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1、10申请公布号CN104193819A43申请公布日20141210CN104193819A21申请号201410443759722申请日20140903C07K14/62200601C07K1/3020060171申请人韩飞地址150030黑龙江省哈尔滨市香坊区红旗大街104号翰林苑小区3单元1201申请人张京宏72发明人张京宏韩飞74专利代理机构哈尔滨市伟晨专利代理事务所普通合伙23209代理人张金珠54发明名称胰岛素二聚体晶体的合成和保存方法57摘要本发明公开了胰岛素二聚体晶体的合成和保存方法，它涉及一种胰岛素合成和保存方法。本发明要解决现有胰岛素二聚体的制取方法复杂、产率低、产物不稳定。
2、，保存时间短的技术问题。本发明合成以胰岛素六聚体为原料，与二肽在催化剂的作用下反应，再在由精氨酸、谷氨酸、L谷氨酰胺、L甲硫氨酸、L谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、2N吗啉乙磺酸、苯酚丙醇溶液配置的结晶液中进行结晶。保存方法将胰岛素二聚体晶体放在PH为668的结晶液中，在310下密闭的避光玻璃容器中保存。本发明制备的胰岛素二聚体为自然结构，无基因工程成分，副作用小，适用于对胰岛素类似物过敏者，保存时间可达一年以上。51INTCL权利要求书2页说明书6页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页附图1页10申请公布号CN10419381。
3、9ACN104193819A1/2页21胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于胰岛素二聚体晶体的合成方法是按下述步骤进行的步骤一、将精氨酸、谷氨酸、L谷氨酰胺、甲硫氨酸、L谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷、硫酸钠、2N吗啉乙磺酸、苯酚丙酮溶液加入去离子水中配置反应液，调节PH值5273；步骤二、将步骤一的反应液在1215下搅拌152H，加胰岛素六聚体水溶液，充分混匀后加入二肽水溶液，继续搅拌2H，再加入催化剂，再在1215条件下继续搅拌反应812小时，反应过程中搅拌速度始终保持在400600R/MIN，获得胰岛素二聚体溶液；步骤三、将精氨酸、谷氨酸、L谷氨酰胺、L甲硫氨酸、L谷胱甘。
4、肽、醋酸锌、柠檬酸钠三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、2N吗啉乙磺酸、苯酚丙醇溶液加入去离子水中配置结晶液，调节PH值5273，然后以600750R/MIN转速搅拌30NIN，按11体积比加入胰岛素二聚体溶液后室温下进行结晶，获得胰岛素二聚体晶体。2根据权利要求1所述胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于步骤一所述的反应液中精氨酸的浓度为0102MOL/L，谷氨酸的浓度为005MOL/L，L谷氨酰胺的浓度为005008MOL/L，甲硫氨酸的浓度为004MOL/L，L谷胱甘肽的浓度为003MOL/L，醋酸锌的浓度为8MMOL/L，柠檬酸钠的浓度为0035MOL/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为063110M。
5、OL/L，硫酸钠的浓度为06MOL/L，2N吗啉乙磺酸的浓度为01028MOL/L，苯酚丙酮溶液占反应液体积的7375，苯酚丙酮溶液的质量百分浓度为006。3根据权利要求1所述胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于步骤一调节PH值为6265。4根据权利要求1所述胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于步骤二中所述的胰岛素六聚体为R6态的胰岛素六聚体和/或T3R3态的胰岛素六聚体。5根据权利要求1所述胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于步骤二中胰岛素六聚体水溶液的浓度为32G/L，反应液与胰岛素六聚体水溶液的体积比为251。6根据权利要求1所述胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于二肽水溶液的浓。
6、度为01MOL/L，反应液与二肽水溶液的体积比为101。7根据权利要求1所述胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于步骤二中催化剂由精氨酸、脯氨酸和水组成，催化剂中精氨酸的浓度为5MOL/L，脯氨酸的浓度为5MOL/L，催化剂与二肽溶液体积比为12。8根据权利要求1所述胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于步骤三所述的结晶液中精氨酸的浓度为027045MOL/L，谷氨酸的浓度为04MOL/L，L谷氨酰胺的浓度为05MOL/L，甲硫氨酸的浓度为04053MOL/L，L谷胱甘肽的浓度为037045MOL/L，醋酸锌的浓度为1MOL/L，柠檬酸钠的浓度为1MOL/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为06311。
7、0MOL/L，氯化钠的浓度为5MOL/L，2N吗啉乙磺酸的浓度为01028MOL/L，苯酚丙醇溶液的质量百分比浓度为5，苯酚丙酮溶液占结晶液体积的7375，苯酚丙酮溶液的质量百分浓度为006。9根据权利要求1所述胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于步骤三采用悬滴法结晶。10胰岛素二聚体晶体的保存方法，其特征在于将胰岛素二聚体晶体放在PH为6权利要求书CN104193819A2/2页368的权利要求1或8所述的结晶液中，在310下密闭的避光玻璃容器中保存。权利要求书CN104193819A1/6页4胰岛素二聚体晶体的合成和保存方法技术领域0001本发明涉及一种胰岛素合成和保存方法。背景技术00。
8、02胰岛素作为一种重要的蛋白质，对其研究至今已有近一百年的历史。胰岛素本质为一种具有生物活性的蛋白质，通常以较为稳定的六聚体形式存在，被广泛用于糖尿病的治疗。0003目前的胰岛素制剂按作用时间可分为五大类，其中起效最为迅速的一类胰岛素属门冬胰岛素和赖脯胰岛素，起效时间15分钟左右。缺点是此类胰岛素药物均为胰岛素类似物，其结构与天然胰岛素存在差别，是用相应氨基酸取代原有氨基酸来达到快速起效的目的，不适用于对对应氨基酸或胰岛素类似物过敏的糖尿病患者，且人工合成的胰岛素类似物存在潜在副作用。0004具有自然结构的胰岛素作用时间最快也不低于半小时，相对起效速度较慢，影响糖尿病重患的最佳抢救时间。因在实。
9、际治疗过程中，胰岛素以六聚体形式保存在溶液中，以注射方式进入人体，但胰岛素六聚体在人体中首先被分解成二聚或三聚体，最后分解至单体才能发挥治疗作用。若病人血糖已处于危险水平而对上述胰岛素类似物过敏，则传统胰岛素起效慢易造成生命危险。0005可迅速起效的胰岛素二聚体发现已久，因结构具有高度不稳定性使其制取和保存都相对困难，至今未有成熟药品见于市场。0006目前，胰岛素二聚体主要处于研究阶段，而且现有实验室制取方法过于复杂，产率较低现有的产率一般是2030，产物因极度不稳定而无法保存较长时间。发明内容0007本发明要解决现有胰岛素二聚体存在制取方法复杂、产率低、产物不稳定，且保存时间短的技术问题；而。
10、提供了胰岛素二聚体晶体的合成和保存方法。0008本发明中胰岛素二聚体晶体的合成方法是按下述步骤进行的0009步骤一、将精氨酸、谷氨酸、L谷氨酰胺、甲硫氨酸、L谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷TRIS、硫酸钠、2N吗啉乙磺酸MES、苯酚丙酮溶液加入去离子水中配置反应液，调节PH值5273；0010步骤二、将所配置反应液在1215下搅拌152H，加胰岛素六聚体水溶液，充分混匀后加入二肽水溶液，继续搅拌2H，再加入催化剂，再在1215条件下继续搅拌反应812小时，反应过程中搅拌速度始终保持在400600R/MIN，获得胰岛素二聚体溶液；0011步骤三、将精氨酸、谷氨酸、L谷氨酰胺、L甲硫。
11、氨酸、L谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠三羟甲基氨基甲烷TRIS、氯化钠、2N吗啉乙磺酸MES、苯酚丙醇溶液加入去离子水中配置结晶液，调节PH值5273，然后搅拌30MIN，按11体积比加入胰岛素二聚体溶说明书CN104193819A2/6页5液后室温下进行结晶，或者采用悬滴法结晶，获得胰岛素二聚体晶体。0012步骤一所述的反应液中精氨酸的浓度为0102MOL/L，谷氨酸的浓度为005MOL/L，L谷氨酰胺的浓度为005008MOL/L，甲硫氨酸的浓度为004MOL/L，L谷胱甘肽的浓度为003MOL/L，醋酸锌的浓度为8MMOL/L，柠檬酸钠的浓度为0035MOL/L，三羟甲基氨基甲烷TRIS的浓。
12、度为063110MOL/L，硫酸钠的浓度为06MOL/L，2N吗啉乙磺酸MES的浓度为01028MOL/L，苯酚丙酮溶液苯酚丙酮溶液占反应液体积的7375，苯酚丙酮溶液的质量百分浓度为006。0013PH值小于52时酸性过强，与人体PH偏差过大，且产率低，无实用价值；在PH值在6265处产率达到峰值，随PH继续增大大于65后产率会降低，PH值大于73产率低，PH过高时ZN离子会继续与胰岛素配合，使溶液中胰岛素构型发生变化更倾向于六聚。PH的调节可用MES及TRIS的生物缓冲液调节，当PH值偏差过大时可用NAOH或者HCL溶液进行调节。0014步骤二中所述的胰岛素六聚体为R6态的胰岛素六聚体和/。
13、或T3R3态的胰岛素六聚体，构型稳定，适合作原料；当胰岛素六聚体为组合物时，按任意比组合。0015步骤二中胰岛素六聚体水溶液的浓度为32G/L，反应液与胰岛素六聚体水溶液的体积比为251。0016所述二肽水溶液浓度为01MOL/L，反应液与二肽的体积比为101。二肽可由苯丙氨酸与甘氨酸缩合反应制成的按现有方法制备即可。0017步骤二中催化剂催化剂由精氨酸、脯氨酸和水组成，催化剂中精氨酸的浓度为5MOL/L，脯氨酸的浓度为5MOL/L，催化剂与二肽溶液体积比为12，加入催化剂目的是稳定并防止蛋白质凝结。0018步骤三所述的结晶液中精氨酸的浓度为027045MOL/L、谷氨酸的浓度为04MOL/L。
14、，L谷氨酰胺的浓度为05MOL/L，甲硫氨酸的浓度为04053MOL/L，L谷胱甘肽的浓度为037045MOL/L，醋酸锌的浓度为1MOL/L，柠檬酸钠的浓度为1MOL/L，三羟甲基氨基甲烷TRIS的浓度为063110MOL/L，氯化钠的浓度为5MOL/L，2N吗啉乙磺酸MES的浓度为01028MOL/L，苯酚丙醇溶液的质量百分比浓度为5，苯酚丙酮溶液占结晶液体积的7375，苯酚丙酮溶液的质量百分浓度为006。0019本发明胰岛素二聚体晶体的保存方法将胰岛素二聚体晶体放在PH为668上述的结晶液中，在310下密闭的避光玻璃容器中保存。0020本专利发明了以六聚体胰岛素及相应氨基酸溶液为原料制取。
15、并保存稳定二聚体胰岛素结晶的技术，为其应用于快速胰岛素市场迈出了重要一步，并填补了具有天然结构的胰岛素见效慢这一空白。此方法为工业制取二聚胰岛素奠定了基础。本专利涉及的二聚体胰岛素制备及保存技术未来可作为一种新型快速类天然胰岛素药物应用于市场，且产物胰岛素二聚体为自然结构参见图1，无基因工程成分，副作用小，适用于对胰岛素类似物过敏者。本发明方法制备的胰岛素二聚体是无色颗粒状晶体，颗粒极细小，显微镜下侧呈立方晶体。0021胰岛素二聚体制剂给药方式是注射。0022本发明方法获得的胰岛素二聚体纯度较高，且保存方法稳定易行，货架期长，在一年以上，有利于药品的存放及使用。本发明方法制备条件稳定，工艺简单。
16、，能制备出稳定的说明书CN104193819A3/6页6二聚体胰岛素，产率较高，所用各类药品环保、无对人体有害物质。附图说明0023图1是二聚体胰岛素分子模型。具体实施方式0024具体实施方式一本实施方式中胰岛素二聚体晶体的合成方法是按下述步骤进行的0025步骤一、将精氨酸、谷氨酸、L谷氨酰胺、甲硫氨酸、L谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷TRIS、硫酸钠、2N吗啉乙磺酸MES、苯酚丙酮溶液加入去离子水中配置反应液，调节PH值；0026步骤二、将200ML所配置反应液在12下搅拌2H，加80ML浓度为32G/L的R6态的胰岛素六聚体水溶液用去离子水配制，充分混匀后加入20ML浓度为0。
17、1MOL/L二肽，继续搅拌2H，再加入10ML催化剂，再在12条件下继续搅拌反应12小时，反应过程中搅拌速度始终保持在300R/MIN采用磁力搅拌器搅拌，获得胰岛素二聚体溶液；0027所述催化剂由催化剂催化剂由精氨酸、脯氨酸和水组成，催化剂中精氨酸的浓度为5MOL/L，脯氨酸的浓度为5MOL/L，催化剂与二肽溶液体积比为12。0028步骤三、将精氨酸、谷氨酸、L谷氨酰胺、L甲硫氨酸、L谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠三羟甲基氨基甲烷TRIS、氯化钠、2N吗啉乙磺酸MES、苯酚丙醇溶液加入去离子水中配置结晶液，调节PH值，然后用600R/MIN转速磁力搅拌器搅拌30MIN，按11体积比加入胰岛素二聚体。
18、溶液后20下结晶，结晶过程需要1014天，获得胰岛素二聚体晶体。0029步骤一所述的反应液中精氨酸的浓度为01MOL/L，谷氨酸的浓度为005MOL/L，L谷氨酰胺的浓度为005MOL/L，甲硫氨酸的浓度为004MOL/L，L谷胱甘肽的浓度为003MOL/L，醋酸锌的浓度为8MMOL/L，柠檬酸钠的浓度为0035MOL/L，三羟甲基氨基甲烷TRIS的浓度为063MOL/L，硫酸钠的浓度为06MOL/L，2N吗啉乙磺酸MES的浓度为01MOL/L，苯酚丙酮溶液质量百分浓度006，苯酚丙酮溶液与反应液的体积比为1135。0030二肽合成方法为苯丙氨酸与甘氨酸缩合反应制成的二肽；双线合成，其一为苯丙。
19、氨酸PHE，其二为甘氨酸GLY。左线为PHE在碱性条件下加入BOC保护，GLY酸性条件下加入甲醇保护，二者保护后在DCC存在下混合反应形成肽键DCC为有机氧化剂。0031说明书CN104193819A4/6页70032步骤三所述的结晶液中精氨酸的浓度为027MOL/L、谷氨酸的浓度为04MOL/L，L谷氨酰胺的浓度为05MOL/L，甲硫氨酸的浓度为04MOL/L，L谷胱甘肽的浓度为037MOL/L，醋酸锌的浓度为1MOL/L，柠檬酸钠的浓度为1MOL/L，三羟甲基氨基甲烷TRIS的浓度为063MOL/L，氯化钠的浓度为5MOL/L，2N苯酚丙酮溶液与反应液的体积比为1135MES的浓度为01M。
20、OL/L，苯酚丙醇溶液的质量百分比浓度为5，苯酚丙酮溶液与结晶液的体积比为1135。0033产率的计算方法所得结晶质量除以步骤二所加胰岛素质量，不同PH值下产品产率如表10034表10035步骤一的PH值步骤三的PH值产率存放时间4239153751546882约一年62628670多于一年65688343多于一年说明书CN104193819A5/6页873755564多于一年808223600036保存若需长时间保存所得二聚体胰岛素，可将步骤2所得结晶前溶液调节于PH668，置于密封且透光性低的容器中，于略低于室温的温度保存。保存时间可达一年以上。0037所得晶体以X射线单晶衍射晶体分析后所。
21、得数据如表4。另取一组PH48，一组PH75的六聚体形式作为对比。在分析时所得晶体直接投入液氮中快速冷却，用于X射线单晶衍射分析，采用COOT及CCP4用于建模及分析所得数据，结果见表2。0038表2X射线衍射数据对比表003900400041能通过表2证明本实施方式获得产品为胰岛素二聚体，产品纯度高。所得二聚体胰岛素分子模型如图1。其中不同颜色代表不同种类氨基酸，由图1可知产物胰岛素二聚体为自然结构。本实施方式方法制备的胰岛素二聚体是无色颗粒状晶体，颗粒极细小，显微镜下呈立方晶形。0042具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中结晶液PH调为668，其他反应不变，产品在310。
22、下密闭的避光玻璃容器中保存。0043胰岛素二聚体保存时间长达1年以上。0044具体实施方式三本实施方式中胰岛素二聚体晶体的合成方法是按下述步骤进行的0045本实施方式中胰岛素二聚体晶体的合成方法是按下述步骤进行的0046步骤一、将精氨酸、谷氨酸、L谷氨酰胺、甲硫氨酸、L谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷TRIS、硫酸钠、2N吗啉乙磺酸MES、苯酚丙酮溶液加入去离子水中配置反应液，调节PH值；0047步骤二、将200ML所配置反应液在14下搅拌15H，加80ML浓度为32G/L的T3R3态的胰岛素六聚体水溶液，充分混匀后加入20ML浓度为01MOL/L二肽，继续搅拌2H，再加入10ML。
23、催化剂，再在14条件下继续搅拌反应12小时，反应过程中搅拌速度始终保持在说明书CN104193819A6/6页9600R/MIN采用磁力搅拌，获得胰岛素二聚体溶液；0048所述催化剂由精氨酸、脯氨酸和水组成，催化剂中精氨酸的浓度为5MOL/L，脯氨酸的浓度为5MOL/L，催化剂与二肽溶液体积比为12。0049步骤三、将精氨酸、谷氨酸、L谷氨酰胺、L甲硫氨酸、L谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠三羟甲基氨基甲烷TRIS、氯化钠、2N吗啉乙磺酸MES、苯酚丙醇溶液加入去离子水中配置结晶液，调节PH值，然后采用磁力搅拌器，转速750RPM搅拌30MIN，按11体积比加入胰岛素二聚体溶液后25下结晶，结晶过程。
24、需1014天，获得胰岛素二聚体晶体。0050步骤一所述的反应液中精氨酸的浓度为02MOL/L，谷氨酸的浓度为005MOL/L，L谷氨酰胺的浓度为008MOL/L，甲硫氨酸的浓度为004MOL/L，L谷胱甘肽的浓度为003MOL/L，醋酸锌的浓度为8MMOL/L，柠檬酸钠的浓度为0035MOL/L，三羟甲基氨基甲烷TRIS的浓度为110MOL/L，硫酸钠的浓度为06MOL/L，2N吗啉乙磺酸MES的浓度为028MOL/L、苯酚丙酮溶液的质量百分浓度为006，苯酚丙酮溶液与反应液的体积比为1135。0051步骤二中所述的胰岛素六聚体为R6态的胰岛素六聚体和/或T3R3态的胰岛素六聚体。0052步骤。
25、三所述的结晶液中精氨酸的浓度为045MOL/L、谷氨酸的浓度为04MOL/L，L谷氨酰胺的浓度为05MOL/L，甲硫氨酸的浓度为053MOL/L，L谷胱甘肽的浓度为045MOL/L，醋酸锌的浓度为1MOL/L，柠檬酸钠的浓度为1MOL/L，三羟甲基氨基甲烷TRIS的浓度为110MOL/L，氯化钠的浓度为5MOL/L，2N吗啉乙磺酸MES的浓度为028MOL/L，苯酚丙醇溶液的质量百分比浓度为5，苯酚丙酮溶液与结晶液的体积比为1135。0053本实施方式中产物胰岛素二聚体为自然结构。本实施方式方法制备的胰岛素二聚体是无色颗粒状晶体，颗粒极细小，显微镜下呈立方晶形,保存时间可达一年以上。说明书CN104193819A1/1页10图1说明书附图CN104193819A10。