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1、10申请公布号CN104212909A43申请公布日20141217CN104212909A21申请号201410505403122申请日20140926C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人泸州医学院地址646000四川省泸州市忠山路3段319号72发明人傅俊江74专利代理机构成都高远知识产权代理事务所普通合伙51222代理人李高峡张娟54发明名称金银花的检测试剂盒和检测方法57摘要本发明公开了金银花的核苷酸序列，还公开了检测前述序列的试剂在制备金银花检测试剂中的用途，以及金银花的检测试剂盒和检测方法。本发明检测试剂盒和检测方法可以准确、有效的鉴别金银花，特异性。
2、强，耗时短，应用前景良好。51INTCL权利要求书1页说明书12页序列表5页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书12页序列表5页附图3页10申请公布号CN104212909ACN104212909A1/1页21SEQIDNO13所示的3种核苷酸序列。2检测SEQIDNO13任意一项所示核苷酸序列的试剂在制备金银花检测试剂中的用途。3根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述检测试剂包括扩增SEQIDNO13任意一项所示核苷酸序列的试剂。4根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述扩增的试剂包括SEQIDNO56、SEQIDNO78或SEQIDNO910所示的。
3、引物对。5一种检测金银花的试剂盒，其特征在于包括检测SEQIDNO13任意一项所述核苷酸序列的相关试剂。6根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂包括扩增SEQIDNO13任意一项所示核苷酸序列的试剂。7根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述扩增的试剂包括SEQIDNO56、SEQIDNO78或SEQIDNO910所示的引物对。8根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述金银花是产自美国休斯顿、广东深圳或四川乐山的金银花。9一种金银花的检测方法，其特征在于包括如下步骤A，提取金银花样本DNA提取待检样本中的DNA；B，检测用权利要求57任意一项所述的试剂盒检测待检样本，即可。10根据。
4、权利要求9所述的检测方法，其特征在于所述金银花是产自美国休斯顿、广东深圳或四川乐山的金银花。权利要求书CN104212909A1/12页3金银花的检测试剂盒和检测方法技术领域0001本发明涉及一种金银花的检测试剂盒和检测方法。背景技术0002金银花，又名忍冬学名LONICERAJAPONICA。药材金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬及同属植物干燥花蕾或带初开的花。金银花自古被誉为清热解毒的良药。它性甘寒气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪。金银花既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等症，均效果显著。现代研究证明，金银花含有绿原酸、木犀草素苷等药理活。
5、性成分，对溶血性链球菌、金黄葡萄球菌等多种致病菌及上呼吸道感染致病病毒等有较强的抑制力，另外还可增强免疫力、抗早孕、护肝、抗肿瘤、消炎、解热、止血凝血、抑制肠道吸收胆固醇等，其临床用途非常广泛，可与其它药物配伍用于治疗呼吸道感染、菌痢、急性泌尿系统感染、高血压等40余种病症。0003金银花药用价值和保健用途广泛，社会需求量大。市场上经常出现以其他植物冒充金银花使用，目前，最为常见的金银花伪品是山银花，山银花是忍冬科植物山银花的干燥花蕾或带初开的花。目前金银花伪品的检测通常以颜色、形状等性状为标准进行鉴别，不易掌握，具有一定的局限性。发明内容0004为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的、。
6、方便准确的金银花检测试剂盒和检测方法。0005本发明提供了SEQIDNO13所示的3种核苷酸序列。0006本发明还提供了检测SEQIDNO13任意一项所示核苷酸序列的试剂在制备金银花检测试剂中的用途。0007所述检测SEQIDNO13任意一项所述核苷酸序列的试剂包括扩增SEQIDNO13任意一项所示核苷酸序列的试剂。0008所述扩增的试剂包括SEQIDNO56、SEQIDNO78或SEQIDNO910所示的引物对。0009本发明检测金银花的试剂盒，包括检测SEQIDNO13任意一项所述核苷酸序列的相关试剂。0010所述试剂包括扩增SEQIDNO13任意一项所示核苷酸序列的试剂。0011所述扩增。
7、的试剂包括SEQIDNO56、SEQIDNO78或SEQIDNO910所示的引物对。0012优选地，所述金银花是产自美国休斯顿、广东深圳或四川乐山的金银花。0013本发明一种金银花的检测方法，包括如下步骤0014A，提取金银花样本DNA提取待检样本中的DNA；0015B，检测用前述的试剂盒检测待检样本，即可。说明书CN104212909A2/12页40016优选地，所述金银花是产自美国休斯顿、广东深圳或四川乐山的金银花。0017本发明SEQIDNO13所示核苷酸序列为金银花特异性序列，通过检测这些序列可以有效区分金银花和山银花，鉴定待检样本是否为金银花，保证食品安全，本发明方法操作简便，具有良。
8、好的应用前景。0018下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，都是本发明保护的内容。附图说明0019图1用于克隆的RAPD扩增片段。A用所示的高GC引物FY27扩增后用于克隆的JYHGC1和JYHGC2片段。B用所示的高GC引物FY28扩增后用于克隆的JYHGC6片段。C用所示的高GC引物FY29扩增后用于克隆的JYHGC7片段。通道“M”为标明DNA分子量大小的DL2000DNA标记。0020图2所克隆的片段通过测序后获得的。
9、DNA序列信息。A克隆JYHGC11的DNA序列。B克隆JYHGC21的DNA序列。C克隆JYHGC72的DNA序列。D克隆JYHGC62的DNA序列。0021图3SCAR标记JYHGC11,JYHGC21,JYHGC72和JYHGC62在各物种的检测。通道15是从广东深圳、湖北宜昌、四川峨眉和乐山、湖南娄底来的5种金银花；通道67是福建和海南桂圆；通道89是凸灵芝和红芝；通道10是栀子花；通道11是广东荔枝；通道12从广西采集的野生龙荔；通道13泸州青果；通道14是四川凉山天麻；通道15是地丁；通道16是四川古蔺的赶黄草；通道17是沟景天；通道18是大鼠肝脏。0022图4SCAR标记JYHG。
10、C11,JYHGC21,JYHGC72和JYHGC62在鉴别山银花中的作用。通道17是从美国休斯顿、广东深圳、湖北宜昌、四川峨眉和乐山、湖南娄底来的6种金银花；通道7是重庆秀山县的“山银花”灰毡毛忍冬。具体实施方式0023实施例1RAPD技术扩增金银花特异SCAR标记0024一、CTAB法提取植物DNA00251、收集广东、广西、四川峨眉、四川乐山以及湖南各地产金银花及其它植物物种样本，同时收集美国休斯顿的金银花。置于4冰箱备用；00262、取植物叶片或花蕾约2G左右减碎放于研钵中，加入石英砂快速研磨成粉末状，将粉末装入5ML离心管中，装入的量约占离心管的1/3；00273、加入2ML65预热。
11、的CTAB提取缓冲液HEXADECYLTRIMETHYLAMMONIUMBROMIDE和4L巯基乙醇，充分混匀，于65水浴40MIN，间隔10MIN振荡1次以免成团；00284、每管加入等体积的氯仿异戊醇241，充分振荡5MIN使其成乳白色，室温下4000RPM离心15MIN，取上清于一新的5ML离心管中剪掉TIP头后吸取上清，以免打断DNA；说明书CN104212909A3/12页500295、缓慢加入等体积预冷的异丙醇于离心管中，上下颠倒混匀操作轻柔，20冰箱预冷30MIN后，4000RPM离心6MIN；00306、去掉液体，用70的乙醇和无水乙醇清洗1次加入70的乙醇后，上下颠倒洗涤，于。
12、离心机4000RPM离心2MIN后，倒掉液体。加入无水乙醇，重复1次。洗脱完毕后，倒掉液体后，4000RPM离心2MIN后，用移液器吸进残余液体；00317、开盖置于室温干燥5MIN，用100L的DDH2O洗脱，置于4过夜使其完全溶解后，放于20长期保存；00328、DNA纯化00331加入终浓度100NG/ML的RNASEA、2L的蛋白酶K20MG/ML，37保温1H；00342加入等体积的酚/氯仿/异戊醇上下颠倒混匀使其成乳白色，室温下4000RPM离心5MIN；00353取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇再次抽提；00364取上清液后加入终浓度为03MOL/L的NAACPH48，23倍体积。
13、冷的无水乙醇，20冰箱放置1H左右，10000R/MIN4离心10MIN，除去上清；00375用70乙醇洗涤沉淀23次，自然干燥后溶液DDH2O中备用。0038注意事项根据需要，DNA的纯化也可采用商业销售的各种DNA纯化试剂盒纯化。00399、DNA质量检测和浓度分析00401电泳法1的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。00412NANODROP法测OD值法0042打开分光光度计图标，选择NUNCLIACID；NANODROP，ND10000043加入DDH2O4L，点击OK，初始化仪器；0044再次加入DDH2O4L，选择DNA50，点击BLANK；0045加入样本1L，点击MEASURE，。
14、测出值后作好详细记录。0046滴入DDH2O4L洗涤两次。0047注意事项00481260NM、230NM、280NM下的吸光度分别代表了核酸、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD260/OD280R体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的DNA的R值应在1820之间，当R18时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R22时，说明有RNA的污染。004910、将DNA用1TE稀释到10NG/L,保存在20备用。005011、动物组织或者细胞样本中DNA提取采用酚/氯仿法，详细见精编医学分子生物学实验指导中国医药科技出版社，主编傅俊江0051二、RAPD技术PCR扩增00521。
15、、设计并合成长度为10个核苷酸的高GC含量的引物，100GC含量引物并进行HPLC高效液相色谱纯化后纯度达95左右，其它引物经检测纯度均高。各条高GC含量引物的名称、序列见下表10053表1各个高GC引物序列0054说明书CN104212909A4/12页6名称序列53FY27GCAGGCGGCGFY28CGAGCCCGCCFY29GCCGACCGGC00552、用改良RAPD技术进行PCR扩增0056以步骤一提取的核酸作为模板，用前述引物分别扩增，PCR体系如下所示。00570058充分混匀后，于离心机12000RPM离心15S，置于PCR仪APPLIEDBIOSYSTEMS96WELLTH。
16、ERMALCYCLER，LIFETECHNOLOGY,USA。0059PCR条件如下0060006100623、DNA电泳详见精编医学分子生物学实验指导中国医药科技出版社，主编傅俊江00631制备15的琼脂糖凝胶，将PCR产物按顺序全部点样到凝胶孔内，同时点样一个DNA分子大小标记DL2000，TIANGEN公司，北京。注意不需要加载样缓冲液，PCR扩增用的2MIX就预加了相关成分。00642电泳电泳仪由北京百晶生物有限公司生产，BGSUBMIDICELL，常选择电压110V，电泳时间30MIN即可，也可根据实际情况进行相应的调整。0065三、RAPD扩增条带的分离00661、将上述用高GC含。
17、量引物在金银花中进行改良RAPD扩增获得电泳产物，割取目说明书CN104212909A5/12页7的条带如图1所示，用胶回收试剂盒天根，DP209回收目的片段常用2030L洗脱；0067割取目的条带0068JYHGC1GDJYHFY27引物扩增0069JYHGC2GDJYHFY27引物扩增0070JYHGC6GDJYHFY28引物扩增0071JYHGC7GDJYHFY29引物扩增00722、将胶回收产物和T载体进行10的琼脂糖凝胶电泳电泳仪由北京百晶生物有限公司生产，BGSUBMIDICELL，常选择110V，20MIN，EB染色确定连接时加入目的片段与T载体的各自的量。0073四、克隆007。
18、4应用A/T克隆法T载体克隆00751、连接反应反应体系10L两EP管分别加入00760077充分混匀后，12000RPM离心15S，于4连接过夜或者16812H。00782、DH5感受态细菌的制备00791取15MLEP管，加入500L无AMP无氨苄青霉素的LB培养基，挑取一DH5感受态细菌，于37震荡培养过夜不超过16H；00802取一100ML锥形瓶，加入10无AMP无氨苄青霉素的LB培养基，按照150或者1100加入培养过夜的DH5菌液，37震荡培养23H达OD值0608具体时间根据菌液的浑浊度而定；00813将10ML菌液全部转入预冷的50ML管中，冰浴15MIN；008244000。
19、RPM离心5MINTHERMO公司，LEGENDMICRO21R，弃去上清将上清弃干净，残留的培养基可能会影响感受态细胞的活性；0083注意0084A不同的离心机，离心条件不一样，需要严格掌物离心力和离心时间；0085B离心过了会严重影响感受态细菌的活性；00865加入1ML4100MMOL/L的CACL2溶液，轻轻混匀后再加入9ML于4预冷100MMOL/L的CACL2溶液，冰浴30MIN此步骤操作应轻柔，勿用TIP吹打，利用手腕的力量使其混匀，整个操作应在冰上完成；008764000RPM离心5MIN，弃去上清；00887加入2ML4100MMOL/L的CACL2溶液，轻轻混匀后置于4冰箱。
20、中备用。说明书CN104212909A6/12页800893、转化00901连接过夜的两管分别加入50LDH5感受态细胞，手指轻弹管底混匀。另取一空白预冷EP管加入50LDH5感受态细胞作为空白对照，冰浴30MIN。0091242热激45S90S，冰浴23MIN，不要摇动离心管。00923加入300LLB无AMP无氨苄青霉素的液体培养基，于37振荡培养45MIN，目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。00934将离心管中的菌液混匀，全部铺皿涂布用量可根据具体实验作相应的调整，待平板表面干燥后，倒置平板，37CO2孵箱中孵育1216H。00943、阳性克隆的鉴定00951蓝白筛选法0。
21、096首先LBAMP固体培养板配制方法称取LB肉体粉末5G、375G琼脂粉15于一干净锥形瓶中，加入250MLDDH2O充分混匀后，于121KPA高压灭菌30MIN，放入水浴锅中降到60，加入250L氨苄青霉素100MG/L，250LIPTG50MG/L，SOLARBIO，NOI8070、1000LXGAL20MG/L，SOLARBIO，NO924B035充分混匀后，于超净工作台中倒制固体培养板20ML/板，待其冷却后置于4保存。另外，IPTG、XGAL也可使用前30MIN铺皿后于CO2孵箱中烤干备用20ML培养板使用20LIPTG50MG/L、40LXGAL20MG/L即可。0097将转化产。
22、物全部涂布到上述固体培养板上，37孵箱孵育16H，可见固体板上蓝白菌落，白色可能为阳性克隆。0098挑取白色菌落，振荡培养用于下述PCR鉴定、酶切鉴定以及测序测定。00992PCR鉴定设计PGMT载体引物T7与SP6的引物对，T7引物5TAATACGACTCACTATAGGG3,SP6引物5ATTTAGGTGACACTATAGAA3。进而进行PCR鉴定反应体系10L。扩增的片段大小与目的片段大小一致即为阳性克隆。0100取15MLEP管，加入500L含有AMP有氨苄青霉素的LB液体培养基，挑取一阳性克隆菌，于37震荡培养45H；0101待菌液稍浑浊，取0205L进行PCR扩增；0102菌液PC。
23、R0103菌液PCR体系总体积10L01040105充分混匀后，于离心机12000RPM离心15S，置于PCR仪APPLIEDBIOSYSTEMS96WELLTHERMALCYCLER，LIFETECHNOLOGY，USA。0106PCR条件0107说明书CN104212909A7/12页90108PCR结束后，琼脂糖凝胶电泳胶浓度根据其目的片段的大小而定。0109PCR鉴定为阳性，可以测序。01103酶切鉴定法ECORI酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，出现目的片段即为阳性克隆。0111取15MLEP管，加入500LA有氨苄青霉素的LB培养基，挑取一阳性克隆菌，于37震荡培养45H；0112待菌液。
24、浑浊，将其全部转入加有02ML菌液的1020ML管中，37震荡培养过夜；0113取23ML菌液，用质粒小提试剂盒天根，DP103提取质粒DNA,60100L的DDH2O洗脱；0114质粒DNA含量的测定测OD值0115打开分光光度计图标，选择NUNCLIACID；NANODROP，ND10000116加入DDH2O4L，点击OK，初始化仪器；0117再次加入DDH2O4L，选择DNA50，点击BLANK；0118加入样本1L，点击MEASURE，测出值后作好详细记录。0119滴入DDH2O4L洗涤两次。0120质粒DNA进行酶切0121酶切体系10L01220123充分混匀后，于离心机1200。
25、0RPM离心15S。012437水浴23H；0125酶切结束后，琼脂糖凝胶电泳胶的浓度根据其目的片段的大小而定。0126酶切鉴定显示JYHGC11、JYHGC21、JYHGC72和JYHGC62为阳性克隆。0127五、测序分析01281、序列测定将酶切鉴定提示为阳性克隆的JYHGC11、JYHGC21、JYHGC72和JYHGC62进行SANGER测序分析结果如图2所示。说明书CN104212909A8/12页100129金银花JYHGC11克隆的序列如SEQIDNO1所示435BP，图2A0130CGAAGGAATACACGAAGGCAGGTTTCAGAGCTCGATAAAGCAGACGAA。
26、GACTTCCAACGCATATAGGTAACTAACCGCCTGTTATCCCGGAAAGTCTAATCGCAGGCCAACGGGCGGCAACGGTAAGTATGGCAAGCTAACTGCTGGGAGAACGGTTAGTGTACCAACAACTGAGGAAGGCGGTCCAGGTGGCATAAAAGATAGGTAATCTAATGAATGCTCGGATGCTATGCCGCTTGATTAAGGTTAGTAAGTTAAACTACTATTGTATGAGGATTCGATCACAGTCCCTGTGTAAACGCAATCTCATTCTCAACTTCCTATGCCCCACGAGGTTTGTTCGGCTTA。
27、AACCTTCTCATAACTAAAGTCTTTACCCAATCTTTAAAGCGAAACCATCAAAGTTCCATCTGCTCACGATACATAGAGCCGACCGCC0131金银花JYHGC21克隆的序列如SEQIDNO2所示388BP，图2B0132ACAGCGGCCCTTGCTCATTTGTCACTGCACTCGAGCGATACAGCGCGTTGCTTCTGGGCAACGACCTAGCATTAACAGTATTATATTGTTTGTCCATGTCATAAAGATTCGACTTAGTTTGACGTTGGCTGTCGACTGCCTAACACAACCCTCCTCCTTTTTTCGGGCTT。
28、GGGACCGGCAGCATTGAAGTAACACTGGCGGAGTTAAGGACTTGAAGATAAAATTAAATTAAATCGGTCGTACCTTTGCAATCCTTTGAACGATCGTTAAACACCCAGAATCAATTGCTAGAGCTATACCTTCCCCAATTAATAGCTTACAATTCAGCCATAAGCATCGAAACATAGATGTTCTTATAAATCGAAGATGCTTGGATCAAGTCGCCGCC0133金银花JYHGC62克隆的序列如SEQIDNO3所示715BP，图2D0134TAGCACTTCTTCAGCTAAAATAAACTTTCCGGTTTGGAA。
29、CCCTTGTCGCAGCCCTCGAGAAGCTGGAAAGTACCCATGTGGCACACCATCCACAAGCACTCCAAAGTGTTCATTACAGAAACATCCATGTATCAAATTCCGCCATTTCTCACAAAAGCCGAATTTAGTCATTACTCCCAAAAAGCCCATTCGATCCAAAAAGATGCTTTTGCCATATCCTGAGTTTCTTTTGACCCCCCCCTCCCTCCTATTAAGCCTTTCGGTTTAAATCCCCTATCACTTAAAGCCACCTCGTGAGCCAAGGAGATCTTCTCTACATTAGTCCTTTAACAAAAGCCC。
30、CTTGTTCCTTAAAAAAAATGATAGGGGGAATCCAACTAATTCTTCGAGCTAGAGATAATTTTTGAGAAAAAGTGACACTCCTTCAAATATCCCATAAATAAAGGTAGGTCGGAATTGGTGAAAATGTGAAGGACTTTCTACTTTCGGAATAAGGGCAATGCTATTTTCATTCAAACTTAGGGCTTAACAGCGCCTTCAGCAAAGAAATTGTGAACCGCCCTGACCAGGTCGTCTTCAATAATCTTCCAACAGTGAGAATCAAAAAGAAGAACTGGGAATCCATCAATTTAAAGGATAGGG。
31、GAGGCACAGCCCCCAACCAATGGAGTGGTTACGTCCAATATGTCCTCCCTTATTCCCGACATGTTATGGTGCCCCG0135金银花JYHGC72克隆的序列如SEQIDNO4所示1036BP，图2C0136GGCATGCCTCTTCAGTTGTGCCCTCAAGAGCACGTGCTGCCTTGAGCGCCATCGGGTTTCCTGTGTTGCATACCTACCAGACGGAATTCTCTCGTTCTACGTTGCCATTTCTCCCTGCGTTGCTCACGCAGCGCGGGGCGACACCGAGGCGCTCCCTGTGATCCACGTTCGTCCCACCCA。
32、AGGGTGATTCGTTCGTGGCCCATTGGGCACGCCCGATCTCGTGGATACGGAACATTGTGCGGGCACGGGGTCATCGGCCCTTATCTGCCCTTACAAAGCGTTCTCGCTTCTTACGAACGACAGTCGTGCACGTCTTGGCCCCTCCAGCGACACCGAGCGGGGAGGGATCATGCGGCGCCGACGTCGGAGAGGAATGCTACCTGGTTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTGTAAGTATGAACTAATTCAGACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATT。
33、AAATCAGTTATAGTTTGTTTGATGGTATCTGCTACTCGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCTAATACGTGCAACAAACCCCGACTTCTGGAAGGGATGCATTTATTAGATAAAAGGTCGACGCGGGCTCTGCCCGTTGCTGCGATGATTCATGATAACTCGACGGATCGCACGGCCCTCGTGCCGGCGACGCATCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACTATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGA。
34、AACGGCTACCACATCCCAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACCGGGCTCATAGAGTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGTTG说明书CN104212909A109/12页11CAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGACTTTGGGTTGGGTCGGCCGG01372、同源性搜寻0138将测序获得。
35、的如上图2所示序列，在NCBIHTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST/上进行比对，判别其是否是未知序列与已知序列相同及其同源性。0139将如上图2所示序列，在NCBI上进行BLAST分析，虽然部分序列的一段与其它物种有部分相似性，但未见相同或者重复序列，说明如它们所示序列为新的、金银花特有的核苷酸序列，是金银花特异的SCAR标记。0140实施例2用本发明方法特异扩增金银花基因01411、实验方法0142一根据实施例1得到的SEQIDNO14所示的序列，设计4对引物，合成。01430144二PCR扩增01451、取金银花样本及其他物种样本DNA若干18个样本和重庆秀山县山银花DN。
36、A品种一个，稀释成10NG/L备用。01462、PCR扩增01471PCR体系10L0148说明书CN104212909A1110/12页120149充分混匀后，于离心机12000RPM离心15S，置于PCR仪APPLIEDBIOSYSTEMS96WELLTHERMALCYCLER，LIFETECHNOLOGY，USA。01502PCR扩增条件0151015201533、琼脂糖凝胶电泳胶浓度根据其目的片段的大小而定。0154详见精编医学分子生物学实验指导中国医药科技出版社，主编傅俊江01551脂糖凝胶的配置用电子天平称取08G琼脂粉，加入1TAE40ML，放入微波炉中充分溶解中火至沸腾，中低火。
37、至沸腾2次，置于实验桌上，加入EB2L，混匀，待冷却至50备用；01562用075MM16孔宽齿梳，配制胶板，将制胶板放入制胶槽中，将溶解的琼脂糖约50，倒入其中，直至厚度为6MM如有气泡要把气泡赶出，待其在室温下充分凝固后备用；01573点样01584100V电泳45MIN；01594、图像摄取BIORAD，UNIVERSALHOOD0160二、实验结果0161结果如图34所示0162采用本发明SEQIDNO56所示引物对可以有效扩增美国休斯顿、广东深圳、四川乐山金银花的基因，得到242BP的金银花特异条带JYHGC11，而不会扩增其他地方的金银花的基因，也不会扩增其他物种的基因，如，山银花。
38、、栀子花等，说明SEQIDNO56所示引物对可以有效鉴别美国休斯顿、广东深圳、四川乐山的金银花。0163采用本发明SEQIDNO78所示引物对可以扩增不同产地的金银花的基因，得到180BP的金银花特异条带JYHGC21，而不会扩增其他物种基因，如，山银花，说明SEQIDNO78所示引物对可以有效鉴定金银花。0164采用本发明SEQIDNO910所示引物对可以有效扩增不同产地的金银花基因，说明书CN104212909A1211/12页13得到275BP的特异条带JYHGC62，而不会扩增山银花，说明SEQIDNO78所示引物对可以有效区分金银花和山银花，可以鉴别金银花。0165采用SEQIDNO。
39、1112所示引物对可以扩增285BP金银花特异条带JYHGC72，但是也会扩增山银花等其他物种，不能有效鉴定金银花。0166实验结果说明，本发明SEQIDNO56、SEQIDNO78、SEQIDNO910所示引物的特异性良好，可以通过分别扩增JYHGC11、JYHGC21、JYHGC62所示核酸片段，准确鉴定金银花，而SEQIDNO1112所示引物则难以有效区分金银花和山银花。0167实施例3本发明金银花检测试剂盒0168一、试剂盒组成0169本试剂盒含有0170CTAB提取缓冲液200ML；01712TAQMASTERMIX，其中，引物可以选用SEQIDNO56、SEQIDNO78、SEQI。
40、DNO910所示引物中的一对引物或者多对引物500L；0172阴性对照模板DNA山银花DNA一管50L；0173阳性对照模板DNA金银花DNA一管50L；0174灭菌DDH2O1500L。0175一CTAB提取缓冲液0176CTAB提取缓冲液100ML01770178用HCL调至PH50，加H2O至100ML0179二PCR体系2TAQMASTERMIX的配方0180说明书CN104212909A1312/12页140181二、检测方法0182一PCR扩增01831、CTAB提取缓冲液提取待检样本DNA。01842、进行PCR扩增0185具体如下0186不同品种DNA1L50NG/L01872。
41、TAQMASTERMIX5L0188DDH2O4L0189充分混匀后，12000RPM离心30S；0190注2TAQMASTERMIX，同时取不同DNA模板设定阳性和阴性对照01913、放入PCR仪上MASTERCYCLER5331PCR仪器，德国EPPENDORF，或者其它PCR仪器如APPLIEDBIOSYSTEMS96WELLTHERMALCYCLER，采用如下程序。01920193二琼脂糖凝胶电泳01941、脂糖凝胶的配置用电子天平称取08G琼脂粉，加入05TAE40ML，放入微波炉中充分溶解中火至沸腾，中低火至沸腾2次，置于实验桌上，加入EB2UL，混匀，待冷却至50备用；01952。
42、、用075MM16孔宽齿梳，配制胶板，将制胶板放入制胶槽中，将溶解的琼脂糖约50，倒入其中，直至厚度为6MM如有气泡要把气泡赶出，待其在室温下充分凝固后备用；01963、点样注意加样顺序，并加上DNA的分子MARKER01974、100V电泳45MIN；0198三结果检测与分析0199在凝胶成像仪下观察结果，结果照相保存，并分析结果。0200综上，本发明提供的检测试剂盒和检测方法可以有效鉴定金银花，特异性强，耗时短，检测快速，具有良好的临床应用前景。说明书CN104212909A141/5页150001序列表CN104212909A152/5页1600020003序列表CN104212909A163/5页170004序列表CN104212909A174/5页180005序列表CN104212909A185/5页19序列表CN104212909A191/3页20图1说明书附图CN104212909A202/3页21图2说明书附图CN104212909A213/3页22图3图4说明书附图CN104212909A22。