单管扩增同时检测Α和Β地中海贫血基因试剂盒.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410509044.7	申请日：	2014.09.28
公开号：	CN104212910A	公开日：	2014.12.17
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20140928\|\|\|公开
IPC分类号：	C12Q1/68	主分类号：	C12Q1/68
申请人：	广东凯普生物科技股份有限公司
发明人：	苏彬峰; 李烈军
地址：	521000 广东省潮州市经济开发区试验区北片高新区D5-3-3-4
优先权：
专利代理机构：		代理人：
PDF下载：	PDF下载

内容摘要

本发明公开了一种单管扩增同时检测α和β地中海贫血基因的试剂盒，包括：（1）一个基因芯片，其上带有探针，探针为SEQIDNo:1-37和SEQIDNo:1-37互补的序列；（2）一组用于多重PCR的引物，为SEDIDNo.38-46。本发明所述地贫基因检测试剂盒在同一个反应管中同时实现α-地贫基因扩增和β-地贫基因扩增，可同时检测3种缺失型α-地贫（--SEA、-α3.7和-α4.2）、3种突变型α-地贫（CS、QS、WS）以及19种突变型β-地贫。在同一个反应管中同时扩增α-地贫基因和β-地贫基因，可大大提高诊断效率和诊断准确性、降低成本、缩短检测时间，对开展地贫人群筛查，遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。

权利要求书

1.  单管扩增同时检测α和β地中海贫血基因的试剂盒，包括：
（1）一个基因芯片，其上带有探针，探针为SEQ ID No:1-37和SEQ ID No:1-37互补的序列；
（2）一组用于多重PCR的引物，为SED ID No.38-46。

2.  根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，还包括用于多重PCR的反应液，反应液按每人份含量由以下组份组成：
10 × PCR Buffer    5.00 μl；
5×PCR Enhancer     7.00 μl；
25 mM MgCl₂      3.00 μl；
25 mM dNTPs     0.80 μl；
100μM引物1    0.15μl；
100μM 引物2  0.15μl；
100μM 引物3  0.15μl；
100μM 引物4  0.10μl；
100μM 引物5  0.10μl；
100μM 引物6  0.15μl；
100μM 引物7  0.15μl；
100μM 引物8  0.15μl；
100μM 引物9  0.15μl；
H₂O   27.45 μl；
DNA聚合酶5U/μl     0.50 μl。

3.  根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述引物的5′端标记有生物素。

4.  根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。

5.  根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。

说明书

单管扩增同时检测α和β地中海贫血基因试剂盒
技术领域
本发明涉及基因领域，具体是一种单管扩增同时检测α和β地中海贫血基因试剂盒。
背景技术
地中海贫血（简称地贫）是由于人体基因突变或者缺失而导致α，β-珠蛋白肽链合成速率的不平衡，从而引起的溶血性贫血。地贫为全世界的高发病率遗传病之一，广泛分布于地中海国家及其他疟疾曾经高发地区。我国以长江以南各省发病率高，除广东、广西、海南省等发病率最高外，贵州、云南、四川等也是高发区。地贫常见的两种类型是α-地贫和β-地贫。
α-地贫是由于常染色体遗传性缺陷，使α珠蛋白基因缺失或功能障碍导致α珠蛋白肽链合成减少或不合成引起的慢性溶血病。α珠蛋白基因位于第16号染色体短臂末端的α珠蛋白基因簇中，该基因包括二个重复的α基因（α₂和α₁）、一个胚胎期类α基因（ζ₂）、三个假基因（Ψζ₁、Ψα₂和Ψα₁）和一个功能未知的基因（θ1），其排列顺序为：5′-ζ₂-Ψζ₁-Ψα₂ -Ψα₁-α₂-α₁-θ₁-3′，全长约30Kb。就一个单倍体而言：地贫可分为三类缺陷：地贫1，缺失两个基因（--/）；地贫2，缺失一个基因（-α/）；非缺失性α基因发生点突变或少数几个碱基的缺失（α^Tα或αα^T）。目前已鉴定的α地贫缺失类型至少36种，东南亚缺失型（--^SEA）、右侧缺失（-α^3.7）和左侧缺失（-α^4.2）是中国人最常见的3种缺失型。非缺失型α地贫点突变类型有30多种，在中国人群中最常见的Constant Spring(CS)、Quong Sze(QS)和Westmead（WS）。
β-地贫是由于血红蛋白的β珠蛋白基因突变导致β珠蛋白肽链缺如(β°)或合成不足(β+)，从而引起的遗传性溶血性贫血病。β珠蛋白基因位于11号染色体短臂（11p15），基因排列顺序为5′-ε-Gγ-Aγ-Ψβ-δ-β-3′，长度约60Kb。绝大多数β地贫是由于点突变所致，少数为基因缺失所致。β⁰珠蛋白生成障碍性贫血，突变导致β链的合成完全受抑制，无β链生成；β⁺珠蛋白生成障碍性贫血，突变导致β链的合成部分受抑制，有少量β链合成；非典型β珠蛋白生成障碍性贫血，分子缺陷位于β珠蛋白基因启动区或位点控制区（LCR），导致β珠蛋白表达受影响。全世界已报道170种左右β珠蛋白基因的突变型，导致中国人群β地贫发生的突变基因有23种。最主要的6种CD41-42(-4bp)，IVS-II-654(C-T)，CD17(A-T)，CD71-72(+A)，-28(A-G)以及CD26(G-A)，占中国人β地贫突变基因总数的80%以上，而且这些不同的β地贫基因在不同地区的发生率也有所不同。
该病在我国的患者及基因携带者大约有3000万，对我国的人口素质及国民健康造成了极大威胁。据前些年调研，仅在广西α-地贫基因携带率高达15％，β-地贫基因携带率也达到5％，全广西地中海贫血基因携带者约900多万，广东地中海贫血基因携带者也是近千万。按照该病的遗传规律，如果夫妻二人均为相同类型地中海基因携带者，则有25％的几率生出重型或中间型地中海贫血患儿，也就是说，每年全国有成千上万的重型或中间型地中海贫血患儿出生。
地中海贫血症的临床表型多样，可以从正常到需要反复输血，甚至危及生命，导致患者在未成年前夭折甚至死胎。该病在我国南方的高发病率，对社会和家庭产生巨大的精神和经济压力。然而目前该病尚缺乏理想的治疗方法，筛查是降低致病基因在人群中传递及降低患病率最有效的方法。研究和检测地中海贫血是一项很有意义的工作，它对开展地贫人群筛查，遗传咨询和产前诊断有重要的知道意义。对提高人口素质和促进整个社会的经济发展有重要的意义。
α-地贫传统的临床血液学检测方法如常规参数检测分析、红细胞渗透脆性试验、血红蛋白稳定性试验等特异性不高，较易产生假阴性；而肽链分析、HPLC、ELISA等检测方法由于检测单一、操作繁琐等原因正被技术日益成熟的基因检测所替代。传统基因诊断技术主要采用Southern印迹杂交方法，灵敏度高、准确率高，但操作时间长、要求DNA量多、需要同位素等原因使其只用于研究，不能进行大规模筛查。而普通PCR电泳技术，其方法与传统的Southern分子杂交相比操作简易、快速、准确、经济且易推广，为α-地贫基因诊断提供了较为有效的方法，但特异性较低，无法检测出常见的CS、QS、WS点突变，而且易出现假阴性或假阳性。β-地贫常用诊断技术有：RFLP(限制性片段长度多态性)连锁分析，寡核苷酸探针技术，等位基因特异性核苷酸(ASO)探针杂交技术，等位基因特异性扩增技术(ASPCR或ARMS)，反向杂交技术(RDB)，PCR斑点杂交法以及基因芯片等技术。
由于杂交分析检测技术特异性高，因而被广为推崇。DNA杂交是高密度基因芯片之核心分析方法，能在同一芯片上同时分析千万个不同的基因片段，大大加速了研究的速度。而在临床的应用上，低密度芯片更能达到灵敏度、特异性双高的严格要求，该方法已用于遗传病的基因分析许多年，其特异性在分辨单一碱基(SNP) 多态性中已达到100%的准确，故特别适用于基因分型。鉴于α-地贫主要以缺失类型为主，β-地贫的突变类型较多，因此采用先PCR扩增，再进行杂交是最简便快捷的筛查地中海贫血基因的方法，同时避免Gap-PCR体系设计以及单碱基突变的捕获的困难。杂交技术和PCR扩增技术结合，具有技术操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广、成本相对低的特点。
如申请号为201110117563.5的中国发明专利“α，β-地中海贫血的突变基因联合检测试剂盒”，该基因检测试剂盒通过PCR扩增技术结合杂交技术首次实现α，β-地贫同步联合检测，检出率高、灵敏度高、特异度好、假阳性率和假阴性率低，在临床诊断中得到了一定的推广。但是该产品需要将α-地贫和β-地贫分别在两个不同的PCR反应液中进行扩增，两种不同的扩增程序需要用两台PCR仪。申请号为201210494748.2的中国发明专利“α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒”虽然是用同一个扩增程序进行PCR扩增，在样本量少时一台PCR仪可以完成，但是该产品需要两种反应液（反应液I和反应液II），两次加样，两管扩增才能完成。这些产品对操作要求条件高、步骤繁琐、耗时长，尚不能满足临床诊断简便快速的要求。
至今为止，临床上用于检测地贫的产品，尚未出现在同一反应管中同时进行α-地贫和β-地贫基因扩增的产品。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种可在同一反应管中同时扩增α-珠蛋白基因缺失及基因突变区域和β-珠蛋白基因突变区域，同时检测3种缺失型α-地贫（--^SEA、-α^3.7和 -α^4.2）、3种突变型α-地贫（CS、QS、WS）及19种突变型β-地贫的单管扩增同时检测α和β地中海贫血基因的试剂盒，包括：
（1）一个基因芯片，其上带有探针，探针为SEQ ID No:1-37和SEQ ID No:1-37互补的序列；
（2）一组用于多重PCR的引物，为SED ID No.38-46。
本发明的探针序列如下：

名称碱基数序列号序列NP16SEQ ID NO.15′ -GTAGCCGTTCCTCCTG-3′ --^SEA18SEQ ID NO.25′ -CTAGTCGGGAGGCTGAGG-3′ -α^3.718SEQ ID NO.35′ -TGCCTGAGTTTTTTCCCT-3′ -α^4.217SEQ ID NO.45′ -CTGTCCCGGAATGTGCC-3′CSN17SEQ ID NO.55′ -AATACCGTTAAGCTGGA-3′QSN18SEQ ID NO.65′ -GCCTCCCTGGACAAGTTC-3′WSN18SEQ ID NO.75′ -CCTGCGGTGCACGCCTCC-3′CSM16SEQ ID NO.85′ -ATACCGTCAAGCTGGA-3′QSM16SEQ ID NO.95′ -CCTCCCCGGACAAGTT-3′WSM15SEQ ID NO.105′ -TGCGGTGCAGGCCTC-3′41-42N18SEQ ID NO.115′ -GGACTCAAAGAACCTCTG-3′17N18SEQ ID NO.125′ -TTCACCTTGCCCCACAGG-3′654N20SEQ ID NO.135′ -ATTGCTATTGCCTTAACCCA-3′ -28N19SEQ ID NO.145′ -GCCCTGACTTTTATGCCCA-3′71-72N20SEQ ID NO.155′ -CCATCACTAAAGGCACCGAG-3′βeN17SEQ ID NO.165′ -GGGCCTCACCACCAACT-3′IVS-I-1N18SEQ ID NO.175′ -TTGATACCAACCTGCCCA-3′27-28N18SEQ ID NO.185′ -CTGCCCAGGGCCTCACCA-3′41-42M17SEQ ID NO.195′ -CAAAGGACTCAACCTCT-3′43M18SEQ ID NO.205′ -AAGGACTAAAAGAACCTC-3′17M17SEQ ID NO.215′ -CGTTCACCTAGCCCCAC-3′14-15M16SEQ ID NO.225′ -CTTGCCCCACCAGGGC-3′654M18SEQ ID NO.235′ -TGCTATTACCTTAACCCA-3′71-72M19SEQ ID NO.245′ -CCATCACTTAAAGGCACCG-3′ -28M17SEQ ID NO.255′ -CCTGACTTCTATGCCCA-3′ -29M18SEQ ID NO.265′ -GCCCTGACTTTCATGCCC-3′ -30M15SEQ ID NO.275′ -TGACTTTTGTGCCCA-3′ -32M18SEQ ID NO.285′ -GACTTTTATTCCCAGCCC-3′βeM18SEQ ID NO.295′ -CAGGGCCTTACCACCAAC-3′IVS-I-1M16SEQ ID NO.305′ -GATACCAAACTGCCCA-3′IVS-I-1M16SEQ ID NO.315′ -ATACCAATCTGCCCAG-3′IVS-I-5M16SEQ ID NO.335′ -TTGATAGCAACCTGCC-3′27-28M17SEQ ID NO.325′ -CTGCCCAGGGGCCTCAC-3′31M17SEQ ID NO.345′ -CCACCAGCACCTAAGGG-3′CapM17SEQ ID NO.355′ -TGGTGTCTGAGGTTGCT-3′CapM18SEQ ID NO.365′ -AGCAAATGGAAGCAATAG-3′IntM17SEQ ID NO.375′ -GATGCACCCTGGTGTCT-3′

上述探针具有相近的Tm值，涵盖了25种地中海贫血突变类型，包括a-地贫常见的3种a-珠蛋白基因缺失（--^SEA、-α^4.2、-α^3.7）和3种突变型（CSM、 QSM、WSM）及基因缺失和突变的正常对照点（NP、CSN、QSN、WSN）；b-地贫常见的19种b-珠蛋白基因突变[（-28(A-G)、-29(A-G)、Cap(-AAAC，A-C)、Int（T-G）、CD14/15（+G）、CD17(A-T)、CD27/28（+C）、βE(G-A)、CD31(-C)、CD41/42 (-TCTT)、CD43(G-T)、CD71/72(+A)、IVS-I-1(G-T，G-A)、IVS-I-5(G-C)、IVS-II-654(C-T)、 -30(T-C)、-32(C-A)]及8种正常对照（41/42N、17N、654N、71/72N、-28N、bEN、IVS-I-1N、27/28N）。本发明针对各种地中海贫血及正常对照的探针的长度一般在14-25个碱基左右，探针5′或3′端进行氨基化处理。试验探针覆盖了98%以上常见的b基因突变位点及99%以上常见的a基因突变位点。本发明设计的探针有着合理的碱基成分、Tm值相近，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性大大增加。
本发明的引物序列如下：
名称碱基数序列号序列引物122SED ID No.385′ -CCACATCCCCTCACCTACATTC-3′引物222SED ID No.395′ -GAAGGGCCGGTGCAAGGAGGGG-3′引物321SED ID No.405′ -CTCCACTTTCCCTCCTCCATC-3′引物421SED ID No.415′ -TCGTGTCCACCGTCATCATAG-3′引物521SED ID No.425′ -GGACAGACGGTGGGAGAAGAC-3′引物620SED ID No.435′ -CAAGGACGGGACTGAGGTTA-3′引物721SED ID No.445′ -AGGGAGGGAGGAGGGTTTATT-3′引物822SED ID No.455′ -CAGAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3′引物922SED ID No.465′ -CCACACCAGCCACCACTTTCTG-3′

以上引物组合可同时扩增α-珠蛋白基因缺失及基因突变区域和β-珠蛋白基因突变区域。
本发明的试剂盒，还包括用于多重PCR的反应液，反应液由以下组份组成：
试剂组成每人份含量10 × PCR Buffer5.00 μl5×PCR Enhancer7.00 μl25 mM MgCl₂3.00 μl25 mM dNTPs0.80 μl100μM引物10.15μl100μM 引物20.15μl100μM 引物30.15μl100μM 引物40.10μl100μM 引物50.10μl100μM 引物60.15μl100μM 引物70.15μl100μM 引物80.15μl100μM 引物90.15μlH₂O27.45 μlDNA聚合酶5U/μl0.50 μl总体积45.00 μl

本发明上述的试剂盒，所述引物的5′端标记有生物素。
本发明上述的试剂盒，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。
本发明上述的试剂盒，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。
本发明所述地中海贫血基因检测试剂盒能一次试验同时检测缺失型α-地贫、非缺失型α-地贫和β-地贫，即一次试验检测6种常见类型的α-地贫（3种缺失型和3种突变型）以及19种突变型β-地贫，检测时间短、成本低、操作方便，对开展地贫人群筛查，遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。
本发明在设计合理的基础上，通过大量的实验调整，使本发明PCR扩增能在同一个条件同一个反应液中同时进行。只需要一种反应液，降低了成本；只需要一次加样，简化了操作步骤；只需要一台PCR仪即可完成，大大节约了实验室资源；而其他同类技术检测一个样本至少需要两种反应液、两次加样和两台PCR仪。

附图说明
以下是附图的说明，以便于理解上述发明的目的和具体特征。
图1为本发明的基因芯片上探针的具体分布位置的图片，每个位置代表不同的基因突变。
图2 .1为--^SEA/αα，β^N /β^N突变型的检测结果图片。
图2 .2为-α^3.7/αα，β^N/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .3为-α^4.2/αα，β^N /β^N突变型的检测结果图片。
图2 .4为α^CSα /αα，β^N /β^N突变型的检测结果图片。
图2 .5为α^QSα /αα，β^N /β^N突变型的检测结果图片。
图2 .6为α^WSα /αα，β^N /β^N突变型的检测结果图片。
图2 .7为αα /αα，β^41-42/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .8为αα /αα，β¹⁷/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .9为αα /αα，β⁶⁵⁴/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .10为αα /αα，β^71-72/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .11为αα /αα，β^-28/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .12为αα /αα，β^βE/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .13为αα /αα，β⁴³/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .14为αα /αα，β^14-15/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .15为αα /αα，β^-30/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .16为αα /αα，β^-32/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .17为αα /αα，β^-29/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .18为αα /αα，β^Cap(-AAAC)/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .19为αα /αα，β^Cap(A-C)/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .20为αα /αα，β³¹/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .21为αα /αα，β^IVS-I-5/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .22为αα /αα，β^Int/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .23为αα /αα，β^IVS-I-1(G-T)/β^N突变型的检测结果图片。
图2 .24为αα /αα，β^IVS-I-1(G-A)β^N突变型的检测结果图片。
图2 .25为αα /αα，β^27-28/β^N突变型的检测结果图片。
具体实施方式
1. 用于扩增待检样品中DNA的特异性引物的设计及PCR反应体系确定
1-1 引物设计
根据α-地贫基因缺失、α-地贫基因突变和β-地贫基因突变的序列资料设计了9条引物用于PCR扩增，9条引物组合置于同一个反应管中进行多重PCR，同时扩增α-地贫和β-地贫基因。

1-2 多重PCR反应体系的确定
通过大量的实验对比，控制Mg^2＋浓度、引物浓度和PCR Enhancer浓度可以做到a-地贫基因和β-地贫基因同时高效率扩增，特异性好。最终确定最优的PCR反应体系见表1：PCR反应液45μl，DNA加样量5μl，总反应体积为50μl。
表1 地贫多重PCR反应体系
试剂组成每人份加样量10 × PCR Buffer5.00 μl5×PCR Enhancer7.00 μl25 mM MgCl₂3.00 μl25 mM dNTPs0.80 μl100μM引物10.15μl100μM 引物20.15μl100μM 引物30.15μl100μM 引物40.10μl100μM 引物50.10μl100μM 引物60.15μl100μM 引物70.15μl100μM 引物80.15μl100μM 引物90.15μlH₂O27.45 μlDNA聚合酶5U/μl0.50 μlDNA模板5.00 μl总体积50.00 μl

1-3 多重PCR扩增程序的确定
经过大量实验对比优化，控制退火温度和退火时间可以做到特异性好，扩增效率高，最终确定的最佳扩增程序为：95°C热启动15min， 97°C变性50 sec、60°C退火60 sec、72°C延伸120 sec，共35个循环，最后一步72°C延伸10min。
在同一个条件同一个反应管中同时扩增a-地贫基因和β-地贫基因，减少了PCR仪的需求量，减少了操作步骤，降低了成本，一次加样就能够同时检测缺失型a-地贫、非缺失型a-地贫和突变型β-地贫；而其他同类试剂检测一个样本至少需要两种反应液、两次加样和两台PCR仪。

2. 用于检测a，b-地中海贫血的基因芯片的制备
2-1  探针的设计
a-地贫常见于3种a-珠蛋白基因缺失（--^SEA、-α^4.2、-α^3.7）和3种突变型（QS、CS、WS）；b-地贫常见于19种b-珠蛋白基因突变[（-28(A-G)、-29(A-G)、Cap(-AAAC，A-C)、Int（T-G）、CD14/15（+G）、CD17(A-T)、CD27/28（+C）、βE(G-A)、CD31(-C)、CD41/42 (-TCTT)、CD43(G-T)、CD71/72(+A)、IVS-I-1(G-T，G-A)、IVS-I-5(G-C)、IVS-II-654(C-T)、 -30(T-C)、-32(C-A)]，为检测上述a，b-地贫常见的突变类型，本发明共设计了37条探针，探针具体为SEQ ID No.1~37。这些探针有着合理的碱基成分、Tm值相近，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性大大增加。
探针的点样和固定
（1）探针的点样和排列
在直接寡核苷酸DNA探针的固定中，先将DNA探针用探针稀释液（pH8.4的0.5MNa₂CO₃和0.5MNaHCO₃的溶液）混合，进行点样。完成DNA探针的合成之后，启动DNA点样装置，在芯片制作程序的控制下，进行DNA探针的打印。通过DNA打印针每次取一个DNA探针，通过三维定点传递装置将DNA探针传递到指定的点样位置。完成一次打印后，荷样打印针清洗、干燥，进行下一轮探针的点样，依次类推，直至所有DNA探针传递点样完毕。
各探针在基因芯片上的具体分布位置见图1，本发明的基因芯片总共36个格子，其中左下角的一个格子为空白，没有探针；IVS-I-1M位点由双探针组成（SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31）；CapM位点由双探针组成（SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36）；其他位点每个格子对应一条探针。
（2）DNA探针的固定方法
对尼龙膜进行处理，首先放入0.1M HCl溶液中浸泡30秒钟，然后把已除去残余溶液的膜放入20%的EDAC溶液中浸泡15分钟，最后放在洗膜盘中用200mL的纯化水冲洗10秒钟，此步骤重复3次，再放到吸水纸上除去多余的残液。转入温度为20℃、湿度为45%的烘干箱内烘干12小时。将已烘干的尼龙膜用Kimwipes纸隔开，转入封口薄膜袋中，放进点膜间的冰箱中，贮藏在4℃的温度下，备用。
通过微量移液设备将上述制备好的探针分别点在上述的尼龙膜上，每滴0.4μL。点膜结束后，将膜放置于室温15分钟，进行反应。然后将膜转入0.1M NaOH溶液中浸泡10分钟，停止反应。将洗好的膜转入温度为20℃、湿度为45%的烘干箱内烘干12小时，即制得基因芯片。
利用DNA芯片进行检测
将步骤1中获得的地贫DNA样品的扩增产物在步骤2中制备的基因芯片进行检测，DNA样品和基因芯片中尼龙膜上的探针反应，最后根据显色情况进行判断。
将获得的地贫扩增产物在95°C下变性5~10分钟，迅速转移到冰水混合物中，放置2分钟。然后加入到预先温浴到42°C的0.8 mL杂交液（2×SSC/0.1%SDS）中，混合后加入杂交仪的反应孔中，应用于步骤2制得的基因芯片，42°C杂交30分钟，然后用溶液WB1（0.5×SSC/0.1%SDS，42°C温浴）清洗3~4遍。加入0.5mL封阻液（0.25%脱脂奶粉，0.05%硫柳汞），25°C封闭5分钟。抽干后加入0.5mL的酶标液（TBS中溶解的带有链霉亲和素标记的AP酶），酶标5分钟。用0.8mL溶液A（TBS，0.1% Tween20及0.05%叠氮钠）清洗4遍，然后加入0.5mL的显色液（NBT/BCIP），避光显色5分钟。最后用溶液B冲洗3遍，晾干，分析显色情况，判读结果。
序列表

<110>  广东凯普生物科技股份有限公司

<120>  单管扩增同时检测α和β地中海贫血基因试剂盒

<160>  46

<210>  1
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  NP

<400>  1
gtagccgttc ctcctg                                                     16

<210>  2
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  --^SEA

<400>  2
ctagtcggga ggctgagg                                                   18

<210>  3
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  -α^3.7

<400>  3
tgcctgagtt ttttccct                                                   18

<210>  4
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  -α^4.2

<400>  4
ctgtcccgga atgtgcc                                                    17

<210>  5
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  CSN

<400>  5
aataccgtta agctgga                                                    17

<210>  6
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  QSN

<400>  6
gcctccctgg acaagttc                                                   18

<210>  7
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  WSN

<400>  7
cctgcggtgc acgcctcc                                                   18

<210>  8
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  CSM

<400>  8
ataccgtcaa gctgga                                                     16

<210>  9
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  QSM

<400>  9
cctccccgga caagtt                                                     16

<210>  10
<211>  15
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  WSM

<400>  10
tgcggtgcag gcctc                                                      15

<210>  11
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  41-42N

<400>  11
ggactcaaag aacctctg                                                   18

<210>  12
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  17N

<400>  12
ttcaccttgc cccacagg                                                   18

<210>  13
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  654N

<400>  13
attgctattg ccttaaccca                                                 20

<210>  14
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  -28N

<400>  14
gccctgactt ttatgccca                                                  19

<210>  15
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  71-72N

<400>  15
ccatcactaa aggcaccgag                                                 20

<210>  16
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  βeN

<400>  16
gggcctcacc accaact                                                    17

<210>  17
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  IVS-I-1N

<400>  17
ttgataccaa cctgccca                                                   18

<210>  18
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  27-28N

<400>  18
ctgcccaggg cctcacca                                                   18

<210>  19
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  41-42M

<400>  19
caaaggactc aacctct                                                    17

<210>  20
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  43M

<400>  20
aaggactaaa agaacctc                                                   18

<210>  21
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  17M

<400>  21
cgttcaccta gccccac                                                    17

<210>  22
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  14-15M

<400>  22
cttgccccac cagggc                                                     16

<210>  23
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  654M

<400>  23
tgctattacc ttaaccca                                                   18

<210>  24
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  71-72M

<400>  24
ccatcactta aaggcaccg                                                  19

<210>  25
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  -28M

<400>  25
cctgacttct atgccca                                                    17

<210>  26
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  -29M

<400>  26
gccctgactt tcatgccc                                                   18

<210>  27
<211>  15
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  -30M

<400>  27
tgacttttgt gccca                                                      15

<210>  28
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  -32M

<400>  28
gacttttatt cccagccc                                                   18

<210>  29
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  βeM

<400>  29
cagggcctta ccaccaac                                                   18

<210>  30
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  IVS-I-1M

<400>  30
gataccaaac tgccca                                                     16

<210>  31
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  IVS-I-1M

<400>  31
ataccaatct gcccag                                                     16

<210>  32
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  IVS-I-5M

<400>  32
ttgatagcaa cctgcc                                                     16

<210>  33
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  27-28M

<400>  33
ctgcccaggg gcctcac                                                    17

<210>  34
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  31M

<400>  34
ccaccagcac ctaaggg                                                    17

<210>  35
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  CapM

<400>  35
tggtgtctga ggttgct                                                    17

<210>  36
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  CapM

<400>  36
agcaaatgga agcaatag                                                   18

<210>  37
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  IntM

<400>  37
gatgcaccct ggtgtct                                                    17

<210>  38
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  引物1

<400>  38
ccacatcccc tcacctacat tc                                              22

<210>  39
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  引物2

<400>  39
gaagggccgg tgcaaggagg gg                                              22

<210>  40
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  引物3

<400>  40
ctccactttc cctcctccat c                                               21

<210>  41
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  引物4

<400>  41
tcgtgtccac cgtcatcata g                                               21

<210>  42
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  引物5

<400>  42
ggacagacgg tgggagaaga c                                               21

<210>  43
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  引物6

<400>  43
caaggacggg actgaggtta                                                 20

<210>  44
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  引物7

<400>  44
agggagggag gagggtttat t                                               21

<210>  45
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  引物8

<400>  45
cagaagagcc aaggacaggt ac                                              22

<210>  46
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<223>  引物9

<400>  46
ccacaccagc caccactttc tg                                              22

资源描述

《单管扩增同时检测Α和Β地中海贫血基因试剂盒.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《单管扩增同时检测Α和Β地中海贫血基因试剂盒.pdf（38页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、10申请公布号CN104212910A43申请公布日20141217CN104212910A21申请号201410509044722申请日20140928C12Q1/6820060171申请人广东凯普生物科技股份有限公司地址521000广东省潮州市经济开发区试验区北片高新区D533472发明人苏彬峰李烈军54发明名称单管扩增同时检测和地中海贫血基因试剂盒57摘要本发明公开了一种单管扩增同时检测和地中海贫血基因的试剂盒，包括（1）一个基因芯片，其上带有探针，探针为SEQIDNO137和SEQIDNO137互补的序列；（2）一组用于多重PCR的引物，为SEDIDNO3846。本发明所述地贫基因检测。

2、试剂盒在同一个反应管中同时实现地贫基因扩增和地贫基因扩增，可同时检测3种缺失型地贫（SEA、37和42）、3种突变型地贫（CS、QS、WS）以及19种突变型地贫。在同一个反应管中同时扩增地贫基因和地贫基因，可大大提高诊断效率和诊断准确性、降低成本、缩短检测时间，对开展地贫人群筛查，遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表15页附图14页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表15页附图14页10申请公布号CN104212910ACN104212910A1/1页21单管扩增同时检测和地中海贫血基因的试剂盒，包括（1）一个。

3、基因芯片，其上带有探针，探针为SEQIDNO137和SEQIDNO137互补的序列；（2）一组用于多重PCR的引物，为SEDIDNO3846。2根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，还包括用于多重PCR的反应液，反应液按每人份含量由以下组份组成10PCRBUFFER500L；5PCRENHANCER700L；25MMMGCL2300L；25MMDNTPS080L；100M引物1015L；100M引物2015L；100M引物3015L；100M引物4010L；100M引物5010L；100M引物6015L；100M引物7015L；100M引物8015L；100M引物9015L；H2O2745L；。

4、DNA聚合酶5U/L050L。3根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述引物的5端标记有生物素。4根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。5根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。权利要求书CN104212910A1/7页3单管扩增同时检测和地中海贫血基因试剂盒技术领域0001本发明涉及基因领域，具体是一种单管扩增同时检测和地中海贫血基因试剂盒。背景技术0002地中海贫血（简称地贫）是由于人体基因突变或者缺失而导致，珠蛋白肽链合成速率的不平衡，从而引起的溶血性贫血。地贫为全世界的高发病率遗传病之一，广泛分布于地中海国家及。

5、其他疟疾曾经高发地区。我国以长江以南各省发病率高，除广东、广西、海南省等发病率最高外，贵州、云南、四川等也是高发区。地贫常见的两种类型是地贫和地贫。0003地贫是由于常染色体遗传性缺陷，使珠蛋白基因缺失或功能障碍导致珠蛋白肽链合成减少或不合成引起的慢性溶血病。珠蛋白基因位于第16号染色体短臂末端的珠蛋白基因簇中，该基因包括二个重复的基因（2和1）、一个胚胎期类基因（2）、三个假基因（1、2和1）和一个功能未知的基因（1），其排列顺序为521212113，全长约30KB。就一个单倍体而言地贫可分为三类缺陷地贫1，缺失两个基因（/）；地贫2，缺失一个基因（/）；非缺失性基因发生点突变或少数几个碱基。

6、的缺失（T或T）。目前已鉴定的地贫缺失类型至少36种，东南亚缺失型（SEA）、右侧缺失（37）和左侧缺失（42）是中国人最常见的3种缺失型。非缺失型地贫点突变类型有30多种，在中国人群中最常见的CONSTANTSPRINGCS、QUONGSZEQS和WESTMEAD（WS）。0004地贫是由于血红蛋白的珠蛋白基因突变导致珠蛋白肽链缺如或合成不足，从而引起的遗传性溶血性贫血病。珠蛋白基因位于11号染色体短臂（11P15），基因排列顺序为5GA3，长度约60KB。绝大多数地贫是由于点突变所致，少数为基因缺失所致。0珠蛋白生成障碍性贫血，突变导致链的合成完全受抑制，无链生成；珠蛋白生成障碍性贫血，突。

7、变导致链的合成部分受抑制，有少量链合成；非典型珠蛋白生成障碍性贫血，分子缺陷位于珠蛋白基因启动区或位点控制区（LCR），导致珠蛋白表达受影响。全世界已报道170种左右珠蛋白基因的突变型，导致中国人群地贫发生的突变基因有23种。最主要的6种CD41424BP，IVSII654CT，CD17AT，CD7172A，28AG以及CD26GA，占中国人地贫突变基因总数的80以上，而且这些不同的地贫基因在不同地区的发生率也有所不同。0005该病在我国的患者及基因携带者大约有3000万，对我国的人口素质及国民健康造成了极大威胁。据前些年调研，仅在广西地贫基因携带率高达15，地贫基因携带率也达到5，全广西地中。

8、海贫血基因携带者约900多万，广东地中海贫血基因携带者也是近千万。按照该病的遗传规律，如果夫妻二人均为相同类型地中海基因携带者，则有25的几率生出重型或中间型地中海贫血患儿，也就是说，每年全国有成千上万的重型或中间型地中海贫血患儿出生。说明书CN104212910A2/7页40006地中海贫血症的临床表型多样，可以从正常到需要反复输血，甚至危及生命，导致患者在未成年前夭折甚至死胎。该病在我国南方的高发病率，对社会和家庭产生巨大的精神和经济压力。然而目前该病尚缺乏理想的治疗方法，筛查是降低致病基因在人群中传递及降低患病率最有效的方法。研究和检测地中海贫血是一项很有意义的工作，它对开展地贫人群筛查。

9、，遗传咨询和产前诊断有重要的知道意义。对提高人口素质和促进整个社会的经济发展有重要的意义。0007地贫传统的临床血液学检测方法如常规参数检测分析、红细胞渗透脆性试验、血红蛋白稳定性试验等特异性不高，较易产生假阴性；而肽链分析、HPLC、ELISA等检测方法由于检测单一、操作繁琐等原因正被技术日益成熟的基因检测所替代。传统基因诊断技术主要采用SOUTHERN印迹杂交方法，灵敏度高、准确率高，但操作时间长、要求DNA量多、需要同位素等原因使其只用于研究，不能进行大规模筛查。而普通PCR电泳技术，其方法与传统的SOUTHERN分子杂交相比操作简易、快速、准确、经济且易推广，为地贫基因诊断提供了较为有。

10、效的方法，但特异性较低，无法检测出常见的CS、QS、WS点突变，而且易出现假阴性或假阳性。地贫常用诊断技术有RFLP限制性片段长度多态性连锁分析，寡核苷酸探针技术，等位基因特异性核苷酸ASO探针杂交技术，等位基因特异性扩增技术ASPCR或ARMS，反向杂交技术RDB，PCR斑点杂交法以及基因芯片等技术。0008由于杂交分析检测技术特异性高，因而被广为推崇。DNA杂交是高密度基因芯片之核心分析方法，能在同一芯片上同时分析千万个不同的基因片段，大大加速了研究的速度。而在临床的应用上，低密度芯片更能达到灵敏度、特异性双高的严格要求，该方法已用于遗传病的基因分析许多年，其特异性在分辨单一碱基SNP多态。

11、性中已达到100的准确，故特别适用于基因分型。鉴于地贫主要以缺失类型为主，地贫的突变类型较多，因此采用先PCR扩增，再进行杂交是最简便快捷的筛查地中海贫血基因的方法，同时避免GAPPCR体系设计以及单碱基突变的捕获的困难。杂交技术和PCR扩增技术结合，具有技术操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广、成本相对低的特点。0009如申请号为2011101175635的中国发明专利“，地中海贫血的突变基因联合检测试剂盒”，该基因检测试剂盒通过PCR扩增技术结合杂交技术首次实现，地贫同步联合检测，检出率高、灵敏度高、特异度好、假阳性率和假阴性率低，在临床诊断中得到了一定的推广。但是该。

12、产品需要将地贫和地贫分别在两个不同的PCR反应液中进行扩增，两种不同的扩增程序需要用两台PCR仪。申请号为2012104947482的中国发明专利“和地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒”虽然是用同一个扩增程序进行PCR扩增，在样本量少时一台PCR仪可以完成，但是该产品需要两种反应液（反应液I和反应液II），两次加样，两管扩增才能完成。这些产品对操作要求条件高、步骤繁琐、耗时长，尚不能满足临床诊断简便快速的要求。0010至今为止，临床上用于检测地贫的产品，尚未出现在同一反应管中同时进行地贫和地贫基因扩增的产品。发明内容0011本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种可在同一反应管中同时扩增珠蛋。

13、白基因缺失及基因突变区域和珠蛋白基因突变区域，同时检测3种缺失型地贫说明书CN104212910A3/7页5（SEA、37和42）、3种突变型地贫（CS、QS、WS）及19种突变型地贫的单管扩增同时检测和地中海贫血基因的试剂盒，包括（1）一个基因芯片，其上带有探针，探针为SEQIDNO137和SEQIDNO137互补的序列；（2）一组用于多重PCR的引物，为SEDIDNO3846。0012本发明的探针序列如下名称碱基数序列号序列NP16SEQIDNO15GTAGCCGTTCCTCCTG3SEA18SEQIDNO25CTAGTCGGGAGGCTGAGG33718SEQIDNO35TGCCTGAG。

14、TTTTTTCCCT34217SEQIDNO45CTGTCCCGGAATGTGCC3CSN17SEQIDNO55AATACCGTTAAGCTGGA3QSN18SEQIDNO65GCCTCCCTGGACAAGTTC3WSN18SEQIDNO75CCTGCGGTGCACGCCTCC3CSM16SEQIDNO85ATACCGTCAAGCTGGA3QSM16SEQIDNO95CCTCCCCGGACAAGTT3WSM15SEQIDNO105TGCGGTGCAGGCCTC34142N18SEQIDNO115GGACTCAAAGAACCTCTG317N18SEQIDNO125TTCACCTTGCCCCACA。

15、GG3654N20SEQIDNO135ATTGCTATTGCCTTAACCCA328N19SEQIDNO145GCCCTGACTTTTATGCCCA37172N20SEQIDNO155CCATCACTAAAGGCACCGAG3EN17SEQIDNO165GGGCCTCACCACCAACT3IVSI1N18SEQIDNO175TTGATACCAACCTGCCCA32728N18SEQIDNO185CTGCCCAGGGCCTCACCA34142M17SEQIDNO195CAAAGGACTCAACCTCT343M18SEQIDNO205AAGGACTAAAAGAACCTC317M17SEQIDNO2。

16、15CGTTCACCTAGCCCCAC31415M16SEQIDNO225CTTGCCCCACCAGGGC3654M18SEQIDNO235TGCTATTACCTTAACCCA37172M19SEQIDNO245CCATCACTTAAAGGCACCG328M17SEQIDNO255CCTGACTTCTATGCCCA329M18SEQIDNO265GCCCTGACTTTCATGCCC330M15SEQIDNO275TGACTTTTGTGCCCA332M18SEQIDNO285GACTTTTATTCCCAGCCC3EM18SEQIDNO295CAGGGCCTTACCACCAAC3IVSI1M16S。

17、EQIDNO305GATACCAAACTGCCCA3IVSI1M16SEQIDNO315ATACCAATCTGCCCAG3IVSI5M16SEQIDNO335TTGATAGCAACCTGCC32728M17SEQIDNO325CTGCCCAGGGGCCTCAC331M17SEQIDNO345CCACCAGCACCTAAGGG3CAPM17SEQIDNO355TGGTGTCTGAGGTTGCT3CAPM18SEQIDNO365AGCAAATGGAAGCAATAG3INTM17SEQIDNO375GATGCACCCTGGTGTCT3上述探针具有相近的TM值，涵盖了25种地中海贫血突变类型，包括A地。

18、贫常见的3种A珠蛋白基因缺失（SEA、42、37）和3种突变型（CSM、QSM、WSM）及基因缺失和突变的正常对照点（NP、CSN、QSN、WSN）；B地贫常见的19种B珠蛋白基因突变（28AG、29AG、CAPAAAC，AC、INT（TG）、CD14/15（G）、CD17AT、CD27/28（C）、EGA、CD31C、CD41/42TCTT、CD43GT、CD71/72A、IVSI1GT，说明书CN104212910A4/7页6GA、IVSI5GC、IVSII654CT、30TC、32CA及8种正常对照（41/42N、17N、654N、71/72N、28N、BEN、IVSI1N、27/28N。

19、）。本发明针对各种地中海贫血及正常对照的探针的长度一般在1425个碱基左右，探针5或3端进行氨基化处理。试验探针覆盖了98以上常见的B基因突变位点及99以上常见的A基因突变位点。本发明设计的探针有着合理的碱基成分、TM值相近，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性大大增加。0013本发明的引物序列如下名称碱基数序列号序列引物122SEDIDNO385CCACATCCCCTCACCTACATTC3引物222SEDIDNO395GAAGGGCCGGTGCAAGGAGGGG3引物321SEDIDNO405CTCCACTTTCCCTCCTCCATC3引物42。

20、1SEDIDNO415TCGTGTCCACCGTCATCATAG3引物521SEDIDNO425GGACAGACGGTGGGAGAAGAC3引物620SEDIDNO435CAAGGACGGGACTGAGGTTA3引物721SEDIDNO445AGGGAGGGAGGAGGGTTTATT3引物822SEDIDNO455CAGAAGAGCCAAGGACAGGTAC3引物922SEDIDNO465CCACACCAGCCACCACTTTCTG3以上引物组合可同时扩增珠蛋白基因缺失及基因突变区域和珠蛋白基因突变区域。0014本发明的试剂盒，还包括用于多重PCR的反应液，反应液由以下组份组成试剂组成每人份含。

21、量10PCRBUFFER500L5PCRENHANCER700L25MMMGCL2300L25MMDNTPS080L100M引物1015L100M引物2015L100M引物3015L100M引物4010L100M引物5010L100M引物6015L100M引物7015L100M引物8015L100M引物9015LH2O2745LDNA聚合酶5U/L050L总体积4500L本发明上述的试剂盒，所述引物的5端标记有生物素。0015本发明上述的试剂盒，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。0016本发明上述的试剂盒，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。0017本发明所述地中海贫血基因检测试剂盒能一。

22、次试验同时检测缺失型地贫、非缺失型地贫和地贫，即一次试验检测6种常见类型的地贫（3种缺失型和3种突变型）以及19种突变型地贫，检测时间短、成本低、操作方便，对开展地贫人群筛查，遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。0018本发明在设计合理的基础上，通过大量的实验调整，使本发明PCR扩增能在同一个条件同一个反应液中同时进行。只需要一种反应液，降低了成本；只需要一次加样，简化说明书CN104212910A5/7页7了操作步骤；只需要一台PCR仪即可完成，大大节约了实验室资源；而其他同类技术检测一个样本至少需要两种反应液、两次加样和两台PCR仪。0019附图说明0020以下是附图的说明，以便于理解上述发。

23、明的目的和具体特征。0021图1为本发明的基因芯片上探针的具体分布位置的图片，每个位置代表不同的基因突变。0022图21为SEA/，N/N突变型的检测结果图片。0023图22为37/，N/N突变型的检测结果图片。0024图23为42/，N/N突变型的检测结果图片。0025图24为CS/，N/N突变型的检测结果图片。0026图25为QS/，N/N突变型的检测结果图片。0027图26为WS/，N/N突变型的检测结果图片。0028图27为/，4142/N突变型的检测结果图片。0029图28为/，17/N突变型的检测结果图片。0030图29为/，654/N突变型的检测结果图片。0031图210为/，7。

24、172/N突变型的检测结果图片。0032图211为/，28/N突变型的检测结果图片。0033图212为/，E/N突变型的检测结果图片。0034图213为/，43/N突变型的检测结果图片。0035图214为/，1415/N突变型的检测结果图片。0036图215为/，30/N突变型的检测结果图片。0037图216为/，32/N突变型的检测结果图片。0038图217为/，29/N突变型的检测结果图片。0039图218为/，CAPAAAC/N突变型的检测结果图片。0040图219为/，CAPAC/N突变型的检测结果图片。0041图220为/，31/N突变型的检测结果图片。0042图221为/，IVSI。

25、5/N突变型的检测结果图片。0043图222为/，INT/N突变型的检测结果图片。0044图223为/，IVSI1GT/N突变型的检测结果图片。0045图224为/，IVSI1GAN突变型的检测结果图片。0046图225为/，2728/N突变型的检测结果图片。具体实施方式00471用于扩增待检样品中DNA的特异性引物的设计及PCR反应体系确定11引物设计根据地贫基因缺失、地贫基因突变和地贫基因突变的序列资料设计了9条引物用于PCR扩增，9条引物组合置于同一个反应管中进行多重PCR，同时扩增地贫和说明书CN104212910A6/7页8地贫基因。004812多重PCR反应体系的确定通过大量的实验。

26、对比，控制MG2浓度、引物浓度和PCRENHANCER浓度可以做到A地贫基因和地贫基因同时高效率扩增，特异性好。最终确定最优的PCR反应体系见表1PCR反应液45L，DNA加样量5L，总反应体积为50L。0049表1地贫多重PCR反应体系试剂组成每人份加样量10PCRBUFFER500L5PCRENHANCER700L25MMMGCL2300L25MMDNTPS080L100M引物1015L100M引物2015L100M引物3015L100M引物4010L100M引物5010L100M引物6015L100M引物7015L100M引物8015L100M引物9015LH2O2745LDNA聚合酶5。

27、U/L050LDNA模板500L总体积5000L13多重PCR扩增程序的确定经过大量实验对比优化，控制退火温度和退火时间可以做到特异性好，扩增效率高，最终确定的最佳扩增程序为95C热启动15MIN，97C变性50SEC、60C退火60SEC、72C延伸120SEC，共35个循环，最后一步72C延伸10MIN。0050在同一个条件同一个反应管中同时扩增A地贫基因和地贫基因，减少了PCR仪的需求量，减少了操作步骤，降低了成本，一次加样就能够同时检测缺失型A地贫、非缺失型A地贫和突变型地贫；而其他同类试剂检测一个样本至少需要两种反应液、两次加样和两台PCR仪。00512用于检测A，B地中海贫血的基因。

28、芯片的制备21探针的设计A地贫常见于3种A珠蛋白基因缺失（SEA、42、37）和3种突变型（QS、CS、WS）；B地贫常见于19种B珠蛋白基因突变（28AG、29AG、CAPAAAC，AC、INT（TG）、CD14/15（G）、CD17AT、CD27/28（C）、EGA、CD31C、CD41/42TCTT、CD43GT、CD71/72A、IVSI1GT，GA、IVSI5GC、IVSII654CT、30TC、32CA，为检测上述A，B地贫常见的突变类型，本发明共设计了37条探针，探针具体为SEQIDNO137。这些探针有着合理的碱基成分、TM值相近，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的。

29、问题而影响杂交的结果，使检查的准确性大大增加。0052探针的点样和固定（1）探针的点样和排列在直接寡核苷酸DNA探针的固定中，先将DNA探针用探针稀释液（PH84的05MNA2CO3说明书CN104212910A7/7页9和05MNAHCO3的溶液）混合，进行点样。完成DNA探针的合成之后，启动DNA点样装置，在芯片制作程序的控制下，进行DNA探针的打印。通过DNA打印针每次取一个DNA探针，通过三维定点传递装置将DNA探针传递到指定的点样位置。完成一次打印后，荷样打印针清洗、干燥，进行下一轮探针的点样，依次类推，直至所有DNA探针传递点样完毕。0053各探针在基因芯片上的具体分布位置见图1，。

30、本发明的基因芯片总共36个格子，其中左下角的一个格子为空白，没有探针；IVSI1M位点由双探针组成（SEQIDNO30和SEQIDNO31）；CAPM位点由双探针组成（SEQIDNO35和SEQIDNO36）；其他位点每个格子对应一条探针。0054（2）DNA探针的固定方法对尼龙膜进行处理，首先放入01MHCL溶液中浸泡30秒钟，然后把已除去残余溶液的膜放入20的EDAC溶液中浸泡15分钟，最后放在洗膜盘中用200ML的纯化水冲洗10秒钟，此步骤重复3次，再放到吸水纸上除去多余的残液。转入温度为20、湿度为45的烘干箱内烘干12小时。将已烘干的尼龙膜用KIMWIPES纸隔开，转入封口薄膜袋中，。

31、放进点膜间的冰箱中，贮藏在4的温度下，备用。0055通过微量移液设备将上述制备好的探针分别点在上述的尼龙膜上，每滴04L。点膜结束后，将膜放置于室温15分钟，进行反应。然后将膜转入01MNAOH溶液中浸泡10分钟，停止反应。将洗好的膜转入温度为20、湿度为45的烘干箱内烘干12小时，即制得基因芯片。0056利用DNA芯片进行检测将步骤1中获得的地贫DNA样品的扩增产物在步骤2中制备的基因芯片进行检测，DNA样品和基因芯片中尼龙膜上的探针反应，最后根据显色情况进行判断。0057将获得的地贫扩增产物在95C下变性510分钟，迅速转移到冰水混合物中，放置2分钟。然后加入到预先温浴到42C的08ML杂。

32、交液（2SSC/01SDS）中，混合后加入杂交仪的反应孔中，应用于步骤2制得的基因芯片，42C杂交30分钟，然后用溶液WB1（05SSC/01SDS，42C温浴）清洗34遍。加入05ML封阻液（025脱脂奶粉，005硫柳汞），25C封闭5分钟。抽干后加入05ML的酶标液（TBS中溶解的带有链霉亲和素标记的AP酶），酶标5分钟。用08ML溶液A（TBS，01TWEEN20及005叠氮钠）清洗4遍，然后加入05ML的显色液（NBT/BCIP），避光显色5分钟。最后用溶液B冲洗3遍，晾干，分析显色情况，判读结果。说明书CN104212910A1/15页10序列表广东凯普生物科技股份有限公司单管扩增同。

33、时检测和地中海贫血基因试剂盒46116DNA人工序列NP1GTAGCCGTTCCTCCTG16218DNA人工序列SEA2CTAGTCGGGAGGCTGAGG18318DNA人工序列序列表CN104212910A102/15页11373TGCCTGAGTTTTTTCCCT18417DNA人工序列424CTGTCCCGGAATGTGCC17517DNA人工序列CSN5AATACCGTTAAGCTGGA17618DNA人工序列QSN6序列表CN104212910A113/15页12GCCTCCCTGGACAAGTTC18718DNA人工序列WSN7CCTGCGGTGCACGCCTCC18816DN。

34、A人工序列CSM8ATACCGTCAAGCTGGA16916DNA人工序列QSM9CCTCCCCGGACAAGTT16序列表CN104212910A124/15页131015DNA人工序列WSM10TGCGGTGCAGGCCTC151118DNA人工序列4142N11GGACTCAAAGAACCTCTG181218DNA人工序列17N12TTCACCTTGCCCCACAGG181320DNA序列表CN104212910A135/15页14人工序列654N13ATTGCTATTGCCTTAACCCA201419DNA人工序列28N14GCCCTGACTTTTATGCCCA191520DNA人工序。

35、列7172N15CCATCACTAAAGGCACCGAG201617DNA人工序列序列表CN104212910A146/15页15EN16GGGCCTCACCACCAACT171718DNA人工序列IVSI1N17TTGATACCAACCTGCCCA181818DNA人工序列2728N18CTGCCCAGGGCCTCACCA181917DNA人工序列4142M19序列表CN104212910A157/15页16CAAAGGACTCAACCTCT172018DNA人工序列43M20AAGGACTAAAAGAACCTC182117DNA人工序列17M21CGTTCACCTAGCCCCAC17221。

36、6DNA人工序列1415M22CTTGCCCCACCAGGGC16序列表CN104212910A168/15页172318DNA人工序列654M23TGCTATTACCTTAACCCA182419DNA人工序列7172M24CCATCACTTAAAGGCACCG192517DNA人工序列28M25CCTGACTTCTATGCCCA172618DNA序列表CN104212910A179/15页18人工序列29M26GCCCTGACTTTCATGCCC182715DNA人工序列30M27TGACTTTTGTGCCCA152818DNA人工序列32M28GACTTTTATTCCCAGCCC18291。

37、8DNA人工序列序列表CN104212910A1810/15页19EM29CAGGGCCTTACCACCAAC183016DNA人工序列IVSI1M30GATACCAAACTGCCCA163116DNA人工序列IVSI1M31ATACCAATCTGCCCAG163216DNA人工序列IVSI5M32序列表CN104212910A1911/15页20TTGATAGCAACCTGCC163317DNA人工序列2728M33CTGCCCAGGGGCCTCAC173417DNA人工序列31M34CCACCAGCACCTAAGGG173517DNA人工序列CAPM35TGGTGTCTGAGGTTGCT1。

38、7序列表CN104212910A2012/15页213618DNA人工序列CAPM36AGCAAATGGAAGCAATAG183717DNA人工序列INTM37GATGCACCCTGGTGTCT173822DNA人工序列引物138CCACATCCCCTCACCTACATTC223922DNA序列表CN104212910A2113/15页22人工序列引物239GAAGGGCCGGTGCAAGGAGGGG224021DNA人工序列引物340CTCCACTTTCCCTCCTCCATC214121DNA人工序列引物441TCGTGTCCACCGTCATCATAG214221DNA人工序列序列表CN10。

39、4212910A2214/15页23引物542GGACAGACGGTGGGAGAAGAC214320DNA人工序列引物643CAAGGACGGGACTGAGGTTA204421DNA人工序列引物744AGGGAGGGAGGAGGGTTTATT214522DNA人工序列引物845序列表CN104212910A2315/15页24CAGAAGAGCCAAGGACAGGTAC224622DNA人工序列引物946CCACACCAGCCACCACTTTCTG22序列表CN104212910A241/14页25图1说明书附图CN104212910A252/14页26图21图22说明书附图CN1042129。

40、10A263/14页27图23图24说明书附图CN104212910A274/14页28图25图26说明书附图CN104212910A285/14页29图27图28说明书附图CN104212910A296/14页30图29图210说明书附图CN104212910A307/14页31图211图212说明书附图CN104212910A318/14页32图213图214说明书附图CN104212910A329/14页33图215图216说明书附图CN104212910A3310/14页34图217图218说明书附图CN104212910A3411/14页35图219图220说明书附图CN104212910A3512/14页36图221图222说明书附图CN104212910A3613/14页37图223图224说明书附图CN104212910A3714/14页38图225说明书附图CN104212910A38。

展开阅读全文