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1、10申请公布号CN104195117A43申请公布日20141210CN104195117A21申请号201410470155122申请日20140916C12N7/01200601C12N15/861200601A61K48/00200601A61P35/0020060171申请人武汉百奥京生物医药有限公司地址430075湖北省武汉市洪山区高新大道光谷生物城B4栋二楼72发明人黄昆刘欣然郑凌吴琼74专利代理机构武汉科皓知识产权代理事务所特殊普通合伙42222代理人汪俊锋54发明名称一种携带靶向分裂期磷蛋白1基因的小发夹RNA的重组溶瘤腺病毒57摘要本发明属于生物药学领域，涉及一种携带靶向人源。
2、驱动蛋白分裂期磷蛋白1基因的小发夹RNA的重组溶瘤腺病毒及其制备方法。本发明提供一种全新的肝癌药物靶标分裂期磷蛋白1，其弥补传统基因治疗药物靶标P53基因的广谱性；本发明还提供了一种表达针对分裂期磷蛋白1的小发夹RNA的重组溶瘤腺病毒制备方法；同时本发明提供了该重组溶瘤腺病毒在制备癌症治疗药物中的应用。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表2页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表2页附图3页10申请公布号CN104195117ACN104195117A1/1页21MPHOSPH1在作为肝癌基因治疗药物靶标上的应用。2一种携带靶向分裂期磷蛋。
3、白1基因的小发夹RNA的重组溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，质粒PSP55/SHMPP1的构建用XBAI和BAMHI限制性内切酶，双酶切消化PXC2质粒，回收1170KP片段并克隆到经同样双酶切的PZD55载体中，构建成质粒PXC255；以HEK293细胞基因组DNA为模板，引物如下正向5ATGAATTCCGCGTTCTTTGAAAGCAG3，反向5AATCTCGAGTGCCGCCGCCGCCACCT3，经PCR扩增，得到含人269BP存活素基因的启动子部分片段，并克隆到PTG19T载体上，构成质粒PTG19SP；3）PTG19SP经XHOIANDSALI双酶切，回收28。
4、0BP片段并克隆到PXC255的SALI限制性位点，经过鉴定存活素基因启动子的方向，得到质粒PSP55；4）合成如下两条寡聚核苷酸正向5GTGAAGAAGTGCGACCGAAGAAGACTTCGGTCGCACTTCTTCACCTTTTTG3，反向5AATTCAAAAAGGTGAAGAAGTGCGACCGAAGTCTTCTTCGGTCGCACTTCTTCAC3，分别退火，克隆到经APAI/ECORI双酶切的PBS/U6载体上，其中APAI经T4DNA聚合酶处理成平端，得到质粒PBS/U6SHMPP1；5）PBS/U6SHMPP1经BAMHI消化，回收400BP包含U6/SHMPP1表达框的片段并。
5、克隆到PSP55的BGLII位点上得到质粒PSPSHMPP155；步骤二，同源重组法构建重组溶瘤腺病毒6孔板每孔铺入40105人胚肾细胞系HEK293细胞，共转染穿梭质粒PSPSHMPP155与大质粒PBHGE3，二周之后观察细胞状态直至产生空斑；步骤三，病毒收集纯化从空斑中挑选病毒单克隆，鉴定后大规模复制病毒，收集细胞培养物，经氯化铯密度梯度离心纯化病毒。3权利要求2所构建的重组溶瘤腺病毒在制备治疗肝癌药物中的应用。权利要求书CN104195117A1/5页3一种携带靶向分裂期磷蛋白1基因的小发夹RNA的重组溶瘤腺病毒0001技术领域0002本发明涉及生物药学领域，具体来说，涉及一种携带靶向。
6、人源驱动蛋白分裂期磷蛋白1基因的小发夹RNA的重组溶瘤腺病毒及其制备方法。背景技术0003原发性肝癌在世界范围内每年约发病26万例。我国肝癌发病率约占全世界的40以上，每年新发病例约10余万。我国肝癌死亡率位居所有癌症死亡人数的第二位，每年约有13万患者死于肝癌。传统外科切除和微创外科手术是目前主要的治疗手段。然而由于肝部瘤体积过大、位置不佳以及肝功能储备不足等原因常常导致手术失败，再加上术后的高复发率使得手术治疗肝癌往往达不到预期。而由于肝癌对化疗的不敏感性或易产生耐药性等原因，单独运用化学疗法治疗肝癌的效果十分有限。因此，作为新兴的治疗手段，基因疗法治疗肝癌被寄予厚望。0004目前，我国一。
7、类新药“今又生”重组人P53腺病毒注射液，是世界上第一个以重组腺病毒作为载体进行癌症基因治疗的上市药物，临床上主要用于治疗鼻咽癌、头颈部鳞癌、喉癌等实体瘤。但这类以非复制型腺病毒载体携带抗癌基因的药物在临床应用上也存在难以克服的不足之处。首先，以一类新药“今又生”为例，该药以抗癌基因P53为靶点，在肿瘤细胞中引入外源P53蛋白以达成抗癌作用。但现在已有很多文献报道，P53基因在一半以上的癌症中失活，或者由于突变以及显性抑制作用，其抗癌作用失去甚至由抑癌基因变为癌基因。如果不事先对病人进行基因诊断和预测，对占一半以上的P53基因失活或对P53不敏感癌症患者使用这类药物，将很难实现其抗癌效果。因此。
8、，寻找P53替代抗癌通路中的分子靶点，是目前应用基因疗法治疗癌症研究中的关键。第二，目前该类药物的病毒载体缺乏较强的肿瘤靶向作用，使得药物难于在靶部形成聚集，欲提高药物局部浓度需加大用药剂量，容易引起机体免疫反应造成不良后果；第三，由于其载体是非复制型病毒载体，在感染肿瘤细胞后外源抗癌基因表达时间相对较短，往往在抗癌蛋白表达尚未形成有效的抗癌浓度之前已经被机体所清除，导致基因治疗效果不佳。0005发明人在寻找肿瘤治疗的新靶点过程中，通过分析肝癌临床样本发现驱动蛋白家族中的一个成员分裂期磷蛋白1（MPHASEPHOSPHOPROTEIN1，MPHOSPH1）基因，在绝大多数肝癌组织中相比癌旁组织。
9、及非肝癌组织显著高表达。该结果以前未见国内外文献报道。基于RNA干扰（RNAI）技术，发明人构建了表达MPHOSPH1的小发夹RNA（SMALLHAIRPINRNA，SHRNA）的重组腺病毒载体（以下简称为ADSHMPP1，如图1所示），该重组腺病毒能在小鼠体内下调肝癌细胞内源MPHOSPH1的表达，显著阻滞细胞有丝分裂，并同时诱导多倍体细胞的形成，最终诱导肝癌细胞发生衰老及有丝分裂后凋亡，与传统P53信号通路相比具有不同的抗癌机制。动物体内结果显示，静脉注射该重组腺病毒，不仅能显著抑制小鼠原位肝说明书CN104195117A2/5页4癌的发生，恢复动物由于肝癌所导致的肝损伤，且能显著提升肝癌。
10、对于化疗药物紫杉醇的敏感性，产生协同抗癌作用，显示了良好的临床应用价值。发明内容0006本发明所要解决的的第一个问题在于提供一种全新的肝癌药物靶标分裂期磷蛋白1，其弥补传统基因治疗药物靶标P53基因的广谱性；本发明所要解决的第二个问题是提供了一种表达针对分裂期磷蛋白1的小发夹RNA的重组溶瘤腺病毒及其制备方法；本发明所要解决的第三个问题，是提供了该重组溶瘤腺病毒在制备癌症治疗药物中的应用。0007本发明提供了一种携带靶向人源的驱动蛋白分裂期磷蛋白1的小发夹RNA的重组溶瘤腺病毒ADSHMPP1的构建方法，与野生型腺病毒相比，该重组溶瘤腺病毒由肿瘤特异性启动子存活素启动子替换病毒复制必需基因E1。
11、A的启动子，删除复制非必需基因E1B55KD，并插入分裂期磷蛋白1的小发夹RNA的表达框（如图1所示），其具体方案如下步骤一，质粒PSP55/SHMPP1的构建1）用XBAI和BAMHI限制性内切酶，双酶切消化PXC2质粒，回收1170KP片段并克隆到经同样双酶切的PZD55载体中，构建成质粒PXC255；2）以HEK293细胞基因组DNA为模板，引物如下正向5ATGAATTCCGCGTTCTTTGAAAGCAG3（SEQIDNO1），反向5AATCTCGAGTGCCGCCGCCGCCACCT3（SEQIDNO2），经PCR扩增，得到含人269BP存活素（SURVIVIN）基因的启动子部分片段。
12、，并克隆到PTG19T载体上，构成质粒PTG19SP；3）PTG19SP经XHOIANDSALI双酶切，回收280BP片段并克隆到PXC255的SALI限制性位点，经过鉴定存活素基因启动子的方向，得到质粒PSP55；4）合成如下两条寡聚核苷酸正向5GTGAAGAAGTGCGACCGAAGAAGACTTCGGTCGCACTTCTTCACCTTTTTG3（SEQIDNO3），反向5AATTCAAAAAGGTGAAGAAGTGCGACCGAAGTCTTCTTCGGTCGCACTTCTTCAC3（SEQIDNO4），分别退火，克隆到经APAI/ECORI双酶切的PBS/U6载体上，其中APAI经T4D。
13、NA聚合酶处理成平端，得到质粒PBS/U6SHMPP1；5）PBS/U6SHMPP1经BAMHI消化，回收400BP包含U6/SHMPP1表达框的片段并克隆到PSP55的BGLII位点上得到质粒PSPSHMPP155；步骤二，同源重组法构建重组溶瘤腺病毒6孔板每孔铺入40105人胚肾细胞系HEK293细胞，共转染穿梭质粒PSPSHMPP155与大质粒PBHGE3，二周之后观察细胞状态直至产生空斑；步骤三，病毒收集纯化从空斑中挑选病毒单克隆，鉴定后大规模复制病毒，收集细胞培养物，经氯化铯密度梯度离心纯化病毒。0008本发明重组腺病毒ADSHMPP1作为肝癌基因治疗的新型载体其突出优点有三点，首先。
14、，其靶标分子分裂期磷蛋白1是发明人在肝癌中发现的一个全新的癌基因，该蛋白说明书CN104195117A3/5页5在细胞分裂末期中的胞质分裂过程中起着至关重要的作用。使用小发夹RNA能够极大的抑制该蛋白活性，阻止肝癌细胞有丝分裂，显著抑制肝癌的发生和发展，并且与抗细胞微管类化疗药物（其药物机理也是抑制细胞分裂）联用，如紫杉醇，会显著降低肝癌对紫杉醇的药物抵抗，产生显著的协同抗癌作用，在临床上对于应用化疗治疗肝癌具有较好的促进作用；第二，ADSHMPP1能显著改善由于肝癌所导致的肝损伤，这一突出优点使得靶向分裂期磷蛋白1的肝癌基因治疗在临床应用上尤其具有积极意义。总所周知，目前临床上治疗肝癌第一选。
15、择是外科手术，但是由于种种原因，特别是由于肝癌患者肝功能储备不足而难以实施手术。因此，如果能在治疗肝癌，缩小瘤体积的同时恢复病人肝功能储备，对于病人进一步的积极治疗，比如说手术切除，肝移植等具有极其重要的意义；第三，ADSHMPP1使用的是肿瘤特异复制性重组腺病毒。该病毒在野生型腺病毒的基础上替换病毒复制必需基因E1A的启动子为肿瘤特异性启动子存活素启动子，并删除了病毒在正常细胞中复制必需基因E1B55KD，使得病毒复制严格限制在肿瘤细胞中，而在正常细胞中不复制，在提高基因治疗效果的同时也提高了其对正常组织的安全性，克服了以往使用非复制型病毒作为基因治疗载体的一系列不足之处。附图说明0009图。
16、1为腺病毒基因组结构示意图，上排为野生型腺病毒，下排为ADSHMPP1。0010图2为ADSHMPP1抑制裸鼠肝癌原位移植瘤的发生。0011图3为ADSHMPP1显著降低动物血中谷草转氨酶指标并提高白蛋白指标。0012图4为ADSHMPP1抑制动物皮下移植瘤，并显示和紫杉醇具有协同抗癌作用。0013图5为重组溶瘤腺病毒在肝癌细胞中特性复制，并特异性在肿瘤细胞中大量表达外源报告基因。具体实施方式0014下面结合附图和实施例进一步说明本发明。0015实施例1重组腺病毒ADSHMPP1的构建方法质粒PSP55/SHMPP1的构建1）用XBAI和BAMHI限制性内切酶，双酶切消化PXC2质粒，回收11。
17、70KP片段并克隆到经同样双酶切的PZD55载体中，构建成质粒PXC255。00162）以HEK293细胞基因组DNA为模板，引物如下正向5ATGAATTCCGCGTTCTTTGAAAGCAG3，反向5AATCTCGAGTGCCGCCGCCGCCACCT3，经PCR扩增，得到含人269BP存活素（SURVIVIN）基因的启动子部分片段，并克隆到PTG19T载体上，构成质粒PTG19SP。00173）PTG19SP经XHOIANDSALI双酶切，回收280BP片段并克隆到PXC255的SALI限制性位点，经过鉴定存活素基因启动子的方向，得到质粒PSP55。00184）合成如下两条寡聚核苷酸正向5。
18、GTGAAGAAGTGCGACCGAAGAAGACTTCGGTCGCACTTCTTCACCTTTTTG3，反向5AATTCAAAAAGGTGAAGAAGTGCGACCGAAGTCTTCTTCGGTCGCACTTCTTCAC3，说明书CN104195117A4/5页6分别退火，克隆到经APAI/ECORI双酶切的PBS/U6载体上，其中APAI经T4DNA聚合酶处理成平端，得到质粒PBS/U6SHMPP1。00195）PBS/U6SHMPP1经BAMHI消化，回收400BP包含U6/SHMPP1表达框的片段并克隆到PSP55的BGLII位点上得到质粒PSPSHMPP155。00206孔板每孔铺入。
19、40105人胚肾细胞系HEK293细胞，待细胞密度到80左右进行质粒转染。转染时，将上步得到的穿梭质粒PSPSHMPP155与大质粒PBHGE3按照质量比21混合，每孔加入15GDNA并补加BUFFEREC至总体积100L，然后加入12LENHANCER,震荡混匀；室温放置5分钟离心；加入15LEFFECTENETRANSFECTIONREAGENT，吹打混匀，室温放置20分钟；向转染复合物中加入600L完全培养基，混匀后加入孔中，并轻轻摇动平板是复合物均匀混合。37培养618小时后换液。继续培养48小时后，吸干培液并在每孔中加入2ML低熔点琼脂糖125AGAROSE,75FBS，等琼脂糖凝固。
20、后转移至培养箱。之后观察细胞状态直至产生空斑。0021从空斑中挑选病毒单克隆，经过PCR鉴定后进行大规模培养，收集细胞培养物，经氯化铯密度梯度离心纯化病毒。具体操作过程如下将293细胞铺于5080个10CM培养皿，待细胞密度达到90以后，每块板感染合适滴度的病毒，待细胞全部病变后47天，每块板中加入约500L10NONIDETP40NP40裂解液以裂解细胞。收集整个细胞裂解物，12000RPM离心10分钟，弃细胞碎片，收集上清。每100ML上清加入50MLPEG800020PEG8000，25MNACL，冰上2小时沉淀病毒。12000RPM离心上述混合物20分钟，弃上清，将沉淀物悬浮在10ML。
21、密度为110G/ML的氯化铯溶液中溶剂为20MMTRISHCL，PH8047000RPM低温离心5分钟，收集病毒悬浮液。氯化铯密度梯度溶液的制备加入20ML的氯化铯密度140G/ML，溶剂同上，再加入30ML密度为130G/ML的氯化铯溶液，再加入5ML的病毒悬浮液。20000RPM，室温离心2小时。收集密度在130140G/ML之间的病毒条带至透析袋中，透析袋用前用10MM的EDTA溶液煮沸10分钟。在透析缓冲液015M蔗糖，001MTRISHCLPH80，2MMMGCL2中，4透析过夜，中间换一次透析液。收集病毒，冻存于80。三种密度的CSCL溶液配制溶于灭菌20MMTRIS,PH80如下。
22、表1三种密度的氯化铯溶液配方密度20浓度W/V氯化铯质量终体积140G/ML565483G10ML130G/ML314024G10ML110G/ML121438G10ML实施例2ADSHMPP1抑制肝癌的发生在动物原位肝癌抑制瘤模型中，通过尾静脉分四次注射总计2109PFUADSHMPP1，在两周内能明显抑制肝癌移植瘤的发生（图2）。0022实施例3ADSHMPP1修复肝损伤在动物原位肝癌抑制瘤模型中，通过尾静脉分四次注射总计2109PFUADSHMPP1，在两周内能明显改善动物肝损伤，修复肝功能，血浆中谷草转氨酶和白蛋白的数值得到明显改善（图3）。0023实施例4ADSHMPP1增强肝癌对于。
23、紫杉醇的敏感性在动物皮下肝癌移植瘤模型中，给予总计2109PFU的ADSHMPP1能显著抑制移植瘤说明书CN104195117A5/5页7的生长，且和紫杉醇联用后抗癌效果明显，较药物单用组抑癌效果显著增加（图4A）。通过药物合用软件CALCUSYN计算，两种药物联用具有协同作用（图4B）。0024实施例5ADSHMPP1在肿瘤细胞中特异性复制ADSHMPP1分别以01MOI感染正常细胞及肝癌细胞，48小时后收集细胞基因组DNA，实时荧光定量PCR检测病毒E3DNA的相对水平并计算病毒相对复制能力。利用携带报告基因绿色荧光蛋白的重组腺病毒以相同的MOI感染不同细胞，96小时后检测细胞内绿色荧光的。
24、强度，估算病毒外源基因的表达能力。结果显示ADSHMPP1在肝癌细胞HEPG2,HEP3B,BEL7404,HUH7中相比正常肝细胞L02和QSG7701中复制能力显著提高（图5A），其表达外源基因的能力也有显著性增强（图5B），显示了良好的安全性。说明书CN104195117A1/2页8SEQUENCELISTING武汉百奥京生物医药有限公司一种携带靶向分裂期磷蛋白1基因的小发夹RNA的重组溶瘤腺病毒4PATENTINVERSION33126DNA人工序列1ATGAATTCCGCGTTCTTTGAAAGCAG26226DNA人工序列2AATCTCGAGTGCCGCCGCCGCCACCT26351DNA人工序列3GTGAAGAAGTGCGACCGAAGAAGACTTCGGTCGCACTTCTTCACCTTTTTG51序列表CN104195117A2/2页9455DNA人工序列4AATTCAAAAAGGTGAAGAAGTGCGACCGAAGTCTTCTTCGGTCGCACTTCTTCAC55序列表CN104195117A1/3页10图1图2说明书附图CN104195117A102/3页11图3图4说明书附图CN104195117A113/3页12图5说明书附图CN104195117A12。