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1、10申请公布号CN104195270A43申请公布日20141210CN104195270A21申请号201410484127522申请日20140919C12Q1/70200601C12Q1/6820060171申请人天津市水生动物疫病预防控制中心地址300221天津市河西区解放南路442号72发明人孙金生薛淑霞孙妍耿绪云74专利代理机构天津市北洋有限责任专利代理事务所12201代理人陆艺54发明名称对虾白斑综合症病毒可视快速检测试剂盒及检测方法57摘要本发明公开了一种对虾白斑综合症病毒可视快速检测试剂盒及检测方法，检测试剂盒包括试剂A将十六烷基三甲基溴化铵、NACL、乙二胺四乙酸和羟基甲基。
2、氨基甲烷盐酸加水至100ML得到溶液；试剂B蛋白酶K水溶液；试剂C核酸提取磁珠重悬在双蒸水中；试剂D异丙醇；试剂E乙醇水溶液；试剂F灭菌双蒸水；试剂G对虾白斑综合症病毒阳性质粒；装有试剂H的检测管本发明试剂盒的整个操作过程十分简便，在152个小时之内就可以完成对虾WSSV的检测，并且不需要任何高端的仪器设备，仅需要一个水浴锅或金属浴就可以完成，适合在实际生产的过程中推广使用。51INTCL权利要求书2页说明书6页序列表3页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页序列表3页附图1页10申请公布号CN104195270ACN104195270A1/2页21一。
3、种对虾白斑综合症病毒可视快速检测试剂盒，其特征是包括试剂A，用下述方法制成将十六烷基三甲基溴化铵、NACL、乙二胺四乙酸和羟基甲基氨基甲烷盐酸加水至100ML得到溶液，溶液中十六烷基三甲基溴化铵的克数为153G，NACL的浓度为1315M，乙二胺四乙酸的浓度为1525MM，羟基甲基氨基甲烷盐酸的浓度为1525MM；调节PH75得到试剂A；试剂B浓度为2030MG/ML的蛋白酶K水溶液；试剂C100MG核酸提取磁珠重悬在1ML的双蒸水中；试剂D异丙醇；试剂E体积百分比浓度为6575的乙醇水溶液；试剂F灭菌双蒸水；试剂G对虾白斑综合症病毒阳性质粒；装有试剂H的检测管在检测管中按比例用10倍含MGS。
4、O4的恒温扩增反应缓冲液25L，40MM的脱氧核糖核苷酸35L，25MM的MGCL26L，5M的甜菜碱4L，100M的用SEQIDNO1所示的引物P104L，100M的用SEQIDNO2所示的引物P204L，100M的用SEQIDNO3所示的引物P302L，100M的用SEQIDNO4所示的引物P402L，100M的用SEQIDNO5所示的引物P5005L，100M的用SEQIDNO6所示的引物P6005L，BSTDNA聚合酶8U，钙黄绿素染料1L，灭菌双蒸水37L混合；研磨棒、吸管、牙签、15ML样品管和磁力架。2根据权利要求1所述的一种对虾白斑综合症病毒可视快速检测试剂盒，其特征是所述对虾。
5、白斑综合症病毒阳性质粒是用下述方法制成PCR扩增对虾白斑综合症病毒的一段保守区序列SEQIDNO7，琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化，连接到PMD18T载体上并转化到TOP10细胞中，测序鉴定阳性克隆子，把测序正确的阳性克隆子在LB培养基中重新培养，用质粒提取试剂盒提取质粒即为对虾白斑综合症病毒阳性质粒。3使用权利要求1的试剂盒检测对虾白斑综合症病毒的方法，其特征是包括如下步骤步骤一、模板的制备1取对虾的仔虾个体或幼虾的个体或成虾的鳃丝组织为样品2050MG至称为样品管1的15ML样品管中，用吸管加入试剂A至样品管1的三分之一处；2向样品管1中滴加13滴试剂B，用研磨棒将样品进行研磨，5060水浴放置。
6、4560分钟；3用吸管吸取上清液至称为样品管2的另一个15ML样品管中；用吸管充分吹打试剂C，使核酸提取磁珠悬浮，向样品管2中滴入1滴试剂C；4向样品管2中滴入1015滴试剂D，轻轻颠倒混匀后，放到磁力架上；待管中的核酸提取磁珠都集中到管底后，用吸管将上清液吸出并弃掉；5向样品管2中滴入1020滴试剂E，充分颠倒混匀后，放到磁力架上，待管中的核酸提取磁珠集中到管底后，用吸管将上清液吸出并弃掉；6重复步骤5；7将样品管2的管盖打开，5060水浴放置25分钟；8向样品管2中滴入13滴试剂F，用手指轻弹样品管底部，使核酸提取磁珠充分悬权利要求书CN104195270A2/2页3浮，将样品管2放到磁力。
7、架上，待管中的核酸提取磁珠都集中到管底后，9099水浴放置35分钟，放到磁力架上，室温冷却13分钟；步骤二、LAMP扩增及结果判定用3个牙签分别蘸取试剂F、试剂G及样品管2中的样品上清液，至3个装有试剂H的检测管内，置于6065水浴保温3045分钟，9099水浴保温13分钟后取出，立即用肉眼观察反应液的颜色；含有试剂G的检测管为阳性对照显示为荧光绿色，含有试剂F的检测管为空白对照显示为橙黄色，样品的反应液颜色与阳性对照和空白对照比较，表示结果。4根据权利要求2所述的检测方法，其特征是所述对虾为凡纳滨对虾，中国对虾，斑节对虾或日本对虾。权利要求书CN104195270A1/6页4对虾白斑综合症病。
8、毒可视快速检测试剂盒及检测方法技术领域0001本发明涉及水产养殖中病原的检测技术，具体涉及对虾白斑综合症病毒WHITESPOTSYNDROMEVIRUS,WSSV的可视快速检测试剂盒及检测方法。背景技术0002对虾白斑综合症病毒是一种具有囊膜的双链DNA病毒，57天内致对虾死亡率高达100，给对虾养殖业造成严重的经济损失。白斑病毒感染的宿主范围很广，不仅侵染各种野生及养殖的对虾，而且侵染其他水生甲壳类如蟹类、螯虾和龙虾等，特别是对对虾种群影响最为严重。2009年对虾白斑综合症被农业部一、二、三类动物疫病病种名录列为水生生物一类疫病。针对对虾白斑综合症目前还没有有效的治疗手段，及早发现并采取必要。
9、措施阻止病毒传播是公认最有效的方法。因此建立灵敏、准确、快速、便捷的对虾白斑综合症病毒检测技术是减少白斑综合症爆发的重要途径。0003目前WSSV的常用检测方法有目测观察法、组织染色法、电子显微镜检查法、酶联免疫法、PCR和定量PCR方法。目测观察法和组织染色法虽然用时较短，但是一般只能在病毒严重感染，产生组织病变时才能确诊，不适用于早期诊断；电子显微镜检查法、酶联免疫法以及PCR方法等虽然灵敏度高，特异性强，但操作繁琐复杂，需要昂贵的实验仪器和专业的技术人员，耗时较长，限制了在生产中的推广应用。0004环介导等温扩增LOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLICATION,LAMP。
10、是一种新的核酸扩增技术，在6065的恒温条件下，经过3050分钟就可以完成核酸扩增反应。LAMP反应中可形成明显的白色焦磷酸沉淀，可通过对浊度的观察或加入荧光染料，通过颜色的变化来判断反应结果。该技术具有高特异性、高效性、快速、简便等特点，广泛应用于各种病原体的检测。目前，该项技术已经应用到WSSV的检测，但由于快速提取核酸的方法可能无法将核酸充分提取出来而导致假阴性，以及采用SYBGREEN等染料可能会产生的假阳性等问题，阻碍了LAMP检测技术在对虾养殖过程中的推广应用。发明内容0005本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种对虾白斑综合症病毒的可视化快速检测试剂盒。0006本发明的第二个。
11、目的是提供一种使用对虾白斑综合症病毒可视快速检测试剂盒检测对虾白斑综合症病毒的方法。0007本发明的技术方案概述如下0008一种对虾白斑综合症病毒可视快速检测试剂盒，包括0009试剂A，用下述方法制成将十六烷基三甲基溴化铵、NACL、乙二胺四乙酸和羟基甲基氨基甲烷盐酸加水至100ML得到溶液，溶液中十六烷基三甲基溴化铵的克数为153G，NACL的浓度为1315M，乙二胺四乙酸的浓度为1525MM，羟基甲基氨基甲烷盐酸的浓度为1525MM；调节PH75得到试剂A；说明书CN104195270A2/6页50010试剂B浓度为2030MG/ML的蛋白酶K水溶液；0011试剂C100MG核酸提取磁珠重。
12、悬在1ML的双蒸水中；0012试剂D异丙醇；0013试剂E体积百分比浓度为6575的乙醇水溶液；0014试剂F灭菌双蒸水；0015试剂G对虾白斑综合症病毒阳性质粒；0016装有试剂H的检测管在检测管中按比例用10倍含MGSO4的恒温扩增反应缓冲液25L，40MM的脱氧核糖核苷酸35L，25MM的MGCL26L，5M的甜菜碱4L，100M的用SEQIDNO1所示的引物P104L，100M的用SEQIDNO2所示的引物P204L，100M的用SEQIDNO3所示的引物P302L，100M的用SEQIDNO4所示的引物P402L，100M的用SEQIDNO5所示的引物P5005L，100M的用SEQ。
13、IDNO6所示的引物P6005L，BSTDNA聚合酶8U，钙黄绿素染料1L，灭菌双蒸水37L混合；0017研磨棒、吸管、牙签、15ML样品管和磁力架。0018对虾白斑综合症病毒阳性质粒是用下述方法制成PCR扩增对虾白斑综合症病毒的一段保守区序列SEQIDNO7，琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化，连接到PMD18T载体上并转化到TOP10细胞中，测序鉴定阳性克隆子，把测序正确的阳性克隆子在LB培养基中重新培养，用质粒提取试剂盒提取质粒即为对虾白斑综合症病毒阳性质粒。0019使用上述试剂盒检测对虾白斑综合症病毒的方法，包括如下步骤0020步骤一、模板的制备00211取对虾的仔虾个体或幼虾的个体或成虾的鳃丝。
14、组织为样品2050MG至称为样品管1的15ML样品管中，用吸管加入试剂A至样品管1的三分之一处；00222向样品管1中滴加13滴试剂B，用研磨棒将样品进行研磨，5060水浴放置4560分钟；00233用吸管吸取上清液至称为样品管2的另一个15ML样品管中；用吸管充分吹打试剂C，使核酸提取磁珠悬浮，向样品管2中滴入1滴试剂C；00244向样品管2中滴入1015滴试剂D，轻轻颠倒混匀后，放到磁力架上；待管中的核酸提取磁珠都集中到管底后，用吸管将上清液吸出并弃掉；00255向样品管2中滴入1020滴试剂E，充分颠倒混匀后，放到磁力架上，待管中的核酸提取磁珠集中到管底后，用吸管将上清液吸出并弃掉；00。
15、266重复步骤5；00277将样品管2的管盖打开，5060水浴放置25分钟；00288向样品管2中滴入13滴试剂F，用手指轻弹样品管底部，使核酸提取磁珠充分悬浮，将样品管2放到磁力架上，待管中的核酸提取磁珠都集中到管底后，9099水浴放置35分钟，放到磁力架上，室温冷却13分钟；0029步骤二、LAMP扩增及结果判定0030用3个牙签分别蘸取试剂F、试剂G及样品管2中的样品上清液，至3个装有试剂H的检测管内，置于6065水浴保温3045分钟，9099水浴保温13分钟后取出，立即用肉眼观察反应液的颜色；含有试剂G的检测管为阳性对照显示为荧光绿色，含有试剂F的检测管为空白对照显示为橙黄色，样品的反。
16、应液颜色与阳性对照和空白对照比较，表示结果。说明书CN104195270A3/6页60031对虾优选为凡纳滨对虾，中国对虾，斑节对虾或日本对虾。0032本发明的优点0033我们优选了对虾白斑综合症病毒的基因组保守序列区设计了6条特异性引物，相比较4条特异性引物不仅提高了检测的特异性和灵敏度，而且极大缩短了反应时间；采用磁珠提取核酸的方法，可以充分地将待测样品中的核酸提取出来，避免了由于核酸提取不完全在之后检测的过程中出现假阴性的情况；使用钙黄绿素染料可以严格遵守LAMP反应的不开盖原则，避免了SYBGREEN等其它显色原理类似的染料必须在扩增反应结束后开盖再加入的情况，极大降低了假阳性率；该试。
17、剂盒的整个操作过程十分简便，在152个小时之内就可以完成对虾WSSV的检测，并且不需要任何高端的仪器设备，仅需要一个水浴锅或金属浴就可以完成，适合在实际生产的过程中推广使用。附图说明0034图1试剂盒检测结果的颜色判定。图中1号管为空白对照反应结果，2号管为阳性对照反应结果，3号管为实施例5检测结果。具体实施方式0035十六烷基三甲基溴化铵、羟基甲基氨基甲烷盐酸购自上海生工生物工程股份有限公司；0036蛋白酶K购自天根生化科技有限公司；0037核酸提取磁珠购自厦门鑫海东方生物科技有限公司；0038BSTDNA聚合酶，10倍含MGSO4的恒温扩增反应缓冲液，40MM的脱氧核糖核苷酸，25MM的M。
18、GCL2购自NEWENGLANDBIOLABS；00395M的甜菜碱购自SIGMA；0040钙黄绿素染料购自荣研生物科技有限公司；0041质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；0042下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。0043实施例10044一种对虾白斑综合症病毒可视快速检测试剂盒，包括0045试剂A，用下述方法制成将十六烷基三甲基溴化铵、NACL、乙二胺四乙酸和羟基甲基氨基甲烷盐酸加水至100ML得到溶液，溶液中十六烷基三甲基溴化铵的克数为15G，NACL的浓度为13M，乙二胺四乙酸的浓度为15MM，羟基甲基氨基甲烷盐酸的浓度为15MM；调节PH75得到试剂A；0046试剂B浓度为。
19、20MG/ML的蛋白酶K水溶液；0047试剂C100MG核酸提取磁珠重悬在1ML的双蒸水中；0048试剂D异丙醇；0049试剂E体积百分比浓度为65的乙醇水溶液；0050试剂F灭菌双蒸水；0051试剂G对虾白斑综合症病毒阳性质粒实施例4制备；上面的各个试剂可以放在试剂管中也可放在检测管中；说明书CN104195270A4/6页70052装有试剂H的检测管在检测管中按比例用10倍含MGSO4的恒温扩增反应缓冲液25L，40MM的脱氧核糖核苷酸35L，25MM的MGCL26L，5M的甜菜碱4L，100M的用SEQIDNO1所示的引物P104L，100M的用SEQIDNO2所示的引物P204L，10。
20、0M的用SEQIDNO3所示的引物P302L，100M的用SEQIDNO4所示的引物P402L，100M的用SEQIDNO5所示的引物P5005L，100M的用SEQIDNO6所示的引物P6005L，BSTDNA聚合酶8U，钙黄绿素染料1L，灭菌双蒸水37L混合；0053研磨棒；吸管；牙签；15ML样品管；磁力架；说明书。0054实施例20055一种对虾白斑综合症病毒可视快速检测试剂盒，包括0056试剂A，用下述方法制成将十六烷基三甲基溴化铵、NACL、乙二胺四乙酸和羟基甲基氨基甲烷盐酸加水至100ML得到溶液，溶液中十六烷基三甲基溴化铵的克数为25G，NACL的浓度为14M，乙二胺四乙酸的浓。
21、度为20MM，羟基甲基氨基甲烷盐酸的浓度为20MM；调节PH75得到试剂A；0057试剂B浓度为25MG/ML的蛋白酶K水溶液；0058试剂C、试剂D同实施例1的试剂C、试剂D；0059试剂E体积百分比浓度为70的乙醇水溶液；0060试剂F、试剂G、装有试剂H的检测管同实施例1的试剂F、试剂G、装有试剂H的检测管；0061研磨棒；吸管；牙签；15ML样品管；磁力架；说明书。0062实施例30063一种对虾白斑综合症病毒可视快速检测试剂盒，包括0064试剂A，用下述方法制成将十六烷基三甲基溴化铵、NACL、乙二胺四乙酸和羟基甲基氨基甲烷盐酸加水至100ML得到溶液，溶液中十六烷基三甲基溴化铵的克。
22、数为3G，NACL的浓度为15M，乙二胺四乙酸的浓度为25MM，羟基甲基氨基甲烷盐酸的浓度为25MM；调节PH75得到试剂A；0065试剂B浓度为30MG/ML的蛋白酶K水溶液；0066试剂C、试剂D同实施例1的试剂C、试剂D；0067试剂E体积百分比浓度为75的乙醇水溶液；0068试剂F、试剂G、装有试剂H的检测管同实施例1的试剂F、试剂G、装有试剂H的检测管；0069研磨棒；吸管；牙签；15ML样品管；磁力架；说明书。0070实施例40071对虾白斑综合症病毒阳性质粒是用下述方法制成0072PCR扩增对虾白斑综合症病毒的一段保守区序列SEQIDNO7，琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化，连接到PMD。
23、18T载体上并转化到TOP10细胞中，经含有氨苄的LB培养基平板扩大培养，测序鉴定阳性克隆子，把测序正确的阳性克隆子在含有氨苄的LB培养基中重新培养，用质粒提取试剂盒提取质粒即为对虾白斑综合症病毒阳性质粒，作为试剂盒的阳标。0073实施例50074使用实施例1的试剂盒检测对虾白斑综合症病毒的方法，包括如下步骤说明书CN104195270A5/6页80075步骤一、模板的制备00761取中国对虾的仔虾个体为样品20MG至称为样品管1的15ML样品管中，用吸管加入试剂A至样品管1的三分之一处约两满吸管；00772向样品管1中滴加1滴试剂B，用研磨棒快速将样品进行研磨，50水浴放置45分钟；0078。
24、3取出样品管，用吸管吸取上清注意不要吸取残留的样品碎片液至称为样品管2的另一个15ML样品管中；用吸管充分吹打试剂C，使核酸提取磁珠悬浮，向样品管2中滴入1滴试剂C；00794用吸管向样品管2中滴入10滴试剂D，轻轻颠倒混匀后，放到磁力架上；待管中的核酸提取磁珠都集中到管底后，用吸管将上清液吸出并弃掉；00805用吸管向样品管2中滴入10滴试剂E，充分颠倒混匀后，放到磁力架上，待管中的核酸提取磁珠集中到管底后，用吸管将上清液吸出并弃掉；00816重复步骤5；00827将样品管2的管盖打开，50水浴放置2分钟取出；00838向样品管2中滴入1滴试剂F，用手指轻弹样品管底部，使核酸提取磁珠充分悬浮。
25、，将样品管2放到磁力架上，待管中的核酸提取磁珠都集中到管底后，99水浴放置3分钟，放到磁力架上，室温冷却1分钟；吸取不同的试剂要分别使用吸管；0084步骤二、LAMP扩增及结果判定0085用3个牙签分别沾取试剂F、试剂G及样品管2中的样品上清液，至3个装有试剂H的检测管内，置于60水浴保温30分钟，90水浴保温1分钟后取出，立即用肉眼观察反应液的颜色；含有试剂G的检测管为阳性对照显示为荧光绿色，含有试剂F的检测管为空白对照显示为橙黄色，样品的反应液颜色与阳性对照和空白对照比较，样品结果显示为荧光绿色，阳性，见图1。耗时15个小时。0086实施例60087使用实施例2的试剂盒检测对虾白斑综合症病。
26、毒的方法，包括如下步骤0088步骤一、模板的制备00891取斑节对虾的幼虾的个体为样品30MG至称为样品管1的15ML样品管中，用吸管加入试剂A至样品管1的三分之一处约两满吸管；00902向样品管1中滴加2滴试剂B，用研磨棒快速将样品进行研磨，55水浴放置55分钟；00913取出样品管，用吸管吸取上清注意不要吸取残留的样品碎片液至称为样品管2的另一个15ML样品管中；用吸管充分吹打试剂C，使核酸提取磁珠悬浮，向样品管2中滴入1滴试剂C；00924用吸管向样品管2中滴入12滴试剂D，轻轻颠倒混匀后，放到磁力架上；待管中的核酸提取磁珠都集中到管底后，用吸管将上清液吸出并弃掉；00935用吸管向样品。
27、管2中滴入15滴试剂E，充分颠倒混匀后，放到磁力架上，待管中的核酸提取磁珠集中到管底后，用吸管将上清液吸出并弃掉；00946重复步骤5；00957将样品管2的管盖打开，55水浴放置3分钟取出；说明书CN104195270A6/6页900968向样品管2中滴入2滴试剂F，用手指轻弹样品管底部，使核酸提取磁珠充分悬浮，将样品管2放到磁力架上，待管中的核酸提取磁珠都集中到管底后，95水浴放置4分钟，放到磁力架上，室温冷却2分钟；0097步骤二、LAMP扩增及结果判定0098用3个牙签分别沾取试剂F、试剂G及样品管2中的样品上清液，至3个装有试剂H的检测管内，置于63水浴保温40分钟，95水浴保温2分。
28、钟后取出，立即用肉眼观察反应液的颜色；含有试剂G的检测管为阳性对照显示为荧光绿色，含有试剂F的检测管为空白对照显示为橙黄色，样品的反应液颜色与阳性对照和空白对照比较，样品结果显示为橙黄色，阴性。耗时2个小时。0099实施例70100使用实施例3的试剂盒检测对虾白斑综合症病毒的方法，包括如下步骤0101步骤一、模板的制备01021取日本对虾成虾的鳃丝组织为样品50MG至称为样品管1的15ML样品管中，用吸管加入试剂A至样品管1的三分之一处约两满吸管；01032向样品管1中滴加3滴试剂B，用研磨棒快速将样品进行研磨，60水浴放置60分钟；01043取出样品管，用吸管吸取上清注意不要吸取残留的样品碎。
29、片液至称为样品管2的另一个15ML样品管中；用吸管充分吹打试剂C，使核酸提取磁珠悬浮，向样品管2中滴入1滴试剂C；01054用吸管向样品管2中滴入15滴试剂D，轻轻颠倒混匀后，放到磁力架上；待管中的核酸提取磁珠都集中到管底后，用吸管将上清液吸出并弃掉；01065用吸管向样品管2中滴入20滴试剂E，充分颠倒混匀后，放到磁力架上，待管中的核酸提取磁珠集中到管底后，用吸管将上清液吸出并弃掉；01076重复步骤5；01087将样品管2的管盖打开，60水浴放置5分钟取出；01098向样品管2中滴入3滴试剂F，用手指轻弹样品管底部，使核酸提取磁珠充分悬浮，将样品管2放到磁力架上，待管中的核酸提取磁珠都集中。
30、到管底后，90水浴放置5分钟，放到磁力架上，室温冷却3分钟；0110步骤二、LAMP扩增及结果判定0111用3个牙签分别沾取试剂F、试剂G及样品管2中的样品上清液，至3个装有试剂H的检测管内，置于65水浴保温45分钟，99水浴保温3分钟后取出，立即用肉眼观察反应液的颜色；含有试剂G的检测管为阳性对照显示为荧光绿色，含有试剂F的检测管为空白对照显示为橙黄色，样品的反应液颜色与阳性对照和空白对照比较，样品结果显示为荧光绿色，阳性。耗时2个小时。0112用实施例7的方法对凡纳滨对虾成虾的鳃丝组织为样品进行检测，其它同本实施例，其结果样品结果显示为荧光绿色，阳性。0113引物合成由上海生工完成。说明书CN104195270A1/3页1000010002序列表CN104195270A102/3页110003序列表CN104195270A113/3页12序列表CN104195270A121/1页13图1说明书附图CN104195270A13。