种候选内参基因中筛选出POLYIC应激实验中表达最稳定的内参基因，数据真实可靠。00282筛选出的内参基因适用于长牡蛎P。
13、OLYIC应激实验中免疫相关基因或其他说明书CN104073557A3/8页5功能基因的表达分析，能显著提高所得数据的准确性。其应用较为普遍，操作相对简单，成本较低，灵敏度高，精确度高。00293本研究筛选出的的三个内参基因是经过严格的内参筛选程序选出的，是长牡蛎在POLYIC应激条件下表达最稳定的内参基因。附图说明0030图1GENORM软件计算出的各内参管家基因表达稳定值；0031图2GENORM通过成对变异系数VN/VN1确定最适合的内参基因的数目。具体实施方式0032下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。本发明所采用实验用品均来自市购，所用英文标记均为产品包装名称。。
14、0033序列表1SEQIDNO1的信息ACTIN基因0034序列特征长度1423BP0035类型核酸0036链型双链0037拓扑结构线形0038分子类型DNA0039特性名称ACTIN0040来源长牡蛎0041序列描述牡蛎ACTIN基因全长，基因编号AF0260630042CCGAACTCAAACCATCACTTTCTTGTCTGGATATTAATCTTACAACTTCACAATGGGAGATGAAGATATTGCAGCTTTAGTCGTAGACAATGGATCCGGAATGTGCAAGGCCGGATTTGCCGGAGACGATGCTCCCAGAGCTGTGTTTCCCTCCATTGTCGGA。
15、CGCCCCAGACATCAGGGTGTGATGGTTGGTATGGGACAGAAGGACAGCTATGTAGGAGACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGTATCCTCACCCTCAAGTACCCCATTGAACACGGCATCGTCACCAACTGGGATGACATGGAGAAAATCTGGCATCATACCTTCTACAATGAACTCCGTGTGGCCCCAGAGGAACACCCCGTCCTCCTGACCGAGGCCCCACTCAACCCCAAGGCCAACAGAGAAAAGATGACACAGATCATGTTCGAGACCTTCAACTCTCCCGCCATGTACGTCGCCATC。
16、CAGGCCGTACTGTCCCTGTACGCTTCCGGTCGTACAACCGGTATCGTACTCGACTCCGGAGATGGTGTGTCTCACACAGTCCCCATCTACGAAGGTTACGCCCTTCCCCACGCCATCATGAGATTGGATCTCGCTGGACGTGATCTGACCGATTACCTCATGAAAATCCTCACAGAACGTGGATACTCTTTCACCACCACAGCCGAGAGAGAAATCGTCAGAGACATCAAGGAGAAACTGTGCTACGTTGCCCTGGACTTCGAACAAGAGATGACTACTGCTGCTTCATCCTCATCTCTA。
17、GAGAAGAGCTATGAACTTCCCGACGGTCAGGTCATCACCATTGGCAACGAGCGATTCAGGTGCCCAGAGGCCATGTTCCAGCCATCCTTCCTTGGAATGGAATCTTCCGGAATCCATGAAACATCATACAACAGTATCATGAAATGTGATGTCGATATCCGTAAAGACTTGTACGCTAATATTGTCCTGTCTGGAGGTACCACCATGTTCCCCGGCATTGCTGACCGTATGCAAAAGGAGGTCACCGCCCTCGCTCCCCCAACAATGAAGATTAAGGTCATTGCTCCACCTGAGAGGAAA。
18、TACTCCGTCTGGATCGGTGGTTCCATCCTTGCTTCTCTCTCCACCTTCCAACAGATGTGGATCAGCAAACAGGAGTACGACGAATCTGGACCATCCATTGTCCACAGGAAATGCTTCTAAATAGACTCATTAGTTTTAATAAGATTCTTTTTCTGTAGTTTAAATTGTTTAGTAGTAGTTCTCATTACACACACGTGATGATTGAGTAAAGACCTTCTGGCCATCAAGTGGCTGTGATAGGAGTTTAATATAGATTGCATACCCCTTAGAAATATCTTAGATCAGACTAGTATGAAATAT。
19、GATAAAGCTTTATTA说明书CN104073557A4/8页6ACACTGTTTCGTTCTTGATTCTGAATAAAATGTTATCACATTGTT0043序列表2SEQIDNO2的信息GAPDH基因0044序列特征长度928BP0045类型核酸0046链型双链0047拓扑结构线形0048分子类型DNA0049特性名称GAPDH0050来源长牡蛎0051序列描述牡蛎GAPDH部分基因序列，基因编号AJ5448860052ACGGTTTCGGGCGGATCGGTCGTCTTGTCCTTAGGGCAGCCTTGGACAAAGGAGTTGATGTTGTTGCAGTCAATGATCCTTT。
20、CATTGACCTTGACTATATGGTTTACATGTTCAAATATGATTCAACTCACGGAGTTTTCAATGGGGAGATTAAAATTGATGGAGGAAAACTGGTGATCAATGGGAAGGCAATGTCCGTATATTGCGAACGGGATCCAGCCAACATTCCCTGGTCCAAGGATGGTGCTGAATACATTGTCGACTCTACAGGGTGCTTTACTACTCTTGACAAAGCAGGGTCTCATATGAAAGGAGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCCCCCTCAGCTGACGCACCCATGTTTGTTTGTGGTGTCAATGC。
21、AGAAAAGTACTCCAAAGACCAGAACATCGTCAGCAACGCATCCTGCACCACAAATTGTCTTGCCCCTCTTGCAAAAGTGATTCATGAGAAATTTGGAATTGTTGAAGGTTTGATGACAACAGTCCATGCGTACACAGCCACCCAGAAGGTTGTGGATGGCCCAAGCAACAAGGATTGGCGTGGTGGTAGAGGTGCAGCCCAAAACATCATCCCCTCCTCAACTGGAGCTGCCAAAGCTGTCGGAAAGGTTATCCCAGATTTGAACGGAAAATTGACCGGAATGGCTTTCCGCGTACCAGT。
22、TCCAGATGTTTCCGTTGTTGATTTAACCTGCAGAATCAATAAAGGGGCATCATACAATGATATTAAGGCAGCCATCAAGGCAGCCTCTGAGAATGAATTGAAAGGCATTTTGGGATACACAGAAGATGATGTTGTTTCCCAGGATTTCCGTGGAGACAAGCGAAGCAGCATTTTTGATGCAAAGGCTGGAATTGCCTTGAATGACAATTTTGTGAAGCTTGTGTCTTGGTACGACAATGAATACGG0053列表3SEQIDNO3的信息RS18基因0054序列特征长度459BP0055类型核酸0056链型双。
23、链0057拓扑结构线形0058分子类型DNA0059特性名称RS180060来源长牡蛎0061序列描述牡蛎RS18基因序列，基因编号CGI_100081010062ATGGCTTTGATACTGCCAGAGAAGTTTCAGCACATTCTTCGTATCCTCAACACAAATATTGATGGACGAAGGAAAATTATGTTCGCTATGACTGCCATCAAGGGTATCGGTAGACGATATGCTAATGTTGTCTGCAAGAAAGCTGATGTAGATATCACAAAAAGGGCAGGGGAACTCTCAGAAGAAGAGATTGACAAAATTGTCACAATTATGCAGAA。
24、CCCTCGTCAGTACAAGATTCCTGACTGGTTCCTTAACAGGCAGAAAGACATTAAGGATGGTAAATTCAGCCAGGTCATGTCCAACACACTGGACAACAAACTCCGTGAGGATCTGGAGCGACTAAAGAAGATCCGAGCACACAGAGGTCTCCGTCACTACTGGGGTCTAAGAGTGAGAGGACAGCACACAAAGACCACAGGAAGAAGAGGAAGAACTGTCGGTGTGGCCAAGAAGAAGTAA说明书CN104073557A5/8页70063实施例10064候选内参基因的选择我们选取长牡蛎常用5个的内参基因EL。
25、ONGATIONFACTOR1,ACTIN,18SRRNA,28SRRNA和GAPDH，以及在牡蛎幼虫发育过程中表达稳定的内参基因RS18和RL7，还有另外3个从牡蛎基因组中获得的人的管家基因的同源基因SKP1，HNRP和UBCD1共10个基因作为内参基因的候选基因。所选取的内参基因序列见表10065定量实验所用实验材料实验用成体健康长牡蛎平均壳高90MM购于青岛胶南。实验前暂养于充气的过滤海水中，水温维持在181。POLYIC应激实验120只长牡蛎均分为两组，每组60只。实验组60只每只注射100LPOLYIC10MGML1INPBS，对照组60只每只注射100LPBS。在注射后0H，3H，。
26、6H，12H，24H，48H，72H，实验组与对照组每组分别随机抽取6只牡蛎，用无菌注射器抽取血淋巴后，800G离心10MIN收集血细胞，重悬于TRIZOL试剂中备RNA提取用。0066RNA提取方法用TRIZOL按照说明书的步骤提取血细胞总RNA。0067实施例20068经过荧光定量PCR评估候选内参基因表达稳定性根据候选基因序列设计出特异的引物对见表1，在POLYIC应激样品中进行荧光定量PCR，获得每个候选基因在各个应激时间点的表达数据即CT值THRESHOLDCYCLE，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。根据CT值，用内参筛选常用的GENORM软件计算出每个候选基因。
27、的稳定值，稳定值越小，代表基因表达越稳定。另外，GENORM软件通过成对变异系数VN/VN1的分析可以确定最适合管家基因的数目。VANDESOMPELE等建议把015设置为成对变异系数的阈值，高于015就需要再添加额外的管家基因一般认为选取3个内参基因对获取准确的定量数据已经足够。GENORM的具体算法及原理参见文献【VANDESOMPELEJ,DEPRETERK,PATTYNF,POPPEB,VANROYN,DEPAEPEA,SPELEMANF2002ACCURATENORMALIZATIONOFREALTIMEQUANTITATIVERTPCRDATABYGEOMETRICAVERAGIN。
28、GOFMULTIPLEINTERNALCONTROLGENESGENOMEBIOL37RESEARCH00341003411】。选出适合的内参基因，组合后作为基因定量的内参。其具体实施方案如下00691、实验材料实验用成体健康牡蛎平均壳高90MM购于青岛胶南。实验前暂养于充气的过滤海水中，水温维持在181。POLYIC应激实验120只牡蛎均分为两组，每组60只，实验组60只每只注射100LPOLYIC10MGML1INPBS，对照组60只每只注射100LPBS。在注射后0H，3H，6H，12H，24H，48H，72H，实验组与对照组每组分别随机抽取6只牡蛎，用无菌注射器抽取血淋巴后，800G离。
29、心10MIN收集血细胞，重悬于TRIZOL试剂中备RNA提取用。00702、RNA提取用TRIZOL按照说明书的步骤提取总RNA。00713、第一链CDNA的合成用PRIMESCRIPTTMRTREAGENTKITWITHGDNAERASERPERFECTREALTIME试剂盒，市购于TAKARA公司按照说明书将步骤2获得的总RNA反转成CDNA，作为荧光定量PCR模板。00721去除基因组DNA反应。按如下成分于冰上配制反应混合液，0073说明书CN104073557A6/8页8试剂使用量5GDNAERASERBUFFER20LGDNAERASER10LTOTALRNA1UGRNASEFRE。
30、EDH2OUPTO10L0074007542反应，2MIN，然后放置于4。00762反转录反应。按如下成分于冰上配制20L的反应体系0077试剂使用量步骤1的反应液100LPRIMESCRIPTRTENZYMEMIXI10LRTPRIMERMIX10L5PRIMESCRIPTBUFFER2FORREALTIME40LRNASEFREEDH2O40L007837反应15MIN，85，5SEC失活酶，4保存CDNA。需长期保存时，放于20。00794、引物设计根据所选内参基因序列用PRIMERPREMIER5软件设计出相应的特异性引物。设计好后交由上海桑尼公司合成。0080表1本发明所用的内参基因。
31、名称，缩写，基因ID和引物序列0081说明书CN104073557A7/8页900825、PCR反应在ABI7500FASTREALTIMEPCR仪荧光定量PCR仪，市购于ABI公司中进行。每个PCR反应做3个重复。反应结束后获得每个候选基因在不同时间点的CT值。按如下成分于冰上配制20L的PCR反应体系0083试剂使用量2SYBRGREENPCRMIXTAKARA100L10MM正向引物04L10MM反向引物04LROXREFERENCEDYEII04LCDNA步骤3获得20LDDH2OUPTO20L0084PCR扩增程序为95预变性2MIN；95，3SEC，60，30SEC，步循环40次；。
32、仪器自动制作溶解曲线。通过观察ABI7500FASTREALTIMEPCR仪在PCR反应后生成的溶解曲线为单一峰判定所用引物无非特异扩增；用2L的PCR产物在3的琼脂糖胶中150V电泳25MIN，观察到条带单一，从而进一步确定所用引物的特异扩增。00856、根据步骤5中获得的CT值见表2，用内参筛选常用的GENORM软件计算选出稳定值最小的两个管家基因ACTIN和GAPDH，但是成对变异系数分析显示两个内参基说明书CN104073557A8/8页10因不足以作为研究基因表达的内参，需要再添加额外的内参基因RS18。因此将这三个内参基因组合后作为POLYIC应激实验功能基因表达分析的基因定量内参。
33、。00867、长牡蛎基因ACTIN，GAPDH和RS18在长牡蛎POLYIC应激实验不同时间点取样样品中稳定表达即表达量变化小，能够在相对定量法实时荧光定量PCR中作为内参基因。同时使用三个稳定表达的内参基因作为内参；三个基因内参的表达量CT值为ACTIN，GAPDH和RS18基因在长牡蛎POLYIC应激实验不同时间点的表达量CT值的算术平均数，通过以上基因内参校正实验误差，能够提高实验的准确性。0087表2POLYIC刺激后不同时间点的内参基因定量CT值0088说明书CN104073557A101/10页1100010002序列表CN104073557A112/10页120003序列表CN104073557A123/10页130004序列表CN104073557A134/10页140005序列表CN104073557A145/10页150006序列表CN104073557A156/10页160007序列表CN104073557A167/10页170008序列表CN104073557A178/10页180009序列表CN104073557A189/10页190010序列表CN104073557A1910/10页20序列表CN104073557A201/1页21图1图2说明书附图CN104073557A21。