牙鲆钙调蛋白和钙网蛋白的应用.pdf

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是牙鲆钙调蛋白和钙网蛋白表达质粒的制备和应用。所述表达钙调蛋白和钙网蛋白的质粒pCNCam和pCNCrt在抗细菌感染中应用。本发明的钙调蛋白和钙网蛋白表达质粒注射鱼类后能够显著提高鱼类抵抗细菌感染的能力。

1.  牙鲆钙调蛋白和钙网蛋白的应用，其特征在于：所述钙调蛋白或 钙网蛋白用于制备抗细菌感染的制剂。

2.  按权利要求1所述的牙鲆钙调蛋白和钙网蛋白的应用，其特征在 于：以牙鲆cDNA为模板，分别用引物F1/R1或F2/R2进行PCR扩增， 扩增产物分别与载体pCN3连接，即获得钙调蛋白质粒pCNCam或钙网蛋 白质粒pCNCrt；所述F1为5’- GATATCGCCACCATGGCTGATCAGCTTACAGAAGAGC-3’；R1为5’- GATATCCTTCGCTGTCATCATTTGTACGAACT-3’；F2为5’- CCCGGGGCCACCATGAAGGTCCTCGGCGTAGCAG-3’；R2为5’- CCCGGGAAGCTCATCTTTAAGTTTTGCTTCCTCCTC-3’。

3.  按权利要求1所述的牙鲆钙调蛋白和钙网蛋白的应用，其特征在 于：所述表达钙调蛋白和钙网蛋白的质粒pCNCam或pCNCrt在制备增强 鱼类抗细菌感染制剂中的应用。

牙鲆钙调蛋白和钙网蛋白的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是牙鲆钙调蛋白和钙网蛋白的应用。
背景技术
钙是机体各项生理活动不可缺少的离子,对于维持细胞膜生物电位、正常的神经传导和肌肉伸缩与舒张都具有重要作用。钙调蛋白(calmodulin,CaM)和钙网蛋白(Calreticulin,Crt)均是Ca²⁺结合蛋白，在钙代谢中扮演重要角色。CaM广泛存在于真核生物细胞中，可以调节细胞内Ca²⁺的浓度；在内质网中，CaM还可以被用作Ca²⁺的储存介质。CaM参与介导的生命活动有炎症反应、细胞凋亡、肌肉收缩、细胞内运动以及免疫反应等。Crt是内质网中能够结合Ca²⁺的蛋白，具有维持胞内Ca²⁺稳态的作用。Crt还可作为分子伴侣，帮助新合成的内质网蛋白正确折叠。另外，Crt还出现在细胞膜表面及细胞外环境中，参与细胞粘附、抗原呈递、基因表达调控以及细胞凋亡和抗肿瘤免疫应答等过程。目前鱼类钙调蛋白和钙网蛋白研究很少，其功能亦未知。
发明内容
本发明目的在于提供牙鲆钙调蛋白和钙网蛋白的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
牙鲆钙调蛋白和钙网蛋白的应用，所述钙调蛋白或钙网蛋白用于制备抗细菌感染的制剂。
具体为：以牙鲆cDNA为模板，分别用引物F1/R1或F2/R2进行PCR扩增，扩增产物分别与载体pCN3连接，即获得钙调蛋白质粒pCNCam或钙网蛋白质粒pCNCrt；所述F1为5’-GATATCGCCACCATGGCTGATCAGCTTACAGAAGAGC-3’；R1为5’-GATATCCTTCGCTGTCATCATTTGTACGAACT-3’；F2为5’-CCCGGGGCCACCATGAAGGTCCTCGGCGTAGCAG-3’；R2为5’-CCCGGGAAGCTCATCTTTAAGTTTTGCTTCCTCCTC-3’。
所述表达钙调蛋白和钙网蛋白的质粒pCNCam或pCNCrt在制备增强鱼类抗细菌感染制剂中的应用。
本发明具有如下优点：本发明的钙调蛋白和钙网蛋白表达质粒注射牙鲆后能够显著提高鱼类的抗细菌能力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.大肠杆菌用Hanahan方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)。
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例1
钙调蛋白和钙网蛋白表达质粒pCNCam和pCNCrt的构建：
牙鲆钙调蛋白和钙网蛋白的序列已被报道(GenBank accession number：EU519228和DQ535486)。钙调蛋白有一个典型钙离子结合域(氨基酸85-147)；钙网蛋白有一个典型的钙网蛋白结构域(氨基酸20-331)。pCNCam的构建如下：以牙鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增钙调蛋白基因。PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA,然后94℃ 40s,63℃ 60s,72℃ 60s,5个循环后改为94℃ 40s,65℃ 60s,72℃ 60s,30个循环。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2－4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5α后在含有100μg/ml安卡青霉素(Ap)、40μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷和24μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18－24小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒pBSCam。将表达载体pCN3(构建过程参见Jiao XD,Zhang M,Hu YH,Sun L.Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda antigens.Vaccine 2009；27:5195–202.)用限制性内切酶EcoRV酶切后回收5.4kb片段，同时将pBSCam用EcoRV酶切回收0.5kb片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2－4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在氨苄青霉素(100ug/ml)的LB培养基培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，命名为pCNCam。通过DNA测序分析证明了pCNCam为含有钙调蛋白基因序列和结构域的表达质粒。
pCNCrt的构建如下：以牙鲆cDNA为模板，用引物F2和R2进行PCR扩增钙网蛋白基因。PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA,然后94℃ 40s,65℃ 60s,72℃ 60s,5个循环后改为94℃ 40s,70℃ 60s,72℃ 60s,30个循环。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(同上)于室温连接2－4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5α后在含有100μg/ml安卡青霉素、40μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷和24μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18－24小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒pBSCrt。将表达载体pCN3(同上)用限制性内切酶EcoRV酶切后回收5.4kb片段，同时 将pBSCrt用SmaI酶切回收1.3kb片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2－4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，命名为pCNCrt。通过DNA测序分析证明了pCNCrt为含有钙网蛋白基因序列和结构域的表达质粒。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-GATATCGCCACCATGGCTGATCAGCTTACAGAAGAGC-3’；R1为5’-GATATCCTTCGCTGTCATCATTTGTACGAACT-3’；F2为5’-CCCGGGGCCACCATGAAGGTCCTCGGCGTAGCAG-3’；R2为5’-CCCGGGAAGCTCATCTTTAAGTTTTGCTTCCTCCTC-3’。
实施例2
钙调蛋白和钙网蛋白表达质粒pCNCam和pCNCrt的应用
步骤1)质粒注射
将上述实施例1的pCNCam和pCNCrt在PBS中稀释至100ug/ml，即为pCNCam和pCNCrt稀释液。将30条牙鲆(重约12g)随机分为3组，每组10条。将这3组分别命名为A，B和C。将A组的每条鱼分别注射100ul pCNCam稀释液，将B组的每条鱼分别注射100ul pCNCrt稀释液，将C组(对照组)的每条鱼分别注射100ul PBS。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na₂HPO₄.12H₂O,0.024％NaH₂PO₄，余量为水。
步骤2)细菌悬液制备
在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TX1至OD₆₀₀为1,然后离心(5000g，4℃)10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为1x10⁶cfu/ml。
所述菌株TX1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.2330，保藏日期为2008年1月9日，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；分类命名为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。
步骤3)攻毒感染
在上述步骤1)注射后第3天，将A,B和C三组的每条鱼注射100ul上述步骤2)的细菌悬液。在感染后48h，取鱼肾脏和脾脏组织，在2ml PBS中匀浆，将100ul匀浆液涂布于LB平板。将平板置于30℃培养48h，计算出现的菌落数。结果表明，A组鱼肾脏和脾脏的细菌数为5.6x10²和6.5x10²，B组鱼肾脏和脾脏的细菌数为6.3x10²和7.3x10²，C组鱼肾脏和脾脏的细菌数为2.8x10³和3.8x10³。统计学分析表明，A组和B组鱼肾脏和脾脏的细菌数皆显著(P<0.01)低于C组鱼。
这些结果表明，表达钙调蛋白和钙网蛋白的质粒pCNCam和pCNCrt 能够显著增强鱼类抵抗细菌的侵染。