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1、10申请公布号CN104073464A43申请公布日20141001CN104073464A21申请号201410321893X22申请日20140708C12N5/07120100171申请人西藏天虹科技股份有限责任公司地址850000西藏自治区拉萨市经济技术开发区B区拉青路72发明人张春颖74专利代理机构北京远大卓悦知识产权代理事务所普通合伙11369代理人史霞54发明名称一种CHO细胞无血清培养基及其制备方法57摘要本发明公开了一种CHO细胞无血清培养基及其制备方法，通过加入化学成分明确的多种氨基酸、维生素、无机盐、微量元素及生物碱、脂肪酸及激素等补充因子，使该培养基能使CHO细胞在悬浮。
2、培养条件下无需适应即可快速生长，细胞密度和细胞活性都可以与有血清培养基相当，既能满足CH0细胞培养需求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素，降低生产成本，可完全取代有血清培养基进行CHO细胞的大规模培养和生产。另外，通过采用粉末状保存的方式，可以有效规避产品运输风险，降低运输成本，满足对CHO细胞进行规模化培养生产的需求。51INTCL权利要求书2页说明书10页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书10页附图1页10申请公布号CN104073464ACN104073464A1/2页21一种CHO细胞无血清培养基，其特征在于，包括下列重量份的组分氨基酸。
3、组合物13002000；维生素组合物1225；无机盐组合物1015；微量元素组合物00050006；无菌水9001100。2如权利要求1所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述氨基酸组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种丙氨酸735315、精氨酸152132115、天冬酰胺402625048、半胱氨酸38264512、谷氨酸8143251、甘氨酸8143045、组氨酸304810598、异亮氨酸534113125、亮氨酸589416723、赖氨酸912519326、甲硫氨酸15266142、苯丙氨酸34128356、脯氨酸17343541、丝氨酸27319515、苏氨酸54169724。
4、、色氨酸8275241、酪氨酸572114513、缬氨酸532511831和谷氨酰胺58341124893；其中所述氨基酸均为L氨基酸。3如权利要求2所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述维生素组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种维生素B600102、维生素B12002042、维生素C910、维生素E030031、生物素04121、氯化胆碱00640072、D泛酸钙00040005、叶酸00620081、肌醇083143、烟酰胺017020、吡哆醇盐酸盐0001500017、核黄素006029、腐胺二酸盐000501000503、氢化可的松0001500018和吡哆醛HCL1019。
5、48。4如权利要求3所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述无机盐组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种碳酸氢钠24402451、氯化钠699550703120、氯化钾3128131390、氯化镁29653042、硫酸镁48854921、一水磷酸二氢钠62516253、磷酸氢二钠71037215、硫酸锌04310445、氯化钙1166011732、五水硫酸铜0001400016和七水硫酸铁00620071。5如权利要求4所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述微量元素组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种硝酸银0000100005、硫酸锰00000800008、硅酸钠00030。
6、012、钼酸铵000190018、钒酸铵00000700007、氯化镍000003000031、氯化锡000002000023、亚硒酸钠00000500005、六水氯化铝00000100001、硫酸钡00000100001、氯化铝00000100001、硫代甘油00000100001、四水氯化钛00000100001和八水氯化氧锆00000100001。6如权利要求5所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述培养基还包括10008000重量份的补充因子组合物，所述补充因子组合物由下列重量份的组分组成葡萄糖10007300；生物碱类物质组合物1750；大分子糖类物质组合物121；激素类物质组。
7、合物0084049；权利要求书CN104073464A2/2页3脂肪酸类物质组合物014116。7如权利要求6所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述补充因子组合物中的生物碱类物质组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种腺嘌呤243989、次黄嘌呤213856、鸟嘌呤385816、尿嘌呤4371000、胸腺嘌呤021237、胞嘧啶4851000、乙醇胺1241234和腐胺00800832。8如权利要求7所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述补充因子组合物中的大分子糖类物质组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种核糖092957和脱氧核糖0101032；所述补充因子组合物中的脂肪酸。
8、类物质包括下列重量份的组分中的一种或几种硫辛酸010110和亚油酸00420053；此外所述补充因子组合物中还包括032212重量份的B硫基乙醇。9如权利要求8所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述补充因子组合物中的激素类物质包括下列重量份的组分中的一种或几种丙酮酸钠2200023000、氢化可的松0037039、地塞米松003900393、孕酮00060032和雌二醇000280028。10一种CHO细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于，所述CHO细胞无血清培养基也可制为粉末状培养基，包括以下步骤步骤一、按配方量称取所述CHO细胞无血清培养基中的各组分并混合；步骤二、研磨；步骤三、。
9、高温灭菌；步骤四、无菌分装。权利要求书CN104073464A1/10页4一种CHO细胞无血清培养基及其制备方法技术领域0001本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种CHO细胞无血清培养基及其制备方法。背景技术0002传统的含血清培养基中的血清给科研和生产等带来多种不利因素。血清的主要作用在于给细胞提供生长增值所需的激素、生长因子、转移蛋白和其他营养物质，但其存在很多缺点批间差异较大、需要大量验证工作、使用不方便、成分不明确、有抑制生长的成分、尤其不利于疫苗和单克隆抗体等目的产物的分离纯化、容易被病毒和支原体感染；血清昂贵可能发生供应紧张，血清的来源不稳定等问题。0003近年来，国内开始针对CH。
10、O细胞无血清培养开发了许多无血清培养基产品，但是大多数均为了保证细胞的活性，在已有DMEM，DMEM/F12，IMDM等基础培养基的基础上添加了不同来源的蛋白质等添加剂，由于成分复杂，蛋白质及其水解产物会在细胞培养过程中带来污染，影响下游分离纯化，目的产物表达量降低。0004国外商品化的CHO细胞无血清培养基存在如下现状大多以液体的形式提供，不适合大规模生产、价格昂贵、培养基成分配方不确定，SIGMA、INVITROGEN、HYCLONE和LONZA等国际知名培养基，每升价格高达上千元，在一定程度上限制了它的实际应用。发明内容0005本发明的目的是提供一种CHO细胞无血清培养基及其制备方法，通。
11、过加入化学成分明确的多种氨基酸、维生素、无机盐、微量元素及生物碱、脂肪酸及激素等补充因子，使该培养基能使CHO细胞在悬浮培养条件下无需适应即可快速生长，细胞密度和细胞活性都可以与有血清培养基相当，既能满足CHO细胞培养需求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素，降低生产成本，可完全取代有血清培养基进行CHO细胞的大规模培养和生产。另外，通过采用粉末状保存的方式，可以有效规避产品运输风险，降低运输成本，满足对CHO细胞进行规模化培养生产的需求。0006本发明的技术方案为0007一种CHO细胞无血清培养基，其中，包括下列重量份的组分0008氨基酸组合物13002000；0009维生素组合物12。
12、25；0010无机盐组合物1015；0011微量元素组合物00050006；0012无菌水9001100。0013优选的是，所述的CHO细胞无血清培养基中，所述氨基酸组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种0014丙氨酸735315、精氨酸152132115、天冬酰胺402625048、半胱氨酸38264512、谷氨酸8143251、甘氨酸8143045、组氨酸304810598、异亮氨酸说明书CN104073464A2/10页5534113125、亮氨酸589416723、赖氨酸912519326、甲硫氨酸15266142、苯丙氨酸34128356、脯氨酸17343541、丝氨酸273195。
13、15、苏氨酸54169724、色氨酸8275241、酪氨酸572114513、缬氨酸532511831和谷氨酰胺58341124893；0015其中所述氨基酸均为L氨基酸。0016优选的是，所述的CHO细胞无血清培养基中，所述维生素组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种0017维生素B600102、维生素B12002042、维生素C910、维生素E030031、生物素04121、氯化胆碱00640072、D泛酸钙00040005、叶酸00620081、肌醇083143、烟酰胺017020、吡哆醇盐酸盐0001500017、核黄素006029、腐胺二酸盐000501000503、氢化可的松00。
14、01500018和吡哆醛HCL101948。0018优选的是，所述的CHO细胞无血清培养基中，所述无机盐组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种0019碳酸氢钠24402451、氯化钠699550703120、氯化钾3128131390、氯化镁29653042、硫酸镁48854921、一水磷酸二氢钠62516253、磷酸氢二钠71037215、硫酸锌04310445、氯化钙1166011732、五水硫酸铜0001400016和七水硫酸铁00620071。0020优选的是，所述的CHO细胞无血清培养基中，所述微量元素组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种0021硝酸银0000100005、硫酸。
15、锰00000800008、硅酸钠00030012、钼酸铵000190018、钒酸铵00000700007、氯化镍000003000031、氯化锡000002000023、亚硒酸钠00000500005、六水氯化铝00000100001、硫酸钡00000100001、氯化铝00000100001、硫代甘油00000100001、四水氯化钛00000100001和八水氯化氧锆00000100001。0022优选的是，所述的CHO细胞无血清培养基中，所述培养基还包括10008000重量份的补充因子组合物，所述补充因子组合物由下列重量份的组分组成0023葡萄糖10007300；0024生物碱类物质组合。
16、物1750；0025大分子糖类物质组合物121；0026激素类物质组合物0084049；0027脂肪酸类物质组合物014116。0028优选的是，所述的CHO细胞无血清培养基中，所述补充因子组合物中的生物碱类物质组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种腺嘌呤243989、次黄嘌呤213856、鸟嘌呤385816、尿嘌呤4371000、胸腺嘌呤021237、胞嘧啶4851000、乙醇胺1241234和腐胺00800832。0029优选的是，所述的CHO细胞无血清培养基中，0030所述补充因子组合物中的大分子糖类物质组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种核糖092957和脱氧核糖0101032；。
17、0031所述补充因子组合物中的脂肪酸类物质包括下列重量份的组分中的一种或几种硫辛酸010110和亚油酸00420053；说明书CN104073464A3/10页60032此外所述补充因子组合物中还包括032212重量份的B硫基乙醇。0033优选的是，所述的CHO细胞无血清培养基中，所述补充因子组合物中的激素类物质包括下列重量份的组分中的一种或几种丙酮酸钠2200023000、氢化可的松0037039、地塞米松003900393、孕酮00060032和雌二醇000280028。0034一种CHO细胞无血清培养基的制备方法，其中，所述CHO细胞无血清培养基也可制为粉末状培养基，包括以下步骤0035。
18、步骤一、按配方量称取所述CHO细胞无血清培养基中的各组分并混合；0036步骤二、研磨；0037步骤三、高温灭菌；0038步骤四、无菌分装。0039本发明具有以下有益效果通过加入化学成分明确的多种氨基酸、维生素、无机盐、微量元素及生物碱、脂肪酸及激素等补充因子，使该培养基能使CHO细胞在悬浮培养条件下无需适应即可快速生长，通过对比试验检验，细胞密度和细胞活性都可以与有血清培养基相当，并优于国外商品化的CHO细胞无血清培养基，本发明既能满足CHO细胞培养需求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素，降低生产成本，可完全取代有血清培养基进行CHO细胞的大规模培养和生产。另外，通过采用粉末状保存的方。
19、式，可以有效规避产品运输风险，降低运输成本，满足对CHO细胞进行规模化培养生产的需求。附图说明0040图1为所述的CHO细胞无血清培养基制备工艺流程图；0041图2为CHO细胞在本发明所述的CHO细胞无血清培养基和GIBCO公司的CDCHO培养基中生长曲线图。具体实施方式0042下面结合附图对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。0043如图1所示，一种CHO细胞无血清培养基，由下列重量份组分制备而成0044氨基酸组合物13002000；0045维生素组合物1225；0046无机盐组合物1015；0047微量元素组合物00050006；0048无菌水9001100。
20、。0049所述的CHO细胞无血清培养基中，所述氨基酸组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种0050丙氨酸735315、精氨酸152132115、天冬酰胺402625048、半胱氨酸38264512、谷氨酸8143251、甘氨酸8143045、组氨酸304810598、异亮氨酸534113125、亮氨酸589416723、赖氨酸912519326、甲硫氨酸15266142、苯丙氨酸34128356、脯氨酸17343541、丝氨酸27319515、苏氨酸54169724、色氨酸8275241、酪氨酸572114513、缬氨酸532511831和谷氨酰胺58341124893；说明书CN10407。
21、3464A4/10页70051其中所述氨基酸均为L氨基酸。0052所述的CHO细胞无血清培养基中，所述维生素组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种0053维生素B600102、维生素B12002042、维生素C910、维生素E030031、生物素04121、氯化胆碱00640072、D泛酸钙00040005、叶酸00620081、肌醇083143、烟酰胺017020、吡哆醇盐酸盐0001500017、核黄素006029、腐胺二酸盐000501000503、氢化可的松0001500018和吡哆醛HCL101948。0054所述的CHO细胞无血清培养基中，所述无机盐组合物包括下列重量份的组分中的。
22、一种或几种0055碳酸氢钠24402451、氯化钠699550703120、氯化钾3128131390、氯化镁29653042、硫酸镁48854921、一水磷酸二氢钠62516253、磷酸氢二钠71037215、硫酸锌04310445、氯化钙1166011732、五水硫酸铜0001400016和七水硫酸铁00620071。0056所述的CHO细胞无血清培养基中，所述微量元素组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种0057硝酸银0000100005、硫酸锰00000800008、硅酸钠00030012、钼酸铵000190018、钒酸铵00000700007、氯化镍000003000031、氯化锡。
23、000002000023、亚硒酸钠00000500005、六水氯化铝00000100001、硫酸钡00000100001、氯化铝00000100001、硫代甘油00000100001、四水氯化钛00000100001和八水氯化氧锆00000100001。0058所述的CHO细胞无血清培养基中，所述培养基还包括10008000重量份的补充因子组合物，所述补充因子组合物由下列重量份的组分组成0059葡萄糖10007300；0060生物碱类物质组合物1750；0061大分子糖类物质组合物121；0062激素类物质组合物0084049；0063脂肪酸类物质组合物014116。0064所述的CHO细胞无。
24、血清培养基中，所述补充因子组合物中的生物碱类物质组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种腺嘌呤243989、次黄嘌呤213856、鸟嘌呤385816、尿嘌呤4371000、胸腺嘌呤021237、胞嘧啶4851000、乙醇胺1241234和腐胺00800832。0065所述的CHO细胞无血清培养基中，所述补充因子组合物中的大分子糖类物质组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种核糖092957和脱氧核糖0101032；所述补充因子组合物中的脂肪酸类物质包括下列重量份的组分中的一种或几种硫辛酸010110和亚油酸00420053；此外所述补充因子组合物中还包括032212重量份的B硫基乙醇。0066。
25、所述的CHO细胞无血清培养基中，所述补充因子组合物中的激素类物质包括下列重量份的组分中的一种或几种丙酮酸钠2200023000、氢化可的松0037039、地塞米松003900393、孕酮00060032和雌二醇000280028。说明书CN104073464A5/10页80067按配方量称取所述CHO细胞无血清培养基中的各组分，与95105ML无菌水混合溶解，调节PH值为7080后定容至1000ML，用孔径为0305M的微孔滤膜过滤除菌即可。0068一种CHO细胞无血清培养基的制备方法，其中，所述CHO细胞无血清培养基也可制为粉末状培养基，包括以下步骤0069步骤一、按配方量称取所述CHO细胞。
26、无血清培养基中的各组分并混合均匀；0070步骤二、进行充分的研磨，研磨至100200目筛；0071步骤三、高温灭菌，本发明采用高压蒸汽湿热灭菌方法，灭菌温度126132，蒸汽压力00440049MPA，灭菌时间37MIN。0072步骤四、无菌分装，采用无菌操作进行一定剂量的分装并密封。0073使用时仅需按照配方量将粉末状的CHO细胞无血清培养基溶解于无热源无菌水即可制备而成。0074所述CHO细胞全称为中国仓鼠卵巢细胞，所述CHO细胞无血清培养基是在参考现有的文献基础上经过大量实验验证而设计出的培养基配方，通过选择适当的微量元素和氨基酸代替血清蛋白成分，应用PLACKETTBURMAN实验设计。
27、，对培养基添加成分进行了评价，采用响应面分析法优化各个组分的最佳使用剂量得到所述的CHO细胞无血清培养基，其中所述的主要成分的作用分别为00751氨基酸为蛋白合成的前体和合成其他生物大分子的中间体，是细胞提供的必要营养成分；00762维生素是细胞组成成分，细胞的代谢活动，离开维生素都无法进行，因此它是必须的；00773无机盐起到调节渗透压的作用；00784微量元素主要起调节、传递和控制的作用。0079本发明可用于CHO细胞传代培养和高密度连续灌注悬浮培养，具有以下优点00801无任何含血清添加物，化学成分确定，便于配置、储存；00812无需适应即可支持CHO细胞生长、维持活力时间长，在产物表达。
28、方面与血清培养基接近或相当；00823支持细胞长期传代培养；00834所有化学结构已知，有利于产物的分离纯化，提高产品的品质；00845成分均为小分子物质，成本低，适合大规模工业化生产。0085实施例10086按照下列配方称取个组分，本发明所有原料采购SIGMA细胞培养级的原料，并按照相关要求储存。0087L氨基酸的组分和用量0088组分用量单位MG/KG丙氨酸1026说明书CN104073464A6/10页9精氨酸15582天冬酰胺24732半胱氨酸3826谷氨酸816甘氨酸816组氨酸3250异亮氨酸13125亮氨酸16523赖氨酸19026甲硫氨酸6042苯丙氨酸8356脯氨酸3535丝。
29、氨酸9215苏氨酸9524色氨酸5141酪氨酸142130089缬氨酸11231谷氨酰胺1248930090维生素的组分和用量0091组分用量单位MG/KG维生素B602维生素B12042维生素C10说明书CN104073464A7/10页10维生素E031生物素121氯化胆碱0072D泛酸钙0005叶酸0080肌醇141烟酰胺020吡哆醇盐酸盐00016核黄素008腐胺二酸盐000503氢化可的松00017吡哆醛HCL9450092无机盐的组分和用量0093组分用量单位MG/KG碳酸氢钠2451氯化钠6731200094氯化钾31390氯化镁3042硫酸镁4920一水磷酸二氢钠6252磷酸氢。
30、二钠7215硫酸锌0445氯化钙11730说明书CN104073464A108/10页11五水硫酸铜00016七水硫酸铁00710095微量元素的组分和用量0096组分用量单位MG/KG硝酸银00004硫酸锰00008硅酸钠0012钼酸铵0018钒酸铵00006氯化镍000005氯化锡000004亚硒酸钠000004六水氯化铝000004硫酸钡000001氯化铝000001硫代甘油000001四水氯化钛0000010097八水氯化氧锆0000010098补充因子的组分和用量0099组分用量单位MG/KG葡萄糖7000腺嘌呤989次黄嘌呤852说明书CN104073464A119/10页12鸟嘌。
31、呤810尿嘌呤1000胸腺嘌呤237胞嘧啶1000核糖950脱氧核糖1030硫辛酸110亚油酸0052腐胺0832丙酮酸钠23000氢化可的松0039地塞米松0039孕酮0010雌二醇002乙醇胺1234B硫基乙醇2100100将以上组分加入100ML无菌水溶解并混匀，用HCL或NAOH调节PH达到75定容1000ML，用032M微孔滤膜过滤除菌，无菌保存。0101采用本发明所述CHO细胞无血清培养基通过以下方法进行CHO细胞培养并计数0102将已构建的一株ANTIEGFRCHO细胞按常规方法无血清悬浮复苏细胞到T25方瓶，细胞长成致密单层后离心、重悬无血清基础培养基传代培养，传代至少3代以上。
32、，待细胞至对数生长期后逐级扩增至250ML三角瓶，当细胞密度达到4106CELLS/ML，体积40ML时，取相同数量细胞，按照细胞密度1106CELLS/ML，体积40ML，离心、重悬接种250ML三角瓶，将所有三角瓶置于含6的CO2的摇床中37、转速为120RPM振荡培养，每天取样计数，按规定流加，待细胞活率低于80，收获细胞液。一次性接种细胞至培养基，培养数天，每天取样计数，并用台盼蓝染色计算细胞活率。0103与国外公司的培养基新型细胞培养比较0104按照上述的方法驯化ANTIEGFRCHO到GIBCOCDCHO培养基中，取各自驯化好的细胞株，将ANTIEGFRCHO细胞每毫升的密度接种至。
33、含有150ML的250ML三角瓶中；将所有说明书CN104073464A1210/10页13三角瓶置于含6的CO2的摇床中37、转速为120RPM振荡培养，每天取样计数细胞，并用台盼蓝染色计算细胞活率。0105如图2所示，上、下两条曲线分别为本发明所述CHO细胞无血清培养基培养的CHO细胞的生长曲线，处于下方的曲线为GIBCO公司的CDCHO培养基培养中的CHO细胞的生长曲线，处于上方的曲线为本发明的CHO细胞无血清培养基中的CHO细胞的生长曲线，整个培养过程持续9天，培养第4天，本发明的CHO细胞无血清培养基与GIBCO公司的CDCHO培养基中活细胞密度分别达到432106CELLS/ML和31106CELLS/ML，ANTIEGFRCHO在本发明所述的CHO细胞无血清培养基中生长情况优于在国外进口培养基中的生长情况。0106尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。说明书CN104073464A131/1页14图1图2说明书附图CN104073464A14。