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1、10申请公布号CN104073510A43申请公布日20141001CN104073510A21申请号201310101480622申请日20130327C12N15/81200601C12N1/19200601C12N9/20200601C12R1/8420060171申请人清华大学地址100084北京市海淀区北京100084信箱82分箱清华大学专利办公室72发明人印铁刘德华欧先金杜伟74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅54发明名称一种制备耐热脂肪酶的方法及其专用表达载体57摘要本发明公开了一种制备耐热脂肪酶的方法及其专用表达载体。本发明提供了一种重组载体，为将脂。
2、肪酶BTL2编码基因插入毕赤酵母表达载体中，得到的表达脂肪酶重组载体；所述脂肪酶BTL2的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，本发明通过毕赤酵母异源蛋白表达系统胞外分泌获得脂肪酶，使获取方法更加简单、降低该酶的生产成本，在耐热脂肪酶的生产中具有广阔的工业前景。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表6页10申请公布号CN104073510ACN104073510A1/1页21一种重组载体，为将脂肪酶BTL2编码基因插入毕赤酵母表达载体中，得到的表达脂肪酶重组载体；所述脂肪酶BTL2编码基因的核苷酸。
3、序列为序列表中的序列1。2根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于所述毕赤酵母表达载体为PPICZ。3一种重组菌，为将权利要求1或2所述重组载体导入毕赤酵母菌中得到的重组菌。4权利要求1或2所述的重组载体或权利要求3所述的重组菌在制备脂肪酶中的应用。5根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述脂肪酶具有如下1）和/或2）所示的特征1）胞外分泌；2）耐热。6一种制备脂肪酶的方法，包括如下步骤发酵权利要求3所述的重组菌，收集发酵产物的上清液，得到脂肪酶。7根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述发酵按照如下步骤进行1）将权利要求3所述的重组菌在发酵培养基中培养，在培养过程中流加补料；2）向1）培养得。
4、到的发酵体系中流加甲醇溶液诱导培养；所述补料为含12ML/LPTM1的质量百分含量为50甘油水溶液；每1L的PTM1按照如下方法制备6GCUSO45H2O、008GNAI、3GMNSO4H2O、02GNAMOO42H2O、002G硼酸、05GCOCL、20GZNCL2、65GFESO47H2O、02G生物素、50MLH2SO4，用水定容到1L；所述甲醇溶液为含有12ML/LPTM1的甲醇溶液。8根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤1）中，所述培养的PH值为50，所述培养的溶氧量为20；所述培养时间为305H；所述流加补料为在所述培养开始24H后，流加补料4H；步骤2）中，所述诱导培养的PH。
5、值为60，所述诱导培养的溶氧量为20；所述诱导培养的时间为100H，自步骤1）的培养开始记作第0H；所述流加甲醇溶液为待步骤1）培养305H后流加所述甲醇溶液，使甲醇在发酵体系的终浓度控制在0205（体积百分含量）。9根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于每1L所述发酵培养基按照如下方式制备267ML85磷酸、093GCASO4、182GK2SO4、149GMGSO47H2O、413GKOH、40G甘油、35MLPTM1，用水定容到1L。10由权利要求69所述的方法制备的脂肪酶；所述脂肪酶具体具有如下1）和/或2）所示的特征1）胞外分泌；2）耐热。权利要求书CN104073510A1/5页3。
6、一种制备耐热脂肪酶的方法及其专用表达载体技术领域0001本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种制备耐热脂肪酶的方法及其专用表达载体。背景技术0002脂肪酶是一种羧酸酯酶，能够在油水界面催化长链甘油三酯的水解和合成反应。许多脂肪酶具有高度的化学选择性、区域选择性、底物选择性和立体选择性，能够在常温常压下反应，反应条件温和，转化率高，不易产生副产物，因此脂肪酶在食品加工、手性化合物合成、环境治理、生物柴油合成等工业方面有着广泛的应用。脂肪酶的来源包括动物、植物和微生物。相对于动植物脂肪酶，微生物脂肪酶具有更广的作用PH值，作用温度范围和底物特异性，是工业用脂肪酶的重要来源。脂肪酶BTL2的编码基因B。
7、TL2克隆自一种极端耐热的细菌嗜热链状芽孢杆菌（BACILLUSTHERMOCATENULATUS），该酶具有较高的温度稳定性，广泛的PH稳定性且在多种有机溶剂中保持酶活稳定，在工业领域特别是生物柴油工业中具有巨大的应用价值。0003毕赤酵母异源蛋白表达系统是近年来应用得比较多的酵母蛋白表达系统，该系统被认为是表达外源蛋白的理想系统，具有很高的商业应用价值。这个系统的优点有以下几个方面毕赤酵母表达系统具有AOX1强启动子，可以有效调控外源蛋白的表达；毕赤酵母的分子生物学背景清晰，遗传操作简单；该菌体比较容易实现高细胞密度培养，有利于发酵生产。这些优点使得毕赤酵母表达系统成为被广泛利用的外源基因。
8、表达系统，表达不同的蛋白质。0004目前，已经有在大肠杆菌中表达嗜热链状芽孢杆菌脂肪酶BTL2的报道，虽然目的产物的表达量比较高，但表达产物主要集中在细胞内，需要进行后续的分离纯化，提高了成本。发明内容0005本发明的一个目的是提供一种重组载体。0006本发明提供的重组载体，为将脂肪酶BTL2编码基因插入毕赤酵母表达载体中，得到的表达脂肪酶重组载体；0007所述脂肪酶BTL2编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。0008上述重组载体中，所述毕赤酵母表达载体为PPICZ。0009本发明的另一个目的是提供一种重组菌。0010本发明提供的重组菌，为将上述重组载体导入毕赤酵母菌中得到的重组菌。001。
9、1在本发明的实施例中，毕赤酵母菌具体为毕赤酵母X33。0012上述的重组载体或上述的重组菌在制备脂肪酶中的应用也是本发明保护的范围。0013上述应用中，所述脂肪酶具有如下1）和/或2）所示的特征1）胞外分泌；2）耐热。说明书CN104073510A2/5页40014本发明的第三个目的是提供一种制备脂肪酶的方法。0015本发明提供的方法，包括如下步骤发酵上述的重组菌，收集发酵产物的上清液，得到脂肪酶。0016上述方法中，所述发酵按照如下步骤进行00171）将上述的重组菌在发酵培养基中培养，在培养过程中流加补料；00182）向1）培养得到的发酵体系中流加甲醇溶液诱导培养；0019所述补料为含12M。
10、L/LPTM1的质量百分含量为50甘油水溶液；0020每1L的PTM1按照如下方法制备6GCUSO45H2O、008GNAI、3GMNSO4H2O、02GNAMOO42H2O、002G硼酸、05GCOCL、20GZNCL2、65GFESO47H2O、02G生物素、50MLH2SO4，用水定容到1L；0021所述甲醇溶液为含有12ML/LPTM1的甲醇溶液。0022上述方法中，步骤1）中，所述培养的PH值为50，所述培养的溶氧量为20；所述培养时间为305H；所述流加补料为在所述培养开始24H后，流加补料4H；0023步骤2）中，所述诱导培养的PH值为60，所述诱导培养的溶氧量为20；所述诱导培。
11、养的时间为100H，自步骤1）的培养开始记作第0H（请核实）；0024所述流加甲醇溶液为待步骤1）培养305H后流加所述甲醇溶液，使甲醇在发酵体系的终浓度控制在0205（体积百分含量）。0025上述方法中，每1L所述发酵培养基按照如下方式制备267ML85磷酸、093GCASO4、182GK2SO4、149GMGSO47H2O、413GKOH、40G甘油、35MLPTM1，用水定容到1L。0026由上述的方法制备的脂肪酶也是本发明保护的范围；所述脂肪酶具体具有如下1）和/或2）所示的特征1）胞外分泌；2）耐热。0027本发明的实验证明，本发明将优化后的脂肪酶编码基因BTL2利用基因克隆技术，成。
12、功构建了毕赤酵母表达载体PPICZBTL2，利用电穿孔转化技术，得到多拷贝的重组毕赤酵母菌，将重组毕赤酵母菌在5升发酵罐内经过甲醇诱导100小时，细胞密度OD600可以达到350，脂肪酶的分泌量达到300MG/L培养液，酶活达到1000U/ML。经过检测，该脂肪酶最适反应温度为60，在50保温处理30分钟后，酶活可以保持90以上。在PH6570范围内酶活保持稳定。因此，本发明通过毕赤酵母异源蛋白表达系统胞外分泌获得脂肪酶，使获取方法更加简单、降低该酶的生产成本，在耐热脂肪酶的生产中具有广阔的工业前景。具体实施方式0028下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。0029下述实施例。
13、中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。0030以下实施方式用来说明本发明，但不限制本发明的范围0031实施例1、重组毕赤酵母表达载体PPICZBTL2的构建0032将BTL2基因的序列进行优化，根据优化后的BTL2基因（优化后BTL2基因的核苷酸序列作为序列表中的序列1；编码的蛋白BTL2的氨基酸序列为序列表中序列2）以及毕赤酵母表达质粒PPICZ上多克隆位点的特征，设计合成以下两条引物PB1FW5TTTGAATTCGCTGCTTCTCCAAGAGC3（序列3）；PB2REV5AAAGGTACCTGGTCTCAAAGAA说明书CN104073510A3/5页5GCCAA3（序。
14、列4）。PB1、PB2两端分别设计了ECORI和KPNI酶切位点，以小写字体表示。0033以人工合成的序列1所示的BTL2基因为模板，用PB1、PB2为引物,通过PCR方法扩增出BTL2基因。PCR条件预变性955分钟；再进行30个循环的95变性30秒，58退火1分钟，72延伸1分钟；最后72延伸10分钟。0034得到大小约12KB扩增产物；将扩增产物切胶回收后连接到PMD19TSIMPLE载体上，得到重组载体，将重组载体进行ECORI和KPNI双酶切验证（得到1200BP的为阳性）和测序验证（重组载体为将序列表中的序列1插入PMD19TSIMPLE载体的ECORI和KPNI酶切位点间得到的载。
15、体），将验证正确的重组载体命名为PMD19TSIMPLEBTL2。0035分别将PMD19TSIMPLEBTL2和酵母表达载体PPICZ（INVITROGEN,USA,V19520）进行ECORI和KPNI双酶切；回收1200BP的BTL2基因片段和3600BP的PPICZ载体骨架；连接上述BTL2基因片段和PPICZ载体骨架，得到重组表达载体；将重组表达载体用ECORI和KPNI双酶切验证，得到阳性重组表达载体1200KB小片段和3600BP大片段；将阳性重组表达载体进行测序分析，结果该阳性重组表达载体为将序列表中的序列1所示的BTL2基因插入PPICZ载体的ECORI和KPNI双酶切位点间。
16、得到的载体，命名为PPICZBTL2，为重组毕赤酵母表达载体。0036实施例2、耐热脂肪酶的制备00371、重组毕赤酵母的制备0038将实施例1得到的重组毕赤酵母表达载体PPICZBTL2经SACI酶切线性化后，电击法转化毕赤酵母X33（INVITROGEN,USA,C188000）菌株，将转化得到的菌液涂布于含有100G/MLZEOCIN的YPD平板上，30培养至发生同源重组的转化子的菌落长出，随机挑取40个转化子，转接到含有2000G/MLZEOCIN的YPD平板上。0039提取转化子的质粒，送去测序，该质粒为PPICZBTL2，将含有该质粒的转化子命名为X33PPICZBTL2，即为重组。
17、毕赤酵母。0040采用同样的方法将空载体PPICZ转入毕赤酵母X33中，得到X33PPICZ。00412、重组毕赤酵母的诱导表达0042挑取重组毕赤酵母X33PPICZBTL2，接种于25MLBMGY培养基（1酵母提取物、2蛋白胨、100MM磷酸钾PH60、1YNB（YEASTNITROGENBASE）、1甘油、4105生物素），30，200RPM摇床培养至OD600为20左右，离心收集菌体，转接到100MLBMMY培养基（BMGY培养基中的甘油换成05甲醇），继续培养，每24小时取样1ML,并补加甲醇至终浓度05，诱导表达7天，离心收集上清液，得到粗酶液（X33PPICZBTL2）。以X33。
18、PPICZ和X33为对照。0043将粗酶液（X33PPICZBTL2）经SDSPAGE电泳检测，得到分子量38KD的目的蛋白条带，与脂肪酶BTL2理论分子量相同。0044X33PPICZ和X33采用同样的方法诱导培养，离心收集上清液，经过SDSPAGE电泳检测，均未得到分子量38KD的目的蛋白条带，说明均没有产生脂肪酶。0045以三丁酸甘油酯为底物，检测重组毕赤酵母X33PPICZBTL2得到的粗酶液的脂肪酶酶活，检测方法如下0046取4MLPH80、浓度为200MMTRISHCL缓冲液于带塞三角瓶中，加入1ML三丁酸甘油酯，于50，200RPM摇床预热5分钟，加入01ML粗酶液，50，200。
19、RPM摇床震荡反应说明书CN104073510A4/5页65分钟，立即取出加入20ML无水乙醇终止反应，加入4滴酚酞指示剂，用01MNAOH溶液滴定。空白实验在加入酶样品后立即加入20ML无水乙醇终止反应。酶活计算公式如下00470048其中0049V1待测组消耗的NAOH溶液的体积0050V2空白实验所消耗的NAOH溶液的体积0051CNAOH溶液的浓度，MMOL/L0052M酶液的体积，ML0053T反应时间，MIN。0054X33PPICZBTL2的酶活为100U/ML（上清液）。0055采用同样的方法检测X33PPICZ和X33诱导培养，离心收集的上清液，结果均没有酶活。0056说明重。
20、组毕赤酵母可以产生脂肪酶。00573、发酵培养重组毕赤酵母X33PPICZBTL2生产耐热脂肪酶00581）培养基0059种子培养基BMGY1酵母提取物，2蛋白胨，100MM磷酸钾PH60,1YNB（YEASTNITROGENBASE），1甘油，4105生物素00601L发酵培养基按照如下方法制备267ML85磷酸、093GCASO4、182GK2SO4、149GMGSO47H2O、413GKOH、40G甘油、35MLPTM1，用水定容到1000ML。0061补料含12ML/LPTM1的50（质量百分含量）甘油水溶液（将PTM1与50（质量百分含量）甘油水溶液混匀得到混合液，PTM1在混合液中。
21、的终浓度为12ML/L。）0062诱导物为甲醇溶液为PTM1与100甲醇混合，使PTM1在甲醇溶液的浓度为12ML/L。0063PTM1按照如下方法制备6GCUSO45H2O、008GNAI、3GMNSO4H2O、02GNAMOO42H2O、002G硼酸、05GCOCL、20GZNCL2、65GFESO47H2O、02G生物素、50MLH2SO4，用水定容到1000ML。00642）发酵培养0065种子培养从平板上挑取X33PPICZBTL2单菌落，接种到100ML种子培养基中，30，200RPM培养16H，至OD600达到80左右，得到种子培养液。0066高密度发酵以10接种量将种子培养液接。
22、种到装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，进行批次培养00671）诱导前用25氨水控制PH值在50，约培养24小时时，开始流加补料，流加速率控制在使发酵罐溶解氧在培养过程中维持在20，4小时后停止补料；继续培养到305小时，甘油耗尽；00682）甲醇诱导再向1）的发酵体系中流加诱导物甲醇溶液行诱导培养，PH值控制在60左右，通过调节通气，搅拌，甲醇溶液流加速率等控制溶氧量为20，并控制甲醇溶液流加速率，使发酵液甲醇终浓度控制在0205（体积百分含量）。诱导培养100小时（自步说明书CN104073510A5/5页7骤1）的培养开始记作第0H），得到发酵产物，离心发酵产物收集上清液，得到发酵上清液，。
23、即为脂肪酶。0069测量细胞生长，分泌脂肪酶量及其酶活。0070细胞生长的检测方法如下取1ML发酵产物，于600NM测吸光值，结果发酵液OD600可以达到350；0071分泌脂肪酶蛋白量检测方法参考JSAMBROOKANDDRUSSELL,MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL1989,COLDSPRINGHARBOR,NYCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS记载的方法，脂肪酶的分泌量达到300MG/L发酵上清液；0072酶活检测方法见上述2中的方法，酶活达到1000U/ML（发酵上清液）。00733）检测脂肪酶的基本特征0074利用已知的。
24、蛋白质化学标准方法（JSAMBROOKANDDRUSSELL,MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL1989,COLDSPRINGHARBOR,NYCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS）测定发酵得到的脂肪酶的基本特性。0075结果显示，该脂肪酶最适反应温度为60，在50保温处理30分钟后，酶活可以保持90以上；在PH6570范围内酶活保持稳定。说明书CN104073510A1/6页80001序列表CN104073510A2/6页900020003序列表CN104073510A3/6页100004序列表CN104073510A104/6页110005序列表CN104073510A115/6页120006序列表CN104073510A126/6页13序列表CN104073510A13。