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1、10申请公布号CN104059908A43申请公布日20140924CN104059908A21申请号201410085897222申请日20140310C12N15/11200601C12N15/63200601C07K16/18200601C07K16/0620060171申请人深圳市宝凯仑科技有限公司地址518000广东省深圳市宝安区大浪街道大浪社区浪荣路口明君工业园A2栋厂房4、5楼72发明人谢桂华柴宝玲74专利代理机构深圳鼎合诚知识产权代理有限公司44281代理人彭家恩郭燕54发明名称一种制备抗LP（A）多克隆抗血清的引物、质粒及应用57摘要本申请公开了一种用于制备抗LP（A）多克隆。
2、抗血清的引物、质粒及该引物和质粒的应用。本申请率先采用克隆表达技术制备了抗LP（A）多克隆抗血清，并设计了其特异性克隆引物，以及基于该引物的质粒。采用本申请的引物或质粒制备抗原获得的抗LP（A）多克隆抗血清，与传统的提取纯化人血清制备免疫原方法制备的LP（A）抗血清相比，抗血清效价高，可达1256；特异性强，不会与LDL或PLG发生交叉反应；同时，采用本申请的引物或质粒制备抗原获得的抗LP（A）多克隆抗血清的方法还克服了传统方法的血浆来源困难、社会供给不足的问题；提高了LPA检测的准确性和有效性，为LPA检测的推广应用奠定了基础。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表5页附图1页19中华。
3、人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表5页附图1页10申请公布号CN104059908ACN104059908A1/1页21一种用于制备抗LP（A）多克隆抗血清的引物，其特征在于所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物含有SEQIDNO1所示序列，所述下游引物含有所示序列；SEQIDNO15GACATATGAGAAAAGCCCTGTGGTCC3SEQIDNO25GACTCGAGCCCACAATCAAATGAAGA3。2一种用于制备抗LP（A）多克隆抗血清的质粒，其特征在于所述质粒包括载体和插入序列；所述插入序列为权利要求1所述引物以LPA基因为模板进行PCR。
4、扩增获得的产物。3根据权利要求2所述的质粒，其特征在于所述插入序列含有SEQIDNO3所示序列。4根据权利要求2所述的质粒，其特征在于所述载体选自但不仅限于PET系列载体和PGEMT系列载体中的一种。5根据权利要求4所述的质粒，其特征在于所述载体为PET28A。6根据权利要求1所述的引物在制备抗LP（A）多克隆抗血清中的应用。7根据权利要求25任一项所述的质粒在制备抗LP（A）多克隆抗血清中的应用。8根据权利要求7所述的应用，其特征在于包括将所述质粒转化到原核表达细胞或真核表达细胞中进行融合蛋白表达，然后提取纯化蛋白质，获得抗原，采用所述抗原进行动物免疫试验，获得所述LP（A）多克隆抗血清。9。
5、根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述原核表达细胞选自但不仅限于大肠杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌和链霉菌中的一种；所述真核表达细胞选自但不仅限于酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母中的一种。10根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述大肠杆菌选自HB101，BL21，JM109和DH5中的一种；所述抗原含有SEQIDNO4所示序列。权利要求书CN104059908A1/7页3一种制备抗LP（A）多克隆抗血清的引物、质粒及应用技术领域0001本申请涉及抗血清制备领域，特别是涉及一种用于制备抗LP（A）多克隆抗血清的引物、质粒，以及该引物和质粒的应用。背景技术0002血浆脂蛋白按密度分为四大类乳糜微粒缩。
6、写，CM、极低密度脂蛋白缩写，VLDL、低密度脂蛋白缩写，LDL和高密度脂蛋白缩写，HDL。同时，在血浆中还存在一类特殊的脂蛋白脂蛋白A（缩写，LPA），它是一个独立的脂蛋白系统。LPA的脂质成分与LDL相似，主要由胆固醇脂和甘油三酯组成，表面被覆一层磷脂和游离胆固醇，甘油三酯的组份大于LDL，LPA与LDL均是胆固醇转移蛋白的底物。LPA含有两类载脂蛋白APOB100和APOA，前者与LDL的APOB100相同，APOB100上有LDL受体结合位点；后者是LPA的独特载脂蛋白，APOB100和APOA通过1至2个二硫键共价相连。0003从APOA的N末端到C末端，所有的KRINGLE域通过两。
7、两之间的大约30个氨基酸的中间序列依次相连。除最靠近C端的KRINGLE域与纤溶酶原中的KRINGLE5同源外，其余KRINGLE域均与纤溶酶原中的KRINGLE4同源，并依次被命名为KRINGLE110型；需要说明的是，人类APOA与人纤维蛋白溶酶原英文名，PLASMINOGEN缩写，PLG在DNA和蛋白质水平均存在80的同源性，从而具有共同的抗原决定簇，呈免疫交叉反应。在所有这10型的KRINGLE中，不同个体的KRINGLE2型的串联重复数一般在343之间变化，因此APOA的分子量也就在250838KD的范围中变化，其体积与分子量在相同的个体内或不同的个体间都具有较大的差异，因其这种特性。
8、，决定了LPA在不同的个体间具有较大的差异。KRINGLE9型中有7个半胱氨酸，其中未参与分子内二硫键的第4057位半胱氨酸缩写，CYS4057与载脂蛋白B100中的第4326位半胱氨酸缩写，CYS4326形成分子间二硫键，进而组成完整的LPA。0004LPA是动脉粥样硬化的独立危险因素，是冠心病CHD、心肌梗塞MI、脑卒中、动脉重新狭窄的危险因子。另外，LPA水平可作为慢性肾功能衰竭合并心脑血管病及血栓形成的预示指标。LPA的血清水平受遗传因素的高度影响，个体差异很大，主要由APOA基因决定，因种族而异，与性别、年龄无关，不易受环境，生活方式和一般降脂药物的干扰，仅能够被肾衰、急性免疫反应轻。
9、微影响。一般把人血清LPA正常值定为300MG/L。因此，LPA的检测对临床分析和病理分析具有重要的参考价值。0005目前，已知的检测LPA浓度的方法有酶联免疫法、放射免疫法、荧光免疫测定法和免疫比浊法，以上免疫检测方法均需要特异性强的LPA抗血清/抗体作为核心原料。目前基本上都是采用提纯人血清的方法制备免疫原LPA或APOA，即利用超高速离心机通过密度梯度离心制取LPA，或者利用SDSPAGE电泳分离获得APOA抗原；再利用抗原免疫动物获得抗血清。如前面分析，因为LPA含有两类载脂蛋白APOB100和APOA，其中APOB100与LDL的APOB100相同，所以利用LPA作为免疫原制备的抗血。
10、清会与LDL存在免疫交叉反应。而利用APOA作为免疫原，因APOA的氨基酸结构与PLG很相似，而PLG是说明书CN104059908A2/7页4一种以较高浓度存在于人血液中的蛋白质，因此，利用APOA作为免疫原制得的抗血清会因与PLG发生交叉反应。因此，无论是LPA还是APOA作为抗原制备的抗血清都无法准确地测定LPA含量。并且，采用提纯人血清的方法制备免疫原LPA或APOA所需血浆来源困难、社会供给不足；制备的抗血清不仅会与LDL或PLG有交叉反应，特异性较差；而且，抗血清的效价也不高。发明内容0006本申请的目的是提供一种全新的制备抗LPA多克隆抗血清的引物，基于该引物的制备抗LPA多克隆。
11、抗血清的质粒，以及该引物和质粒的应用。0007为了实现以上目的，本申请的一方面公开了一种用于制备抗LP（A）多克隆抗血清的引物，该引物包括上游引物和下游引物，上游引物含有SEQIDNO1所示序列，下游引物含有所示序列；0008SEQIDNO15GACATATGAGAAAAGCCCTGTGGTCC30009SEQIDNO25GACTCGAGCCCACAATCAAATGAAGA3。0010本申请的另一面还公开了一种用于制备抗LP（A）多克隆抗血清的质粒，该质粒包括载体和插入序列；插入序列为本申请的引物以LPA基因为模板进行PCR扩增获得的产物。优选的，插入序列含有SEQIDNO3所示序列。0011。
12、优选的，载体选自但不仅限于PET系列载体和PGEMT系列载体中的一种。更优选的，载体为PET28A。0012本申请的另一面公开了本申请的引物在制备抗LP（A）多克隆抗血清中的应用。0013本申请的再一面公开了本申请的质粒在制备抗LP（A）多克隆抗血清中的应用。0014本申请的质粒在制备抗LP（A）多克隆抗血清中的应用具体包括，将本申请的质粒转化到原核表达细胞或真核表达细胞中进行融合蛋白表达，然后提取纯化蛋白质，获得抗原，采用获得的抗原进行动物免疫试验，获得本申请的LP（A）多克隆抗血清。0015优选的，原核表达细胞选自但不仅限于大肠杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌和链霉菌中的一种，真核表达细胞。
13、选自但不仅限于酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母中的一种。0016本申请的实施方式中抗原含有SEQIDNO4所示序列，优选的，大肠杆菌选自HB101，BL21，JM109和DH5中的一种。0017由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于0018本申请率先采用克隆表达技术制备了抗LP（A）多克隆抗血清，采用本申请的引物或质粒制备抗原获得的抗LP（A）多克隆抗血清，与传统的提取纯化人血清制备免疫原方法制备的LP（A）抗血清相比，抗血清效价高，特异性强，不会与LDL或PLG发生交叉反应；同时，采用本申请的引物或质粒制备抗原获得的抗LP（A）多克隆抗血清的方法还克服了传统方法的血浆来源困难、社会供给不足的问题。
14、；提高了LPA检测的准确性和有效性，为LPA检测的推广应用奠定了基础。附图说明0019图1是本申请实施例中克隆片段的PCR扩增结果图，其中M为MARKER，1和2为PCR扩增产物样品；说明书CN104059908A3/7页50020图2是本申请实施例中收集的融合蛋白的SDSPAGE检测结果图，其中MARKER为蛋白质分子量标，APO（A）为受检样品；0021图3是本申请实施例中收集的融合蛋白的WESTERNBLOT分析结果图，其中MARKER为蛋白质分子量标，APO（A）为受检样品；0022图4是本申请实施例中融合蛋白纯化后再次进行SDSPAGE检测的结果图，其中A为电泳结果图，B为基于电泳结。
15、果的数值分析图。具体实施方式0023本申请的关键在于采用克隆表达方法获得高效、准确的抗原，从而制备出高特异性的抗血清。需要说明的是，虽然克隆表达的原理是已知的，并且，克隆表达制备抗原在多克隆抗体制备中的应用也是蛋白免疫检测领域比较常用的；但是，目前并没有采用克隆表达方法制备抗LP（A）多克隆抗血清的研究，至少，这方面的研究不甚理想；正是如此，本申请为了填补该漏洞，通过对LP（A）蛋白基因进行研究，创造性的基于LPA基因设计了特异性引物，通过该特异性引物构建可用于制备抗LP（A）多克隆抗血清制备的质粒，从而制备出特异性强、效价高的抗LP（A）多克隆抗血清。0024本申请的一个关键点在于所选择的克。
16、隆片段以及特异性的引物序列，可以理解，对于本申请的用于制备抗LP（A）多克隆抗血清的质粒来说，插入片段是其重点，因此，理论上实验室常规使用的原核表达载体，比如PET系列载体、PGEMT系列载体等都适用于本申请；本申请的优选实施方案中选择的是PET28A。0025另外，在进行转化、表达的过程中，同样，目前实验室常规使用的原核表达细胞，如大肠杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌和链霉菌等都适用于本申请，其中，大肠杆菌中常规使用的HB101，BL21，JM109和DH5等也可以用于本申请的融合蛋白表达。当然，原核表达细胞的选择要和选择的载体相符。另外，可以理解，除了可以采用原核表达细胞体系以外，实验室常。
17、规使用的真核细胞表达体系同样适用于本申请，比如酿酒酵母、毕赤巴斯德酵母等。0026下面通过具体实施例并结合附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本申请进行进一步的说明，不应理解为对本申请的限制。0027一、材料与方法00281、载体构建及转化0029（1）引物设计0030经过大量的分析，本申请以人LPA基因为研究对象，选取基因序列号NM_0055772,X062901的序列中第1205012990位片段，共941BP的片段进行克隆表达，并设计其特异性引物，引物序列如表1所示。所设计的引物在生物试剂公司合成。0031表1用于制备抗LP（A）多克隆抗血清的引物00320033（2）表达载体。
18、和宿主说明书CN104059908A4/7页60034本例的表达载体使用PET28A（即PET28A），表达宿主选用ECOLIBL21（DE3），并使用载体自身的HISTAG，PET本身的KANAMYCIN作筛选标记，以获得DH5转化后的质粒。0035（3）目的片段扩增0036采用本例设计的上游引物LPAF和下游引物LPAR，以LPA基因为模板进行扩增，为了获得充足的靶标片段，本例分别进行了两轮PCR扩增。第一轮PCR扩增体系为总体积50L，10PFUBUFFER5L，25MMOL/LDNTPS1L，5U/LPFU酶05L，10MOL/L上游引物2L，10MOL/L下游引物2L，模板DNA2L。
19、，补充DDH2O至50L。第一轮PCR扩增的反应条件为先95预变性3MIN，然后进入18个循环94变性25SEC、50退火25SEC、72延伸35SEC，循环完成后再72保温延伸6MIN，完成PCR扩增。0037第一轮PCR扩增完成后，以第一轮PCR扩增的产物为模板进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增的体系为总体积50L，10PFUBUFFER5L，25MMOL/LDNTPS1L，5U/LPFU酶05L，10MOL/L上游引物2L，10MOL/L下游引物2L，第一轮PCR扩增产物1L，补充DDH2O至50L。第二轮PCR扩增的反应条件为先95预变性3MIN，然后进入22个循环94变性30SE。
20、C、57退火30SEC、72延伸50SEC，循环完成后再72保温延伸8MIN，完成PCR扩增。PCR扩增所用试剂均可通过市场购买获得。0038（4）PCR产物与载体PET28A酶切回收0039PCR产物回收将第二轮PCR扩增产物进行双酶切处理，酶切产物用1琼脂糖凝胶进行电泳，然后采用天根琼脂胶回收试剂盒将目的片段进行回收。PCR扩增产物双酶切体系为总体积50L，10RBUFFER5L，10U/LNDEI酶1L，10U/LXHOI酶1L，第二轮PCR扩增产物20L，补充DDH2O至50L。将配制好的反应体系放入恒温水浴锅中37保温反应4H，反应结束后进行切胶回收，获得用于插入载体的靶标片段。00。
21、40载体PET28A酶切回收采用与PCR产物酶切处理相同的酶，对市场购买的PET28A载体进行相同的双酶切处理。载体PET28A双酶切体系为总体积50L，10RBUFFER5L，10U/LNDEI酶1L，10U/LXHOI酶1L，PET28A载体溶液1L，补充DDH2O至50L。将配制好的反应体系放入恒温水浴锅中37保温反应4H，反应结束后，酶切产物用1琼脂糖凝胶进行电泳，然后采用天根琼脂胶回收试剂盒将目的片段进行回收。0041（5）目的片段与载体连接0042测定酶切回收的第二轮PCR扩增产物，也就是目的片段的浓度；同时，测量酶切回收的载体的浓度。将目的片段和载体进行连接，连接反应体系为总体积。
22、20L，50NG/L的酶切回收目的片段8L，100NG/L的酶切回收载体5L，10T4DNALIGASEBUFFER2L，5U/LT4DNALIGASE1L，补充水至20L。配制好的反应液在入16水浴2H即可。0043（6）转化筛选克隆0044将上述连接反应产物转入BL21中，在K抗性培养基平板上检测筛选出阳性克隆进行测序。00452、融合蛋白的原核表达0046（1）转化0047培养转化表达菌株BL21，划线获得单菌落平板。同时冻存单菌落，保留菌种。本申请的菌种已经在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏号为CCTCCM2013429。说明书CN104059908A5/7页70048（2）培养0。
23、049试管中装入终浓度50UG/ML卡那霉素的LB培养液3ML，挑取单菌落于试管的培养液中，37，220RPM过夜培养。0050将过夜培养的菌液按1200比例接种于200MLLB培养基中，添加卡那霉素至终浓度50UG/ML，37，180RPM扩大培养。0051当扩大培养的培养液的OD值达到08左右时，添加终浓度为1MMOL/L的IPTG，然后改为32，160RPM诱导培养4H，收取培养液样品。0052经过诱导培养的培养液在4进行离心收集菌体，离心速度为10000RPM/MIN，离心收集的菌体用PBS缓冲液悬浮。0053（3）反复冻融破碎菌体0054将用PBS缓冲液重悬的菌体溶液在80和室温条件。
24、下反复冻融菌体三次。具体的，80放置20MIN，然后室温放置30MIN，完成一个循环的冻融。0055冻融完成后10000RPM/MIN，4，离心30MIN，分别收集上清和沉淀。0056离心获得的沉淀采用溶解液悬浮，室温震荡3H，200RPM/MIN，然后再进行离心30MIN，收集上清以备纯化，其中溶解液为含8M尿素的PBS溶液。需要说明的是，此次离心的上清液与步骤中的上清液都是用于蛋白质纯化的，以获取靶标蛋白，定义为样品上清液。0057（4）镍琼脂糖亲和层析0058用10倍柱床体积的BINDINGBUFFER清洗平衡柱子，过柱流速60ML/H。0059样品上清液上柱，以45ML/H流速过柱，收。
25、集滤液。0060步骤的过滤柱继续采用10倍柱床体积的BINDINGBUFFER清洗柱子,流速60ML/H。0061EULTEBUFFER1洗脱，流速45ML/H，收集洗脱液。0062EULTEBUFFER2洗脱,流速45ML/H，收集洗脱液。0063EULTEBUFFER3洗脱,流速45ML/H，收集洗脱液。0064将纯化后的蛋白超滤浓缩，收集样品保存备用，该样品即作为抗原使用的融合蛋白，收集的样品采用SDSPAGE分析。0065BINDINGBUFFER为PBS溶液，其中含有8MOL尿素，10MMOL/L咪唑，300MMOL/LNACL，05TRITONX100，并且PH80；0066EUL。
26、TEBUFFER1为PBS溶液，其中含有8MOL尿素，50MMOL/L咪唑，并且PH80；0067EULTEBUFFER2为PBS溶液，其中含有8MOL尿素，100MMOL/L咪唑，并且PH80；0068EULTEBUFFER3为PBS溶液，其中含有8MOL尿素，500MM咪唑OL/L，并且PH80。0069（5）抗血清制备及鉴定0070动物免疫0071选择青壮年时期并对APOA易感的山羊或兔子进行免疫。将纯化获得的抗原用PBS溶液稀释至15MG/ML，与等体积完全佐剂混合后乳化，山羊每只注射量为28MG，兔子每只注射量12MG，背部、颈部、腋窝皮下结合皮内多点注射。半月后进行第二次免疫，将不。
27、完全佐剂与抗原混合后注射，剂量减半，免疫方法同首免。再半月后进行第三次免疫，剂量与免疫方法同二次免疫。以后每隔一月免疫一次，并采血，用免疫双扩散法测效价。直到抗体效价达到要求后，颈动脉放血得抗血清。其中，抗原用PBS溶液稀释至15MG/ML，山羊每说明书CN104059908A6/7页8只注射量为28MG，兔子每只注射量12MG等数据范围都是根据实验证实的范围，是发明人在大量的实践活动中得出的有效范围。0072抗血清纯化0073饱和硫酸铵法纯化抗血清将抗血清4ML与4MLPBS混合后，边搅拌边逐滴加入8ML饱和硫酸铵，继续温和搅拌10MIN后，4冰箱静置过夜。过夜处理后，4，10000RPM离。
28、心10MIN，弃上清。沉淀用PBS重溶至8ML，然后边轻轻搅拌边逐滴加入4ML饱和硫酸按溶液，然后4冰箱静置过夜。静置过夜后，4，10000RPM离心10MIN，弃上清。最后获得的沉淀用少量生理盐水溶解，然后将生理盐水溶解的溶液放入透析袋中于4进行透析，以置换缓冲液。其中，少量生理盐水，是指刚好能够将沉淀溶解的分量，可以根据具体实验情况或者实践经验确定，在此不作限定。0074DEAE弱阴离子交换树脂进一步纯化DEAE弱阴离子交换树脂纯化柱用002MOL/LPH4075的PBS平衡缓冲液进行平衡，然后将经过饱和硫酸铵法纯化和透析处理的抗血清溶液装入纯化柱中，平衡缓冲液继续平衡直到穿透峰回落至基线。
29、，然后换用盐溶液滴度洗脱并收集各组分；从而获得高纯度的抗体，经过DEAE纯化后的抗体纯度达到95以上。0075（6）抗体鉴定0076效价测定0077采用免疫双扩撒实验对抗体效价进行鉴定。本例对制备的抗体进行64倍、128倍、256倍、512倍、1024倍和2048倍稀释用于效价检测。具体的检测方法为，取干净的载玻片放于平台上，将融化的1琼脂糖趁热用移液管移取6ML，平铺于载玻片上，注意不要溢出，在室温下放置15MIN左右即可使琼脂糖冷却凝固，转移至冰箱冷藏30MIN左右，取出备用。用自制内径约3MM的打孔器在琼脂板上打梅花孔，孔间距4MM，用针头小心将孔中琼脂挑出，当心不要碰伤了孔周围的琼脂。。
30、打孔完毕，封闭孔底，将板底部在酒精灯上烘烤，使底部琼脂微融化即可，也可在琼脂孔底部与板接触处加少量融化的1琼脂。在每组梅花孔的中央孔加入一滴约20UL的人血浆，周围孔加不同稀释度抗血清，加样时注意不要溢出孔外，也不可出现凹形面。冻存盒底部加水制成湿盒，将琼脂板放入湿盒中，注意不可靠近湿盒边缘，以防局部温度过高导致琼脂融化。37温箱中作用48H以上。将湿盒从温箱中取出，在散射光背景下观察，有白色沉淀线的为阳性，以出现白色沉淀线的最大稀释度为血清效价。0078特异性鉴定0079利用免疫电泳来进行特异性鉴定。具体的，用50MMOL/LPH88巴比妥巴比妥钠缓冲液配置2琼脂糖溶液。在载玻片上倒胶后，待。
31、胶凝固，在中间偏下，约载玻片一边1/3处，用自制3MM内径的打孔器打一孔，加满人血清，在免疫电泳仪上，用滤纸搭桥，电流恒流在23MA/CM胶，电泳缓冲液为50MMOL/LPH86巴比妥巴比妥钠，46H即可，电泳过程中观察血浆颜色，不要跑出板外。在胶板上挖槽，槽的大小可以容得下100200L抗血清，放入湿盒，3724H。0080二、结果分析00811、PCR结果0082将第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，其中M为MARKER（GENERULERTMDANLADDERMIX10000BP），1和2分别为两个重复的样品，结果显示，PCR扩增产物的大小与预期的靶标片段大小94。
32、1BP相当。说明书CN104059908A7/7页900832、筛选克隆的测序结果0084将转化筛选的阳性克隆提取质粒，进行测序，测序结果如SEQIDNO3所示序列，将该序列在网上进行比对，与NCBI中序列号为X062901的人LPA基因序列完全相同，同源性为100。证实，本申请所克隆的靶标片段准确无误。00853、融合蛋白的表达及纯化0086（1）融合蛋白的表达定位0087采取反复冻融离心后收集的上清，进行SDSPAGE和WESTERNBLOT分析，两个实验的结果分别如图2和图3所示，结果显示在约38KDA的位置出现明显的新生条带，与理论预期相符，表明融合蛋白在诱导4H后成功得到了表达。00。
33、88（2）融合蛋白的纯化0089将融合蛋白经过镍琼脂糖亲和层析法进行纯化的样品，进行SDSPAGE电泳分析。SDSPAGE电泳结果如图4中A所示，在38KD的位置出现明显条带；图4中B为融合蛋白镍琼脂糖亲和层析洗脱结果。00904、抗血清的鉴定0091（1）效价鉴定0092效价鉴定显示，在64倍、128倍、256倍的抗血清样品对应的检测孔中均有沉淀线；而在抗血清稀释512倍对应的检测孔则基本消失，所以判定该抗血清效价为1256。检测结果图略。0093（2）特异性鉴定0094抗血清特异性检测结果显示，仅与人血清仅在LPA位置有一条沉淀线，而没有其他沉淀线，可见，本例制备的抗血清能特异性针对LPA。
34、，没有与PLG或LDL发生交叉免疫，特异性强；检测结果图略。0095以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。说明书CN104059908A1/5页1000010002序列表CN104059908A102/5页110003序列表CN104059908A113/5页120004序列表CN104059908A124/5页130005序列表CN104059908A135/5页14序列表CN104059908A141/1页15图1图2图3图4说明书附图CN104059908A15。