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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610715705.0 (22)申请日 2016.08.24 (71)申请人 盛世绿源科技有限公司 地址 116000 辽宁省大连市西岗区北京街 126号 (72)发明人 马丽源 (74)专利代理机构 北京方安思达知识产权代理 有限公司 11472 代理人 徐淑东 王宇杨 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种平滑山楂的组培方法 (57)摘要 本发明提供一种平滑山楂的组培方法， 包括 以下步骤： 切取平滑山楂植株个体的半木质化茎。
2、 芽进行预处理， 然后接种到诱导培养基上， 获得 无菌芽苗； 将获得的无菌芽苗切割成带顶芽的茎 段， 接种到增殖培养基上， 获得丛生芽苗； 挑选健 壮的丛生芽苗， 以单个芽苗为单位进行切离， 将 切离后的单个芽苗切割， 然后将茎段接种到生根 培养基上， 获得再生植株； 将株高达4cm、 根系发 达、 叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗 3d， 然后洗净根系附着的培养基， 再移植到栽培 基质中并浇透水， 用塑料薄膜覆盖容器口培养至 长出的新叶完全展开后， 去掉覆盖的塑料薄膜， 获得平滑山楂苗木。 本发明平滑山楂的组培方法 简单、 科学， 具有简便高效、 成本低、 苗产量高的 优点。 权利要求书。
3、2页 说明书5页 CN 106305422 A 2017.01.11 CN 106305422 A 1.一种平滑山楂的组培方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 步骤一、 切取平滑山楂植株个体的半木质化茎芽进行预处理， 然后接种到含0.01 0.1mg/L细胞分裂素、 0.010.1mg/L生长素、 2040g/L蔗糖和57g/L琼脂的诱导培养基 上， 在温度为2030、 湿度为4080、 光照强度为20100 molm-2s-1、 每天光照 1224h、 2030天获得无菌芽苗； 步骤二、 将获得的无菌芽苗切割成1.55.0cm的带顶芽的茎段， 接种到含0.11mg/L 细胞分裂素、 0.01。
4、0.1mg/L生长素、 2040g/L蔗糖和57g/L琼脂的增殖培养基上， 在温 度为2030、 湿度为4080、 光照强度为20100 molm-2s-1、 每天光照1224h、 每1030天更换新鲜培养基的条件下培养13个月， 获得丛生芽苗； 步骤三、 挑选健壮的丛生芽苗， 以单个芽苗为单位进行切离， 将切离后的单个芽苗切割 成长度为2.03.0cm的带顶芽的茎段， 然后将茎段接种到含有0.10.5mg/L生长素、 20 40g/L蔗糖和57g/L琼脂的生根培养基上， 在温度为2030、 湿度为4080、 光照强 度为20100 molm-2s-1、 每天光照1224h条件下培养1030天。
5、， 获得再生植株； 步骤四、 将株高达4cm、 根系发达、 叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3d， 然后洗 净根系附着的培养基， 再移植到栽培基质中并浇透水， 在温度为2030、 湿度为60 80、 光照强度为40100 molm-2s-1、 每天光照1218h的条件下用塑料薄膜覆盖容器 口培养至长出的新叶完全展开后， 去掉覆盖的塑料薄膜， 获得平滑山楂苗木。 2.根据权利要求1所述平滑山楂的组培方法， 其特征在于， 步骤一所述预处理包括以下 步骤： 5-6月份， 晴天上午， 选生长健壮、 树形优美、 无病虫害的优良母本， 采集一年生枝条， 剪成长1.5-2.5cm的带腋芽茎段， 用中性洗。
6、涤剂漂洗后， 流水冲洗2h以上， 后置于工作台备 用； 在超净工作台上， 先用70乙醇处理10-30s， 后用0.1升汞处理1-5min， 然后用无菌水 漂洗5次。 3.根据权利要求1所述平滑山楂的组培方法， 其特征在于， 步骤一、 切取平滑山楂植株 个体的半木质化茎芽进行预处理， 然后接种到含0.01-0.04mg/L细胞分裂素、 0.02-0.05mg/ L生长素、 2535g/L蔗糖和57g/L琼脂的诱导培养基上， 在温度为2025、 湿度为50 80、 光照强度为50100 molm-2s-1、 每天光照1224h、 2030天获得无菌芽苗。 4.根据权利要求1所述平滑山楂的组培方法，。
7、 其特征在于， 其中步骤一中诱导培养基为 MS培养基、 1/2MS培养基、 DKW培养基、 WPM培养基或QL培养基， pH值为56， 细胞分裂素为苄 基腺嘌呤、 玉米素、 激动素或氯吡苯脲， 生长素为萘乙酸或吲哚丁酸。 5.根据权利要求1所述平滑山楂的组培方法， 其特征在于， 步骤二、 将获得的无菌芽苗 切割成1.55.0cm的带顶芽的茎段， 接种到含0.8-1.0mg/L细胞分裂素、 0.020.05mg/L生 长素、 2040g/L蔗糖和57g/L琼脂的增殖培养基上， 在温度为2030、 湿度为60 80、 光照强度为4080 molm-2s-1、 每天光照1220h、 每1030天更换。
8、新鲜培养基的 条件下培养13个月， 获得丛生芽苗。 6.根据权利要求1所述平滑山楂的组培方法， 其特征在于， 步骤二中增殖培养基为MS培 养基、 DKW培养基、 WPM培养基或QL培养基， pH值为56， 细胞分裂素为苄基腺嘌呤、 玉米素、 激动素或氯吡苯脲， 生长素为萘乙酸和/或吲哚丁酸。 7.根据权利要求1所述平滑山楂的组培方法， 其特征在于， 步骤三、 挑选健壮的丛生芽 苗， 以单个芽苗为单位进行切离， 将切离后的单个芽苗切割成长度为2.03.0cm的带顶芽 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 106305422 A 2 的茎段， 然后将茎段接种到含有0.3-0.5mg/L生长素、。
9、 2035g/L蔗糖和57g/L琼脂的生根 培养基上， 在温度为2030、 湿度为4060、 光照强度为50100 molm-2s-1、 每 天光照1220h条件下培养1030天， 获得再生植株。 8.根据权利要求1所述平滑山楂的组培方法， 其特征在于， 步骤三中生根培养基为1/ 2MS培养基或1/3MS培养基， pH值为56， 生长素为吲哚乙酸和/或吲哚丁酸。 9.根据权利要求1所述平滑山楂的组培方法， 其特征在于， 步骤四、 将株高达4cm、 根系 发达、 叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3d， 然后洗净根系附着的培养基， 再移植到 栽培基质中并浇透水， 在温度为2030、 湿度为70。
10、80、 光照强度为60100 mol m-2s-1、 每天光照1215h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至长出的新叶完全展开 后， 去掉覆盖的塑料薄膜， 获得平滑山楂苗木。 10.根据权利要求1所述平滑山楂的组培方法， 其特征在于， 步骤四中所述栽培基质包 含体积比如下的各组分： 草炭土3份， 珍珠岩1-3份。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 106305422 A 3 一种平滑山楂的组培方法 技术领域 0001 本发明涉及组培技术， 尤其涉及一种平滑山楂的组培方法。 背景技术 0002 平滑山楂(绿山楂冬王)Crataegus viridis Winter King 山楂属落叶小乔。
11、木， 树 高4.5一6米， 冠宽3.5一6米。 圆形树冠， 单叶互生， 卵形或倒卵形， 3一5裂， 叶缘具锯齿。 花白 色， 果红色， 果可保留到第二年春季。 生长慢， 喜光， 适宜湿润、 肥沃土壤， 适应性强， 易栽培， 耐修剪。 原产于北美东部。 我国可在北至黑龙江及内蒙古南部， 南至湖南、 安徽、 江苏北部区 域内生长。 该品种以其夺目鲜红、 挂果持久的山楂果而著名， 树龄可达100年之久， 花、 果具 观赏价值， 适合庭园栽种， 既可作庭园景观树， 又可作绿篱等。 0003 由于利用种子进行播种繁殖存在一些局限性， 嫁接繁育技术目前在我国成活率较 低， 因此加强其无性繁殖的研究， 建立。
12、无性繁殖技术体系， 提高我国绿山楂冬王苗木的生产 能力， 能为其广泛应用于城市园林中提供技术保障。 目前我国对于平滑山楂组培的研究尚 无。 发明内容 0004 本发明的目的在于， 针对上述问题， 提出一种平滑山楂的组培方法， 该方法简便高 效， 成本低， 诱导率高， 增殖系数高。 0005 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案是： 一种平滑山楂的组培方法， 包括以下 步骤： 0006 步骤一、 切取平滑山楂植株个体的半木质化茎芽进行预处理， 然后接种到含0.01 0.1mg/L细胞分裂素、 0.010.1mg/L生长素、 2040g/L蔗糖和57g/L琼脂的诱导培养 基上， 在温度为2030。
13、、 湿度为4080、 光照强度为20100 molm-2s-1、 每天光 照1224h、 2030天获得无菌芽苗； 0007 步骤二、 将获得的无菌芽苗切割成1.55.0cm的带顶芽的茎段， 接种到含0.1 1mg/L细胞分裂素、 0.010.1mg/L生长素、 2040g/L蔗糖和57g/L琼脂的增殖培养基上， 在温度为2030、 湿度为4080、 光照强度为20100 molm-2s-1、 每天光照12 24h、 每1030天更换新鲜培养基的条件下培养13个月， 获得丛生芽苗； 0008 步骤三、 挑选健壮的丛生芽苗， 以单个芽苗为单位进行切离， 将切离后的单个芽苗 切割成长度为2.03.。
14、0cm的带顶芽的茎段， 然后将茎段接种到含有0.10.5mg/L生长素 (两种生长素， 浓度均为0.1-0.5mg/L)、 2040g/L蔗糖和57g/L琼脂的生根培养基上， 在 温度为2030、 湿度为4080、 光照强度为20100 molm-2s-1、 每天光照12 24h条件下培养1030天， 获得再生植株； 0009 步骤四、 将株高达4cm、 根系发达、 叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3d， 然 后洗净根系附着的培养基， 再移植到栽培基质中并浇透水， 在温度为2030、 湿度为60 80、 光照强度为40100 molm-2s-1、 每天光照1218h的条件下用塑料薄膜覆盖容。
15、 说 明 书 1/5 页 4 CN 106305422 A 4 器口培养至长出的新叶完全展开后， 去掉覆盖的塑料薄膜， 获得平滑山楂苗木， 即完成平滑 山楂的微繁方法。 0010 进一步地， 步骤一所述预处理包括以下步骤： (大连地区)5-6月份， 晴天上午， 选生 长健壮、 树形优美、 无病虫害的优良母本， 采集一年生枝条， 剪成长1.5-2.5cm的带腋芽茎 段， 用中性洗涤剂漂洗后， 流水冲洗2h以上， 后置于工作台备用； 在超净工作台上， 先用70 乙醇处理10-30s， 后用0.1升汞处理1-5min， 然后用无菌水漂洗5次。 0011 进一步地， 步骤一、 切取平滑山楂植株个体的半。
16、木质化茎芽进行预处理， 然后接种 到含0.01-0.04mg/L细胞分裂素、 0.02-0.05mg/L生长素、 2535g/L蔗糖和57g/L琼脂的 诱导培养基上， 在温度为2025、 湿度为5080、 光照强度为50100 molm-2s -1、 每天光照1224h、 2030天获得无菌芽苗。 0012 进一步地， 其中步骤一中诱导培养基为MS培养基、 1/2MS培养基、 DKW培养基、 WPM培 养基或QL培养基， pH值为56， 细胞分裂素为苄基腺嘌呤、 玉米素、 激动素或氯吡苯脲， 生长 素为萘乙酸或吲哚丁酸。 0013 进一步地， 步骤二、 将获得的无菌芽苗切割成1.55.0cm的。
17、带顶芽的茎段， 接种到 含0.8-1.0mg/L细胞分裂素、 0.020.05mg/L生长素、 2040g/L蔗糖和57g/L琼脂的增殖 培养基上， 在温度为2030、 湿度为6080、 光照强度为4080 molm-2s-1、 每天 光照1220h、 每1030天更换新鲜培养基的条件下培养13个月， 获得丛生芽苗。 0014 进一步地， 步骤二中增殖培养基为MS培养基、 DKW培养基、 WPM培养基或QL培养基， pH值为56， 细胞分裂素为苄基腺嘌呤、 玉米素、 激动素或氯吡苯脲， 生长素为萘乙酸和/或 吲哚丁酸。 0015 进一步地， 步骤三、 挑选健壮的丛生芽苗， 以单个芽苗为单位进行。
18、切离， 将切离后 的单个芽苗切割成长度为2.03.0cm的带顶芽的茎段， 然后将茎段接种到含有0.3-0.5mg/ L(两种生长素、 浓度均为0.3-0.5mg/L)生长素、 2035g/L蔗糖和57g/L琼脂的生根培养 基上， 在温度为2030、 湿度为4060、 光照强度为50100 molm-2s-1、 每天光 照1220h条件下培养1030天， 获得再生植株。 0016 进一步地， 步骤三中生根培养基为生长素为1/2MS培养基或1/3MS培养基， pH值为5 6， 生长素为吲哚乙酸和/或吲哚丁酸。 0017 进一步地， 步骤四、 将株高达4cm、 根系发达、 叶片展开的再生植株在培养室。
19、内敞口 炼苗3d， 然后洗净根系附着的培养基， 再移植到栽培基质中并浇透水， 在温度为2030、 湿度为7080、 光照强度为60100 molm-2s-1、 每天光照1215h的条件下用塑料 薄膜覆盖容器口培养至长出的新叶完全展开后， 去掉覆盖的塑料薄膜， 获得平滑山楂苗木， 即完成平滑山楂的微繁方法。 0018 进一步地， 步骤四中所述栽培基质包含体积比如下的各组分： 草炭土3份， 珍珠岩 1-3份。 优选为草炭土3份， 珍珠岩2份。 0019 本发明平滑山楂的组培方法步骤科学、 合理， 与现有技术相比较具有以下优点： 0020 1、 预处理简便， 污染率低， 无菌材料的保存率高， 可达8。
20、0。 0021 2、 初代培养基的诱导率高， 可达80以上。 0022 3、 增殖培养基的增殖速度快、 苗生长整齐一致、 增殖系数高， 可达7.0 说 明 书 2/5 页 5 CN 106305422 A 5 具体实施方式 0023 以下结合实施例对本发明进一步说明： 0024 实施例1 0025 本实施例公开了一种平滑山楂的组培方法， 包括以下步骤： 0026 步骤一、 切取平滑山楂植株个体的半木质化茎芽进行预处理， 然后接种到含 0.05mg/L细胞分裂素、 0.05mg/L生长素、 30g/L蔗糖和6g/L琼脂的诱导培养基上， 在温度为 25、 湿度为60、 光照强度为70 molm-2。
21、s-1、 每天光照20h、 2030天获得无菌芽苗； 0027 步骤二、 将获得的无菌芽苗切割成1.55.0cm的带顶芽的茎段， 接种到含0.05mg/ L细胞分裂素、 0.05mg/L生长素、 30g/L蔗糖和6g/L琼脂的增殖培养基上， 在温度为30、 湿 度为60、 光照强度为60 molm-2s-1、 每天光照20h、 每20天更换新鲜培养基的条件下培 养2个月， 获得丛生芽苗； 0028 步骤三、 挑选健壮的丛生芽苗， 以单个芽苗为单位进行切离， 将切离后的单个芽苗 切割成长度为2.03.0cm的带顶芽的茎段， 然后将茎段接种到含有0.3mg/L生长素、 30g/L 蔗糖和6g/L琼。
22、脂的生根培养基上， 在温度为2030、 湿度为60、 光照强度为60 molm -2s-1、 每天光照19h条件下培养20天， 获得再生植株； 0029 步骤四、 将株高达4cm、 根系发达、 叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3d， 然 后洗净根系附着的培养基， 再移植到栽培基质中并浇透水， 在温度为25、 湿度为70、 光 照强度为70 molm-2s-1、 每天光照15h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至长出的新 叶完全展开后， 去掉覆盖的塑料薄膜， 获得平滑山楂苗木， 即完成平滑山楂的微繁方法。 0030 上述预处理以大连地区为例， 包括以下步骤： 5-6月份， 晴天上午， 选生长健。
23、壮、 树 形优美、 无病虫害的优良母本， 采集一年生枝条， 剪成长1.5-2.5cm的带腋芽茎段， 用中性洗 涤剂漂洗后， 流水冲洗2h以上， 后置于工作台备用； 在超净工作台上， 先用70乙醇处理 20s， 后用0.1升汞处理3min， 然后用无菌水漂洗5次。 0031 其中步骤一中诱导培养基为MS培养基， pH值为56， 细胞分裂素为苄基腺嘌呤， 生 长素为萘乙酸； 步骤二中增殖培养基为MS培养基， pH值为56， 细胞分裂素为苄基腺嘌呤， 生长素为萘乙酸； 步骤三中生根培养基为生长素为MS培养基， pH值为56， 生长素为吲哚乙 酸和吲哚丁酸； 步骤四中栽培基质按体积份数比为3份的草炭土。
24、、 2份的珍珠岩。 0032 实施例2 0033 本实施例公开了一种平滑山楂的组培方法， 包括以下步骤： 0034 步骤一、 切取平滑山楂植株个体的半木质化茎芽进行预处理， 然后接种到含 0.01mg/L细胞分裂素、 0.1mg/L生长素、 20g/L蔗糖和7g/L琼脂的诱导培养基上， 在温度为20 、 湿度为40、 光照强度为100 molm-2s-1、 每天光照12h、 30天获得无菌芽苗； 0035 步骤二、 将获得的无菌芽苗切割成1.55.0cm的带顶芽的茎段， 接种到含0.1mg/L 细胞分裂素、 0.1mg/L生长素、 40g/L蔗糖和5g/L琼脂的增殖培养基上， 在温度为30、 。
25、湿度 为80、 光照强度为100 molm-2s-1、 每天光照24h、 每30天更换新鲜培养基的条件下培 养3个月， 获得丛生芽苗； 0036 步骤三、 挑选健壮的丛生芽苗， 以单个芽苗为单位进行切离， 将切离后的单个芽苗 切割成长度为2.03.0cm的带顶芽的茎段， 然后将茎段接种到含有0.5mg/L生长素、 40g/L 说 明 书 3/5 页 6 CN 106305422 A 6 蔗糖和7g/L琼脂的生根培养基上， 在温度为20、 湿度为40、 光照强度为100 molm -2s-1、 每天光照12h条件下培养10天， 获得再生植株； 0037 步骤四、 将株高达4cm、 根系发达、 叶。
26、片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3d， 然 后洗净根系附着的培养基， 再移植到栽培基质中并浇透水， 在温度为30、 湿度为80、 光 照强度为40 molm-2s-1、 每天光照12h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至长出的新 叶完全展开后， 去掉覆盖的塑料薄膜， 获得平滑山楂苗木， 即完成平滑山楂的微繁方法。 0038 上述预处理以大连地区为例， 包括以下步骤： 5-6月份， 晴天上午， 选生长健壮、 树 形优美、 无病虫害的优良母本， 采集一年生枝条， 剪成长1.5-2.5cm的带腋芽茎段， 用中性洗 涤剂漂洗后， 流水冲洗2h以上， 后置于工作台备用； 在超净工作台上， 先用70乙醇处。
27、理 30s， 后用0.1升汞处理5min， 然后用无菌水漂洗5次。 0039 其中步骤一中诱导培养基为DKW培养基， pH值为56， 细胞分裂素为氯吡苯脲， 生 长素为吲哚丁酸； 步骤二中增殖培养基为MS培养基， pH值为56， 细胞分裂素为苄基腺嘌 呤， 生长素为吲哚丁酸； 步骤三中生根培养基为生长素为WPM培养基， pH值为56， 生长素为 吲哚乙酸和吲哚丁酸； 步骤四中栽培基质按体积份数比为3份的草炭土、 2份的珍珠岩。 0040 实施例3 0041 本实施例公开了一种平滑山楂的组培方法， 包括以下步骤： 0042 步骤一、 切取平滑山楂植株个体的半木质化茎芽进行预处理， 然后接种到含 。
28、0.07mg/L细胞分裂素、 0.03mg/L生长素、 25g/L蔗糖和5g/L琼脂的诱导培养基上， 在温度为 20、 湿度为70、 光照强度为50 molm-2s-1、 每天光照18h、 30天获得无菌芽苗； 0043 步骤二、 将获得的无菌芽苗切割成1.55.0cm的带顶芽的茎段， 接种到含0.8mg/L 细胞分裂素、 0.09mg/L生长素、 20g/L蔗糖和7g/L琼脂的增殖培养基上， 在温度为20、 湿度 为80、 光照强度为100 molm-2s-1、 每天光照24h、 每30天更换新鲜培养基的条件下培 养2个月， 获得丛生芽苗； 0044 步骤三、 挑选健壮的丛生芽苗， 以单个芽。
29、苗为单位进行切离， 将切离后的单个芽苗 切割成长度为2.03.0cm的带顶芽的茎段， 然后将茎段接种到含有0.5mg/L生长素、 20g/L 蔗糖和5g/L琼脂的生根培养基上， 在温度为30、 湿度为40、 光照强度为80 molm-2s -1、 每天光照24h条件下培养30天， 获得再生植株； 0045 步骤四、 将株高达4cm、 根系发达、 叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3d， 然 后洗净根系附着的培养基， 再移植到栽培基质中并浇透水， 在温度为30、 湿度为60、 光 照强度为60 molm-2s-1、 每天光照18h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至长出的新 叶完全展开后， 去掉。
30、覆盖的塑料薄膜， 获得平滑山楂苗木， 即完成平滑山楂的微繁方法。 0046 上述预处理以大连地区为例， 包括以下步骤： 5-6月份， 晴天上午， 选生长健壮、 树 形优美、 无病虫害的优良母本， 采集一年生枝条， 剪成长1.5-2.5cm的带腋芽茎段， 用中性洗 涤剂漂洗后， 流水冲洗2h以上， 后置于工作台备用； 在超净工作台上， 先用70乙醇处理 10s， 后用0.1升汞处理3min， 然后用无菌水漂洗5次。 0047 其中步骤一中诱导培养基为DKW培养基， pH值为56， 细胞分裂素为激动素， 生长 素为吲哚丁酸； 步骤二中增殖培养基为DKW培养基， pH值为56， 细胞分裂素为氯吡苯脲。
31、， 生 长素为萘乙酸； 步骤三中生根培养基为生长素为DKW培养基， pH值为56， 生长素为吲哚乙 酸和吲哚丁酸； 步骤四中栽培基质按体积份数比为3份的草炭土、 2份的珍珠岩。 说 明 书 4/5 页 7 CN 106305422 A 7 0048 最后应说明的是： 以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其限制； 尽 管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明， 本领域的普通技术人员应当理解： 其依 然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分或者全部技术特征进 行等同替换； 而这些修改或者替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术 方案的范围。 说 明 书 5/5 页 8 CN 106305422 A 8 。