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1、10申请公布号CN104195260A43申请公布日20141210CN104195260A21申请号201410485406322申请日20140922C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心地址300461天津市滨海新区天津港保税区京门大道158号158号72发明人张裕君郭京泽赵瑾源刘鹏贺艳54发明名称一种新的转基因玉米品系MIR604检测试剂盒及其检测方法57摘要本发明通过巧妙地设计针对转基因玉米品系MIR604的带标记的特异性引物和竞争性引物，应用PCR扩增和试纸条联合检测技术，实现了MIR604的高效快速检测。该方法。
2、特异性强，灵敏度高和稳定性好，使用方便快捷，节约成本和时间，原理和操作简单，不需特殊仪器，适合检验检疫部门运用和推广。51INTCL权利要求书1页说明书4页序列表1页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页序列表1页附图1页10申请公布号CN104195260ACN104195260A1/1页21一种用于转基因玉米品系MIR604检测的特异性引物和竞争性引物，其特征在于，序列为上游引物604FBIO5BIOTINTCCGCAATGTGTTATTAAGAGT3下游引物604BT5FITCTATTATAATCCGAAACGGAGCA3竞争引物604FCOMP。
3、5GGCCTTAATAACACATTGCGGA3。2一种用于检测转基因玉米品系MIR604的试剂盒其特征在于，包括如下成分（1）阳性对照转基因玉米品系MIR604DNA模板和阴性对照非转基因玉米DNA模板（2）MIR604上下游引物和竞争引物上游引物604FBIO5BIOTINTCCGCAATGTGTTATTAAGAGT3下游引物604BT5FITCTATTATAATCCGAAACGGAGCA3竞争引物604FCOMP5GGCCTTAATAACACATTGCGGA3（3）10EXTAQPCRBUFFER,DDH2O,25MMDNTP,5U/LEXTAQ酶（4）生物素（BIOTIN）、荧光素（F。
4、ITC）抗原标记的薄膜层析试纸条。3一种转基因玉米品系MIR604的快速检测方法，包括如下步骤（1）PCR反应体系10EXTAQBUFFER25LDNTP（25MMOL/L）1L上游引物（10MOL/L）05L下游引物（10MOL/L）05L竞争引物（10MOL/L）4L模板DNA1LEXTAQ酶5U/L025LDDH2O1525L总体积25L（2）PCR反应条件94预变性1MIN，94变性30S，57退火30S，72延伸30S，30个循环，72延伸5MIN（3）判定结果PCR产物用试纸条检测，若控制线正常，检测线呈现阳性，则说明该样品含有转基因玉米品系MIR604，若呈现阴性，则说明该样品中。
5、不含有转基因玉米品系MIR604。权利要求书CN104195260A1/4页3一种新的转基因玉米品系MIR604检测试剂盒及其检测方法技术领域0001本发明涉转基因玉米品系检测领域，提供了一种利用PCR扩增和核酸试纸条联合检测技术快速检测转基因玉米品系MIR604的方法及其试剂盒，适用于口岸检验检疫机构应用对转基因玉米品系MIR604的检测。背景技术0002伴随着转基因技术的快速发展，转基因作物种类越来越多，种植面积也逐年递增，转基因涉及的作物种类繁多，包括大豆、玉米、小麦、棉花、番茄、马铃薯等，而每个转基因品系都有独特的基因组插入位置及边界序列，目前我国对进口转基因玉米产品采取审批制度，未经。
6、允许的玉米品系禁止进入我国，建立转基因产品品系鉴定方法有实际的需求。0003由于普通PCR方法的凝胶成像检测、实时荧光PCR检测方法都需要价格高昂的专用检测设备，昂贵的仪器设备成本限制了PCR检测方法的推广。0004本发明本研究通过巧妙地设计针对转基因玉米品系MIR604的带标记的特异性引物和竞争性引物，应用PCR扩增和核酸试纸条联合检测技术，实现了转基因玉米品系MIR604的高效快速检测。该方法特异性强，灵敏度高和稳定性好，对于提高MIR604品系的准确性、缩短检测时间具有重要的作用。该检测方法方便快捷，节约成本和时间，原理和操作简单，不需特殊仪器，适合检验检疫部门运用和推广，同时对其他玉米。
7、品系的快速检测也具有重要的借鉴意义。发明内容0005本发明需要解决的技术问题是提供用于检测MIR604的特异性引物和竞争性引物。0006本发明需要解决的另一问题是提供包含上述引物的PCR检测试剂盒。0007本发明用于检测MIR604的PCR引物序列为上游引物604FBIO5BIOTINTCCGCAATGTGTTATTAAGAGT3下游引物604BT5TCTATTATAATCCGAAACGGAGCA3竞争引物604FCOMP5GGCCTTAATAACACATTGCGGA3。0008本发明的MIR604检测试剂盒，包括以下成分（1）MIR604DNA模板和阴性对照拟MIR604DNA模板（2）MI。
8、R604上下游引物和竞争引物上游引物604FBIO5BIOTINTCCGCAATGTGTTATTAAGAGT3下游引物604BT5TCTATTATAATCCGAAACGGAGCA3竞争引物604FCOMP5GGCCTTAATAACACATTGCGGA3。0009（3）10EXTAQPCRBUFFER,DDH2O,25MMDNTP,5U/LEXTAQ酶用上述方法对待测样品DNA进行PCR扩增，PCR产物用试纸条检测，若控制线正常，检说明书CN104195260A2/4页4测线呈现阳性，则说明该样品含有MIR604，若呈现阴性，则说明该样品中不含有MIR604。0010与现有技术相比，本发明的进步。
9、在于使用仪器简单，无需琼脂糖凝胶电泳、紫外凝胶成像，从而避免了溴化乙锭的污染，节省时间，特异性强，灵敏度高，稳定性好，降低了实验室的投入，适合基层实验室推广使用。0011附图说明图1为转基因玉米品系MIR604试纸条特异性检测结果，1为MON810，2为MON863、3为TC1507、4为ES3272、5为GA21、6为59122、7为MIR604、8为BT11、9为BT176、10为NK603、11为非转基因玉米基因组DNA、12为DDH2O，从图1可以看出使用本试剂盒能准确地检测出转基因玉米品系MIR604。0012具体实施方式0013MIR604引物设计1TCCGCAATGTGTTATT。
10、AAGAGTTGGTGGTACGGGTACTTTAACTAACGAGGTGTGTCGCG61CAGCGCTCCTGCACGGATGTAGCTTTGGATTGCTGGATAATGTCTCGCGCAAGCGTCGTA121TTTATTTATTTATTTATTACAGCCTCCACCGCCGTGCGTGCTCCGTTTCGGATTATAATA根据转基因地衣芽孢杆菌的重组DNA序列，利用引物设计软件设计两组引物、探针（下划线位置），上游引物5标记生物素（BIOTIN），下游引物5标记荧光素（TC），以及上游引物竞争引物。0014上游引物604FBIO5BIOTINTCCGCAATGTGTTATTAAG。
11、AGT3下游引物604BT5TCTATTATAATCCGAAACGGAGCA3竞争引物604FCOMP5GGCCTTAATAACACATTGCGGA3。0015本实验测试了10种转基因玉米品系及一种非转基因玉米，见下表编号供试玉米种类1MON8102MON8633TC15074ES32725GA216591227MIR6048BT119BT17610NK60311非转基因玉米实施例1、转基因玉米品系MIR604的检测DNA提取采用QIAGENDNEASYPLANTMINIKIT试剂盒，按步骤提取玉米基因组DNA溶于100ULTE中，20保存备用。0016PCR扩增分别以MON810、MON86。
12、3、TC1507、ES3272、GA21、59122、BT11、BT176、NK603、非转基因玉米基因组DNA为阴性对照，MIR604基因组DNA作为阳性对照，DDH2O为空白对照，进行PCR扩增。0017PCR反应体系说明书CN104195260A3/4页510EXTAQBUFFER25LDNTP（25MMOL/L）1L上游引物（10MOL/L）05L下游引物（10MOL/L）05L竞争引物（10MOL/L）4L模板DNA1LEXTAQ酶5U/L025LDDH2O1525L总体积25LPCR反应条件94预变性1MIN，94变性30S，57退火30S，72延伸30S，30个循环，72延伸5M。
13、IN。0018试纸条检测分别取4L扩增产物加到试纸条的样品垫上，然后滴加23滴缓冲液，5MIN后判读并记录结果,结果如图1，1为MON810，2为MON863、3为TC1507、4为ES3272、5为GA21、6为59122、7为MIR604、8为BT11、9为BT176、10为NK603、11为非转基因玉米基因组DNA、12为DDH2O。0019结果表明，图1的控制线均正常，只有7号MIR604在检测线出现特异性红色条带，其余转基因玉米品系、非转基因玉米及空白对照均无条带出现，只有在MIR604检测试纸条的检测线显示特异性条带时，表明检测物中含有转基因玉米品系MIR604成分。0020序列表。
14、SEQUENCELISTING天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心一种新的转基因玉米品系MIR604检测试剂盒及其检测方法201408203122DNA人工序列1TCCGCAATGTGTTATTAAGAGT22222DNA人工序列2TATTATAATCCGAAACGGAGCA22322说明书CN104195260A4/4页6DNA人工序列3GGCCTTAATAACACATTGCGGA22说明书CN104195260A1/1页7序列表SEQUENCELISTING天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心一种新的转基因玉米品系MIR604检测试剂盒及其检测方法3122DNA人工序列1TCCGCAATGTGTTATTAAGAGT22222DNA人工序列2TATTATAATCCGAAACGGAGCA22322DNA人工序列3GGCCTTAATAACACATTGCGGA22序列表CN104195260A1/1页8图1说明书附图CN104195260A。