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1、10申请公布号CN104059978A43申请公布日20140924CN104059978A21申请号201410299744822申请日20140627C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人安徽师范大学地址241002安徽省芜湖市弋江区九华南路189号科技服务部72发明人晏鹏晏龙耿章珍吴孝兵74专利代理机构北京润平知识产权代理有限公司11283代理人孙向民董彬54发明名称用于鉴定云豹的多重PCR引物和方法以及它们在鉴定云豹中的应用57摘要本发明公开了一种用于鉴定云豹的多重PCR引物，其中，所述多重PCR引物包括如SEQIDNO1和SEQIDNO2所示的引物对1，。
2、以及如SEQIDNO3和SEQIDNO4所示的引物对2。本发明还公开了一种利用多重PCR鉴定云豹的方法，该方法包括提取待测样品的总DNA并对总DNA进行PCR扩增；将扩增后的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；其中，所述多重PCR引物为上述多重PCR引物，若泳道中出现2条条带，则判断所述待测样品为来自云豹的样品。本发明还公开了一种上述多重PCR引物或鉴定方法在鉴定云豹中的应用。通过设计上述两对引物，实现了简便易行且经济实用地鉴定云豹的目的。51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表3页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表3页附图1页10申请公布号CN1。
3、04059978ACN104059978A1/1页21一种用于鉴定云豹NEOFELISNEBULOSA的多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物包括如SEQIDNO1和SEQIDNO2所示的引物对1，以及如SEQIDNO3和SEQIDNO4所示的引物对2。2一种利用多重PCR鉴定云豹NEOFELISNEBULOSA的方法，其特征在于，所述方法包括1提取待测样品的总DNA；2采用多重PCR引物对步骤1中提取的总DNA进行PCR扩增；3取步骤2中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；其中，所述多重PCR引物为权利要求1中所述的多重PCR引物，其中，在步骤3所得的琼脂糖凝胶电泳图中，若含有步骤2得到。
4、的产物的泳道中出现2条条带，则判断所述待测样品为来自云豹的样品，若含有步骤2得到的产物的泳道中不出现2条条带，则判断所述待测样品不是来自云豹的样品。3根据权利要求2所述的方法，其中，出现的2条条带中所含有的DNA片段的长度分别为230BP和370BP。4根据权利要求3所述的方法，其中，以30L的PCR扩增体系为基准，每条引物的浓度分别为02505PMOL/L，DNA模板的用量为4555NG。5根据权利要求2或4中所述的方法，其中，所述PCR扩增过程的退火温度为5560，退火时间为2540S。6根据权利要求1所述的多重PCR引物或权利要求25中任意一项所述的方法在鉴定云豹NEOFELISNEBU。
5、LOSA中的应用。权利要求书CN104059978A1/6页3用于鉴定云豹的多重PCR引物和方法以及它们在鉴定云豹中的应用技术领域0001本发明涉及生物检测领域，具体地，涉及一种用于鉴定云豹的多重PCR引物及使用所述多重PCR引物鉴定云豹的方法，以及它们在鉴定云豹中的应用。背景技术0002基于分类学的准确物种鉴定是人类认知自然和可持续发展的必要前提。它为生物多样性的保护、物种资源的可持续性利用，以及生物来源的新产品开发等提供了知识和理论基础。对于物种的鉴定，传统的方法主要是采用形态学证据来进行。但该方法的一些缺陷也造成了濒危动物保护工作的局限，例如表型可塑性和遗传可变性、无法区分隐存分类单元、。
6、受生物性别和发育阶段限制等。在野生动物保护的实践工作中，一些来源不明的送检动物样品往往是不完整且样品量较小，已很难从形态学上加以识别，如毛发、残肢、腐败组织、骨骼、皮张及粪便等。但是，根据中华人民共和国野生动物保护法的规定，准确的物种信息是量刑的重要法律证据，直接涉及到犯罪嫌疑人的切身权力和行政部门的严格执法问题。0003云豹NEOFELISNEBULOSA是哺乳纲MAMMALIA食肉目CARNIVORA猫科FELIDAE云豹属NEOFELIS的猫科动物。云豹身体两侧具云状的暗色斑纹，体长约70110厘米，尾长约7090厘米，体重约1640千克，为豹亚科最小者。云豹在中国的分布北限在陕西秦岭、。
7、甘肃南部，西至西藏察隅等地，南止于海南省，东至浙江省及台湾省。我国共有两个亚种指名亚种NEOFELISNEBULOSANEBULOSA，我国云豹皆为指名亚种；台湾亚种NEOFELISNEBULOSABRACHYURUS，现已灭绝。云豹作为食物网中的顶级食肉动物，捕食多种动物，在营养级序列中占据着多个级别，也是维持生态系统功能和生物多样性水平的关键物种。与世界其它的猫科动物一样，云豹同样受到分布密度低、活动范围大、猎物数量下降、偷猎等因素的广泛威胁。在中国，云豹已被列为国家一级重点保护野生动物。在全世界，也被列入世界自然保护联盟IUCN易危VU级物种，同时还被濒危野生动植物种国际贸易公约CITE。
8、S列入附录I物种，云豹及其物种产品被严格禁止国际商业贸易。因此，在实际的野生动物保护工作中，对云豹物种及其相关制品进行科学、准确地物种鉴定是开展各项执法工作的前提。0004另一方面，由于受到活动隐匿、难以捕获等原因的限制，目前开展有关大型猫科动物的种群生态学研究只能依赖于间接的证据，例如痕迹证据如足迹、擦痕、尿迹及抓痕等和对当地居民的走访调查等。但痕迹仅能对野生云豹种群提供定性的数据，并不能实现跟踪并监测野外种群的数量动态波动。近年来，以动物粪便为研究材料的粪便DNA分析技术极大地扩展了非损伤性取样的范围，丰富了保护遗传学的研究技术。通过对粪便DNA中多种遗传标记的识别，研究者可以对野生动物的。
9、种群数量调查、领域边界划定、生活史、种群遗传结构和遗传多样性等方面进行深入的研究。在开展基于粪便DNA的兽类种群生态学研究中，往往需要研究者首先对采自野外的大量兽类粪便样品根据粪型特点进行初步的说明书CN104059978A2/6页4判别，将云豹物种的粪便单独挑选出来备用，这是一项非常耗费时间的前期准备工作。同时，由于粪型等形态学特征往往在野外及送回实验室的运输过程中容易受到破坏，给大量粪便样品的识别和鉴定带来困难。如果依靠分子测序方法进行鉴定，则会造成花费增大的经济问题。此外，已有大量研究表明，较小扩增产物长度一般500BP可有效地提高针对粪便DNA的PCR特异性和成功率。这要求我们开发的特。
10、异引物扩增产物还必须具有片度不能太大的特点。0005近年来DNA分类鉴定技术的飞速发展为物种的保护、野生动物的有效管理提供了强大的工具。动物线粒体DNAMTDNA的CYTB基因和12SRRNA基因中同时存在较快和较慢进化的密码子位点，以及保守区域和突变区域的存在使得其可应用于动物系统学研究。目前被广大学者认为是开展动物种上和种下阶元间系统进化研究最好的分子遗传标记之一。0006因此，提供一种无需DNA的测序、序列比对等繁琐步骤，同时对样品来源无限制，且可仅通过一次PCR扩增即可快速有效地实现对云豹物种的精确测定的多重PCR引物是本发明亟需解决的问题。发明内容0007针对上述现有技术，本发明的目。
11、的在于克服现有技术中通过形态学特征对云豹物种进行测定的局限性，或是以常规方法对粪便中DNA进行测定来确定物种的方法的耗时耗力且花费较大的问题，提供一种简便快捷且经济的用于鉴定云豹的多重PCR引物和鉴定云豹的方法，以及它们在鉴定云豹中的应用。0008为了实现上述目的，本发明提供一种用于鉴定云豹NEOFELISNEBULOSA的多重PCR引物，其中，所述多重PCR引物包括如SEQIDNO1和SEQIDNO2所示的引物对1，以及如SEQIDNO3和SEQIDNO4所示的引物对2。0009本发明还提供了一种利用多重PCR鉴定云豹NEOFELISNEBULOSA的方法，其中，所述方法包括00101提取待。
12、测样品的总DNA；00112采用多重PCR引物对步骤1中提取的总DNA进行PCR扩增；00123取步骤2中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；0013其中，所述多重PCR引物为如上所述的多重PCR引物，0014其中，在步骤3所得的琼脂糖凝胶电泳图中，若含有步骤2得到的产物的泳道中出现2条条带，则判断所述待测样品为来自云豹的样品，若含有步骤2得到的产物的泳道中不出现2条条带，则判断所述待测样品不是来自云豹的样品。0015本发明还提供了一种根据上述多重PCR引物或上述鉴定方法在鉴定云豹NEOFELISNEBULOSA中的应用。0016本发明通过设计两组PCR引物，利用多重PCR扩增的方法，对待测样品通。
13、过一次常规的PCR扩增即可通过琼脂糖凝胶电泳图中的条带显示判定出该物种是否为云豹，且所用的DNA模板可从动物的毛皮、肌肉组织、内脏或粪便中提取，大大降低了取样的难度，且该方法可简便快捷地鉴定云豹，从而达到了简便易行且经济实用地鉴定云豹的效果。0017本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。说明书CN104059978A3/6页5附图说明0018附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中0019图1是实施例13和对比例19的扩增产物的糖凝胶电泳图；其中，泳道C来自双蒸水样品、泳道1来。
14、自雪豹的肌肉样品、泳道2来自金钱豹的肌肉样品、泳道3和泳道4来自云豹的肌肉样品、泳道5来自云豹的粪便样品、泳道6来自东北虎的肌肉样品、泳道7来自猞猁的皮张样品、泳道8来自豹猫的肌肉样品、泳道9来自野猪的粪便样品、泳道10来自藏酋猴的粪便样品、泳道11来自黄鼬的粪便样品、泳道M为分子量标记。具体实施方式0020以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。0021本发明提供了一种用于鉴定云豹NEOFELISNEBULOSA的多重PCR引物，其中，所述多重PCR引物包括如SEQIDNO1和SEQIDNO2所示的引物对1，以。
15、及如SEQIDNO3和SEQIDNO4所示的引物对2。0022本发明还提供了一种利用多重PCR鉴定云豹NEOFELISNEBULOSA的方法，其中，所述方法包括00231提取待测样品的总DNA；00242采用多重PCR引物对步骤1中提取的总DNA进行PCR扩增；00253取步骤2中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；0026其中，所述多重PCR引物为如上所述的多重PCR引物，0027其中，在步骤3所得的琼脂糖凝胶电泳图中，若含有步骤2得到的产物的泳道中出现2条条带，则判断所述待测样品为来自云豹的样品，若含有步骤2得到的产物的泳道中不出现2条条带，则判断所述待测样品不是来自云豹的样品。0028在本发。
16、明中，出现的2条条带中所含有的DNA片段的长度分别为230BP和370BP。0029在本发明中，为了达到更好的PCR扩增效果，使得得到的琼脂糖凝胶电泳图更清晰可见，便于更好地确定实验结果，以30L的PCR扩增体系为基准，每条引物的浓度分别为02505PMOL/L，DNA模板的用量为4555NG。其中，用于PCR扩增的聚合酶以及缓冲液可以为本领域常规聚合酶和缓冲液，其用量具体的可以参照说明书中的详细说明。本发明在此不再详细赘述。0030所述PCR扩增过程中的退火过程可以为本领域所常规使用的退火方式及退火参数，在本发明中，为了得到更好的扩增效果，所述PCR扩增过程的退火温度为5560，退火时间为2。
17、540S。另外，对于PCR扩增中的变性条件、延伸条件以及循环数等参数的设置均为本领域常规的设置，本发明在此不再详细赘述。0031本发明还提供了一种根据上述多重PCR引物或上述鉴定方法在鉴定云豹NEOFELISNEBULOSA中的应用。0032以下将通过实施例对本发明进行详细描述。0033需要阐明的是，所述引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成且引物浓度为10PMOL/L，所述裂解液可以为本领域常规使用的DNA裂解液，例如，在本发明中，每升所述说明书CN104059978A4/6页6裂解液中含有50MMOL的TRISHCLPH80、25MMOL的乙二胺四乙酸PH80、100MMOL的氯化钠和1。
18、重量份的十二烷基硫酸钠，本发明中使用的DNTPMIX为TRANSGENE公司的市售品，蛋白酶K为MERCK公司的市售品，所述DNA纯化试剂盒为TIANGEN公司的市售品，其余所使用的化学试剂均为常规市售分析纯试剂。0034实施例10035将05G表1中编号为3的待测样品置于离心管中并在离心管中将待测样品用消毒剪刀剪碎，然后向离心管中依次加入500L的裂解液，30L的10十二烷基硫酸钠和3L的20MG/ML的蛋白酶K，充分混匀后56水浴消化12H至管内液体澄清。向上述消化后的混合物中加入TRIS平衡酚500L，并轻微振荡5MIN后置于11000R/MIN的离心机上离心10MIN，取离心后的上清液。
19、。重复上述离心步骤两次。向重复离心后最终得到的上清液中加入冰冻无水乙醇1000L并于20下放置1H后置于12000R/MIN的离心机上离心13MIN后，弃上清液，并向得到的沉淀中加入70的乙醇800L，并轻微振荡05MIN后置于13000R/MIN的离心机上冰冻离心13MIN，弃上清液。重复上述离心步骤两次。将得到的沉淀置于无菌操作台上自然晾干25H后向其中加入TE溶液400L，轻微振荡并用手指轻弹离心管后于4下放置3H后进行琼脂糖凝胶电泳，得到总DNA。0036向PCR仪的样品管中加入10L的10PCRBUFFER，每条引物各1L，2L的2MMOL/L的DNTPMIX，2L的25MMOL/L。
20、的MG2，1U的TAQ酶和50NG的总DNA，并用双蒸水补齐至30L。PCR反应条件为95预变性5MIN；然后进行30个循环，该循环包括95变性40S，58退火30S和72延伸35S；最后再作72延伸10MIN。在上述反应条件下进行PCR扩增。将扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示泳道编号为3。0037实施例20038按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为4表1中，所述每条引物的用量为075L，所述总DNA的用量为45NG，所述退火温度为55，所述退火时间为40S，电泳结果如图1所示泳道编号为4。0039实施例30040按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样。
21、品编号为5表1中，所述每条引物的用量为125L，所述总DNA的用量为55NG，所述退火温度为60，所述退火时间为25S，电泳结果如图1所示泳道编号为5。0041对比例10042将表1中编号为C的双蒸水作为总DNA，按照实施例1的方法进行扩增及琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示泳道编号为C。0043对比例20044按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为1表1中，电泳结果如图1所示泳道编号为1。0045对比例30046按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为2表1中，电泳结果如图1所示泳道编号为2。0047对比例40048按照实施例2的方法进行操作，不同的是，待测样品编号。
22、为6表1中，电泳结果说明书CN104059978A5/6页7如图1所示泳道编号为6。0049对比例50050按照实施例2的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为7表1中，电泳结果如图1所示泳道编号为7。0051对比例60052按照实施例2的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为8表1中，电泳结果如图1所示泳道编号为8。0053对比例70054按照实施例3的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为9表1中，电泳结果如图1所示泳道编号为9。0055对比例80056按照实施例3的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为10表1中，电泳结果如图1所示泳道编号为10。0057对比例90058按照实施例3的方。
23、法进行操作，不同的是，待测样品编号为11表1中，电泳结果如图1所示泳道编号为11。0059检测例0060将得到两条条带的含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶块用干净的手术刀切下并在DNA纯化试剂盒中纯化后送至上海生工生物工程技术有限公司进行测序。0061表10062编号物种样品类型采集地C双蒸水1雪豹PANTHERAUNCIA肌肉安徽宁国2金钱豹PANTHERAPARDUS肌肉安徽宁国3云豹NEOFELISNEBULOSA肌肉安徽宁国4云豹NEOFELISNEBULOSA肌肉安徽宁国5云豹NEOFELISNEBULOSA粪便安徽黄山6东北虎PANTHERATIGRISALTAICA肌肉安徽宁国7猞猁。
24、LYNXLYNX皮张安徽宁国8豹猫PRIONAILURUSBENGALENSIS肌肉安徽宁国9野猪SUSSCROFA粪便安徽黄山10藏酋猴MACACATHIBETANA粪便安徽黄山11黄鼬MUSTELASIBIRICA粪便安徽黄山0063通过表1的样品信息和图1所示的电泳图可以看出，本发明通过设计两组PCR引物，对待测样品仅通过一次常规的PCR扩增即可通过琼脂糖凝胶电泳图中的条带显示判定出该物种是否为云豹，且电泳结果与样品信息完全符合，证实了该鉴定方法的可靠性，同时，送至上海生工生物工程技术有限公司进行测序的DNA片段的序列与数据库中已知的云豹物种的序列进行比对后，得到的比对结果表明该测序的D。
25、NA片段的序列与已知的云豹物种的序列的同源性在97以上，故而也进一步证实了该待测样品的物种为云豹，而且在本实验中，所用的DNA模板可从动物的毛皮、肌肉组织、内脏或粪便中提取，大大降低了取样的难度，且该方法可简便快捷地鉴定云豹，从而达到了简便易行且经济实用地鉴定云豹的说明书CN104059978A6/6页8效果。0064以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。0065另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。0066此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。说明书CN104059978A1/3页900010002序列表CN104059978A2/3页100003序列表CN104059978A103/3页11序列表CN104059978A111/1页12图1说明书附图CN104059978A12。