能够抑制自身免疫、 炎症和癌症进程的新型趋化因子结合 多肽 技术领域 本发明公开了能够结合趋化因子的新型多肽， 更特别地但不排它地公开了能够调 节趋化因子依赖性过程 (chemokine-dependent processes) 如自身免疫、 炎症和癌症的多 肽。
背景技术 趋化因子是参与炎性疾病过程的许多生物因子之一。趋化因子属于一组小的、 ～ 8-14kDa 的、 大多数为碱性的肝素结合蛋白质， 所述的肝素结合蛋白质既与它们的一级结构 相关， 又与 4 个保守性半胱氨酸残基的存在相关。
趋化因子是已证明为体外白细胞亚群体的选择性化学引诱物， 并可诱导体内炎 性细胞积聚的趋化性细胞因子。除了化学趋向性之外， 趋化因子还可以介导白细胞脱 粒 (leukocyte de-granulation)[Baggiolini and Dahinden， Immunol Today 1994， 15 ： 127-133]、 粘附受体的上调 [Vaddi and Newton， J Immunol 1994， 153 ： 4721-4732]， 以及人
免疫缺陷病毒复制的抑制 [Cocchi 等人， Science 1995， 270 ： 1811-1815]。
趋化因子对免疫系统中的细胞招募 (recruitment) 和活化起着重要作用。它们也 在除了免疫系统之外的许多不同细胞类型中具有多种多样的作用， 包括例如在中枢神经系 统的各种细胞中 [Ma 等人， PNAS 1998， 95 ： 9448-9453]， 和在内皮细胞中， 其中它们导致血 管生成或抑制血管生成作用 (angiostatic effects)[Strieter 等人， J Biol Chem 1995， 270 ： 27348-27357]。 特定趋化因子可以对肿瘤具有多种作用， 包括血管生成、 促进生长和转 移， 以及抑制对癌症的免疫反应， 而其它趋化因子可以抑制肿瘤介导的血管生成和促进抗 肿瘤免疫反应。
由于在炎症和相关病症如哮喘、 动脉硬化、 同种异体移植排斥、 AIDS 和自身免疫性 病症 ( 例如， 多发性硬化、 关节炎、 重症肌无力、 狼疮 ) 中起着关键作用， 趋化因子受体日益 受到关注。
国 际 专 利 申 请 PCT/IL03/00155( 以 WO 03/072599 公 开 ) 和 美 国 专 利 No.7,488,717 公 开 了 能 够 结 合 趋 化 因 子 和 调 节 它 们 的 生 物 功 能 的 新 型 肽 和 模 拟 肽 (peptidomimetics)。 发明内容
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含至少一种附接到 Fc 结构域或其片 段上的趋化因子结合肽的分离多肽。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含本文所述的多肽和药学可接受载体 的药物组合物。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了本文所述多肽在制造用于调节趋化因子 生物效应的药物中的用途。根据本发明一些实施方式的方面， 提供了调节趋化因子生物效应的方法， 该方法 包括向需要其的受验者 ( 受试者、 对象、 或主体， subject) 给予治疗有效量的本文所述多 肽， 从而调节趋化因子的生物效应。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了本文所述多肽在制造用于治疗选自以下 的病症的药物中的用途 ： 炎症、 过敏症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫反应 (non-optimal immune response)、 细胞迁移异常 ( 异常的细胞迁移， abnormal cell migration)、 自身免 疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥 (allograft rejection)、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银 屑病、 动脉硬化 (atherosclerosis)、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了治疗选自以下的病症的方法 ： 炎症、 过敏 症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺 血， 该方法包括向需要其的受验者给予本文所述多肽， 从而调节和 / 或抑制趋化因子的生 物效应。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了编码本文所述多肽的分离多核苷酸。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含本文所述多核苷酸的核酸构建体。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含上述核酸构建体的细胞。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了制取 ( 制备、 生成， generate) 多肽的方 法， 该方法包括培养上述细胞， 和分离该多肽。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含附接到水溶性聚合物上的本文所述 多肽的结合物 (conjugate)。
根据本发明一些实施方式， 该多肽进一步包含接头。
根据本发明一些实施方式， 该接头是氨基酸接头。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域选自 IgG Fc 结构域、 IgA Fc 结构域、 IgD Fc 结构域、 IgE Fc 结构域， 和 IgM Fc 结构域。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽附接在 Fc 结构域或其片段的 N 末端 上。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽附接在 Fc 结构域或其片段的 C 末端 上。
根据本发明一些实施方式， 该接头由 4 ～ 10 个氨基酸组成。
根据本发明一些实施方式， 该接头是六肽。
根据本发明一些实施方式， 该接头是如 SEQ ID NO ： 162 中列出的肽。
根据本发明一些实施方式， 该多肽进一步包含信号肽。
根据本发明一些实施方式， 该信号肽在该多肽的 N- 末端。
根据本发明一些实施方式， 该多肽具有下式 ：
W-X-Y-Z
其中 ：
W 是信号肽 ；X 是趋化因子结合肽 (chemokine-binding peptide) ；
Y 是接头 ； 且
Z 是 Fc 结构域或其片段。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽长度为 10 ～ 20 个氨基酸。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽长度为 12 ～ 13 个氨基酸。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽的特征是具有结合到至少一种选 自 I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞趋化因子 ( 嗜酸粒细胞趋化蛋白， eotaxin) 和 RANTES 的趋化因子上的能力。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽选自 SEQ ID NO ： 1-157。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽选自 BKT-P2(SEQ ID NO ： 101) 和 BKT-P46(SEQ ID NO ： 76)。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽具有表现出与选自 SEQ ID NO ： 1-157 的氨基酸序列具有至少 90％序列同源性 (sequence homology) 的氨基酸序列。
根据本发明一些实施方式， 上述序列同源性为至少 95％。
根据本发明一些实施方式， 该信号肽包含 IL-6 信号肽。 根据本发明一些实施方式， 该信号肽具有 SEQ ID NO ： 161。
根据本发明一些实施方式， 该信号肽具有表现出与 SEQ ID NO ： 161 具有至少 90％ 序列同源性的氨基酸序列。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域是人 Fc 结构域。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域是 IgG Fc 结构域。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域是 IgG1 结构域。
根 据 本 发 明 一 些 实 施 方 式，该 Fc 结 构 域 或 其 片 段 是 非 糖 基 化 的 (non-glycosylated)。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域或其片段具有 SEQ ID NO ： 160。
根据本发明一些实施方式， 该多肽的特征是具有抑制至少一种趋化因子与趋化因 子受体 (chemokine receptor) 结合的能力。
根据本发明一些实施方式， 该多肽的特征是具有增强至少一种趋化因子与趋化因 子受体结合的能力。
根据本发明一些实施方式， 该药物组合物包装在包装材料中， 并在包装材料中或 包装材料上标识用于调节趋化因子的生物效应。
根据本发明一些实施方式， 该药物组合物包装在包装材料中， 并在包装材料中或 包装材料上标识用于治疗选自以下的病症 ： 炎症、 过敏症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫 反应、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排 斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动 脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
根据本发明一些实施方式， 该药物组合物调配用于静脉给予、 口服给予、 皮下给 予、 局部给予 (topical administration) 和 / 或鼻内给予。
根据本发明一些实施方式， 该药物调配用于静脉给予、 口服给予、 皮下给予、 局部 给予和 / 或鼻内给予。
根据本发明一些实施方式， 给予包括静脉给予、 口服给予、 皮下给予、 局部给予和 / 或鼻内给予。
根据本发明一些实施方式， 调节包括抑制。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子选自 I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细 胞趋化因子和 RANTES。
根据本发明一些实施方式， 该生物效应选自炎性效应、 细胞迁移、 肿瘤生长和癌转 移 (cancer metastasis)。
根据本发明一些实施方式， 该多肽用于治疗选自以下的病症 ： 炎症、 过敏症、 迟发 型超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红 斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感 染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
根据本发明一些实施方式， 该分离多核苷酸具有选自 SEQ ID NO ： 168 和 SEQ ID NO ： 169 的核酸序列。
根据本发明一些实施方式， 该水溶性聚合物是聚乙二醇。
除非另有限定， 否则本文使用的所有技术和 / 或科学术语的含义都与本发明所属 领域普通技术人员通常理解的相同。虽然下面描述了示例方法和 / 或材料， 但本发明实施 方式的实施或试验中可使用与本文所述的那些相似或者等同的方法和 / 或材料。如有冲 突， 以专利说明书为准， 包括定义。另外， 材料、 方法和实例仅为了说明， 而不旨在进行不必 要的限制。 附图说明 本文仅参考附图通过实例说明本发明的一些实施方式。关于下面详细讨论的附 图， 要强调的是， 所示细节仅为了举例， 用于示意性地讨论本发明的实施方式。 就此而言， 参 考附图所作的描述将使本领域技术人员明了本发明实施方式可以如何实施。
在该图中 ：
图 1A 和 1B 是载体的载体图谱 (vector maps)， 该载体用于编码根据本发明一些 实施方式的多肽， 即， SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC， 图 1A) 和 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC， 图 1B)， 并进一步编码对氨必西林 ( 氨苄青霉素， ampicillin)(Amp) 和嘌呤霉素 (puromycin) (Puro) 具有抗性的基因 ；
图 2 是 Western 印迹 ( 蛋白杂交印迹， Western blot) 图像， 示出遗传加工 ( 基因 设计， genetically engineered) 用于产生示例多肽 SEQ ID NO ： 158( 泳道 1 和 2) 和 SEQ ID NO ： 159( 泳道 3-5) 的 HEK 293T 细胞池中的 IgG Fc， 以及 50ng( 泳道 6)、 100ng( 泳道 7)、 200ng( 泳道 8) 和 300ng( 泳道 9) 的对照 IgG Fc 的表达 ；
图 3A ～ 3C 是 示 出 在 暴 露 于 肽 BKT-P2(SEQ ID NO ： 101) 前 后， IP-10( 图 3A)、 I-TAC( 图 3B) 和 MIG( 图 3C) 诱导的 T 细胞与 VCAM-1 的粘附随剪切流 (shear flow) 的变 化 ( 在热灭活的 SDF-1 细胞因子存在下情况的 T 细胞粘附示为对照 ) 的图表 ；
图 4A ～ 4C 是示出在暴露于根据本发明一些实施方式的多肽， BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 前后， IP-10( 图 4A)、 I-TAC( 图 4B) 和 MIG( 图 4C) 诱导的 T 细胞与 VCAM-1 的粘 附随剪切流的变化 ( 在热灭活的 SDF-1 细胞因子存在情况下的 T 细胞粘附示为对照 (den))
的图表 ；
图 5A 和 5B 是示出对照小鼠以及用具有 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC) 的示例多 肽处理的小鼠的 EAE( 实验自身免疫性脑脊髓炎 ) 平均临床得分随着用 PLP( 蛋白脂质蛋白 质 ) 免疫从而诱导急性疾病后的时间的变化 ( 图 5A)， 和 EAE 平均累积临床得分 ( 图 5B) 的 图表 ；
图 6A 和 6B 是示出对照小鼠以及用具有 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC) 或 SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC) 的示例多肽处理的小鼠的 EAE( 实验自身免疫性脑脊髓炎 ) 平均临床 得分随着用 PLP( 蛋白脂质蛋白质 ) 免疫从而诱导急性疾病后的时间的变化 ( 图 6A)， 和 EAE 平均累积临床得分 ( 图 6B) 的图表 ；
图 7 是示出对照小鼠以及用具有 SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC) 或 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC) 的示例多肽处理的小鼠的 EAE( 实验自身免疫性脑脊髓炎 ) 平均临床得分 随着用 MOG 肽免疫从而诱导慢性疾病后的时间的变化的图表 ；
图 8A 和 8B 是示出健康小鼠 ( 阴性 CTRL)、 关节炎小鼠 ( 阳性 CTRL) 以及用具有 SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC) 的示例多肽处理的关节炎小鼠的膝关节腔 (knee cavity) 中 的嗜中性粒细胞 ( 图 8A) 和单核细胞 ( 图 8B) 的水平的图表 ； 以及 图 9 是具有 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC) 和 SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC) 的示例 多肽对迟发型超敏反应的抑制 ( 示出地塞米松 (Dex.) 的抑制用于比较 ) 的图表。
具体实施方式
本发明公开了能够结合趋化因子的新型多肽， 更特别地但不排它地， 涉及能够调 节趋化因子依赖性过程如自身免疫、 炎症和癌症的多肽。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前， 应理解本发明的应用不必局限于下 面的说明所列出的或通过实施例列举的细节。本发明能够有其它实施方式， 或能够以多种 方式实施或实现。
如上面背景部分所述的， 已描述了 ( 例如， 在国际专利申请 PCT/IL03/00155( 以 WO 03/072599 公开 ) 和美国专利 No.7,488,717) 能够结合到趋化因子上并能够调节它们的生 物功能的肽和结构相关的化合物。此种肽的实例在 SEQ ID NO ： 1-157 中列出。由于其能 够调节趋化因子功能的能力， 此种肽具有多种治疗应用。 然而， 此种肽的治疗益处典型地受 到， 例如肽在体内的短半衰期的限制。
当试图制取具有改进特性的趋化因子结合肽时， 本发明人将趋化因子结合肽附接 ( 连接， attach) 到 Fc 结构域片段上。
如下面实施例部分证明的， 简化本发明实践的同时， 发现包含趋化因子结合肽和 Fc 结构域片段的多肽惊人地表现出改进的趋化因子结合能力。进一步发现， 该多肽表现出 改进的治疗免疫相关性疾病和障碍如多发性硬化、 关节炎和迟发型超敏反应的体内功效， 以及长的循环寿命 (circulation lifetime)。
现参考附图和表格， 图 1A 和 1B 示出用于表达根据本发明一些实施方式的示例多 肽的示例 DNA 构建体， 该示例多肽称为 BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 和 BKT-P46-FC(SEQ ID NO ： 159)。图 2 示出前述示例多肽在细胞培养物中的表达， 如通过 Western 印迹检测的。
“BKT-P2-FC” 和 “BKT-P46-FC” 是本发明所有者 (owners) 所有的商标。BKT-P2-FC是 指 还 在 临 时 专 利 申 请 No.61/213,493 中 称 为 “IL6 信 号 肽 -BKT-P2- 间 隔 子 -FC” 、 “P2-Fc” 、 “BKT-Fc-2” 、 “BKT-Fc-P2” 、 “IL6-P2-Fc” 、 “IL6-P2-Fc N297A” 和 “IL6-BioPep1-Fc N297A”的 多 肽。BKT-P46-FC 是 指 还 在 临 时 专 利 申 请 No.61/213,493 中 称 为 “IL6 信 号 肽 -BKT-P46- 间 隔 子 -FC” 、 “BKT-Fc-46” 、 BKT-FC-46” 、 “P46-FC” 、 IL6-P46-Fc” 、 “IL6-P46-Fc N297A” 和 “IL6-BioPep2-Fc N297A” 的多肽。
表 3 示 出 前 述 示 例 多 肽 与 多 种 趋 化 因 子 的 结 合 的 解 离 常 数 (dissociation constants)。
图 4A-4C 示出示例多肽 (SEQ ID NO ： 158) 对一些趋化因子生物活性 ( 诱导 T 细胞 粘附 ) 的抑制作用。 作为比较， 图 3A-3C 示出该多肽所基于的趋化因子结合肽 (SEQ ID NO ： 101) 对相同活性的抑制作用。表 4 概述了示例多肽 (SEQ ID NO ： 158 和 SEQ ID NO ： 159) 以及它们所基于的趋化因子结合肽 ( 分别为 SEQ ID NO ： 101 和 SEQ ID NO ： 76) 抑制多种趋 化因子活性的能力。
图 5A、 5B、 6 和 7 示出根据本发明一些实施方式的示例多肽对抗小鼠 EAE( 实验自 身免疫性脑脊髓炎 ) 进展的功效。图 8A 和 8B 示出示例多肽对抗小鼠关节炎的功效。图 9 示出示例多肽对抗迟发型超敏反应的功效。
表 5 给出可以包括在根据本发明实施方式的多肽中的趋化因子结合肽。
因而， 本文给出的实验结果表明， 根据本发明实施方式的多肽能够结合到趋化因 子上 ( 参见例如表 3)， 是甚至比相应趋化因子结合肽更有效的趋化因子活性调节剂 ( 参见， 例如表 4 和图 3A、 3B、 4A 和 4B)， 可以治疗有效地治疗多种病症 ( 参见例如图 5A-9)。
因此， 根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含至少一种附接到抗体 (e.g.、 IgG、 IgA、 IgD、 IgE、 IgM 抗 体 )Fc 结 构 域 或 Fc 结 构 域 片 段 上 的 趋 化 因 子 结 合 肽 的 分 离多肽。包含附接到 Fc 结构域或其片段上的肽的分子在本文中可称为 “肽体 ( 多肽， peptibodies)” 。
在一些实施方式中， 该多肽包含单个趋化因子结合肽。
替换地， 该多肽包含多于一个的趋化因子结合肽 ( 例如， 2、 3、 4 或 5 个趋化因子结 合肽 )。该趋化因子结合肽可以彼此相同或不同。
如本文使用的术语 “趋化因子结合肽” 是指任何特征为具有结合到溶液中至少一 种趋化因子上的能力的肽 ( 例如， 多达 20 个氨基酸残基的肽 )。示例趋化因子包括， 但不 局限于， CCL1( 其中 CCL 是趋化因子 (C-C 基序 ) 配体的简称 )、 MCP-1( 本领域中也称为 CCL2)、 MIP-1( 包括 MIP-1α 和 / 或 MIP-1β)、 RANTES( 本领域中也称为 CCL5)、 CCL6、 CCL7、 CCL8、 CCL9、 嗜酸性粒细胞趋化因子 ( 本领域中也称为 CCL11)、 CCL12、 CCL13、 CCL14、 CCL15、 CCL16、 CCL17、 CCL18、 CCL19、 CCL20、 CCL21、 CCL22、 CCL23、 CCL24、 CCL25、 CCL26、 CCL27、 CCL28、 CXCL1( 其中 CXCL 是趋化因子 (C-X-C 基序 ) 配体的简称 )、 CXCL2、 CXCL3、 CXCL4、 CXCL5、 CXCL6、 CXCL7、 白介素 (interleukin)-8( 本领域中也称为 CXCL8)、 MIG( 本领域中也 称为 CXCL9)、 IP-10( 本领域中也称为 CXCL10)、 I-TAC( 本领域中也称为 CXCL11)、 SDF-1( 本 领域中也称为 CXCL12)、 BCA-1( 本领域中也称为 CXCL13)、 CXCL14、 CXCL15、 CXCL16、 CXCL17、 XCL1、 XCL2 和 CX3CL1。根据一个实施方式， 该肽可以结合到至少一种选自以下的趋化因子 上： I-TAC( 干扰素可诱导的 T 细胞 α 化学引诱物 )、 IP-10(10kDa 干扰素 γ- 可诱导的蛋 白 )、 MIG(γ 干扰素诱导的单核因子 (monokine))、 MCP-1( 单核细胞趋化蛋白 -1)、 嗜酸性粒细胞趋化因子和 RANTES( 活化后调节的、 正常 T 细胞表达与分泌的 )。
与趋化因子的结合可以通过本领域中已知的任何合适的技术 ( 例如， ELISA) 测 定。 可选地， 该结合是这样的， 以便该肽与趋化因子的结合的解离常数 (Kd) 小于 10-4M， 可选 -5 -6 地小于 10 M， 并可选地小于 10 M。测定解离常数的合适的技术是技术人员已知的。
可以根据本发明实施方式使用的趋化因子结合肽描述在国际专利申请 PCT/ IL03/00155( 以 WO 03/072599 公开 ) 和美国专利 No.7,488,717 中。
在一些实施方式中， 该趋化因子结合肽的长度为 5 ～ 50 个氨基酸， 可选地 5 ～ 40 个氨基酸， 可选地 5 ～ 30 个氨基酸， 可选地 7 ～ 20 个氨基酸， 可选地 9 ～ 20 个氨基酸， 并 可选地为 10 ～ 20 个氨基酸。根据示例实施方式， 该趋化因子结合肽的长度为约 12 个氨基 酸。
可选地， 该趋化因子结合肽选自 SEQ ID NO ： 1 ～ 157。
在一些实施方式中， 该趋化因子结合肽的特征是存在至少 2 个组氨酸残基和整体 带正电荷 (overall positive charge)( 例如， 带正电荷的氨基酸数目多于带负电荷的氨基 酸 )， 其中该肽主要由选自 H、 S、 A、 L、 I、 K、 R、 T 和 P 的氨基酸组成 ( 例如， 该肽的至少 40％， 并可选地至少 50％由前述氨基酸组成 )。 具 有 前 述 特 征 的 肽 实 例 包 括， 但 不 局 限 于， SIFAHQTPTHKN(SEQ ID NO ： 100)、 SIPSHSIHSAKA(SEQ ID NO ： 101)、 SAISDHRAHRSH(SEQ ID NO ： 96)、 SAGHIHEAHRPL(SEQ ID NO ： 95)、 ACHASLKHRC(SEQ ID NO ： 44)、 AHSLKSITNHGL(SEQ ID NO ： 46)、 ESDLTHALHWLG(SEQ ID NO ： 54) 、HSACHASLKHRC(SEQ ID NO ： 69) 、WSAHIVPYSHKP(SEQ ID NO ： 143) 、 YATQHNWRLKHE(SEQ ID NO ： 145)、 CAHLSPHKC(SEQ ID NO ： 1)、 GVHKHFYSRWLG(SEQ ID NO ： 61)、 HPTTPIHMPNF(SEQ ID NO ： 66)、 SVQTRPLFHSHF(SEQ ID NO ： 113)， 和 VHTSLLQKHPLP(SEQ ID NO ： 133)。SIPSHSIHSAKA(SEQ ID NO ： 101)， 在本文称为 “BKT-P2” ， 是示例趋化因子结合 肽。
在一些实施方式中， 该趋化因子结合肽的特征是存在至少 2 个相邻的 ( 邻近的， adjacent) 组氨酸残基和整体带正电荷 ( 例如， 带正电荷的氨基酸数目多于带负电荷的氨 基酸 )， 其中该肽主要由选自 H、 P、 T、 L、 R、 W 和 F 的氨基酸组成 ( 例如， 该肽的至少 40％， 并 可选地至少 50％由前述氨基酸组成 )。
具 有 前 述 特 征 的 肽 实 例 包 括， 但 不 局 限 于， GDFNSGHHTTTR(SEQ ID NO ： 59)、 HHFHLPKLRPPV(SEQ ID NO ： 64)、 HHTWDTRIWQAF(SEQ ID NO ： 65)、 LDYPIPQTVLHH(SEQ ID NO ： 76)、 LLADTTHHRPWP(SEQ ID NO ： 79)、 TRLVPSRYYHHP(SEQ ID NO ： 125)、 CHHNLSWEC(SEQ ID NO ： 7) 和 SFWHHHSPRSPL(SEQ ID NO ： 99)。LDYPIPQTVLHH(SEQ ID NO ： 76) 在本文称为 “BKT-P46” ， 是示例趋化因子结合肽。
可选地， 该趋化因子结合肽具有表现出与选自 SEQ ID NO ： 1 ～ 157( 例如， SEQ ID NO ： 76 和 101) 的氨基酸序列具有至少 70％， 至少 80％， 至少 90％序列同源性的氨基酸序 列。可选地， 该序列同源性至少为 95％。可选地， 该序列同源性为 100％。
同源性可以利用国家生物技术信息中心 (NCBI)BlastP 软件用缺省参数测定。同 源性也可以指缺失、 插入或替换 (substitution) 变体， 包括其氨基酸替换及其具有生物活 性的多肽片段。
如本文使用的 “Fc 结构域” 是指抗体重链区， 典型地包含该重链的至少两个恒定结
构域 (CH2 和 CH3 结构域， 如同本领域中定义的这些术语 )。该 Fc 结构域可以例如以二聚 体形式， 通过用木瓜蛋白酶消化抗体获得。通过二硫键相连的 Fc 结构域多肽的二聚体形成 抗体的 “尾部” 区。如本领域众所周知的， 这些类别的抗体的 Fc 结构域可以是多聚体形式。 因而， 该 Fc 结构域可选地为单聚体， 可选地为二聚体， 并可选地为多聚体。可选地， 本文所 述的多肽是二聚体形式， 该多肽包含 Fc 二聚体， 或者为多聚体形式， 该多肽包含 Fc 多聚体。
该 Fc 结构域可以包括天然 Fc 结构域 ( 即， 抗体中天然存在的结构域 ) 的修饰 形式， 例如， 与天然 Fc 结构域具有至少 90％同源性， 可选地至少 95％同源性， 和可选地至 少 98 ％同源性的多肽。修饰的 Fc 结构域描述在例如国际专利申请 WO 97/34631 和 WO 96/32478 中。
可选地， 对天然 Fc 进行修饰以便除去提供本发明实施方式不需要的结构特征或 生物活性的位点。 此种位点的实例包括， 影响或参与二硫键形成、 与所选宿主细胞的不相容 性、 在所选宿主细胞中表达后 N 末端异质性 (N-terminal heterogeneity)、 糖基化、 与补体 的相互作用、 与 Fc 受体 ( 除了新生儿 Fc 受体 (neonatal Fc receptor)) 的结合， 和 / 或抗 体依赖性细胞毒性的残基。
根据本发明实施方式的多肽也可以包含 Fc 结构域的片段。可选地， 该片段包含如 上文定义的 Fc 结构域的至少 20％， 可选地至少 50％， 和可选地至少 80％。 该 Fc 结构域或其片段可选地包括新生儿 Fc 受体 (FcRn) 的结合位点。
如下面实施例部分中列举的， 根据本发明实施方式的多肽在血液循环中具有相对 长的寿命， 给予后显著水平的多肽在血液中保持至少 11 天。
根据一个实施方式， Fc 结构域或其片段与趋化因子结合肽附接形成体内半衰期比 单独趋化因子结合肽长的多肽。这可能是由于 Fc 结构域的血清半衰期长 ( 这可能是由于 Fc 通过结合到 FcRn 上而被再利用 (salvage))， 和 / 或由于该多肽的尺寸大于该趋化因子 结合肽， 这可以减少肾小球过滤 (glomerular filtration) 对血流的清除 (clearance)。 根 据另一个实施方式， 所形成的多肽与单独趋化因子结合肽相比免疫原性降低。
根据可选的实施方式， 该 Fc 结构域或其片段是人 Fc 结构域 ( 例如， 源自人抗体 ) 或其片段。
根据示例实施方式， 该 Fc 结构域 ( 或其片段 ) 是 IgG( 例如 IgG1)Fc 结构域 ( 或 其片段 )。可选地， 该 Fc 结构域、 或其片段是非糖基化的。
根据示例实施方式， 该 Fc 片段具有与带有 N297A 突变的人 IgG1 Fc 片段相对应的 SEQ ID NO ： 160。
可选地， 该 Fc 结构域 ( 或其片段 ) 的 N 末端附接 ( 直接或通过接头 ) 到趋化因子 结合肽上。该 N 末端可选地附接到至少一个趋化因子结合肽上， 例如， 通过附接到包含至少 一个趋化因子结合肽的序列上。
替换地或另外地， 该 Fc 结构域 ( 或其片段 ) 的 C 末端， 直接或通过接头 ( 例如氨基 酸接头 ) 附接到趋化因子结合肽上。该 C 末端可选地附接到至少一个趋化因子结合肽上。
除了本文所述的趋化因子结合肽和 Fc 结构域或片段之外， 本文所述的多肽可以 进一步包含一个或多个另外的肽序列。此种序列可以可选地选择， 以便提供期望的生物活 性或结构特征， 例如， 可改进该多肽的治疗功效或使该多肽容易生产的活性或特征。
因而， 例如， 该多肽可选地包含至少一个所选的能够指导该多肽的运送 ( 转运，
transport) 的信号肽。
可选地， 选择能够促进表达该多肽的细胞 ( 例如， 哺乳动物细胞 ) 分泌该多肽的信 号肽。
可选地， 包括空泡信号序列 (vacuolar signal sequence)( 针对植物转染产生的 多肽 )。
在示例实施方式中， 该多肽包含 IL-6( 白介素 -6) 信号肽 ( 例如 SEQ ID NO ： 161)， 或具有表现出与 IL-6 信号肽具有至少 90％同源性 ( 可选地至少 95％同源性 ) 的氨基酸序 列的信号肽。
上述另外的肽序列 ( 例如， 信号肽 ) 可以存在于该多肽的 N 末端， 或该多肽的 C 末 端， 或者该多肽的中间 ( 例如， 在 Fc 结构域或片段和趋化因子结合肽之间， 或者在两个趋化 因子结合肽之间 )。
因而， 本文所述的 Fc 结构域或片段、 一个趋化因子结合肽 ( 或多个趋化因子结合 肽 ) 和任意一个另外的肽 ( 或任意多个另外的肽 )( 如果存在 ) 可以在该多肽内以任何顺 序彼此附接。
该 Fc 结构域或片段、 一个趋化因子结合肽 ( 或多个趋化因子结合肽 ) 和任意一个 另外的肽 ( 或任意多个另外的肽 )( 如果存在 ) 直接或通过接头 ( 例如氨基酸接头 ) 独立 地彼此附接。 然而， 一些信号肽的活性取决于所处在多肽内的特定区域 ( 例如， N 末端、 C 末端 )。 因此， 根据一些实施方式， 信号肽位于该多肽内特定区域处。
根据示例实施方式， 该信号肽 ( 例如， IL-6 信号肽 ) 在该多肽的 N 末端。N 末端具 有信号肽的多肽实例包括下式多肽 ：
W-X-Z、 W-X-Y-Z、 W-Y-X-Z、 W-Y-X-Y-Z、 W-Z-X、 W-Z-Y-X、 W-Y-Z-X 和 W-Y-Z-Y-X，
其中 W 是信号肽， X 是趋化因子结合肽， Y 是接头 ( 例如， 氨基酸接头 )， Z 是 Fc 结 构域或片段。根据示例实施方式， 该多肽具有上式 W-X-Y-Z。
该接头 ( 也称为 “间隔子” ) 可选地为包含氨基酸、 二肽、 三肽， 或 4 个或更多氨基 酸的氨基酸接头。此种接头是有利的， 因为它们使该多肽能够包含单个连续 (contiguous) 多肽链， 该单个连续多肽链容易作为融合蛋白生产。 该接头典型地这样选择， 以便它不干扰 趋化因子结合肽与其靶趋化因子的结合。可选地， 该接头是由 4 ～ 10 个氨基酸组成的肽 ( 例如， 六肽 )。根据示例实施方式， 该接头是 SEQ ID NO ： 162 中列出的肽。在包含多于一 个的接头的实施方式中， 该接头可以彼此相同或不同。
根据本发明优选的实施方式， 该多肽能够结合到至少一个趋化因子上 ( 例如， 经 由该多肽中的趋化因子结合肽与该趋化因子的相互作用 )。多肽与趋化因子的结合在许多 情况下都会影响趋化因子 ( 例如， I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞趋化因子和 / 或 RANTES) 结合到趋化因子受体上的能力。
因此， 在一些实施方式中， 该多肽的特征是具有能够抑制至少一种趋化因子与趋 化因子受体结合的能力。可选地， 结合的抑制是这样的， 即， 在存在该多肽的情况下的解离 常数 ( 针对趋化因子与受体的结合 ) 比在缺少该多肽的情况下的解离常数高至少 10％， 可 选地至少 100％。
在一些实施方式中， 该多肽的特征是具有能够增强至少一种趋化因子与趋化因子
受体结合的能力。可选地， 结合的增强是这样的， 即， 在存在该多肽的情况下的解离常数 ( 针对趋化因子与受体的结合 ) 比在缺少该多肽的情况下的解离常数低至少 10％， 可选地 至少 50％。
应理解， 根据本发明实施方式的多肽可以可选地抑制至少一种趋化因子与趋化因 子受体结合， 也可以增强至少一种其它趋化因子与趋化因子受体结合。
如本文使用的术语 “多肽” 包括天然多肽 ( 例如， 降解产物、 以合成方式合成的多 肽或重组多肽 ) 和模拟肽 ( 典型地为以合成方式合成的 )， 以及类肽 (peptoids) 或半类肽 (semipeptoids)， 类肽或半类肽是多肽类似物， 可以具有例如使该多肽在身体内更稳定或 更能够透入细胞中的修饰。 此种修饰包括， 但不局限于， N′末端修饰， C′末端修饰， 多肽键 修饰， 包括但不局限于， CH2-NH、 CH2-S、 CH2-S ＝ O、 O ＝ C-NH、 CH2-O、 CH2-CH2、 S ＝ C-NH、 CH ＝ CH 或 CF ＝ CH， 主链修饰和残基修饰。 制备模拟肽化合物的方法在本领域中是熟知的， 明确说明在例如 Quantitative Drug Design， C.A.Ramsden Gd.， Chapter 17.2， F.Choplin Pergamon Press(1992) 中。
该 多 肽 内 的 多 肽 键 (-CO-NH-) 可 以 被 例 如 N- 甲 基 化 键 (-N(CH3)-CO-)、 酯键 (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、 酮 亚 甲 基 键 (-CO-CH2-)、 α- 氮 杂 键 (-NH-N(R)-CO-) 替 换， 其 中 R 是 任 何 烷 基， 例 如， 甲 基、 carba 键 (-CH2-NH-)、 羟 基 亚 乙 基 键 (-CH(OH)-CH2-)、 硫 代 酰 胺 键 (-CS-NH-)、 烯 烃 双 键 (-CH ＝ CH-)、 逆 向 酰 胺 键 (-NH-CO-)、 多肽衍生物 (-N(R)-CH2-CO-)， 其中 R 是天然出现在碳原子上的 “正 (normal)” 侧链。
这些修饰可以发生在沿着多肽链的任何键上， 甚至同时出现在数个 ( 例如 2-3 个 ) 键上。
可以用天然芳香族氨基酸， Trp、 Tyr 和 Phe 替换合成的非天然酸如苯基甘氨酸、 1， 2， 3， 4- 四氢异喹啉 -3- 羧酸 (TIC)、 萘基丙氨酸 (Nal)、 Phe 的环甲基化衍生物、 Phe 的卤化 衍生物或 o- 甲基 -Tyr。
本文所述的天然存在的肽和多肽 ( 例如， Fc 结构域序列、 信号肽 ) 的氨基酸序列， 可以是天然存在的蛋白质中多肽的氨基酸序列或者包含保守性或非保守性替换的那些。
如本文使用的 “保守性替换” 是指用天然或非天然存在的氨基酸或具有相似空间 特性 (steric properties) 的模拟肽替换该肽天然序列中存在的氨基酸。如果待替换天然 氨基酸的侧链是极性或疏水性的， 那么保守性替换应当用也是极性或疏水性的 ( 除了具有 与被替换氨基酸侧链具有相同的空间特性之外 ) 天然存在的氨基酸、 非天然存在的氨基酸 或模拟肽部分进行替换。
因为天然存在的氨基酸通常是根据它们的特性分类的， 所以容易确定用天然存在 的氨基酸进行的保守性替换， 只要记住按照本发明带电氨基酸被空间上类似的不带电氨基 酸的替换被认为是保守性替换。
对于用非天然存在的氨基酸进行保守性替换， 也可以使用本领域熟知的氨基酸类 似物 ( 合成氨基酸 )。天然存在的氨基酸的模拟肽明确记载在技术人员已知的文献中。
当进行保守性替换时， 替换氨基酸的侧链上应当具有与原始氨基酸侧链的相同或 相似的官能团。
如本文使用的术语 “非保守性替换”是指用另一种具有不同电化学和 / 或空 间特性的天然存在或非天然存在的氨基酸替换如亲本序列 (parent sequence) 中存在的氨基酸。因而， 替换氨基酸的侧链可以显著地大于 ( 或小于 ) 被替换天然氨基酸的 侧链， 和 / 或可以具有电特性显著地不同于被替换氨基酸的官能团。这类非保守性替 换的实例包括用苯丙氨酸或环己基甲基甘氨酸替换丙氨酸、 用异亮氨酸替换甘氨酸， 或 用 -NH-CH[(-CH2)5COOH]-CO- 替换天冬氨酸。 落在本发明范围内的那些非保守性替换， 是还 构成具有天然肽活性的肽或多肽的那些 ( 例如， Fc 结构域序列、 信号肽 )。
如本说明书和下面权利要求部分中使用的， 术语 “一种氨基酸” 或 “多种氨基酸” 应理解成包括 20 种天然存在的氨基酸 ； 体内翻译后通常被修饰的那些氨基酸， 包括， 例如， 羟基脯氨酸、 磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸 ； 以及其它不寻常氨基酸， 包括但不局限于， 2- 氨基 己二酸、 羟基赖氨酸、 异锁链素 (isodesmosine)、 正缬氨酸 (nor-valine)、 正亮氨酸和鸟氨 酸。此外， 术语 “氨基酸” 包括 D- 和 L- 氨基酸。
下表 1 和 2 列出可以与本发明一起使用的天然存在的氨基酸 ( 表 1) 和非常规或 修饰的氨基酸 ( 表 2)。
表1
氨基酸 丙氨酸 精氨酸 天冬酰胺 天冬氨酸 半胱氨酸 谷氨酰胺 谷氨酸 甘氨酸 组氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 赖氨酸 蛋氨酸 苯丙氨酸 三个字母的缩写 Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Iie Leu Lys Met Phe 单字母符号 A R N D C Q E G H I L K M F15CN 102482324 A 脯氨酸 丝氨酸 苏氨酸 色氨酸 酪氨酸 缬氨酸 任何上述氨基酸
说Pro Ser Thr Trp Tyr Val Xaa明书P S T W Y V X12/39 页表2
优选利用重组技术制取本发明多肽， 因为这些技术更适合于制取相对长的多 肽 ( 例如， 长于 20 个氨基酸 ) 以及它的大批量生产。此种重组技术描述在下列文献中 ：
Bitter 等人， (1987)Methods in Enzymol.153 ： 516-544， Studier 等人 (1990)Methods in Enzymol.185 ： 60-89， Brisson 等 人 (1984)Nature 310 ： 511-514， Takamatsu 等 人 (1987) EMBO J.6 ： 307-311， Coruzzi 等 人 (1984)EMBO J.3 ： 1671-1680， Brogli 等 人， (1984) Science 224 ： 838-843， Gurley 等人 (1986)Mol.Cell.Biol.6 ： 559-565 and Weissbach & Weissbach， 1988， Methods for Plant Molecular Biology， Academic Press， NY， Section VIII， pp 421-463。
为了利用重组技术生产本发明多肽， 将编码本发明多肽的多核苷酸连接到核酸表 达载体中， 该核酸表达载体包含在适合于指导本发明多肽在宿主细胞中的组成型、 组织特 异性或诱导型转录的顺式调节序列 ( 例如， 启动子序列 ) 的转录调控下的多核苷酸序列。
可用于表达趋化因子结合肽的分离多核苷酸实例在 SEQ ID NO ： 163 和 164 中列 出。可用于表达 Fc 片段的分离多核苷酸序列实例为如 SEQ ID NO ： 165 中所列出的。可用 于表达 IL-6 信号肽的分离多核苷酸实例在 SEQ ID NO ： 166 中列出。可用于表达接头的分 离多核苷酸实例在 SEQ ID NO ： 167 中列出。
可用于表达根据本发明一些实施方式的多肽的示例多核苷酸序列在 SEQ ID NO ： 168 和 169 中列出。
短语 “分离多核苷酸 ( 分离的多核苷酸， isolated polynucleotide)” 是指分离并 以 RNA 序列、 互补多核苷酸序列 (cDNA)、 基因组多核苷酸序列和 / 或复合多核苷酸序列 ( 例 如， 上述组合 ) 形式提供的单链或双链核酸序列。
如本文使用的， 短语 “互补多核苷酸序列” 是指利用逆转录酶或任何其它 DNA- 依 赖性 DNA 聚合酶使信使 RNA 逆转录形成的序列。此种序列随后可以利用 DAN 依赖性 DNA 聚 合酶在体内或体外扩增。
如本文使用的， 短语 “基因组多核苷酸序列” 是指从染色体中衍生 ( 分离 ) 的序列， 因而代表染色体的连续部分 (contiguous portion)。
如 本 文 使 用 的，短 语 “复 合 多 核 苷 酸 序 列 (composite polynucleotide sequence)” 是指至少部分互补和至少部分基因组的序列。 复合序列可以包括编码本发明多 肽所需的一些外显子 (exonal) 序列， 以及介于其间的内含子序列。该内含子序列可以是任 何来源的， 包括其它基因， 典型地包括保守性剪接信号序列。 此种内含子序列可以进一步包 括顺式作用的表达调节元件。
如所述的， 本发明实施方式的多核苷酸可以进一步包含编码针对多肽分泌的信号 肽 ( 如上文所讨论的 ) 的信号序列。
在表达和分泌之后， 可选地从形成成熟多肽的前体蛋白中除去信号肽。
本发明多核苷酸可以利用例如本文下面实施例 1 中描述的 PCR 技术， 或本领域中 已知的用于连接两种不同 DNA 序列的任何其它方法或程序 ( 步骤， procedure) 制备。参 见， 例如， “Current Protocols in Molecular Biology” ， eds.Ausubel 等人， John Wiley & Sons， 1992。
如上文所述的， 本发明多核苷酸序列典型地插入在表达载体 ( 即， 核酸构建体 ) 中 从而使重组多肽能被表达。本发明实施方式的表达载体包括使这种载体适合于在原核生 物、 真核生物， 或优选二者 ( 例如， 穿梭载体 (shuttle vectors)) 中复制和整合的另外序 列。典型的克隆载体包含转录和翻译起始序列 ( 例如， 启动子、 增强子 ) 以及转录和翻译终止子 ( 例如， 多聚腺苷化信号 )。
真核启动子典型地包含两类识别序列， TATA 框和上游启动子元件。TATA 框位于转 录起始点上游 25 ～ 30 个碱基对处， 被认为参与指导 RNA 聚合酶开始 RNA 的合成。其它上 游启动子元件决定转录起始速率。
与同源或异源启动子连接时， 增强子元件可促进转录提升至 1,000 倍。增强子 在处于转录起始点上游或者下游的时候是具有活性的。源自病毒的许多增强子元件具有 宽广的宿主范围， 并在多种组织中具有活性。例如， SV40 早期基因增强子适合于许多细胞 类型。适合于本发明的其它增强子 / 启动子组合包括来源于多瘤病毒 (polyoma virus)、 人或鼠巨细胞病毒 (cytomegalovirus， CMV) 的那些， 以及来自各种逆转录病毒如鼠白血 病病毒、 鼠或 Rous 肉瘤病毒和 HIV 的长末端重复序列。参见 Enhancers and Eukaryotic Expression， Cold Spring Harbor Press， Cold Spring Harbor， N.Y.1983， 该文献通过引 用合并在此。
在构建表达载体时， 优选将启动子设置成与异源转录起始位点的距离和它在自然 环境下与转录起始位点的距离近似相同。 然而， 如本领域众所周知的， 在不损坏启动子功能 的情况下可以对这个距离的各种变化进行调节。
除了已描述的元件以外， 本发明的表达载体还可典型地包含其它旨在提高克隆核 酸的表达水平或使携带重组 DNA 的细胞的鉴定易于进行的特定元件。例如， 许多动物病毒 包含促进病毒基因组在允许的细胞类型中进行额外染色体复制的 DNA 序列。携载这些病毒 复制子的质粒可以游离地复制 ( 作为附加体地复制， replicated episomally)， 只要质粒上 携带的基因或宿主细胞基因组的基因能够提供合适的因子即可。
该载体可以包括或可以不包括真核复制子。如果存在真核复制子， 则该载体可利 用合适的可选标记 (selectable marker) 在真核细胞中扩增。如果该载体不包含真核复制 子， 则无法进行游离型扩增 (episomal amplification)。 相反， 重组 DNA 整合到工程细胞的 基因组中， 其中启动子指导期望核酸的表达。
本发明的表达载体可以进一步包括， 另外的允许例如从单一 mRNA 如内核糖体进 入位点 (internal ribosome entry site， IRES) 翻译数种蛋白质的多核苷酸序列和供启动 子嵌合多肽基因组整合用的序列。
哺 乳 动 物 表 达 载 体 的 实 例 包 括， 但 不 限 于， 可 从 Invitrogen 获 得 的 pcDNA3、 pcDNA3.1(+/-)、 pGL3、 pZeoSV2(+/-)、 pSecTag2、 pDisplay、 pEF/myc/cyto、 pCMV/myc/cyto、 pCR3.1、 pSinRep5、 DH26S、 DHBB、 pNMT1、 pNMT41、 pNMT81， 可从 Promega 获得的 pCI， 可从 Strategene 获得的 pMbac、 pPbac、 pBK-RSV 和 pBK-CMV， 可从 Clontech 获得的 pTRES， 和它 们的衍生物。
也可以使用包含来自于真核病毒如逆转录病毒的调节元件的表达载体。 SV40 载体 包括 pSVT7 和 pMT2。源于牛乳头瘤病毒的载体包括 pBV-1MTHA， 源于艾伯斯坦 - 巴尔病毒 + 的载体包括 pHEBO 和 p2O5。其它示例载体包括 pMSG、 pAV009/A 、 pMTO10/A+、 pMAMneo-5、 杆 状病毒 pDSVE， 和任何其它允许蛋白表达在 SV-40 早期启动子、 SV-40 晚期启动子、 金属硫蛋 白启动子 (metallothionein promoter)、 鼠乳腺肿瘤病毒启动子、 Rous 肉瘤病毒启动子、 多 角体蛋白启动子 (polyhedrin promoter) 或其它对真核细胞的表达有效的启动子的指导下 进行的载体。病毒是非常专一的感染原， 它们已在许多情况下发生演变 ( 进化， evolve) 从而 逃避宿主防御机制。典型地， 病毒感染特定细胞类型并在其中繁殖。病毒载体的靶向特异 性利用它的天然特异性而特异性地靶向预定细胞类型， 从而将重组基因导入到受感染细胞 中。因此本发明使用的载体类型将取决于转化的细胞类型。
重组病毒载体对本发明实施方式的多肽表达有用， 因为它们具有诸如横向感染 (lateral infection) 的优点。横向感染是例如逆转录病毒生命周期中固有的， 是单一受 感染细胞产生很多可出芽并感染邻近细胞的子代病毒粒子的过程。结果是大面积迅速受 到感染， 其大部分最初并不是通过原始病毒颗粒感染的。这与纵向型感染 (vertical-type infection) 形成对比， 在纵向型感染中感染原仅通过母系子代 (daughter progeny) 传播。 也可生产不可横向传播的病毒载体。 如果期望目的是将特定基因导入到有限数目的靶细胞 中， 则这种性质可能是有用的。
多种原核或真核细胞可用作表达本发明多肽的宿主表达系统。这些包括， 但不限 于， 微生物， 如用包含多肽编码序列的重组细菌噬菌体 DNA、 质粒 DNA 或粘粒 DNA 表达载体转 化的细菌 ( 例如， 大肠杆菌， 包括但不局限于大肠杆菌菌株 BL21(DE3)plysS、 BL21， (DE3)RP * 和 BL21 以及枯草杆菌 )， 用包含多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母， 用包含多 肽编码序列的重组病毒表达载体 ( 如花椰菜花叶病毒， CaMV ； 烟草花叶病毒， TMV) 感染或用 包含多肽编码序列的重组质粒表达载体如 Ti 质粒转化的植物细胞系统。
有多种方法可以用来将本发明表达载体导入到宿主表达系统细胞中。 此种方法一 般地描述在以下文献中 ： Sambrook 等人， Molecular Cloning ： ALaboratory Manual， Cold Springs Harbor Laboratory， New York(1989， 1992)， in Ausubel 等人， Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley and Sons， Baltimore， Md.(1989)， Chang 等 人， Somatic Gene Therapy， CRC Press， Ann Arbor， Mich.(1995)， Vega 等人， Gene Targeting， CRC Press， Ann Arbor Mich.(1995)， Vectors ： A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses， Butterworths， Boston Mass.(1988)and Gilboa et at.[Biotechniques 4(6) ： 504-512， 1986]， 并包括例如， 用重组病毒载体进行的稳定或短暂转染、 脂质转染、 电 穿孔和感染。另外， 对于正 - 负选择方法参见美国专利 No.5,464,764 和 5,487,992。
通过病毒感染导入核酸具有优于其它方法如脂质转染和电穿孔的数个优点， 因为 病毒的感染性质而可以获得更高的转染效率。
本发明多肽的核酸序列可以针对在特定宿主细胞中的表达进行优化。 此种序列修 饰的实例包括， 但不局限于， 改变 G/C 含量至更接近感兴趣物种中通常发现的， 和除去非典 型地在物种中发现的密码子， 通常称为密码子优化。
短语 “密码子优化” 是指选择合适的 DNA 核苷酸用于接近感兴趣物种内密码子使 用的结构基因或其片段内。因此， 优化的基因或核酸序列是指为了利用所选物种内统计 学上优选或统计学上偏好的密码子已经将其中天然或天然产生的基因的核苷酸序列进行 修饰的基因。通常在 DNA 水平上检测核苷酸序列， 并使用任何合适的程序测定针对在物 种中的表达进行优化的编码区， 这些方法如 Sardana 等 (1996， Plant Cell Reports 15 ： 677-681) 中所述的。 在这种方法中， 可以计算密码子使用的标准偏差， 密码子偏好的量度标 准， 首先发现天然基因每个密码子的使用相对于所选物种高度表达的基因的比例方差， 接 着计算均方差。所用公式是 ： 1SDCU ＝ n ＝ 1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N， 其中 Xn 是指高度表达的基因中的密码子的使用频率 n， 其中 Yn 是指目标基因中的密码子的使用频率 n， N 是指感兴趣 基因中的密码子总数。
根据特定细胞类型的优选密码子使用， 优化核酸序列的一种方法是基于密码子 优化表的直接使用， 无需进行任何额外的统计学计算， 密码子优化表为， 例如通过日本的 NIAS( 农业生物科学研究所 )DNA 库在密码子使用数据库在线提供的那些 (http://www. kazusa.or.jp/condon/)。 密码子使用数据库含有供许多不同物种用的密码子使用表， 已经 基于 Genbank 中呈现的数据在统计学上测定了每个密码子使用表。
通过使用上述表来测定特定物种中每个氨基酸的最优选或最偏好的密码子， 编码 感兴趣蛋白的天然存在的核苷酸序列对于该特定物种是密码子优化的。 这可以通过用关于 氨基酸在统计学上更偏好的相应密码子替代特定物种基因组中具有低统计学发生率的密 码子来实现。 然而， 可以选择一个或多个不太偏好的密码子来删除现有的限制位点， 从而在 潜在有用的连接处 (5’ 和 3′端从而添加信号肽或终止盒 (termination cassettes)， 可以 用来切割或剪接片段来产生正确全长序列的内部位点 ) 创建新的限制位点， 或除去负面影 响 mRNA 稳定性或表达的核苷酸序列。
在任何修饰之前， 天然存在的编码核苷酸序列可能已经含有许多对应于特定物种 中统计学上偏好的密码子。因此， 天然核苷酸序列的密码子优化可以包括测定天然核苷酸 序列内哪个密码子对于特定物种不是统计学上偏好的， 和根据特定物种的密码子使用表对 这些密码子进行修饰从而产生密码子优化的衍生物。 修饰核苷酸序列对于特定物种的密码 子使用可以是全部或部分优化的， 只要修饰核苷酸序列编码的蛋白质是以高于相应天然存 在的或天然的基因编码的蛋白质的水平产生的即可。 通过改变密码子使用构建合成基因描 述于例如 PCT 专利申请 93/07278 中。
因此， 本发明包括上文所述的核酸序列、 其片段、 可与其杂交的序列、 与其同源的 序列、 与其直系同源 (orthologous) 的序列、 编码具有不同密码子使用的相似多肽的序列、 特征在于突变的改变序列， 该突变为， 例如一个或多个核苷酸的缺失， 插入或替换， 其是天 然发生的或人工诱导的， 随机或以有目标的方式进行的。
独立于宿主细胞系统， 应理解除了包含用于转录和翻译所插入编码序列 ( 编码该 多肽 ) 的必需元件， 本发明表达构建体还可以包括设计用于优化所表达多肽的稳定性、 生 产、 纯化、 产率或活性的序列。
在允许表达大量重组多肽的有效条件下培养所转化细胞。有效培养条件包括， 但 不局限于， 允许生产蛋白质的有效培养基、 生物反应器、 温度、 pH 和氧气条件。有效培养基 是指可培养细胞生产本发明重组多肽的任何培养基。此种培养基典型地包括具有可同化 碳、 氮和磷酸酯来源， 以及适当的盐、 矿物质、 金属和其它营养物如维生素的水溶液。 本发明 细胞可以在常规发酵生物反应器、 摇瓶、 试管、 微量滴定盘 (microtiter dishes) 和培养皿 (petri plates) 中培养。培养可以在适合于重组细胞的温度、 pH 和氧含量条件下执行。此 种培养条件在技术人员的技能范围内。
根据用于生产的载体和宿主系统， 本发明所得多肽可以保留在重组细胞中、 分 泌 到 发 酵 培 养 基 中、 分 泌 到 两 个 细 胞 膜 之 间 的 间 隙， 如大肠杆菌的细胞周质间隙 (periplasmic space) 中， 或者保留在细胞或病毒膜表面上。
培养预定时间之后， 对重组多肽进行回收。本文使用的短语 “回收重组多肽” 是指收集包含多肽的全部发酵培养基， 并不意味 着需要额外的分离或纯化步骤。
因而， 本发明多肽可利用多种标准蛋白纯化技术进行纯化， 如， 但不限于， 亲 和 色 谱 法、 离 子 交 换 色 谱 法、 过 滤、 电 泳、 疏 水 作 用 色 谱 法 (hydrophobic interaction chromatography)、 凝胶过滤色谱法、 反相色谱法、 伴刀豆球蛋白 A 色谱法 (concanavalin A chromatography)、 色谱聚焦和差别溶解 (differential solubilization)。
本实施方式的多肽可以通过亲和色谱法常规纯化。蛋白质 A 作为亲和配体的适 合性取决于物种和用在嵌合体中的免疫球蛋白 Fc 结构域的同种型 (isotype)。蛋白质 A 可以用于纯化基于人 γ1、 γ2 或 γ4 重链的嵌合分子 [Lindmark 等人， J.Immunol.Meth.， 62 ： 1-13(1983)].Protein G is preferably used for all mouse isotypes and for humanγ3[Guss 等人， EMBO J.， 5： 1567-1575(1986)]。亲和配体附着的固体载体最经常为 琼脂糖， 但也可以利用其它固体载体。机械稳定的固体载体， 如可控多孔玻璃 (controlled pore glass) 或聚 ( 苯乙烯二乙烯基 ) 苯， 可以获得较琼脂糖可以实现的更快的流速和更 短的加工时间。使嵌合分子结合到蛋白质 A 或 G 亲和柱上的条件完全由 Fc 结构域的特性， 即， 它的物种和同种型控制。一般地， 当选择适当的配体时， 高效结合直接在非条件培养液 中进行。本发明这个方面的结合多肽可以在酸性 pH(3.0 或高于 3.0) 下， 或在含有温和离 液盐 (chaotropic salt) 的中性 pH 缓冲液中高效地洗脱。这个亲和色谱分离步骤可以使 多肽制品纯度＞ 95％。 可以针对蛋白质 A 或 G 使用本领域中已知的其它方法代替亲和色谱法， 或与亲 和色谱法一并纯化本发明实施方式的多肽。例如， 预期该多肽的性质类似于亲硫凝胶色 谱 (thiophilic gel chromatography) 分离的抗体 [Hutchens 等人， Anal.Biochem.， 159 ： 217-226(1986)]and immobilized metal chelate chromatography[Al-Mashikhi et al.， J.Dairy Sci.， 71 ： 1756-1763(1988)]。
为了便于回收， 可以将所表达的编码序列设计成编码本发明多肽和融合的可切割 部分， 例如组氨酸。 此种融合蛋白可以设计成这样的， 以便该多肽可以容易地通过亲和色谱 分离， 例如， 通过固定在对可切割部分有特异性的柱子上。
如果切割位点设计在多肽和可切割部分之间， 那么通过用特异性切割这个位 点 处的融 合 蛋 白 的 适当的 酶或药 剂进行处理可 以使该色 谱柱释放该多 肽 [ 例如， 参 见 Booth 等 人， Immunol.Lett.19 ： 65-70(1988) ； 和 Gardella 等 人， J.Biol.Chem.265 ： 15854-15859(1990)]。
本发明多肽优选以 “基本纯” 的形式收回。
如本文使用的短语 “基本纯” 是指允许该多肽有效地用于本文所述的应用中的纯 度。
除了可以在宿主细胞中合成之外， 本发明多肽也可以利用体外表达系统合成。这 些方法是本领域熟知的， 并且该系统的组分是可商购获得的。
该多肽可以按原样使用， 或进一步修饰。
例如， 可以通过将水溶性聚合物 ( 例如， 聚乙二醇 ) 附接到该多肽上， 对该多肽进 行修饰。 此种水溶性聚合物的附接可以改进该多肽的生物活性， 例如， 通过提高该多肽的溶 解性， 降低该多肽的毒性， 延长该多肽的循环半衰期 ( 例如， 通过降低肾小球过滤 )， 和/或
保护该多肽免受蛋白水解降解进行。
因此， 根据本发明的可选实施方式， 将本文所述的多肽附接到水溶性聚合物上。 聚 乙二醇是合适的水溶性聚合物。适合 ( 例如， 无毒 ) 附接到用于药物给予的多肽上的另外 水溶性聚合物对于本领域技术人员而言是明显的。
该水溶性聚合物可以附接到该多肽的任何部分上 ( 直接或经由接头 )。 可选地， 该 水溶性聚合物附接到除趋化因子结合肽以外的多肽部分上， 以便不干扰其趋化因子结合活 性。
如本文所述和下面实施例部分列举的， 本文所述的多肽对调节趋化因子活性有 效， 其可以具有许多有利的治疗应用。因而， 本文提供了用于调节趋化因子活性和 / 或治疗 多种医学病症的新型高效方法。
因此， 在本发明实施方式的一个方面， 提供了调节趋化因子 ( 例如， I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞趋化因子和 / 或 RANTES) 的生物效应的方法， 该方法包括向需要 其的受验者给予治疗有效量的本文所述的多肽 ( 例如， 本文所述的修饰或未修饰多肽 )。
如本文使用的术语 “方法” 是指用于完成给定任务的方式、 方法、 技术和程序， 包括 但不限于， 化学、 药学、 生物学、 生物化学和医学领域技术人员已知， 或易于从已知方式、 方 法、 技术和程序开发出的那些方式、 方法、 技术和程序。
如下面实施例部分证明的， 本文所述的多肽可以用于治疗多种医学病症。可以通 过包含向需要其的受验者给予本文所述的多肽 ( 例如， 本文所述的修饰或未修饰多肽 ) 的 方法， 治疗该病症。 可以根据本发明实施方式治疗的病症实例包括， 但不局限于， 炎症、 过敏 症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺 血。
可选地， 给予包含静脉给予、 口服给予、 皮下给予、 局部给予和 / 或鼻内给予。
应理解， 本文所述的多肽的 Fc 结构域或片段与单独的趋化因子结合肽相比可以 提供较长的多肽循环半衰期。由于半衰期较长， 所以可以以较小的给予频率在体内维持治 疗有效水平的多肽。
因此， 根据一些实施方式， 给予每周进行不多于一次， 可选地每月进行不多于两 次， 可选地每月进行不多于一次， 可选地每两个月进行不多于一次， 可选地每三个月进行不 多于一次， 和可选地每六个月进行不多于一次。
在替换实施方式中， 单次给予足以获得期望的治疗效果。
类似地， 根据本发明一些实施方式的方面， 提供了如本文所述的多肽 ( 例如， 本文 所述的修饰或未修饰多肽 ) 在制造用于调节 ( 例如， 如本文所述的抑制和 / 或增强 ) 趋化 因子 ( 例如， I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞趋化因子和 / 或 RANTES) 生物效应的 药物中的用途。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了本文所述的多肽 ( 例如， 本文所述的修 饰或未修饰多肽 ) 在制造用于治疗选自以下的病症的药物中的用途 ： 炎症、 过敏症、 迟发型 超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑 狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
如本文使用的， 术语 “治疗” 包括阻断、 基本抑制、 慢化 ( 减缓， slowing) 或逆转病 症的进展， 基本改善病症的临床或美学 (aesthetical) 症状， 或者基本阻止病症的临床或 美学症状出现。
待治疗受验者可以是人或非人动物。优选地， 该受验者是哺乳动物。在一些实施 方式中， 该受验者是人。
利用如本文所述的多肽进行的治疗可以单独提供， 或者与已知对治疗特定疾病有 用的其它药剂一起提供。 本文所述的药物和药物组合物可以可选地进一步包含一种或多种 此类药剂。
可选地， 本文所述的药剂调配用于静脉、 口服、 皮下、 局部给予和 / 或鼻内给予。
可以根据本文所述的本发明实施方式调节的趋化因子的生物效应的实例包括， 但 不局限于， 炎性效应、 细胞迁移、 肿瘤生长和癌转移。
在本文所述的本发明任何方面， 调节生物效应可以包含抑制或增强生物效应。在 示例实施方式中， 调节包含抑制。可选地， 抑制至少一种趋化因子的生物效应， 并增强另外 的趋化因子的生物效应。
在本文所述的方法和用途的任何一个中， 该多肽可以单独使用， 或者， 优选地， 用 作进一步包含药学可接受载体的药物组合物的一部分。
因而， 根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含如本文所述的多肽和药学可 接受载体的药物组合物。
在一些实施方式中， 该组合物包装在包装材料中， 并以印刷形式在该包装材料中 或上标识用于调节如本文所述的趋化因子 ( 例如， I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞 趋化因子和 / 或 RANTES) 的生物效应。
在一些实施方式中， 该组合物包装在包装材料中， 并以印刷形式在该包装材料中 或上标识用于治疗选自以下的病症 ： 炎症、 过敏症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体 移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑 病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
在本发明各个方面， 本文所述的多肽可以照原样或以其药学可接受盐形式给予或 以其它方式利用。
短语 “药学可接受盐” 是指带电荷的母体化合物和其反离子， 其典型地用于改进母 体化合物的溶解性和 / 或降低母体化合物对生物体造成的任何显著刺激， 同时不阻断所给 予化合物的生物活性和特性。
合适的给予途径可以， 例如包括吸入、 口服、 颊部、 直肠、 经粘膜、 经真皮、 真皮内、 经鼻、 肠和 / 或肠胃外途径， 肌内、 皮下和 / 或髓内注射途径， 鞘内、 直接心室内、 静脉、 腹膜 内、 鼻内和 / 或眼内注射途径， 和 / 或直接注入受验者组织区域的途径。 在可选实施方式中， 使用静脉途径、 口服途径、 皮下途径、 局部途径和 / 或鼻内途径。
对于皮肤疾病和障碍 ( 例如， 银屑病、 皮肤过敏症、 皮肤超敏反应 )， 可选地使用局 部给予， 例如， 利用调配用于局部给予的乳膏、 洗液、 凝胶或粉末。
本文所述的方法、 组合物和用途利用治疗有效量的多肽。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
对于用在本发明方法和用途中的任何制剂， 治疗有效量或剂量可以根据体外试验 进行初始估计。 例如， 可以在动物模型中调配剂量， 此种信息可以用于更准确地确定对人有 用的剂量。
本文描述的活性成分的毒性和治疗效能可通过体外、 细胞培养物或实验动物中的 标准药物程序来确定。可利用从这些体外和细胞培养物分析及动物研究中获得的数据， 调 配用于人的剂量范围。该剂量可随着采用的剂型和利用的给予途径而改变。确切的制剂、 给予途径和剂量可由个人医生根据患者的病症加以选择 ( 参见如 Fingl 等人， 1975， ″ The Pharmacological Basis of Therapeutics″， Ch.1 p.1)。
给药可以是单次给予或多次给予， 如本文所述的。
如本文所述的包含一种或多种多肽的药物组合物可以通过本领域熟知的工艺制 造， 如通过常规的混合、 溶解、 造粒、 包糖衣 (dragee-making)、 研粉 (levigating)、 乳化、 作 成胶囊 ( 囊封， encapsulating)、 包埋 (entrapping) 或冷冻干燥工艺。
根据本发明实施方式使用的药物组合物可用常规方法利用一种或多种使活 性成分容易加工成可以药用的制剂的生理可接受载体 ( 包含赋形剂和辅助物 ( 辅剂， auxiliaries)) 调配。合适的剂型取决于所选的给予途径。
对于注射， 该活性成分可以调配在水溶液中， 优选在生理相容性缓冲液如汉克斯 溶液 (Hank’ s 溶液 )、 林格溶液 (Ringer’ s 溶液 )， 或生理盐缓冲液中。
对于口服给予， 该化合物可以容易地通过将活性化合物与本领域熟知的药学可接 受载体相结合而调配。 此类载体使本发明化合物能够调配成供患者口服摄取的片剂、 丸剂、 糖衣丸、 胶囊、 液体、 凝胶、 糖浆剂、 浆液、 混悬剂等。 口服使用的药物制剂可利用固体赋形剂 制造， 可选地研磨所得混合物， 需要时可加入合适的辅助物并在此后对颗粒混合物进行加 工， 从而获得片剂或糖衣核 (dragee cores)。 合适的赋形剂为， 特别是， 填充剂如糖类， 包括 乳糖、 蔗糖、 甘露醇或山梨醇， 纤维素制品如， 玉米淀粉、 小麦淀粉、 大米淀粉、 马铃薯淀粉、 明胶、 黄蓍树胶、 甲基纤维素、 羟丙甲基纤维素、 羧甲基纤维素钠， 和 / 或生理上可接受的聚 合物如聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)。如果需要， 可加入崩解剂， 如交联的聚乙烯吡咯烷酮、 琼脂， 或海藻酸或其盐如海藻酸钠。
糖衣核具有合适的包衣。为此目的， 可使用浓缩的糖溶液， 其可以可选地包含阿 拉伯树胶、 滑石粉、 聚乙烯吡咯烷酮、 卡波姆凝胶、 聚乙二醇、 二氧化钛、 漆溶液 (lacquer solutions) 和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素加入到片剂或糖衣丸包衣 中， 以便鉴定或表征不同的活性化合物剂量组合。
可口服使用的药物组合物， 包括明胶制成的推入配合胶囊 (push-fit capsule)， 以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。 推入配合胶囊可包含与填充剂如 乳糖、 粘合剂如淀粉、 润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁， 和可选的稳定剂混合的活性成分。在软 胶囊中， 活性成分溶解于或悬浮于合适的液体中， 如脂肪油、 液体石蜡， 或液体聚乙二醇。 另 外， 可加入稳定剂。所有用于口服给予的制剂剂量应适合所选的给予途径。
对于颊部给予， 该组合物可采用用常规方法调配的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻吸入给予， 根据本发明使用的活性成分可以所呈现的气溶胶喷雾形 式， 从利用合适的推进剂如二氟二氯甲烷、 三氯氟甲烷、 二氯四氟乙烷， 或二氧化碳的加压包装或喷雾器中方便地递送。在加压气溶胶的情况下， 剂量单位可通过提供用于递送计量 的量的阀门确定。可将用在分配器中的如明胶胶囊和药筒， 调配成包含该化合物与合适的 粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文所述的制剂可以调配用于肠胃外给予， 如通过推注或连续输注给予。注射用 制剂可以单位剂量的形式呈现， 如， 在安瓿或在多剂量容器中， 其中可选地加入防腐剂。该 组合物可以是油性或水性媒介物中的悬浮液、 溶液， 或乳液， 并可含有调配剂如悬浮剂、 稳 定剂， 和 / 或分散剂。
用于肠胃外给予的药物组合物包括水溶性形式活性制剂的水溶液。另外， 可将该 活性成分的悬浮液配制成适当的油性或基于水的注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介物 (vehicles) 包括脂肪油如芝麻油， 或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、 甘油三酯或脂质体。水 性注射悬浮液可包含增大悬浮液粘度的物质， 如羧甲基纤维素钠、 山梨醇， 或葡聚糖。可选 地， 该悬浮液还可包含合适的稳定剂或增大活性成分的溶解度从而允许制备高度浓缩的溶 液的试剂。
替换地， 该活性成分可以是粉末形式， 在使用前用合适的媒介物如无菌的基于无 热源水的溶液进行配制。
根 据 本 发 明 实 施 方 式 的 制 剂 还 可 利 用 如 常 规 栓 剂 基 质 如 可 可 豆 油 (cocoa butter) 或其它甘油酯， 调配成直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂 (retention enemas)。
当然， 该组合物的给予量将取决于受治疗对象、 疼痛严重性、 给予方式， 处方医生 的判断等。
本发明组合物如果需要可放在包装或分配装置中， 如 FDA 批准的试剂盒， 其可 包含含有活性成分的一种或多种单位位剂量形式。该包装可包含， 例如， 玻璃或塑料箔 (plastic foil)， 如泡罩包装 (blister pack)。该包装或分配装置还可附有给予说明。该 包装或分配器还可提供与所含物相关的由管理药物制造、 使用或销售的政府部门所规定的 形式的公告， 该公告反映该部门批准了该组合物形式或人用或兽用。此公告， 例如， 可以是 美国食品和药物管理局对于处方药批准的标志或者是已批准产品插页 (product insert)。
本文所述多肽能够结合到趋化因子上， 因而具有与至少一些趋化因子的结构互补 的结构。因为趋化因子受体也具有与趋化因子互补的结构， 所以期望本文所述的至少一些 多肽的结构域趋化因子受体的结构具有显著的相似性。 该多肽因而可以在一些应用中代替 趋化因子受体， 例如， 当产生能够结合到趋化因子受体上的抗体时。
因此， 在本发明实施方式的另一方面， 提供了能够识别趋化因子受体至少一部分 的抗体。该抗体可选地通过利用生产抗体的标准技术， 生产对抗本文所述多肽的抗体来制 取。
本文也提供了包含本文所述多肽， 用于产生自身抗体的疫苗。该疫苗设计用于在 受验者中产生对抗该多肽的抗体， 其中该抗体将进一步识别和结合到受验者至少一种趋化 因子受体的至少一部分上。 该疫苗可选地包括可以容易地由本领域技术人员选择的任何合 适的疫苗载体， 包括但不局限于， 佐剂、 载体等。
制备免疫原或疫苗组合物的一般方法描述在雷明顿药物科学 (Remington ′ s Pharmaceutical Science)， Mack Publishing Company Easton， Pa.( 最新版 ) 中。为了增 大免疫原性， 可以使本发明多肽吸附或结合到珠粒如胶乳或金珠、 ISCOM 等上。免疫原性组合物可以包含佐剂， 该佐剂为可以添加到免疫原或疫苗制剂中从而增强免疫原性部分的免 疫刺激特性的物质。脂质体也视为佐剂 (Gregoriades， G 等人， Immunological Adjuvants and Vaccines， Plenum Press， New York， 1989)。可以增加多肽免疫原功效的佐剂或药剂 实例包括氢氧化铝、 磷酸铝、 硫酸铝钾 ( 明矾 )、 硫酸铍、 二氧化硅、 高岭土、 碳、 油包水型乳 液和水包油型乳液。优选的一类佐剂是胞壁酰二肽 (muramyl dipeptide， MDP) 以及各种 MDP 衍生物和制剂， 例如， N- 乙酰基 -D- 葡萄糖氨基 -(β-1-4)-N- 乙酰基胞壁酰 -L- 丙氨 酰 -D- 异谷酰胺 (GMDP)(Hornung， R L 等人， Ther Immunol 19952 ： 7-14) 或 ISAF-1( 在含 有 0.4mg 苏氨酰 - 胞壁酰二肽的磷酸盐缓冲溶液中的 5％鲨烯、 2.5％ pluronic L121、 0.2％ 吐温 80 ； 参见例如 Kwak， L W 等人， (1992)N.Engl.J.Med.， 327 ： 1209-1238)。其它有用的 佐剂为， 或者基于霍乱毒素、 细菌性内毒素、 脂质 X、 细菌痤疮丙酸杆菌 (Propionobacterium acnes) 或百日咳鲍特菌 (Bordetella pertussis) 的完整生物体或亚细胞部分、 多聚核 糖核苷酸、 藻酸钠、 羊毛脂、 溶血卵磷脂、 维生素 A、 皂甙和皂甙衍生物如现已用于临床 (Helling， F 等 人， (1995)Cancer Res.， 55 ： 2783-2788 ； Davis， T A 等 人， (1997)Blood， 90 ： 509) 的 QS21(White， A.C. 等人， (1991)Adv.Exp.Med.Biol.， 303 ： 207-210)、 左旋咪唑、 DEAE- 葡聚糖、 阻断共聚物或其它合成佐剂。许多佐剂可以从各种来源商购获得， 例如， Merck 佐剂 65(Merck and Company 有限公司， Rahway， N.J.)， 或弗氏不完全佐剂和完全佐 剂 (Difco Laboratories， Detroit， Mich.)、 Amphigen( 水包油 )、 Alhydrogel( 氢氧化铝 )， 或者 Amphigen 和 Alhydrogel 的混合物。铝已被批准用于人用。
如本文使用的术语 “约” 是指 ±10％。
术语 “包 含” 、 “包 含 的” 、 “包 括” 、 “包 括 的” 、 “具 有” ， 和它们的词形变化形式 (conjugates) 意思是指 “包括但是不限于” 。
术语 “由……组成” 是指 “包括但是不限于” 。
本文使用的术语 “示例” 是指 “用作实例、 例证， 或图例” 。被描述为 “示例” 的任 何实施方式不必解读为优选的或比其它实施方式有利， 和 / 或排除其它实施方式并入的特 征。
本文使用的术语 “可选地” 是指 “提供在一些实施方式中， 而没有提供在其它实施 方式中” 。本发明任何特定实施方式均可包括多个 “可选的” 特征， 除非此类特征相冲突。
如本文使用的， 单数形式 “一个” 、 “一” 和 “该” 包括复数指代， 除非上下文另有明确 规定。例如， 术语 “一种化合物” 或 “至少一种化合物” 可包括多种化合物， 包括其混合物。
在整篇专利申请中， 本发明的各种实施方式可以范围形式呈现。应当理解范围形 式的描述仅是为了方便和简洁， 而不应该解读为对本发明范围的硬性限制。 因此， 范围的描 述应视为已具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的各个数值。例如， 如从 1 至 6 的范围描述应视为已具体地公开了诸如从 1 至 3、 从 1 至 4、 从 1 至 5、 从 2 至 4、 从 2 至 6、 从 3 至 6 等的子范围， 以及在此范围中的各个数值， 例如， 1、 2、 3、 4、 5， 和 6。 不论范围宽度如 何， 这都能适用。
当本文中指出了数值范围时， 其意在包括在所指范围内的任何提及数字。本文中 的表达在第一个指定数和第二个指定数之间的 “范围” 与从第一个指定数 “至” 第二个指定 数的 “范围” 可互换使用， 意在包括第一和第二个指定数及其间的所有数字。
应理解， 为清楚起见而在单独实施方式的上下文中描述的本发明某些特征， 也可结合提供在单个实施方式中。相反， 为简洁起见而在单个实施方式的上下文中描述的本发 明的多种特征， 也可单独地或以任何合适的子组合形式， 或作为适合于本发明的任何其它 被描述的实施方式提供。 在各个实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是这些实 施方式的实质特征， 除非这些实施方式没有这些元素时是不能实施的 (inoperative)。
如上文所描绘的和如下面权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方式和 方面将在下面的实例中找到实验支持。
实施例
现在参考下面的实施例， 结合上面的描述以非限制方式阐述本发明的一些实施方 式。
材料和方法
材料 ：
扩增缓冲液 (X10) 从 Invitrogen 获得 ；
葡聚糖 T-500 从 Pharmacosmos A/S(Denmark) 获得 ；
Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 (DMEM) 从 Biological Industries(Beit Haemek， Israel) 获得 ；
ECL 溶液从 Amersham Biosciences 获得 ；
EcoRI 从 New England Biolabs 获得 ；
增强子溶液 (X10) 从 Invitrogen 获得 ；
嗜酸性粒细胞趋化因子 (Eotaxin)( 人 ) 从 PeproTech(Rocky Hill， NJ， USA) 获 得；
EX-CELL 293 培养基从 SAFC Biosciences 获得 ；
胎牛血清 (FCS) 从 Biological Industries(Beit Haemek， Israel) 获得 ；
聚蔗糖 (Ficoll)1077 从 Sigma 获得 ；
弗氏完全佐剂从 Sigma 或 Difco 获得 ；
FuGENE 6 从 Roche 获得 ；
IP-10( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
IL-8( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
I-TAC( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
MCP-1( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
甲基化牛血清白蛋白 (mBSA) 从 Sigma 获得 ；
MIG( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
NotI 从 New England Biolabs 获得 ；
NuPAGE Bis Tris gels 从 Invitrogen 获得 ；
pIRESpuro3 载体从 BD Biosciences Clontech 获得 ；
蛋白质 A-Sepharose 珠从 Amersham 获得 ；
RANTES( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
RPMI 培养基从 Biological Industries(Beit Haemek， Israel) 获得 ；
SDF-1α( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
Taq 聚合酶 (Platinum Pfx DNA 聚合酶 ) 从 Invitrogen 获得 ； 和VCAM-1( 人 ) 从 R&D Systems， Inc.(Minneapolis， MN) 获得。
所有趋化因子都按照供应商的建议制备。
获取 IL6-BKT 肽 DNA 片段的两步 PCR
在第一 PCR 步骤中， 将 IL6 信号肽 DNA 序列 (SEQ ID NO ： 166) 添加到与每个 BKT 肽的前 9 种氨基酸对应的 DNA 序列中。这个 PCR 反应的产物在第二 PCR 步骤中用作模板从 而添加与 BKT 肽剩余的 3 种氨基酸对应的 DNA 序列、 间隔子序列 (SEQ ID NO ： 167)， 和 3’ 端 的 BstBI 限制性位点。
IL6-Fc pIRES puro DNA 用作第一 PCR 步骤的所有三个 PCR 反应的 NDA 模板。 所有 三个 PCR 反应利用同一正向引物 (T7 引物， SEQ ID NO ： 170) 完成。使用通用的 T7 引物， 形 成 PCR 产物， 该 PCR 产物在 5’ 端包含多个克隆位点， 包括后来用于亚克隆的 NheI 位点。该 反向引物对每个肽均有特异性， SEQ ID NO ： 171 用于 BKT-P2， SEQ ID NO ： 172 用于 BKT-P46。
该 PCR 反应条件如下 ： 20ng DNA 模板、 5μl 扩增 X10 缓冲液、 0.2mM 的每种脱氧核 糖核苷酸 (dNTP)、 0.5mM MgSO4、 5μl 增强子溶液 X10、 0.2μM 的每种引物、 2.5 单位的 Taq 聚合酶， 其中水添加到 50μl 总反应体积。
扩增用起始变性步骤执行， 该起始变性步骤在 94 ℃下执行 3 分钟， 接着执行在 94℃下 30 秒、 52℃下 30 秒， 和 72℃下 30 秒的 30 个循环， 然后 72℃下 10 分钟。
PCR 扩增结束时， 在用溴化乙锭染色和用 UV 光显现的 2％琼脂糖凝胶上分析 5μl 的每种反应混合物。
通过上述程序获得的 PCR 产物用作第二 PCR 步骤的模板。上述 T7 引物用作所有 三个反应的正向引物， 而反向引物对每个肽具有特异性 ； SEQ ID NO ： 173 用于 BKT-P2， SEQ ID NO ： 174 用于 BKT-P46。每种反向引物均编码期望肽的氨基酸 10-12， 和六肽间隔子序列 (SEQ ID NO ： 162)， 并包括 BstB1 限制性位点。
PCR 反应条件如下 ： 0.5μl DNA 模板、 5μl 扩增 X10 缓冲液、 0.2mM 的每种 dNTP、 0.5μM MgSO4、 5μl 增强子溶液 X10、 0.2μM 的每种引物、 2.5 单位的 Taq 聚合酶 ； 其中水添 加至 50μl 总反应体积。
按照上面针对第一 PCR 步骤描述的方法进行扩增和对 PCR 产物进行分析。该 PCR 产物是利用 QiaQuickTM 凝胶提取试剂盒 (QiagenTM) 从凝胶中提取的。
IL6-BKT 肽 DNA 片段与 Fc 序列的连接 (ligation) ：
提取的 IL6-BKT 肽 DNA 产物用 NheI 和 BstBI 进行消化， 按照上面详细描述的从琼 脂糖凝胶中纯化， 并使其连接到之前用相同酶消化的 FcN297ApIRESpuro3 中。 用于编码 SEQ ID NO ： 158 和 159 的载体的图谱分别在图 1A 和 1B 示出。将该连接混合物转化到 DH5a 感 受态细胞中。筛选抗氨必西林的转化体， 并通过克隆 PCR 进一步分析阳性克隆。
从抗氨必西林的克隆中提取 DNA， 并用 EcoRI 和 NotI 限制酶在 37℃下消化 2 小时。 在琼脂糖凝胶上分离反应物。预期阳性克隆可以产生 5123bp 和 868bp 的两条带。该阳性 克隆通过 DNA 测序进行证实。
Western 印迹 ：
收集细胞样品的培养基， 并进行离心 (1000 转 / 分钟， 7 分钟 )。将 1ml 去除细胞 的培养基 (cell-deprived medium) 与 50μl 蛋白质 A-Sepharose 珠一起在室温下温育 45 分钟。温育时间结束时， 用包含 100mM 柠檬酸盐磷酸盐缓冲液 (pH 3.5) 和 10mM DTT( 二硫苏糖醇 ) 的 50μl 样品缓冲液从该珠粒上洗脱蛋白质。将该样品煮沸 3 分钟， 然后将 25μl 样品装到 12％ NuPAGE Bis Tris 凝胶上。将该蛋白质转移到硝化纤维素膜中， 并 用在 PBST( 补充有 0.05％吐温 -20 的 PBS) 中的 10％低脂牛奶封闭。然后在室温下以在封 闭溶液中的 1 ∶ 40,000 浓度， 用人抗 IgG Fc 片段抗体， 接着用结合到 HRP( 辣根过氧化物 酶 ) 上的山羊抗人抗体印迹 (blot) 该膜 1 小时。在与 ECL 溶液一起温育之后， 将该膜暴露 于胶片 (film) 下。
表面等离子共振 (SPR) ：
在覆盖有羧甲基葡聚糖的腔室中， 肽或多肽通常经由赖氨酸残基的氨基或 N 末端 共价结合到该腔室上。通过该腔室以增加的浓度注射趋化因子。
从该表面反射的光线变化与结合蛋白质的量成比例， 并可以通过检测器检测。
对在不同浓度的趋化因子下结合的蛋白量作图， 使得离解系数 (dissociation coefficient) 的计算成为可能。
新鲜血液中的 T- 细胞纯化 ：
将 50ml 血液添加到 10ml 葡聚糖 T-500(6％ w/v) 在 PBS( 磷酸盐缓冲盐水 ) 中的 溶液， 和 7ml 柠檬酸盐缓冲液 (25 克柠檬酸盐、 8 克柠檬酸在 500ml PBS 中 ) 中。将该溶液 在 25℃下温育 30 分钟。将 10ml 聚蔗糖 (Ficoll)1077 添加到该管子底部。然后将该管子 在 18℃下在 2,000 转 / 分钟下离心 30 分钟 ( 以制动离心停止模式 )。收集中间相， 用含有 5％ FCS( 胎牛血清 ) 的 8ml PBS 洗涤两次， 接着在 18℃下在 1,400 转 / 分钟下离心 5 分钟。 8 将该细胞以小于 10 /ml 的浓度重悬在含有 5％ FCS 的 PBS 中。将 2ml 细胞溶液施加在预先 浸渍在 PBS-5％ FCS 中的聚 ( 甲基丙烯酸甲酯 ) 尼龙毛柱中， 然后在 25℃下温育 45 分钟。 每个柱子均用 8ml PBS-5％ FCS 洗涤， 并通过 50ml 5mM 在 PBS 中的 EDTA( 乙二胺四乙酸 ) 洗脱细胞 (T- 细胞和红细胞 )。通过在 4℃下在 1,400 转 / 分钟下离心 ( 开启制动 )5 分钟 获得红色球团 ( 红色细胞沉淀， red pellet)。
为了执行红细胞的裂解， 将该红色球团重悬在 5ml 裂解缓冲液 (155mM NH4Cl、 10mM KHCO3、 0.1mM EDTA、 X0.1PBS) 中 4 分钟， 接着立即加入 50ml 含有 EDTA 的 PBS。在 4℃下在 1,400 转 / 分钟下离心 5 分钟之后， 再次用 50ml PBS-EDTA 洗涤该球团， 并在相同条件下进 6 行再离心。获得白色球团， 将其以 3x10 个细胞 /ml 的浓度重悬在含有 10％ FACS、 L- 谷氨 酰胺、 丙酮酸钠和抗生素的 RPMI 培养基中。将该细胞在 37℃下温育 2 小时， 接着收集未粘 附细胞。该细胞在 37℃下温育过夜之后就已准备就绪可用于实验中。
体外 T 细胞粘附分析 ：
将 10μg/ml 人 VCAM-1 和 2μg/ml 趋 化 因 子 ( 完 整 MIG、 IP-10、 I-TAC、 MCP-1、 RANTES、 SDF-1( 基质细胞衍生因子 -1)、 BCA-1(B- 淋巴细胞趋化因子 -1)、 IL-8( 白介素 -8) 或嗜酸性粒细胞趋化因子， 或作为对照的热灭活 SDF-1) 溶解在由 20mM 碳酸氢盐 (pH 8.5) 缓冲制成的 PBS 中， 并在聚苯乙烯板中在 4℃下温育过夜。替换地， 使用 10μg/ml 趋化因 子， 并将该板在室温下温育 30 分钟。然后洗涤该板 3 次， 并通过与 20mg/ml 在 PBS 中的人 血清白蛋白一起在 37℃下温育 2 小时来进行封闭。
然后将该板装配成平行壁流动腔室的底壁 (lower wall) 并安装在倒置显微镜 镜台上。将 10μg/ml 测试肽在 37 ℃下安放在基质包被的腔室壁 ( 基质涂覆的腔室壁， substrate-coated chamber wall) 上 10 分钟， 然后洗涤。按如上所述的从新鲜血液中纯化出 T 细胞 (5x106/ml， 纯度＞ 98％ )， 使其悬浮在结合缓冲液中， 灌注到腔室中， 并将其在 37℃下安放在基质包被的腔室壁上 1 分钟。启动流动， 并每 5 秒增大 2 ～ 2.5 倍， 在该壁上 产生受控剪切应力。在倒置相差 Diaphot 显微镜 (Nikon) 的 20x 物镜下观察细胞， 并用连 接到 AG-6730S-VHS 录像机 (Panasonic) 上的长积分 LIS-700CCD 摄像机 (Applitech， 以色 列 ) 拍照。在每个间隔后通过分析录制的细胞图像确定可抵抗剪切应力增大造成的分离的 粘附细胞数目， 并表示成初始沉积细胞的百分数。所有粘附实验在多个试区 ( 测试区， test field) 上进行至少三次。
实验自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) ：
在雌性 SJL 和 C57BL/6 小鼠中诱导 EAE。 分别在小鼠侧腹皮下给予 100μg PLP139-151 肽或 250μg MOG35-55 肽 ( 第 0 天 ) 免疫该小鼠。 使 PLP 和 MOG 肽乳化在等体积的含有 800μg 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)H37RA(Difco， Detroit， MI) 的完全弗氏佐剂 (CFA) 中。还在第 0 天和 2 天给小鼠腹膜内注射 300ng 百日咳毒素 (pertussis toxin)。
在免疫后第 9 天， 给小鼠静脉注射 BKT-P2-FC 或 BKT-P46-FC(50μg/ 小鼠 )。在一 些实验中， 当给小鼠静脉注射 BKT-P2-FC 或 BKT-P46-FC 时， 在疾病的高峰期时， 疾病诱导之 后的 14 天对小鼠进行处理。
在 疾 病 诱 导 后 的 30 天 收 集 脊 髓 组 织 样 品，固 定 在 4 ％ 多 聚 甲 醛 (paraformaldehyde) 中， 并脱水和包埋在石蜡中。切出 6μm 脊髓切片， 并经加工用于通 过用苏木精和曙红 (H&E) 染色进行组织学分析从而评价免疫细胞浸润， 并用勒克司坚牢蓝 (luxol fast blue) 标记脱髓鞘区域。
免疫后 30 天收集血液样品， 提取血清用于细胞因子分析。根据制造商说明书通过 小鼠 Th1/Th2 细胞因子试剂盒 -BD 流式微珠阵列 (cytometric bead array， CBA)， 评价细 胞因子水平。
通过监测动物受验者的 EAE 临床得分， 确定 BKT-P2-FC 和 BKT-P46-FC 多肽的作 用。 EAE 临床得分根据下面的标准确定 ： 0- 无疾病 ； 1- 尾巴健康状况 ( 尾音， tail tone) 下 降； 2- 后肢无力或部分麻痹 ； 3- 后肢完全麻痹 ； 4- 前后肢麻痹 ； 5- 垂死状态。通过在实验 结束时合计实验组所有动物的所有结果， 计算累积分数。
对于所有 EAE 实验， 每组均有 10 ～ 12 只小鼠。
实施例 1
制备多肽
将 BKT-P2 肽 (SEQ ID NO ： 101) 和 BKT-P46 肽 (SEQ ID NO ： 76)( 在本文称为 “BKT 肽” ) 用作制备具有融合到分泌的非糖基化人 IgG1Fc(Fc N297A)N’ 末端上的 BKT 肽的多肽 的基础。
为了使 DNA 克隆进行， 使 BKT-P2 和 BKT-P46 肽序列反向翻译成 DNA 序列。每个 BKT 肽序列均融合到编码人 IL6 信号肽的 DNA 序列上以便使哺乳动物系统能够分泌蛋白质。 这个程序通过上文所述的两步 PCR 执行。然后， 使用上文所述的程序， 对通过 PCR 获得的 IL6-BKT 肽 DNA 片段进行消化， 使其框内连接到非糖基化 Fc 序列 ( 含有点突变 N297A) 上， 从而产生称为 IL6-P2-Fc N297A(SEQ ID NO ： 168) 和 IL6-P46-Fc N297A(SEQ ID NO ： 169) 的片段。
然后使用 FuGENE 6 转染试剂， 将 IL6-BKT 肽 -Fc DNA 构建体转染到 HEK-293T细胞中。将每个构建体均转染到 6- 孔板的两个孔中。一个孔专用于 Western 印迹 (WB) 分 析， 第二孔专用于确定稳定池。将该细胞以 500,000 个细胞 / 孔的浓度置于 6 孔板中。1 天 后， 用 6μl FuGENE 和 2μg DNA( 比例为 3 ∶ 1) 转染该细胞。
在专用于 WB 分析的孔中， 24 小时后将该培养基替换成无血清培养基， 并在 48 小时 后收集该培养基。通过使用抗 -Fc 抗体的 Western 印迹分析， 分析短暂转染的细胞， 发现该 细胞可以表达称为 BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 和 BKT-P46-FC(SEQ ID NO ： 159) 的期望多 肽 ( 数据未给出 )。
在 另 一 个 孔 中， 24 小 时 后 将 该 培 养 基 替 换 成 含 有 10 ％ FCS( 胎 牛 血 清 ) 的 DMEM(Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 )， 48 小时后使该细胞胰蛋白酶化并将其转移到含有选 择培养基 ( 含有 10％ FCS 和 5μg/ml 嘌呤霉素的 DMEM) 的 T75 烧瓶中以便获得稳定的克 隆。
使从嘌呤霉素选择 ( 稳定池 ) 中存活的细胞群体繁殖， 并如上文所述的通过 Western 印迹分析来分析该细胞群体的培养基， 以便证实期望多肽的表达。
如图 2 所示， 期望 BKT-P2-FC 和 BKT-P46-FC 多肽表达在所有所测试的细胞培养物 中。 另外， 通过针对 Fc 片段的 ELISA 测试上述池的上清液， 结果指示期望 BKT-P2-FC 或 BKT-P46-FC 多肽表达在所有所测试的细胞培养物中 ( 数据未给出 )。
为了验证细胞的同一性， 执行基因组 PCR， 结果指示正确序列整合在细胞基因组中 ( 数据未给出 )。
将表达期望多肽的每个池的数个等分试样 (aliquot) 冷冻保存在液氮下。数天 后， 使来自每个原液 (stock) 的一个安瓿融化以便证实细胞活力。
然后， 在悬浮液中生长的哺乳动物培养物中生产 BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 和 BKT-P46-FC(SEQ ID NO ： 159) 多肽。将所转染细胞的一个 T175 烧瓶保持在含有选择抗生 素 (5μg/ml 嘌呤霉素 )、 补充有 10％血清的培养基中， 并在 5％ CO2 中在 37℃下进行温育。 胰酶消化之后， 将该细胞转移到补充有 4mM 谷氨酰胺和选择抗生素 (1μg/ml 嘌呤霉素 ) 的 无血清培养基 (EX-CELL 293 培养基 ) 中， 进一步在烧瓶中在 5％ CO2， 37℃下进行温育。3 天后， 在 37℃下将该细胞转移到摇瓶中， 该摇瓶的搅拌速度为 125 转 / 分钟。 当细胞密度达 6 到 2.0-3.5x 10 个细胞 /ml 时， 通过在两个旋转烧瓶中连续稀释使培养物体积增大到多达 4 升。将一个含有 200ml 培养物的摇瓶作为备份保存。
在 4 天的生产期之后， 两个旋转烧瓶的培养物分别达到 3.7x 106 个细胞 /ml， 活力 6 为 91％， 和 4.0x 10 个细胞 /ml， 活力为 92％。通过离心 (5000 转 / 分钟， 15 分钟 ) 从该两 个旋转烧瓶中收获培养基和从该摇瓶中收获 200ml。 共收获 3.5 升， 通过 0.22μm 过滤器过 滤， 并保存在 -80℃ ( 取出两个 1.5ml 样品 )。在蛋白质 A 柱上进一步纯化该多肽 (SEQ ID NO ： 158 或 SEQ ID NO ： 159)。
实施例 2
多肽与趋化因子的亲和力
通过材料和方法部分中描述的表面等离子体共振技术 (SPR)， 测定实施例 1 描述 的多肽与趋化因子的亲和力。结果概括在下表 3 中。
如表 3 所示， 该多肽以可感知程度结合到趋化因子 I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸
性粒细胞趋化因子和 RANTES 中的每个上。
表3： 多肽与趋化因子的结合的解离常数 (Kd)
实施例 3
多肽的体外活性
利用上文描述的体外粘附分析， 将趋化因子结合肽 BKT-P2(SEQ ID NO ： 101) 和 BKT-P46(SEQ ID NO ： 76) 对 T 细胞与 VCAM-1 的粘附的影响与包含前述趋化因子结合肽序 列之一的实施例 1 所述的那些多肽进行比较。前述肽和多肽抑制 T 细胞与 VCAM-1 的粘附 的能力概括在下表 4 中。
表4： 肽对趋化因子依赖性 T 细胞粘附的抑制
++ ＝ 100％抑制
- ＝无抑制 N.D. ＝未测定
如表 4 和图 3A、 3B 和 3C 所示， 该肽 BKT-P2 抑制了 IP-10、 I-TAC、 MCP-1、 RANTES 和 嗜酸性粒细胞趋化因子诱导的 T 细胞粘附， 但不能抑制 MIG 诱导的 T 细胞粘附。
如表 4 和图 4A、 4B 和 4C 所示， 多肽 BKT-P2-FC 抑制了 MIG 诱导的 T 细胞粘附， 以 及 IP-10、 I-TAC、 MCP-1、 RANTES 和嗜酸性粒细胞趋化因子诱导的粘附。
如图 4 中进一步所示的， 肽 BKT-P46 抑制了 I-TAC、 MIG、 MCP-1 和 RANTES 诱导的 T 细胞粘附， 但不能诱导嗜酸性粒细胞趋化因子诱导的粘附， 而多肽 BKT-P46-FC 抑制了嗜酸 性粒细胞趋化因子， 以及 I-TAC、 MIG、 MCP-1 和 RANTES 诱导的 T 细胞粘附。
上面的结果表明， 该多肽调节趋化因子活性的能力相比相应趋化因子结合肽调节 趋化因子活性的能力增强。这可能是由于寿命延长和该多肽相对于该肽的稳定性增强， 和 / 或由于它们三级构象发生变化引起的。
实施例 4
多肽对实验自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 的体内作用
利用材料和方法部分中描述的体内实验自身免疫性脑脊髓炎模型， 测试实施例 1 描述的 BKT-P2-FC 和 BKT-P46-FC 多肽对脑部炎症的作用并进行评分。
如图 5A 和 5B 所示， BKT-P46-FC 多肽大大降低了实验持续期间 ( 到 55 天 )PLP 来 源的 EAE 平均临床得分和累积临床得分 ( 累计临床得分， accumulating clinical score)。
在 该 实 验 第 37 天， 13 只 对 照 小 鼠 中 的 6 只 的 EAE 临 床 得 分 至 少 为 2， 而接受 BKT-P46-FC 多肽的所有 10 只小鼠的 EAE 临床得分都为 0。
另外， 如图 6A 和 6B 所示， BKT-P46-FC 和 BKT-P2-FC 多肽都降低了实验持续期间 ( 到 33 天 )PLP 来源的 EAE 平均临床得分和累积临床得分。
在该实验的第 27 天， 10 只对照小鼠中的 8 只的 EAE 临床得分至少为 2， 而接受 BKT-P2-FC 多肽的 10 只小鼠中的 9 只的 EAE 临床得分为 0， 接受 BKT-P46-FC 多肽的 10 只 小鼠中的 8 只的 EAE 临床得分 0。
类似地， 如图 7 所示， BKT-P46-FC 和 BKT-P2-FC 多肽都降低了实验持续期间 ( 到 55 天 )MOG- 来源的 EAE 临床得分 ( 到 55 天 )。
这些结果表明该多肽对抑制小鼠脑部中的炎性反应， 如 EAE， 多发性硬化模型的炎 性反应有效。
实施例 5
多肽对关节炎的体内作用
利用体内小鼠诱导的关节炎模型， 测试了实施例 1 描述的 BKT-P2-FC 多肽对关节 炎的作用。该分析按照 Coelho 等人 [Arthritis Rheum 2008， 58 ： 2329-2337]， Grespan 等 人， [Arthritis Rheum 2008， 58 ： 2030-2040]and Lemos 等人， [PNAS 2009， 106 ： 5954-5959] 描述的执行。
在第 0 天， 在小鼠尾巴底部真皮内给予含 500μg 甲基化牛血清白蛋白 (mBSA) 的 100μl 盐水乳液和等体积弗氏完全佐剂 (CFA)， 免疫该小鼠。在第 11 天， 按 2mg/kg 的剂量 给予 BKT-P2-FC 多肽。 24 小时后， 对小鼠进行抗原激发。 每只小鼠的左膝关节均接受 10μg mBSA 注射液 ( 在 10μl 无菌盐水中的注射液 )。给予该多肽 48 小时后， 处死该小鼠， 用 PBS 洗涤膝关节腔， 并通过利用荧光激活细胞分选术 (FACS) 计数白细胞， 确定组织中白细胞的 数目。
如图 8A 和 8B 所示， BKT-P2-FC 多肽大大地减少了关节炎膝关节腔内的中性粒细 胞数目， 和单核细胞数目。
这些结果表明， 该多肽对抑制炎性反应， 如类风湿性关节炎的炎性反应有效。
实施例 6多肽对迟发型超敏反应 (DTH) 的体内作用
利用体内迟发型超敏反应小鼠模型， 进一步测试实施例 1 描述的 BKT-P2-FC 和 BKT-P46-FC 多肽对免疫反应的作用。
在第 0 天， 在小鼠尾巴底部真皮内给予含 500μg 甲基化牛血清白蛋白 (mBSA) 的 100μl 盐水乳液和等体积弗氏完全佐剂 (CFA)， 免疫该小鼠 (8 至 10 周龄雄性 C57BL/6 小 鼠 )。12 天后， 对小鼠进行抗原激发。每只小鼠的左膝关节均接受 10μg mBSA 注射液 ( 在 10μl 无菌盐水中的注射液 )， 如 Coelho 等人 [Arthritis Rheum 2008， 58 ： 2329-2337] 和 Healy 等人 [J Immunol 2006， 177 ： 1886-1893] 描述的。在一些小鼠中， 在激发 24 时前， 静 脉注射 BKT-P2-FC(50μg/ 小鼠 )。用 PBS 伪免疫激发的空白小鼠 ( mice) 用作对照 小鼠。抗原激发 24 小时后， 处死小鼠。
如图 9 所示， 上述多肽都抑制迟发型超敏反应， BKT-P2-FC 的效力比 BKT-P46-FC 的 强。
这些结果表明， 该多肽对抑制迟发型超敏反应的炎性反应有效。
实施例 7
多肽的药物动力学
在静脉注射 50μg/ 小鼠的 BKT-P46-FC(SEQ ID NO ： 159) 或 BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 多肽的 C57BL 小鼠中， 测定多肽在小鼠中的药物动力学。
在注射后 2 小时、 24 小时， 5 和 11 天给该小鼠抽血， 并取出血清。根据制造商说明 书利用人总 IgG ELISA 试剂盒 (ICL) 测试血清中多肽的水平。
甚至在注射 11 天后仍可以在血液中检测到该多肽。
这些结果表明， 该多肽具有相当大的体内稳定性。
虽然本发明已结合其特定的实施方式进行描述， 但显然， 对于本领域技术人员而 言， 许多替换、 修改和变更都是很明显的。因此， 本发明旨在包括落在附属权利要求的精神 和宽范围内的所有此类替换、 修改和变更。
本说明书中提到的所有出版物、 专利和专利申请都通过引用完整地合并在本说明 书中， 如同每篇单独的出版物、 专利或专利申请单独地明确被指出通过引用合并在此。另 外， 本申请中任何参考文献的引用或列出不应该被解释为承认此类参考文献是本发明的现 有技术。对于使用的章节标题， 它们不应该被解释为限制性的。
表5： 趋化因子结合肽
趋化因子结合肽名称 BKT-P50 BKT-P10 BKT-P17 BKT-P58 SEQ ID NO ： 1 2 3 4 肽的序列 CAHLSPHKC CDIPWRNEC CDPLRQHSC CDSLGHWLC36CN 102482324 A BKT-P15 BKT-P59 BKT-P56 BKT-P60 BKT-P61 BKT-P62 BKT-P63 BKT-P64 BKT-P65 BKT-P66 BKT-P67 BKT-P68 BKT-P69 BKT-P70 BKT-P57 BKT-P71 BKT-P72 BKT-P73 BKT-P14 BKT-P74 BKT-P75 BKT-P76 BKT-P77 BKT-P16说5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28明书CDYTTRHSC CHGTLNPEC CHHNLSWEC CHIWTLASC CHNTFSPRC CIPLHASLC CITTTSLSC CKLTTCKDC CKNHTTFWC CLKLLSRSC CLLKAHPSC CLNQLKQAC CMNFPSPHC CPQSPTYTC CPSSAIHTC CPTSTARIC CQASSFPSC CQPYFWYRC CQTLTPSIC CSKLGHLWC CSKTPERIX CSNNNRMTC CSPILSLSC CSPTNFTRC33/39 页37CN 102482324 A BKT-P78 BKT-P79 BKT-P80 BKT-P81 BKT-P13 BKT-P82 BKT-P83 BKT-P84 BKT-P85 BKT-P86 BKT-P87
趋化因子结合肽名称 BKT-P88 BKT-P12 BKT-P89 BKT-P90 BKT-P48 BKT-P91 BKT-P44 BKT-P92 BKT-P93 BKT-P94 BKT-P95说29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39明书CSRPAMNVC CSTKAYPNC CSTSSCGSC CSYWGHRDC CTAHDANAC CTANSEKTC CTHPKASMC CTKTINGKC CTNMQSPLC CTPFTKLPC CTPTTDSIC34/39 页SEQ ID NO ： 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50肽的序列 CTQQNGHPC ACTTPSKHQC CTYNVAKPC ACAPLMFSQC ACHASLKHRC AHFSPNLLLGG AHSLKSITNHGL AKTLMPSPFPRT ASAVGSLSIRWQ/L/G ASWVDSRQPSAA CPQLTVGQHRT38CN 102482324 A BKT-P8 BKT-P96 BKT-P97 BKT-P51 BKT-P98 BKT-P99 BKT-P9 BKT-P100 BKT-P27 BKT-P28 BKT-P33 BKT-P101 BKT-P102 BKT-P45 BKT-P55 BKT-P54 BKT-P103 BKT-P104 BKT-P49 BKT-P105 BKT-P6 BKT-P106 BKT-P107 BKT-P108说51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74明书DLPPTLHTTGSP DSSNPIFWRPSS EFLGVPASLVNP ESDLTHALHWLG EVHSTDRYRSIP FGLQPTGDIARR FSMDDPERVRSP FSPLHTSTYRPS GDFNSGHHTTTR GPSNNLPWSNTP GVHKHFYSRWLG HAPLTRSPAPNL HGSLTTLF/LRYEP HHFHLPKLRPPV HHTWDTRIWQAF HPTTPFIHMPNF HRDPXS(P)PSAA/GRP HNVTTRTQRLMP HSACHASLKHRC HSACKLTTCKDG HSACLSTKTNIC IAHVPETRLAQM IFSMGTALARPL INKHPQQVSTLL35/39 页39CN 102482324 A BKT-P7 BKT-P46 BKT-21
趋化因子结合肽名称 BKT-P22/38 BKT-P37 BKT-P109 BKT-P110 BKT-P111 BKT-P112 BKT-P113 BKT-P114 BKT-P42 BKT-P23 BKT-P24 BKT-P115 BKT-P116 BKT-P117 BKT-P118 BKT-P119 BKT-P120 BKT-P39 BKT-P40说75 76 77明书ISPSHSQAQADL LDYPIPQTVLHH LFAAVPSTQFFR36/39 页SEQ ID NO ： 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96肽的序列 LGFDPTSTRFYT LLADTTHHRPWP LPWAPNLPDSTA LQPSQPQRFAPT LSPPMQLQPTYS MHNVSDSNDSAI NSSMLGMLPSSF NTSSSQGTQRLG PGQWPSSLTLYK QIPQMRILHPYG QIQKPPRTPPSL QLTQTMWKDTTL QNLPPERYSEAT QSLSFAGPPAWQ QTTMTPLWPSFS RCMSEVISFNCP RSPYYNKWSSKF SAGHIHEAHRPL SAISDHRAHRSH40CN 102482324 A BKT-P121 BKT-P32 BKT-P31 BKT-P3 BKT-P2 BKT-P122 BKT-P123 BKT-P29 BKT-P124 BKT-P125 BKT-P126 BKT-P127 BKT-P1 BKT-P128 BKT-P129 BKT-P4 BKT-P34 BKT-P130
趋化因子结合肽名称 BKT-P131 BKT-P132 BKT-P133 BKT-P5说97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114明书SEPTYWRPNMSG SFAPDIKYPVPS SFWHHHSPRSPL SIFAHQTPTHKN SIPSHSIHSAKA SIRTSMNPPNLL SLPHYIDNPFRQ SLSKANILHLYG SLVTADASFTPS SMVYGNRLPSAL SPSLMARSSPYW SPNLPWSKLSAY SQTLPYSNAPSP SSTQAHPFAPQL STPNSYSLPQAR STVVMQPPPRPA SVQTRPLFHSHF SVSVGMKPSPRP37/39 页SEQ ID NO ： 115 116 117 118肽的序列 SYIDSMVPSTQT SYKTTDSDTSPL TAAASNLRAVPP TAPLSHPPRPGA41CN 102482324 A BKT-P134 BKT-P135 BKT-P30 BKT-P25 BKT-P136 BKT-P137 BKT-P47 BKT-P138 BKT-P139 BKT-P140 BKT-P141 BKT-P142 BKT-P143 BKT-P144 BKT-P26 BKT-P35 BKT-P145 BKT-P146 BKT-P147 BKT-P148 BKT-P149 BKT-P43 BKT-P150 BKT-P151说119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142明书TGLLPNSSGAGI TGPPSRQPAPLH TLSNGHRYLELL TPSPKLLQVFQA TPSTGLGMSPAV TPVYSLKLGPWP TRLVPSRYYHHP TSPIPQMRTVPP TTNSSMTMQLQR TTTLPVQPTLRN TTTWTTTARWPL TVAQMPPHWQLT TWNSNSTQYGNR TWTLPAMHPRPA VHTSLLQKHPLP VLPNIYMTLSA VMDFASPAHVLP VNQEYWFFPRRP VYSSPLSQLPR VPPIS(R)TFLF(L)ST(K)S VPPLHPALSRXN VSPFLSPTPLLF VSRLGTPSMHPS WPFNHFPWWNVP38/39 页42CN 102482324 A BKT-P52 BKT-P152 BKT-P53 BKT-P153 BKT-P154 BKT-P155 BKT-P156 BKT-P157 BKT-P158 BKT-P36 BKT-P41 BKT-P159
背景技术 趋化因子是参与炎性疾病过程的许多生物因子之一。趋化因子属于一组小的、 ～ 8-14kDa 的、 大多数为碱性的肝素结合蛋白质， 所述的肝素结合蛋白质既与它们的一级结构 相关， 又与 4 个保守性半胱氨酸残基的存在相关。
趋化因子是已证明为体外白细胞亚群体的选择性化学引诱物， 并可诱导体内炎 性细胞积聚的趋化性细胞因子。除了化学趋向性之外， 趋化因子还可以介导白细胞脱 粒 (leukocyte de-granulation)[Baggiolini and Dahinden， Immunol Today 1994， 15 ： 127-133]、 粘附受体的上调 [Vaddi and Newton， J Immunol 1994， 153 ： 4721-4732]， 以及人
趋化因子是已证明为体外白细胞亚群体的选择性化学引诱物， 并可诱导体内炎 性细胞积聚的趋化性细胞因子。除了化学趋向性之外， 趋化因子还可以介导白细胞脱 粒 (leukocyte de-granulation)[Baggiolini and Dahinden， Immunol Today 1994， 15 ： 127-133]、 粘附受体的上调 [Vaddi and Newton， J Immunol 1994， 153 ： 4721-4732]， 以及人
免疫缺陷病毒复制的抑制 [Cocchi 等人， Science 1995， 270 ： 1811-1815]。
趋化因子对免疫系统中的细胞招募 (recruitment) 和活化起着重要作用。它们也 在除了免疫系统之外的许多不同细胞类型中具有多种多样的作用， 包括例如在中枢神经系 统的各种细胞中 [Ma 等人， PNAS 1998， 95 ： 9448-9453]， 和在内皮细胞中， 其中它们导致血 管生成或抑制血管生成作用 (angiostatic effects)[Strieter 等人， J Biol Chem 1995， 270 ： 27348-27357]。 特定趋化因子可以对肿瘤具有多种作用， 包括血管生成、 促进生长和转 移， 以及抑制对癌症的免疫反应， 而其它趋化因子可以抑制肿瘤介导的血管生成和促进抗 肿瘤免疫反应。
由于在炎症和相关病症如哮喘、 动脉硬化、 同种异体移植排斥、 AIDS 和自身免疫性 病症 ( 例如， 多发性硬化、 关节炎、 重症肌无力、 狼疮 ) 中起着关键作用， 趋化因子受体日益 受到关注。
国 际 专 利 申 请 PCT/IL03/00155( 以 WO 03/072599 公 开 ) 和 美 国 专 利 No.7,488,717 公 开 了 能 够 结 合 趋 化 因 子 和 调 节 它 们 的 生 物 功 能 的 新 型 肽 和 模 拟 肽 (peptidomimetics)。 发明内容
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含至少一种附接到 Fc 结构域或其片 段上的趋化因子结合肽的分离多肽。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含本文所述的多肽和药学可接受载体 的药物组合物。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了本文所述多肽在制造用于调节趋化因子 生物效应的药物中的用途。根据本发明一些实施方式的方面， 提供了调节趋化因子生物效应的方法， 该方法 包括向需要其的受验者 ( 受试者、 对象、 或主体， subject) 给予治疗有效量的本文所述多 肽， 从而调节趋化因子的生物效应。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了本文所述多肽在制造用于治疗选自以下 的病症的药物中的用途 ： 炎症、 过敏症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫反应 (non-optimal immune response)、 细胞迁移异常 ( 异常的细胞迁移， abnormal cell migration)、 自身免 疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥 (allograft rejection)、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银 屑病、 动脉硬化 (atherosclerosis)、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了治疗选自以下的病症的方法 ： 炎症、 过敏 症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺 血， 该方法包括向需要其的受验者给予本文所述多肽， 从而调节和 / 或抑制趋化因子的生 物效应。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了编码本文所述多肽的分离多核苷酸。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含本文所述多核苷酸的核酸构建体。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含上述核酸构建体的细胞。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了制取 ( 制备、 生成， generate) 多肽的方 法， 该方法包括培养上述细胞， 和分离该多肽。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含附接到水溶性聚合物上的本文所述 多肽的结合物 (conjugate)。
根据本发明一些实施方式， 该多肽进一步包含接头。
根据本发明一些实施方式， 该接头是氨基酸接头。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域选自 IgG Fc 结构域、 IgA Fc 结构域、 IgD Fc 结构域、 IgE Fc 结构域， 和 IgM Fc 结构域。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽附接在 Fc 结构域或其片段的 N 末端 上。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽附接在 Fc 结构域或其片段的 C 末端 上。
根据本发明一些实施方式， 该接头由 4 ～ 10 个氨基酸组成。
根据本发明一些实施方式， 该接头是六肽。
根据本发明一些实施方式， 该接头是如 SEQ ID NO ： 162 中列出的肽。
根据本发明一些实施方式， 该多肽进一步包含信号肽。
根据本发明一些实施方式， 该信号肽在该多肽的 N- 末端。
根据本发明一些实施方式， 该多肽具有下式 ：
W-X-Y-Z
其中 ：
W 是信号肽 ；X 是趋化因子结合肽 (chemokine-binding peptide) ；
Y 是接头 ； 且
Z 是 Fc 结构域或其片段。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽长度为 10 ～ 20 个氨基酸。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽长度为 12 ～ 13 个氨基酸。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽的特征是具有结合到至少一种选 自 I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞趋化因子 ( 嗜酸粒细胞趋化蛋白， eotaxin) 和 RANTES 的趋化因子上的能力。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽选自 SEQ ID NO ： 1-157。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽选自 BKT-P2(SEQ ID NO ： 101) 和 BKT-P46(SEQ ID NO ： 76)。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽具有表现出与选自 SEQ ID NO ： 1-157 的氨基酸序列具有至少 90％序列同源性 (sequence homology) 的氨基酸序列。
根据本发明一些实施方式， 上述序列同源性为至少 95％。
根据本发明一些实施方式， 该信号肽包含 IL-6 信号肽。 根据本发明一些实施方式， 该信号肽具有 SEQ ID NO ： 161。
根据本发明一些实施方式， 该信号肽具有表现出与 SEQ ID NO ： 161 具有至少 90％ 序列同源性的氨基酸序列。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域是人 Fc 结构域。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域是 IgG Fc 结构域。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域是 IgG1 结构域。
根 据 本 发 明 一 些 实 施 方 式，该 Fc 结 构 域 或 其 片 段 是 非 糖 基 化 的 (non-glycosylated)。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域或其片段具有 SEQ ID NO ： 160。
根据本发明一些实施方式， 该多肽的特征是具有抑制至少一种趋化因子与趋化因 子受体 (chemokine receptor) 结合的能力。
根据本发明一些实施方式， 该多肽的特征是具有增强至少一种趋化因子与趋化因 子受体结合的能力。
根据本发明一些实施方式， 该药物组合物包装在包装材料中， 并在包装材料中或 包装材料上标识用于调节趋化因子的生物效应。
根据本发明一些实施方式， 该药物组合物包装在包装材料中， 并在包装材料中或 包装材料上标识用于治疗选自以下的病症 ： 炎症、 过敏症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫 反应、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排 斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动 脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
根据本发明一些实施方式， 该药物组合物调配用于静脉给予、 口服给予、 皮下给 予、 局部给予 (topical administration) 和 / 或鼻内给予。
根据本发明一些实施方式， 该药物调配用于静脉给予、 口服给予、 皮下给予、 局部 给予和 / 或鼻内给予。
根据本发明一些实施方式， 给予包括静脉给予、 口服给予、 皮下给予、 局部给予和 / 或鼻内给予。
根据本发明一些实施方式， 调节包括抑制。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子选自 I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细 胞趋化因子和 RANTES。
根据本发明一些实施方式， 该生物效应选自炎性效应、 细胞迁移、 肿瘤生长和癌转 移 (cancer metastasis)。
根据本发明一些实施方式， 该多肽用于治疗选自以下的病症 ： 炎症、 过敏症、 迟发 型超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红 斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感 染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
根据本发明一些实施方式， 该分离多核苷酸具有选自 SEQ ID NO ： 168 和 SEQ ID NO ： 169 的核酸序列。
根据本发明一些实施方式， 该水溶性聚合物是聚乙二醇。
除非另有限定， 否则本文使用的所有技术和 / 或科学术语的含义都与本发明所属 领域普通技术人员通常理解的相同。虽然下面描述了示例方法和 / 或材料， 但本发明实施 方式的实施或试验中可使用与本文所述的那些相似或者等同的方法和 / 或材料。如有冲 突， 以专利说明书为准， 包括定义。另外， 材料、 方法和实例仅为了说明， 而不旨在进行不必 要的限制。 附图说明 本文仅参考附图通过实例说明本发明的一些实施方式。关于下面详细讨论的附 图， 要强调的是， 所示细节仅为了举例， 用于示意性地讨论本发明的实施方式。 就此而言， 参 考附图所作的描述将使本领域技术人员明了本发明实施方式可以如何实施。
在该图中 ：
图 1A 和 1B 是载体的载体图谱 (vector maps)， 该载体用于编码根据本发明一些 实施方式的多肽， 即， SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC， 图 1A) 和 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC， 图 1B)， 并进一步编码对氨必西林 ( 氨苄青霉素， ampicillin)(Amp) 和嘌呤霉素 (puromycin) (Puro) 具有抗性的基因 ；
图 2 是 Western 印迹 ( 蛋白杂交印迹， Western blot) 图像， 示出遗传加工 ( 基因 设计， genetically engineered) 用于产生示例多肽 SEQ ID NO ： 158( 泳道 1 和 2) 和 SEQ ID NO ： 159( 泳道 3-5) 的 HEK 293T 细胞池中的 IgG Fc， 以及 50ng( 泳道 6)、 100ng( 泳道 7)、 200ng( 泳道 8) 和 300ng( 泳道 9) 的对照 IgG Fc 的表达 ；
图 3A ～ 3C 是 示 出 在 暴 露 于 肽 BKT-P2(SEQ ID NO ： 101) 前 后， IP-10( 图 3A)、 I-TAC( 图 3B) 和 MIG( 图 3C) 诱导的 T 细胞与 VCAM-1 的粘附随剪切流 (shear flow) 的变 化 ( 在热灭活的 SDF-1 细胞因子存在下情况的 T 细胞粘附示为对照 ) 的图表 ；
图 4A ～ 4C 是示出在暴露于根据本发明一些实施方式的多肽， BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 前后， IP-10( 图 4A)、 I-TAC( 图 4B) 和 MIG( 图 4C) 诱导的 T 细胞与 VCAM-1 的粘 附随剪切流的变化 ( 在热灭活的 SDF-1 细胞因子存在情况下的 T 细胞粘附示为对照 (den))
的图表 ；
图 5A 和 5B 是示出对照小鼠以及用具有 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC) 的示例多 肽处理的小鼠的 EAE( 实验自身免疫性脑脊髓炎 ) 平均临床得分随着用 PLP( 蛋白脂质蛋白 质 ) 免疫从而诱导急性疾病后的时间的变化 ( 图 5A)， 和 EAE 平均累积临床得分 ( 图 5B) 的 图表 ；
图 6A 和 6B 是示出对照小鼠以及用具有 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC) 或 SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC) 的示例多肽处理的小鼠的 EAE( 实验自身免疫性脑脊髓炎 ) 平均临床 得分随着用 PLP( 蛋白脂质蛋白质 ) 免疫从而诱导急性疾病后的时间的变化 ( 图 6A)， 和 EAE 平均累积临床得分 ( 图 6B) 的图表 ；
图 7 是示出对照小鼠以及用具有 SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC) 或 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC) 的示例多肽处理的小鼠的 EAE( 实验自身免疫性脑脊髓炎 ) 平均临床得分 随着用 MOG 肽免疫从而诱导慢性疾病后的时间的变化的图表 ；
图 8A 和 8B 是示出健康小鼠 ( 阴性 CTRL)、 关节炎小鼠 ( 阳性 CTRL) 以及用具有 SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC) 的示例多肽处理的关节炎小鼠的膝关节腔 (knee cavity) 中 的嗜中性粒细胞 ( 图 8A) 和单核细胞 ( 图 8B) 的水平的图表 ； 以及 图 9 是具有 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC) 和 SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC) 的示例 多肽对迟发型超敏反应的抑制 ( 示出地塞米松 (Dex.) 的抑制用于比较 ) 的图表。
具体实施方式
本发明公开了能够结合趋化因子的新型多肽， 更特别地但不排它地， 涉及能够调 节趋化因子依赖性过程如自身免疫、 炎症和癌症的多肽。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前， 应理解本发明的应用不必局限于下 面的说明所列出的或通过实施例列举的细节。本发明能够有其它实施方式， 或能够以多种 方式实施或实现。
如上面背景部分所述的， 已描述了 ( 例如， 在国际专利申请 PCT/IL03/00155( 以 WO 03/072599 公开 ) 和美国专利 No.7,488,717) 能够结合到趋化因子上并能够调节它们的生 物功能的肽和结构相关的化合物。此种肽的实例在 SEQ ID NO ： 1-157 中列出。由于其能 够调节趋化因子功能的能力， 此种肽具有多种治疗应用。 然而， 此种肽的治疗益处典型地受 到， 例如肽在体内的短半衰期的限制。
当试图制取具有改进特性的趋化因子结合肽时， 本发明人将趋化因子结合肽附接 ( 连接， attach) 到 Fc 结构域片段上。
如下面实施例部分证明的， 简化本发明实践的同时， 发现包含趋化因子结合肽和 Fc 结构域片段的多肽惊人地表现出改进的趋化因子结合能力。进一步发现， 该多肽表现出 改进的治疗免疫相关性疾病和障碍如多发性硬化、 关节炎和迟发型超敏反应的体内功效， 以及长的循环寿命 (circulation lifetime)。
现参考附图和表格， 图 1A 和 1B 示出用于表达根据本发明一些实施方式的示例多 肽的示例 DNA 构建体， 该示例多肽称为 BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 和 BKT-P46-FC(SEQ ID NO ： 159)。图 2 示出前述示例多肽在细胞培养物中的表达， 如通过 Western 印迹检测的。
“BKT-P2-FC” 和 “BKT-P46-FC” 是本发明所有者 (owners) 所有的商标。BKT-P2-FC是 指 还 在 临 时 专 利 申 请 No.61/213,493 中 称 为 “IL6 信 号 肽 -BKT-P2- 间 隔 子 -FC” 、 “P2-Fc” 、 “BKT-Fc-2” 、 “BKT-Fc-P2” 、 “IL6-P2-Fc” 、 “IL6-P2-Fc N297A” 和 “IL6-BioPep1-Fc N297A”的 多 肽。BKT-P46-FC 是 指 还 在 临 时 专 利 申 请 No.61/213,493 中 称 为 “IL6 信 号 肽 -BKT-P46- 间 隔 子 -FC” 、 “BKT-Fc-46” 、 BKT-FC-46” 、 “P46-FC” 、 IL6-P46-Fc” 、 “IL6-P46-Fc N297A” 和 “IL6-BioPep2-Fc N297A” 的多肽。
表 3 示 出 前 述 示 例 多 肽 与 多 种 趋 化 因 子 的 结 合 的 解 离 常 数 (dissociation constants)。
图 4A-4C 示出示例多肽 (SEQ ID NO ： 158) 对一些趋化因子生物活性 ( 诱导 T 细胞 粘附 ) 的抑制作用。 作为比较， 图 3A-3C 示出该多肽所基于的趋化因子结合肽 (SEQ ID NO ： 101) 对相同活性的抑制作用。表 4 概述了示例多肽 (SEQ ID NO ： 158 和 SEQ ID NO ： 159) 以及它们所基于的趋化因子结合肽 ( 分别为 SEQ ID NO ： 101 和 SEQ ID NO ： 76) 抑制多种趋 化因子活性的能力。
图 5A、 5B、 6 和 7 示出根据本发明一些实施方式的示例多肽对抗小鼠 EAE( 实验自 身免疫性脑脊髓炎 ) 进展的功效。图 8A 和 8B 示出示例多肽对抗小鼠关节炎的功效。图 9 示出示例多肽对抗迟发型超敏反应的功效。
表 5 给出可以包括在根据本发明实施方式的多肽中的趋化因子结合肽。
因而， 本文给出的实验结果表明， 根据本发明实施方式的多肽能够结合到趋化因 子上 ( 参见例如表 3)， 是甚至比相应趋化因子结合肽更有效的趋化因子活性调节剂 ( 参见， 例如表 4 和图 3A、 3B、 4A 和 4B)， 可以治疗有效地治疗多种病症 ( 参见例如图 5A-9)。
因此， 根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含至少一种附接到抗体 (e.g.、 IgG、 IgA、 IgD、 IgE、 IgM 抗 体 )Fc 结 构 域 或 Fc 结 构 域 片 段 上 的 趋 化 因 子 结 合 肽 的 分 离多肽。包含附接到 Fc 结构域或其片段上的肽的分子在本文中可称为 “肽体 ( 多肽， peptibodies)” 。
在一些实施方式中， 该多肽包含单个趋化因子结合肽。
替换地， 该多肽包含多于一个的趋化因子结合肽 ( 例如， 2、 3、 4 或 5 个趋化因子结 合肽 )。该趋化因子结合肽可以彼此相同或不同。
如本文使用的术语 “趋化因子结合肽” 是指任何特征为具有结合到溶液中至少一 种趋化因子上的能力的肽 ( 例如， 多达 20 个氨基酸残基的肽 )。示例趋化因子包括， 但不 局限于， CCL1( 其中 CCL 是趋化因子 (C-C 基序 ) 配体的简称 )、 MCP-1( 本领域中也称为 CCL2)、 MIP-1( 包括 MIP-1α 和 / 或 MIP-1β)、 RANTES( 本领域中也称为 CCL5)、 CCL6、 CCL7、 CCL8、 CCL9、 嗜酸性粒细胞趋化因子 ( 本领域中也称为 CCL11)、 CCL12、 CCL13、 CCL14、 CCL15、 CCL16、 CCL17、 CCL18、 CCL19、 CCL20、 CCL21、 CCL22、 CCL23、 CCL24、 CCL25、 CCL26、 CCL27、 CCL28、 CXCL1( 其中 CXCL 是趋化因子 (C-X-C 基序 ) 配体的简称 )、 CXCL2、 CXCL3、 CXCL4、 CXCL5、 CXCL6、 CXCL7、 白介素 (interleukin)-8( 本领域中也称为 CXCL8)、 MIG( 本领域中也 称为 CXCL9)、 IP-10( 本领域中也称为 CXCL10)、 I-TAC( 本领域中也称为 CXCL11)、 SDF-1( 本 领域中也称为 CXCL12)、 BCA-1( 本领域中也称为 CXCL13)、 CXCL14、 CXCL15、 CXCL16、 CXCL17、 XCL1、 XCL2 和 CX3CL1。根据一个实施方式， 该肽可以结合到至少一种选自以下的趋化因子 上： I-TAC( 干扰素可诱导的 T 细胞 α 化学引诱物 )、 IP-10(10kDa 干扰素 γ- 可诱导的蛋 白 )、 MIG(γ 干扰素诱导的单核因子 (monokine))、 MCP-1( 单核细胞趋化蛋白 -1)、 嗜酸性粒细胞趋化因子和 RANTES( 活化后调节的、 正常 T 细胞表达与分泌的 )。
与趋化因子的结合可以通过本领域中已知的任何合适的技术 ( 例如， ELISA) 测 定。 可选地， 该结合是这样的， 以便该肽与趋化因子的结合的解离常数 (Kd) 小于 10-4M， 可选 -5 -6 地小于 10 M， 并可选地小于 10 M。测定解离常数的合适的技术是技术人员已知的。
可以根据本发明实施方式使用的趋化因子结合肽描述在国际专利申请 PCT/ IL03/00155( 以 WO 03/072599 公开 ) 和美国专利 No.7,488,717 中。
在一些实施方式中， 该趋化因子结合肽的长度为 5 ～ 50 个氨基酸， 可选地 5 ～ 40 个氨基酸， 可选地 5 ～ 30 个氨基酸， 可选地 7 ～ 20 个氨基酸， 可选地 9 ～ 20 个氨基酸， 并 可选地为 10 ～ 20 个氨基酸。根据示例实施方式， 该趋化因子结合肽的长度为约 12 个氨基 酸。
可选地， 该趋化因子结合肽选自 SEQ ID NO ： 1 ～ 157。
在一些实施方式中， 该趋化因子结合肽的特征是存在至少 2 个组氨酸残基和整体 带正电荷 (overall positive charge)( 例如， 带正电荷的氨基酸数目多于带负电荷的氨基 酸 )， 其中该肽主要由选自 H、 S、 A、 L、 I、 K、 R、 T 和 P 的氨基酸组成 ( 例如， 该肽的至少 40％， 并可选地至少 50％由前述氨基酸组成 )。 具 有 前 述 特 征 的 肽 实 例 包 括， 但 不 局 限 于， SIFAHQTPTHKN(SEQ ID NO ： 100)、 SIPSHSIHSAKA(SEQ ID NO ： 101)、 SAISDHRAHRSH(SEQ ID NO ： 96)、 SAGHIHEAHRPL(SEQ ID NO ： 95)、 ACHASLKHRC(SEQ ID NO ： 44)、 AHSLKSITNHGL(SEQ ID NO ： 46)、 ESDLTHALHWLG(SEQ ID NO ： 54) 、HSACHASLKHRC(SEQ ID NO ： 69) 、WSAHIVPYSHKP(SEQ ID NO ： 143) 、 YATQHNWRLKHE(SEQ ID NO ： 145)、 CAHLSPHKC(SEQ ID NO ： 1)、 GVHKHFYSRWLG(SEQ ID NO ： 61)、 HPTTPIHMPNF(SEQ ID NO ： 66)、 SVQTRPLFHSHF(SEQ ID NO ： 113)， 和 VHTSLLQKHPLP(SEQ ID NO ： 133)。SIPSHSIHSAKA(SEQ ID NO ： 101)， 在本文称为 “BKT-P2” ， 是示例趋化因子结合 肽。
在一些实施方式中， 该趋化因子结合肽的特征是存在至少 2 个相邻的 ( 邻近的， adjacent) 组氨酸残基和整体带正电荷 ( 例如， 带正电荷的氨基酸数目多于带负电荷的氨 基酸 )， 其中该肽主要由选自 H、 P、 T、 L、 R、 W 和 F 的氨基酸组成 ( 例如， 该肽的至少 40％， 并 可选地至少 50％由前述氨基酸组成 )。
具 有 前 述 特 征 的 肽 实 例 包 括， 但 不 局 限 于， GDFNSGHHTTTR(SEQ ID NO ： 59)、 HHFHLPKLRPPV(SEQ ID NO ： 64)、 HHTWDTRIWQAF(SEQ ID NO ： 65)、 LDYPIPQTVLHH(SEQ ID NO ： 76)、 LLADTTHHRPWP(SEQ ID NO ： 79)、 TRLVPSRYYHHP(SEQ ID NO ： 125)、 CHHNLSWEC(SEQ ID NO ： 7) 和 SFWHHHSPRSPL(SEQ ID NO ： 99)。LDYPIPQTVLHH(SEQ ID NO ： 76) 在本文称为 “BKT-P46” ， 是示例趋化因子结合肽。
可选地， 该趋化因子结合肽具有表现出与选自 SEQ ID NO ： 1 ～ 157( 例如， SEQ ID NO ： 76 和 101) 的氨基酸序列具有至少 70％， 至少 80％， 至少 90％序列同源性的氨基酸序 列。可选地， 该序列同源性至少为 95％。可选地， 该序列同源性为 100％。
同源性可以利用国家生物技术信息中心 (NCBI)BlastP 软件用缺省参数测定。同 源性也可以指缺失、 插入或替换 (substitution) 变体， 包括其氨基酸替换及其具有生物活 性的多肽片段。
如本文使用的 “Fc 结构域” 是指抗体重链区， 典型地包含该重链的至少两个恒定结
构域 (CH2 和 CH3 结构域， 如同本领域中定义的这些术语 )。该 Fc 结构域可以例如以二聚 体形式， 通过用木瓜蛋白酶消化抗体获得。通过二硫键相连的 Fc 结构域多肽的二聚体形成 抗体的 “尾部” 区。如本领域众所周知的， 这些类别的抗体的 Fc 结构域可以是多聚体形式。 因而， 该 Fc 结构域可选地为单聚体， 可选地为二聚体， 并可选地为多聚体。可选地， 本文所 述的多肽是二聚体形式， 该多肽包含 Fc 二聚体， 或者为多聚体形式， 该多肽包含 Fc 多聚体。
该 Fc 结构域可以包括天然 Fc 结构域 ( 即， 抗体中天然存在的结构域 ) 的修饰 形式， 例如， 与天然 Fc 结构域具有至少 90％同源性， 可选地至少 95％同源性， 和可选地至 少 98 ％同源性的多肽。修饰的 Fc 结构域描述在例如国际专利申请 WO 97/34631 和 WO 96/32478 中。
可选地， 对天然 Fc 进行修饰以便除去提供本发明实施方式不需要的结构特征或 生物活性的位点。 此种位点的实例包括， 影响或参与二硫键形成、 与所选宿主细胞的不相容 性、 在所选宿主细胞中表达后 N 末端异质性 (N-terminal heterogeneity)、 糖基化、 与补体 的相互作用、 与 Fc 受体 ( 除了新生儿 Fc 受体 (neonatal Fc receptor)) 的结合， 和 / 或抗 体依赖性细胞毒性的残基。
根据本发明实施方式的多肽也可以包含 Fc 结构域的片段。可选地， 该片段包含如 上文定义的 Fc 结构域的至少 20％， 可选地至少 50％， 和可选地至少 80％。 该 Fc 结构域或其片段可选地包括新生儿 Fc 受体 (FcRn) 的结合位点。
如下面实施例部分中列举的， 根据本发明实施方式的多肽在血液循环中具有相对 长的寿命， 给予后显著水平的多肽在血液中保持至少 11 天。
根据一个实施方式， Fc 结构域或其片段与趋化因子结合肽附接形成体内半衰期比 单独趋化因子结合肽长的多肽。这可能是由于 Fc 结构域的血清半衰期长 ( 这可能是由于 Fc 通过结合到 FcRn 上而被再利用 (salvage))， 和 / 或由于该多肽的尺寸大于该趋化因子 结合肽， 这可以减少肾小球过滤 (glomerular filtration) 对血流的清除 (clearance)。 根 据另一个实施方式， 所形成的多肽与单独趋化因子结合肽相比免疫原性降低。
根据可选的实施方式， 该 Fc 结构域或其片段是人 Fc 结构域 ( 例如， 源自人抗体 ) 或其片段。
根据示例实施方式， 该 Fc 结构域 ( 或其片段 ) 是 IgG( 例如 IgG1)Fc 结构域 ( 或 其片段 )。可选地， 该 Fc 结构域、 或其片段是非糖基化的。
根据示例实施方式， 该 Fc 片段具有与带有 N297A 突变的人 IgG1 Fc 片段相对应的 SEQ ID NO ： 160。
可选地， 该 Fc 结构域 ( 或其片段 ) 的 N 末端附接 ( 直接或通过接头 ) 到趋化因子 结合肽上。该 N 末端可选地附接到至少一个趋化因子结合肽上， 例如， 通过附接到包含至少 一个趋化因子结合肽的序列上。
替换地或另外地， 该 Fc 结构域 ( 或其片段 ) 的 C 末端， 直接或通过接头 ( 例如氨基 酸接头 ) 附接到趋化因子结合肽上。该 C 末端可选地附接到至少一个趋化因子结合肽上。
除了本文所述的趋化因子结合肽和 Fc 结构域或片段之外， 本文所述的多肽可以 进一步包含一个或多个另外的肽序列。此种序列可以可选地选择， 以便提供期望的生物活 性或结构特征， 例如， 可改进该多肽的治疗功效或使该多肽容易生产的活性或特征。
因而， 例如， 该多肽可选地包含至少一个所选的能够指导该多肽的运送 ( 转运，
transport) 的信号肽。
可选地， 选择能够促进表达该多肽的细胞 ( 例如， 哺乳动物细胞 ) 分泌该多肽的信 号肽。
可选地， 包括空泡信号序列 (vacuolar signal sequence)( 针对植物转染产生的 多肽 )。
在示例实施方式中， 该多肽包含 IL-6( 白介素 -6) 信号肽 ( 例如 SEQ ID NO ： 161)， 或具有表现出与 IL-6 信号肽具有至少 90％同源性 ( 可选地至少 95％同源性 ) 的氨基酸序 列的信号肽。
上述另外的肽序列 ( 例如， 信号肽 ) 可以存在于该多肽的 N 末端， 或该多肽的 C 末 端， 或者该多肽的中间 ( 例如， 在 Fc 结构域或片段和趋化因子结合肽之间， 或者在两个趋化 因子结合肽之间 )。
因而， 本文所述的 Fc 结构域或片段、 一个趋化因子结合肽 ( 或多个趋化因子结合 肽 ) 和任意一个另外的肽 ( 或任意多个另外的肽 )( 如果存在 ) 可以在该多肽内以任何顺 序彼此附接。
该 Fc 结构域或片段、 一个趋化因子结合肽 ( 或多个趋化因子结合肽 ) 和任意一个 另外的肽 ( 或任意多个另外的肽 )( 如果存在 ) 直接或通过接头 ( 例如氨基酸接头 ) 独立 地彼此附接。 然而， 一些信号肽的活性取决于所处在多肽内的特定区域 ( 例如， N 末端、 C 末端 )。 因此， 根据一些实施方式， 信号肽位于该多肽内特定区域处。
根据示例实施方式， 该信号肽 ( 例如， IL-6 信号肽 ) 在该多肽的 N 末端。N 末端具 有信号肽的多肽实例包括下式多肽 ：
W-X-Z、 W-X-Y-Z、 W-Y-X-Z、 W-Y-X-Y-Z、 W-Z-X、 W-Z-Y-X、 W-Y-Z-X 和 W-Y-Z-Y-X，
其中 W 是信号肽， X 是趋化因子结合肽， Y 是接头 ( 例如， 氨基酸接头 )， Z 是 Fc 结 构域或片段。根据示例实施方式， 该多肽具有上式 W-X-Y-Z。
该接头 ( 也称为 “间隔子” ) 可选地为包含氨基酸、 二肽、 三肽， 或 4 个或更多氨基 酸的氨基酸接头。此种接头是有利的， 因为它们使该多肽能够包含单个连续 (contiguous) 多肽链， 该单个连续多肽链容易作为融合蛋白生产。 该接头典型地这样选择， 以便它不干扰 趋化因子结合肽与其靶趋化因子的结合。可选地， 该接头是由 4 ～ 10 个氨基酸组成的肽 ( 例如， 六肽 )。根据示例实施方式， 该接头是 SEQ ID NO ： 162 中列出的肽。在包含多于一 个的接头的实施方式中， 该接头可以彼此相同或不同。
根据本发明优选的实施方式， 该多肽能够结合到至少一个趋化因子上 ( 例如， 经 由该多肽中的趋化因子结合肽与该趋化因子的相互作用 )。多肽与趋化因子的结合在许多 情况下都会影响趋化因子 ( 例如， I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞趋化因子和 / 或 RANTES) 结合到趋化因子受体上的能力。
因此， 在一些实施方式中， 该多肽的特征是具有能够抑制至少一种趋化因子与趋 化因子受体结合的能力。可选地， 结合的抑制是这样的， 即， 在存在该多肽的情况下的解离 常数 ( 针对趋化因子与受体的结合 ) 比在缺少该多肽的情况下的解离常数高至少 10％， 可 选地至少 100％。
在一些实施方式中， 该多肽的特征是具有能够增强至少一种趋化因子与趋化因子
受体结合的能力。可选地， 结合的增强是这样的， 即， 在存在该多肽的情况下的解离常数 ( 针对趋化因子与受体的结合 ) 比在缺少该多肽的情况下的解离常数低至少 10％， 可选地 至少 50％。
应理解， 根据本发明实施方式的多肽可以可选地抑制至少一种趋化因子与趋化因 子受体结合， 也可以增强至少一种其它趋化因子与趋化因子受体结合。
如本文使用的术语 “多肽” 包括天然多肽 ( 例如， 降解产物、 以合成方式合成的多 肽或重组多肽 ) 和模拟肽 ( 典型地为以合成方式合成的 )， 以及类肽 (peptoids) 或半类肽 (semipeptoids)， 类肽或半类肽是多肽类似物， 可以具有例如使该多肽在身体内更稳定或 更能够透入细胞中的修饰。 此种修饰包括， 但不局限于， N′末端修饰， C′末端修饰， 多肽键 修饰， 包括但不局限于， CH2-NH、 CH2-S、 CH2-S ＝ O、 O ＝ C-NH、 CH2-O、 CH2-CH2、 S ＝ C-NH、 CH ＝ CH 或 CF ＝ CH， 主链修饰和残基修饰。 制备模拟肽化合物的方法在本领域中是熟知的， 明确说明在例如 Quantitative Drug Design， C.A.Ramsden Gd.， Chapter 17.2， F.Choplin Pergamon Press(1992) 中。
该 多 肽 内 的 多 肽 键 (-CO-NH-) 可 以 被 例 如 N- 甲 基 化 键 (-N(CH3)-CO-)、 酯键 (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、 酮 亚 甲 基 键 (-CO-CH2-)、 α- 氮 杂 键 (-NH-N(R)-CO-) 替 换， 其 中 R 是 任 何 烷 基， 例 如， 甲 基、 carba 键 (-CH2-NH-)、 羟 基 亚 乙 基 键 (-CH(OH)-CH2-)、 硫 代 酰 胺 键 (-CS-NH-)、 烯 烃 双 键 (-CH ＝ CH-)、 逆 向 酰 胺 键 (-NH-CO-)、 多肽衍生物 (-N(R)-CH2-CO-)， 其中 R 是天然出现在碳原子上的 “正 (normal)” 侧链。
这些修饰可以发生在沿着多肽链的任何键上， 甚至同时出现在数个 ( 例如 2-3 个 ) 键上。
可以用天然芳香族氨基酸， Trp、 Tyr 和 Phe 替换合成的非天然酸如苯基甘氨酸、 1， 2， 3， 4- 四氢异喹啉 -3- 羧酸 (TIC)、 萘基丙氨酸 (Nal)、 Phe 的环甲基化衍生物、 Phe 的卤化 衍生物或 o- 甲基 -Tyr。
本文所述的天然存在的肽和多肽 ( 例如， Fc 结构域序列、 信号肽 ) 的氨基酸序列， 可以是天然存在的蛋白质中多肽的氨基酸序列或者包含保守性或非保守性替换的那些。
如本文使用的 “保守性替换” 是指用天然或非天然存在的氨基酸或具有相似空间 特性 (steric properties) 的模拟肽替换该肽天然序列中存在的氨基酸。如果待替换天然 氨基酸的侧链是极性或疏水性的， 那么保守性替换应当用也是极性或疏水性的 ( 除了具有 与被替换氨基酸侧链具有相同的空间特性之外 ) 天然存在的氨基酸、 非天然存在的氨基酸 或模拟肽部分进行替换。
因为天然存在的氨基酸通常是根据它们的特性分类的， 所以容易确定用天然存在 的氨基酸进行的保守性替换， 只要记住按照本发明带电氨基酸被空间上类似的不带电氨基 酸的替换被认为是保守性替换。
对于用非天然存在的氨基酸进行保守性替换， 也可以使用本领域熟知的氨基酸类 似物 ( 合成氨基酸 )。天然存在的氨基酸的模拟肽明确记载在技术人员已知的文献中。
当进行保守性替换时， 替换氨基酸的侧链上应当具有与原始氨基酸侧链的相同或 相似的官能团。
如本文使用的术语 “非保守性替换”是指用另一种具有不同电化学和 / 或空 间特性的天然存在或非天然存在的氨基酸替换如亲本序列 (parent sequence) 中存在的氨基酸。因而， 替换氨基酸的侧链可以显著地大于 ( 或小于 ) 被替换天然氨基酸的 侧链， 和 / 或可以具有电特性显著地不同于被替换氨基酸的官能团。这类非保守性替 换的实例包括用苯丙氨酸或环己基甲基甘氨酸替换丙氨酸、 用异亮氨酸替换甘氨酸， 或 用 -NH-CH[(-CH2)5COOH]-CO- 替换天冬氨酸。 落在本发明范围内的那些非保守性替换， 是还 构成具有天然肽活性的肽或多肽的那些 ( 例如， Fc 结构域序列、 信号肽 )。
如本说明书和下面权利要求部分中使用的， 术语 “一种氨基酸” 或 “多种氨基酸” 应理解成包括 20 种天然存在的氨基酸 ； 体内翻译后通常被修饰的那些氨基酸， 包括， 例如， 羟基脯氨酸、 磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸 ； 以及其它不寻常氨基酸， 包括但不局限于， 2- 氨基 己二酸、 羟基赖氨酸、 异锁链素 (isodesmosine)、 正缬氨酸 (nor-valine)、 正亮氨酸和鸟氨 酸。此外， 术语 “氨基酸” 包括 D- 和 L- 氨基酸。
下表 1 和 2 列出可以与本发明一起使用的天然存在的氨基酸 ( 表 1) 和非常规或 修饰的氨基酸 ( 表 2)。
表1
氨基酸 丙氨酸 精氨酸 天冬酰胺 天冬氨酸 半胱氨酸 谷氨酰胺 谷氨酸 甘氨酸 组氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 赖氨酸 蛋氨酸 苯丙氨酸 三个字母的缩写 Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Iie Leu Lys Met Phe 单字母符号 A R N D C Q E G H I L K M F15CN 102482324 A 脯氨酸 丝氨酸 苏氨酸 色氨酸 酪氨酸 缬氨酸 任何上述氨基酸
说Pro Ser Thr Trp Tyr Val Xaa明书P S T W Y V X12/39 页表2
优选利用重组技术制取本发明多肽， 因为这些技术更适合于制取相对长的多 肽 ( 例如， 长于 20 个氨基酸 ) 以及它的大批量生产。此种重组技术描述在下列文献中 ：
Bitter 等人， (1987)Methods in Enzymol.153 ： 516-544， Studier 等人 (1990)Methods in Enzymol.185 ： 60-89， Brisson 等 人 (1984)Nature 310 ： 511-514， Takamatsu 等 人 (1987) EMBO J.6 ： 307-311， Coruzzi 等 人 (1984)EMBO J.3 ： 1671-1680， Brogli 等 人， (1984) Science 224 ： 838-843， Gurley 等人 (1986)Mol.Cell.Biol.6 ： 559-565 and Weissbach & Weissbach， 1988， Methods for Plant Molecular Biology， Academic Press， NY， Section VIII， pp 421-463。
为了利用重组技术生产本发明多肽， 将编码本发明多肽的多核苷酸连接到核酸表 达载体中， 该核酸表达载体包含在适合于指导本发明多肽在宿主细胞中的组成型、 组织特 异性或诱导型转录的顺式调节序列 ( 例如， 启动子序列 ) 的转录调控下的多核苷酸序列。
可用于表达趋化因子结合肽的分离多核苷酸实例在 SEQ ID NO ： 163 和 164 中列 出。可用于表达 Fc 片段的分离多核苷酸序列实例为如 SEQ ID NO ： 165 中所列出的。可用 于表达 IL-6 信号肽的分离多核苷酸实例在 SEQ ID NO ： 166 中列出。可用于表达接头的分 离多核苷酸实例在 SEQ ID NO ： 167 中列出。
可用于表达根据本发明一些实施方式的多肽的示例多核苷酸序列在 SEQ ID NO ： 168 和 169 中列出。
短语 “分离多核苷酸 ( 分离的多核苷酸， isolated polynucleotide)” 是指分离并 以 RNA 序列、 互补多核苷酸序列 (cDNA)、 基因组多核苷酸序列和 / 或复合多核苷酸序列 ( 例 如， 上述组合 ) 形式提供的单链或双链核酸序列。
如本文使用的， 短语 “互补多核苷酸序列” 是指利用逆转录酶或任何其它 DNA- 依 赖性 DNA 聚合酶使信使 RNA 逆转录形成的序列。此种序列随后可以利用 DAN 依赖性 DNA 聚 合酶在体内或体外扩增。
如本文使用的， 短语 “基因组多核苷酸序列” 是指从染色体中衍生 ( 分离 ) 的序列， 因而代表染色体的连续部分 (contiguous portion)。
如 本 文 使 用 的，短 语 “复 合 多 核 苷 酸 序 列 (composite polynucleotide sequence)” 是指至少部分互补和至少部分基因组的序列。 复合序列可以包括编码本发明多 肽所需的一些外显子 (exonal) 序列， 以及介于其间的内含子序列。该内含子序列可以是任 何来源的， 包括其它基因， 典型地包括保守性剪接信号序列。 此种内含子序列可以进一步包 括顺式作用的表达调节元件。
如所述的， 本发明实施方式的多核苷酸可以进一步包含编码针对多肽分泌的信号 肽 ( 如上文所讨论的 ) 的信号序列。
在表达和分泌之后， 可选地从形成成熟多肽的前体蛋白中除去信号肽。
本发明多核苷酸可以利用例如本文下面实施例 1 中描述的 PCR 技术， 或本领域中 已知的用于连接两种不同 DNA 序列的任何其它方法或程序 ( 步骤， procedure) 制备。参 见， 例如， “Current Protocols in Molecular Biology” ， eds.Ausubel 等人， John Wiley & Sons， 1992。
如上文所述的， 本发明多核苷酸序列典型地插入在表达载体 ( 即， 核酸构建体 ) 中 从而使重组多肽能被表达。本发明实施方式的表达载体包括使这种载体适合于在原核生 物、 真核生物， 或优选二者 ( 例如， 穿梭载体 (shuttle vectors)) 中复制和整合的另外序 列。典型的克隆载体包含转录和翻译起始序列 ( 例如， 启动子、 增强子 ) 以及转录和翻译终止子 ( 例如， 多聚腺苷化信号 )。
真核启动子典型地包含两类识别序列， TATA 框和上游启动子元件。TATA 框位于转 录起始点上游 25 ～ 30 个碱基对处， 被认为参与指导 RNA 聚合酶开始 RNA 的合成。其它上 游启动子元件决定转录起始速率。
与同源或异源启动子连接时， 增强子元件可促进转录提升至 1,000 倍。增强子 在处于转录起始点上游或者下游的时候是具有活性的。源自病毒的许多增强子元件具有 宽广的宿主范围， 并在多种组织中具有活性。例如， SV40 早期基因增强子适合于许多细胞 类型。适合于本发明的其它增强子 / 启动子组合包括来源于多瘤病毒 (polyoma virus)、 人或鼠巨细胞病毒 (cytomegalovirus， CMV) 的那些， 以及来自各种逆转录病毒如鼠白血 病病毒、 鼠或 Rous 肉瘤病毒和 HIV 的长末端重复序列。参见 Enhancers and Eukaryotic Expression， Cold Spring Harbor Press， Cold Spring Harbor， N.Y.1983， 该文献通过引 用合并在此。
在构建表达载体时， 优选将启动子设置成与异源转录起始位点的距离和它在自然 环境下与转录起始位点的距离近似相同。 然而， 如本领域众所周知的， 在不损坏启动子功能 的情况下可以对这个距离的各种变化进行调节。
除了已描述的元件以外， 本发明的表达载体还可典型地包含其它旨在提高克隆核 酸的表达水平或使携带重组 DNA 的细胞的鉴定易于进行的特定元件。例如， 许多动物病毒 包含促进病毒基因组在允许的细胞类型中进行额外染色体复制的 DNA 序列。携载这些病毒 复制子的质粒可以游离地复制 ( 作为附加体地复制， replicated episomally)， 只要质粒上 携带的基因或宿主细胞基因组的基因能够提供合适的因子即可。
该载体可以包括或可以不包括真核复制子。如果存在真核复制子， 则该载体可利 用合适的可选标记 (selectable marker) 在真核细胞中扩增。如果该载体不包含真核复制 子， 则无法进行游离型扩增 (episomal amplification)。 相反， 重组 DNA 整合到工程细胞的 基因组中， 其中启动子指导期望核酸的表达。
本发明的表达载体可以进一步包括， 另外的允许例如从单一 mRNA 如内核糖体进 入位点 (internal ribosome entry site， IRES) 翻译数种蛋白质的多核苷酸序列和供启动 子嵌合多肽基因组整合用的序列。
哺 乳 动 物 表 达 载 体 的 实 例 包 括， 但 不 限 于， 可 从 Invitrogen 获 得 的 pcDNA3、 pcDNA3.1(+/-)、 pGL3、 pZeoSV2(+/-)、 pSecTag2、 pDisplay、 pEF/myc/cyto、 pCMV/myc/cyto、 pCR3.1、 pSinRep5、 DH26S、 DHBB、 pNMT1、 pNMT41、 pNMT81， 可从 Promega 获得的 pCI， 可从 Strategene 获得的 pMbac、 pPbac、 pBK-RSV 和 pBK-CMV， 可从 Clontech 获得的 pTRES， 和它 们的衍生物。
也可以使用包含来自于真核病毒如逆转录病毒的调节元件的表达载体。 SV40 载体 包括 pSVT7 和 pMT2。源于牛乳头瘤病毒的载体包括 pBV-1MTHA， 源于艾伯斯坦 - 巴尔病毒 + 的载体包括 pHEBO 和 p2O5。其它示例载体包括 pMSG、 pAV009/A 、 pMTO10/A+、 pMAMneo-5、 杆 状病毒 pDSVE， 和任何其它允许蛋白表达在 SV-40 早期启动子、 SV-40 晚期启动子、 金属硫蛋 白启动子 (metallothionein promoter)、 鼠乳腺肿瘤病毒启动子、 Rous 肉瘤病毒启动子、 多 角体蛋白启动子 (polyhedrin promoter) 或其它对真核细胞的表达有效的启动子的指导下 进行的载体。病毒是非常专一的感染原， 它们已在许多情况下发生演变 ( 进化， evolve) 从而 逃避宿主防御机制。典型地， 病毒感染特定细胞类型并在其中繁殖。病毒载体的靶向特异 性利用它的天然特异性而特异性地靶向预定细胞类型， 从而将重组基因导入到受感染细胞 中。因此本发明使用的载体类型将取决于转化的细胞类型。
重组病毒载体对本发明实施方式的多肽表达有用， 因为它们具有诸如横向感染 (lateral infection) 的优点。横向感染是例如逆转录病毒生命周期中固有的， 是单一受 感染细胞产生很多可出芽并感染邻近细胞的子代病毒粒子的过程。结果是大面积迅速受 到感染， 其大部分最初并不是通过原始病毒颗粒感染的。这与纵向型感染 (vertical-type infection) 形成对比， 在纵向型感染中感染原仅通过母系子代 (daughter progeny) 传播。 也可生产不可横向传播的病毒载体。 如果期望目的是将特定基因导入到有限数目的靶细胞 中， 则这种性质可能是有用的。
多种原核或真核细胞可用作表达本发明多肽的宿主表达系统。这些包括， 但不限 于， 微生物， 如用包含多肽编码序列的重组细菌噬菌体 DNA、 质粒 DNA 或粘粒 DNA 表达载体转 化的细菌 ( 例如， 大肠杆菌， 包括但不局限于大肠杆菌菌株 BL21(DE3)plysS、 BL21， (DE3)RP * 和 BL21 以及枯草杆菌 )， 用包含多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母， 用包含多 肽编码序列的重组病毒表达载体 ( 如花椰菜花叶病毒， CaMV ； 烟草花叶病毒， TMV) 感染或用 包含多肽编码序列的重组质粒表达载体如 Ti 质粒转化的植物细胞系统。
有多种方法可以用来将本发明表达载体导入到宿主表达系统细胞中。 此种方法一 般地描述在以下文献中 ： Sambrook 等人， Molecular Cloning ： ALaboratory Manual， Cold Springs Harbor Laboratory， New York(1989， 1992)， in Ausubel 等人， Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley and Sons， Baltimore， Md.(1989)， Chang 等 人， Somatic Gene Therapy， CRC Press， Ann Arbor， Mich.(1995)， Vega 等人， Gene Targeting， CRC Press， Ann Arbor Mich.(1995)， Vectors ： A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses， Butterworths， Boston Mass.(1988)and Gilboa et at.[Biotechniques 4(6) ： 504-512， 1986]， 并包括例如， 用重组病毒载体进行的稳定或短暂转染、 脂质转染、 电 穿孔和感染。另外， 对于正 - 负选择方法参见美国专利 No.5,464,764 和 5,487,992。
通过病毒感染导入核酸具有优于其它方法如脂质转染和电穿孔的数个优点， 因为 病毒的感染性质而可以获得更高的转染效率。
本发明多肽的核酸序列可以针对在特定宿主细胞中的表达进行优化。 此种序列修 饰的实例包括， 但不局限于， 改变 G/C 含量至更接近感兴趣物种中通常发现的， 和除去非典 型地在物种中发现的密码子， 通常称为密码子优化。
短语 “密码子优化” 是指选择合适的 DNA 核苷酸用于接近感兴趣物种内密码子使 用的结构基因或其片段内。因此， 优化的基因或核酸序列是指为了利用所选物种内统计 学上优选或统计学上偏好的密码子已经将其中天然或天然产生的基因的核苷酸序列进行 修饰的基因。通常在 DNA 水平上检测核苷酸序列， 并使用任何合适的程序测定针对在物 种中的表达进行优化的编码区， 这些方法如 Sardana 等 (1996， Plant Cell Reports 15 ： 677-681) 中所述的。 在这种方法中， 可以计算密码子使用的标准偏差， 密码子偏好的量度标 准， 首先发现天然基因每个密码子的使用相对于所选物种高度表达的基因的比例方差， 接 着计算均方差。所用公式是 ： 1SDCU ＝ n ＝ 1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N， 其中 Xn 是指高度表达的基因中的密码子的使用频率 n， 其中 Yn 是指目标基因中的密码子的使用频率 n， N 是指感兴趣 基因中的密码子总数。
根据特定细胞类型的优选密码子使用， 优化核酸序列的一种方法是基于密码子 优化表的直接使用， 无需进行任何额外的统计学计算， 密码子优化表为， 例如通过日本的 NIAS( 农业生物科学研究所 )DNA 库在密码子使用数据库在线提供的那些 (http://www. kazusa.or.jp/condon/)。 密码子使用数据库含有供许多不同物种用的密码子使用表， 已经 基于 Genbank 中呈现的数据在统计学上测定了每个密码子使用表。
通过使用上述表来测定特定物种中每个氨基酸的最优选或最偏好的密码子， 编码 感兴趣蛋白的天然存在的核苷酸序列对于该特定物种是密码子优化的。 这可以通过用关于 氨基酸在统计学上更偏好的相应密码子替代特定物种基因组中具有低统计学发生率的密 码子来实现。 然而， 可以选择一个或多个不太偏好的密码子来删除现有的限制位点， 从而在 潜在有用的连接处 (5’ 和 3′端从而添加信号肽或终止盒 (termination cassettes)， 可以 用来切割或剪接片段来产生正确全长序列的内部位点 ) 创建新的限制位点， 或除去负面影 响 mRNA 稳定性或表达的核苷酸序列。
在任何修饰之前， 天然存在的编码核苷酸序列可能已经含有许多对应于特定物种 中统计学上偏好的密码子。因此， 天然核苷酸序列的密码子优化可以包括测定天然核苷酸 序列内哪个密码子对于特定物种不是统计学上偏好的， 和根据特定物种的密码子使用表对 这些密码子进行修饰从而产生密码子优化的衍生物。 修饰核苷酸序列对于特定物种的密码 子使用可以是全部或部分优化的， 只要修饰核苷酸序列编码的蛋白质是以高于相应天然存 在的或天然的基因编码的蛋白质的水平产生的即可。 通过改变密码子使用构建合成基因描 述于例如 PCT 专利申请 93/07278 中。
因此， 本发明包括上文所述的核酸序列、 其片段、 可与其杂交的序列、 与其同源的 序列、 与其直系同源 (orthologous) 的序列、 编码具有不同密码子使用的相似多肽的序列、 特征在于突变的改变序列， 该突变为， 例如一个或多个核苷酸的缺失， 插入或替换， 其是天 然发生的或人工诱导的， 随机或以有目标的方式进行的。
独立于宿主细胞系统， 应理解除了包含用于转录和翻译所插入编码序列 ( 编码该 多肽 ) 的必需元件， 本发明表达构建体还可以包括设计用于优化所表达多肽的稳定性、 生 产、 纯化、 产率或活性的序列。
在允许表达大量重组多肽的有效条件下培养所转化细胞。有效培养条件包括， 但 不局限于， 允许生产蛋白质的有效培养基、 生物反应器、 温度、 pH 和氧气条件。有效培养基 是指可培养细胞生产本发明重组多肽的任何培养基。此种培养基典型地包括具有可同化 碳、 氮和磷酸酯来源， 以及适当的盐、 矿物质、 金属和其它营养物如维生素的水溶液。 本发明 细胞可以在常规发酵生物反应器、 摇瓶、 试管、 微量滴定盘 (microtiter dishes) 和培养皿 (petri plates) 中培养。培养可以在适合于重组细胞的温度、 pH 和氧含量条件下执行。此 种培养条件在技术人员的技能范围内。
根据用于生产的载体和宿主系统， 本发明所得多肽可以保留在重组细胞中、 分 泌 到 发 酵 培 养 基 中、 分 泌 到 两 个 细 胞 膜 之 间 的 间 隙， 如大肠杆菌的细胞周质间隙 (periplasmic space) 中， 或者保留在细胞或病毒膜表面上。
培养预定时间之后， 对重组多肽进行回收。本文使用的短语 “回收重组多肽” 是指收集包含多肽的全部发酵培养基， 并不意味 着需要额外的分离或纯化步骤。
因而， 本发明多肽可利用多种标准蛋白纯化技术进行纯化， 如， 但不限于， 亲 和 色 谱 法、 离 子 交 换 色 谱 法、 过 滤、 电 泳、 疏 水 作 用 色 谱 法 (hydrophobic interaction chromatography)、 凝胶过滤色谱法、 反相色谱法、 伴刀豆球蛋白 A 色谱法 (concanavalin A chromatography)、 色谱聚焦和差别溶解 (differential solubilization)。
本实施方式的多肽可以通过亲和色谱法常规纯化。蛋白质 A 作为亲和配体的适 合性取决于物种和用在嵌合体中的免疫球蛋白 Fc 结构域的同种型 (isotype)。蛋白质 A 可以用于纯化基于人 γ1、 γ2 或 γ4 重链的嵌合分子 [Lindmark 等人， J.Immunol.Meth.， 62 ： 1-13(1983)].Protein G is preferably used for all mouse isotypes and for humanγ3[Guss 等人， EMBO J.， 5： 1567-1575(1986)]。亲和配体附着的固体载体最经常为 琼脂糖， 但也可以利用其它固体载体。机械稳定的固体载体， 如可控多孔玻璃 (controlled pore glass) 或聚 ( 苯乙烯二乙烯基 ) 苯， 可以获得较琼脂糖可以实现的更快的流速和更 短的加工时间。使嵌合分子结合到蛋白质 A 或 G 亲和柱上的条件完全由 Fc 结构域的特性， 即， 它的物种和同种型控制。一般地， 当选择适当的配体时， 高效结合直接在非条件培养液 中进行。本发明这个方面的结合多肽可以在酸性 pH(3.0 或高于 3.0) 下， 或在含有温和离 液盐 (chaotropic salt) 的中性 pH 缓冲液中高效地洗脱。这个亲和色谱分离步骤可以使 多肽制品纯度＞ 95％。 可以针对蛋白质 A 或 G 使用本领域中已知的其它方法代替亲和色谱法， 或与亲 和色谱法一并纯化本发明实施方式的多肽。例如， 预期该多肽的性质类似于亲硫凝胶色 谱 (thiophilic gel chromatography) 分离的抗体 [Hutchens 等人， Anal.Biochem.， 159 ： 217-226(1986)]and immobilized metal chelate chromatography[Al-Mashikhi et al.， J.Dairy Sci.， 71 ： 1756-1763(1988)]。
为了便于回收， 可以将所表达的编码序列设计成编码本发明多肽和融合的可切割 部分， 例如组氨酸。 此种融合蛋白可以设计成这样的， 以便该多肽可以容易地通过亲和色谱 分离， 例如， 通过固定在对可切割部分有特异性的柱子上。
如果切割位点设计在多肽和可切割部分之间， 那么通过用特异性切割这个位 点 处的融 合 蛋 白 的 适当的 酶或药 剂进行处理可 以使该色 谱柱释放该多 肽 [ 例如， 参 见 Booth 等 人， Immunol.Lett.19 ： 65-70(1988) ； 和 Gardella 等 人， J.Biol.Chem.265 ： 15854-15859(1990)]。
本发明多肽优选以 “基本纯” 的形式收回。
如本文使用的短语 “基本纯” 是指允许该多肽有效地用于本文所述的应用中的纯 度。
除了可以在宿主细胞中合成之外， 本发明多肽也可以利用体外表达系统合成。这 些方法是本领域熟知的， 并且该系统的组分是可商购获得的。
该多肽可以按原样使用， 或进一步修饰。
例如， 可以通过将水溶性聚合物 ( 例如， 聚乙二醇 ) 附接到该多肽上， 对该多肽进 行修饰。 此种水溶性聚合物的附接可以改进该多肽的生物活性， 例如， 通过提高该多肽的溶 解性， 降低该多肽的毒性， 延长该多肽的循环半衰期 ( 例如， 通过降低肾小球过滤 )， 和/或
保护该多肽免受蛋白水解降解进行。
因此， 根据本发明的可选实施方式， 将本文所述的多肽附接到水溶性聚合物上。 聚 乙二醇是合适的水溶性聚合物。适合 ( 例如， 无毒 ) 附接到用于药物给予的多肽上的另外 水溶性聚合物对于本领域技术人员而言是明显的。
该水溶性聚合物可以附接到该多肽的任何部分上 ( 直接或经由接头 )。 可选地， 该 水溶性聚合物附接到除趋化因子结合肽以外的多肽部分上， 以便不干扰其趋化因子结合活 性。
如本文所述和下面实施例部分列举的， 本文所述的多肽对调节趋化因子活性有 效， 其可以具有许多有利的治疗应用。因而， 本文提供了用于调节趋化因子活性和 / 或治疗 多种医学病症的新型高效方法。
因此， 在本发明实施方式的一个方面， 提供了调节趋化因子 ( 例如， I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞趋化因子和 / 或 RANTES) 的生物效应的方法， 该方法包括向需要 其的受验者给予治疗有效量的本文所述的多肽 ( 例如， 本文所述的修饰或未修饰多肽 )。
如本文使用的术语 “方法” 是指用于完成给定任务的方式、 方法、 技术和程序， 包括 但不限于， 化学、 药学、 生物学、 生物化学和医学领域技术人员已知， 或易于从已知方式、 方 法、 技术和程序开发出的那些方式、 方法、 技术和程序。
如下面实施例部分证明的， 本文所述的多肽可以用于治疗多种医学病症。可以通 过包含向需要其的受验者给予本文所述的多肽 ( 例如， 本文所述的修饰或未修饰多肽 ) 的 方法， 治疗该病症。 可以根据本发明实施方式治疗的病症实例包括， 但不局限于， 炎症、 过敏 症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺 血。
可选地， 给予包含静脉给予、 口服给予、 皮下给予、 局部给予和 / 或鼻内给予。
应理解， 本文所述的多肽的 Fc 结构域或片段与单独的趋化因子结合肽相比可以 提供较长的多肽循环半衰期。由于半衰期较长， 所以可以以较小的给予频率在体内维持治 疗有效水平的多肽。
因此， 根据一些实施方式， 给予每周进行不多于一次， 可选地每月进行不多于两 次， 可选地每月进行不多于一次， 可选地每两个月进行不多于一次， 可选地每三个月进行不 多于一次， 和可选地每六个月进行不多于一次。
在替换实施方式中， 单次给予足以获得期望的治疗效果。
类似地， 根据本发明一些实施方式的方面， 提供了如本文所述的多肽 ( 例如， 本文 所述的修饰或未修饰多肽 ) 在制造用于调节 ( 例如， 如本文所述的抑制和 / 或增强 ) 趋化 因子 ( 例如， I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞趋化因子和 / 或 RANTES) 生物效应的 药物中的用途。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了本文所述的多肽 ( 例如， 本文所述的修 饰或未修饰多肽 ) 在制造用于治疗选自以下的病症的药物中的用途 ： 炎症、 过敏症、 迟发型 超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑 狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
如本文使用的， 术语 “治疗” 包括阻断、 基本抑制、 慢化 ( 减缓， slowing) 或逆转病 症的进展， 基本改善病症的临床或美学 (aesthetical) 症状， 或者基本阻止病症的临床或 美学症状出现。
待治疗受验者可以是人或非人动物。优选地， 该受验者是哺乳动物。在一些实施 方式中， 该受验者是人。
利用如本文所述的多肽进行的治疗可以单独提供， 或者与已知对治疗特定疾病有 用的其它药剂一起提供。 本文所述的药物和药物组合物可以可选地进一步包含一种或多种 此类药剂。
可选地， 本文所述的药剂调配用于静脉、 口服、 皮下、 局部给予和 / 或鼻内给予。
可以根据本文所述的本发明实施方式调节的趋化因子的生物效应的实例包括， 但 不局限于， 炎性效应、 细胞迁移、 肿瘤生长和癌转移。
在本文所述的本发明任何方面， 调节生物效应可以包含抑制或增强生物效应。在 示例实施方式中， 调节包含抑制。可选地， 抑制至少一种趋化因子的生物效应， 并增强另外 的趋化因子的生物效应。
在本文所述的方法和用途的任何一个中， 该多肽可以单独使用， 或者， 优选地， 用 作进一步包含药学可接受载体的药物组合物的一部分。
因而， 根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含如本文所述的多肽和药学可 接受载体的药物组合物。
在一些实施方式中， 该组合物包装在包装材料中， 并以印刷形式在该包装材料中 或上标识用于调节如本文所述的趋化因子 ( 例如， I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞 趋化因子和 / 或 RANTES) 的生物效应。
在一些实施方式中， 该组合物包装在包装材料中， 并以印刷形式在该包装材料中 或上标识用于治疗选自以下的病症 ： 炎症、 过敏症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体 移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑 病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
在本发明各个方面， 本文所述的多肽可以照原样或以其药学可接受盐形式给予或 以其它方式利用。
短语 “药学可接受盐” 是指带电荷的母体化合物和其反离子， 其典型地用于改进母 体化合物的溶解性和 / 或降低母体化合物对生物体造成的任何显著刺激， 同时不阻断所给 予化合物的生物活性和特性。
合适的给予途径可以， 例如包括吸入、 口服、 颊部、 直肠、 经粘膜、 经真皮、 真皮内、 经鼻、 肠和 / 或肠胃外途径， 肌内、 皮下和 / 或髓内注射途径， 鞘内、 直接心室内、 静脉、 腹膜 内、 鼻内和 / 或眼内注射途径， 和 / 或直接注入受验者组织区域的途径。 在可选实施方式中， 使用静脉途径、 口服途径、 皮下途径、 局部途径和 / 或鼻内途径。
对于皮肤疾病和障碍 ( 例如， 银屑病、 皮肤过敏症、 皮肤超敏反应 )， 可选地使用局 部给予， 例如， 利用调配用于局部给予的乳膏、 洗液、 凝胶或粉末。
本文所述的方法、 组合物和用途利用治疗有效量的多肽。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
对于用在本发明方法和用途中的任何制剂， 治疗有效量或剂量可以根据体外试验 进行初始估计。 例如， 可以在动物模型中调配剂量， 此种信息可以用于更准确地确定对人有 用的剂量。
本文描述的活性成分的毒性和治疗效能可通过体外、 细胞培养物或实验动物中的 标准药物程序来确定。可利用从这些体外和细胞培养物分析及动物研究中获得的数据， 调 配用于人的剂量范围。该剂量可随着采用的剂型和利用的给予途径而改变。确切的制剂、 给予途径和剂量可由个人医生根据患者的病症加以选择 ( 参见如 Fingl 等人， 1975， ″ The Pharmacological Basis of Therapeutics″， Ch.1 p.1)。
给药可以是单次给予或多次给予， 如本文所述的。
如本文所述的包含一种或多种多肽的药物组合物可以通过本领域熟知的工艺制 造， 如通过常规的混合、 溶解、 造粒、 包糖衣 (dragee-making)、 研粉 (levigating)、 乳化、 作 成胶囊 ( 囊封， encapsulating)、 包埋 (entrapping) 或冷冻干燥工艺。
根据本发明实施方式使用的药物组合物可用常规方法利用一种或多种使活 性成分容易加工成可以药用的制剂的生理可接受载体 ( 包含赋形剂和辅助物 ( 辅剂， auxiliaries)) 调配。合适的剂型取决于所选的给予途径。
对于注射， 该活性成分可以调配在水溶液中， 优选在生理相容性缓冲液如汉克斯 溶液 (Hank’ s 溶液 )、 林格溶液 (Ringer’ s 溶液 )， 或生理盐缓冲液中。
对于口服给予， 该化合物可以容易地通过将活性化合物与本领域熟知的药学可接 受载体相结合而调配。 此类载体使本发明化合物能够调配成供患者口服摄取的片剂、 丸剂、 糖衣丸、 胶囊、 液体、 凝胶、 糖浆剂、 浆液、 混悬剂等。 口服使用的药物制剂可利用固体赋形剂 制造， 可选地研磨所得混合物， 需要时可加入合适的辅助物并在此后对颗粒混合物进行加 工， 从而获得片剂或糖衣核 (dragee cores)。 合适的赋形剂为， 特别是， 填充剂如糖类， 包括 乳糖、 蔗糖、 甘露醇或山梨醇， 纤维素制品如， 玉米淀粉、 小麦淀粉、 大米淀粉、 马铃薯淀粉、 明胶、 黄蓍树胶、 甲基纤维素、 羟丙甲基纤维素、 羧甲基纤维素钠， 和 / 或生理上可接受的聚 合物如聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)。如果需要， 可加入崩解剂， 如交联的聚乙烯吡咯烷酮、 琼脂， 或海藻酸或其盐如海藻酸钠。
糖衣核具有合适的包衣。为此目的， 可使用浓缩的糖溶液， 其可以可选地包含阿 拉伯树胶、 滑石粉、 聚乙烯吡咯烷酮、 卡波姆凝胶、 聚乙二醇、 二氧化钛、 漆溶液 (lacquer solutions) 和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素加入到片剂或糖衣丸包衣 中， 以便鉴定或表征不同的活性化合物剂量组合。
可口服使用的药物组合物， 包括明胶制成的推入配合胶囊 (push-fit capsule)， 以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。 推入配合胶囊可包含与填充剂如 乳糖、 粘合剂如淀粉、 润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁， 和可选的稳定剂混合的活性成分。在软 胶囊中， 活性成分溶解于或悬浮于合适的液体中， 如脂肪油、 液体石蜡， 或液体聚乙二醇。 另 外， 可加入稳定剂。所有用于口服给予的制剂剂量应适合所选的给予途径。
对于颊部给予， 该组合物可采用用常规方法调配的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻吸入给予， 根据本发明使用的活性成分可以所呈现的气溶胶喷雾形 式， 从利用合适的推进剂如二氟二氯甲烷、 三氯氟甲烷、 二氯四氟乙烷， 或二氧化碳的加压包装或喷雾器中方便地递送。在加压气溶胶的情况下， 剂量单位可通过提供用于递送计量 的量的阀门确定。可将用在分配器中的如明胶胶囊和药筒， 调配成包含该化合物与合适的 粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文所述的制剂可以调配用于肠胃外给予， 如通过推注或连续输注给予。注射用 制剂可以单位剂量的形式呈现， 如， 在安瓿或在多剂量容器中， 其中可选地加入防腐剂。该 组合物可以是油性或水性媒介物中的悬浮液、 溶液， 或乳液， 并可含有调配剂如悬浮剂、 稳 定剂， 和 / 或分散剂。
用于肠胃外给予的药物组合物包括水溶性形式活性制剂的水溶液。另外， 可将该 活性成分的悬浮液配制成适当的油性或基于水的注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介物 (vehicles) 包括脂肪油如芝麻油， 或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、 甘油三酯或脂质体。水 性注射悬浮液可包含增大悬浮液粘度的物质， 如羧甲基纤维素钠、 山梨醇， 或葡聚糖。可选 地， 该悬浮液还可包含合适的稳定剂或增大活性成分的溶解度从而允许制备高度浓缩的溶 液的试剂。
替换地， 该活性成分可以是粉末形式， 在使用前用合适的媒介物如无菌的基于无 热源水的溶液进行配制。
根 据 本 发 明 实 施 方 式 的 制 剂 还 可 利 用 如 常 规 栓 剂 基 质 如 可 可 豆 油 (cocoa butter) 或其它甘油酯， 调配成直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂 (retention enemas)。
当然， 该组合物的给予量将取决于受治疗对象、 疼痛严重性、 给予方式， 处方医生 的判断等。
本发明组合物如果需要可放在包装或分配装置中， 如 FDA 批准的试剂盒， 其可 包含含有活性成分的一种或多种单位位剂量形式。该包装可包含， 例如， 玻璃或塑料箔 (plastic foil)， 如泡罩包装 (blister pack)。该包装或分配装置还可附有给予说明。该 包装或分配器还可提供与所含物相关的由管理药物制造、 使用或销售的政府部门所规定的 形式的公告， 该公告反映该部门批准了该组合物形式或人用或兽用。此公告， 例如， 可以是 美国食品和药物管理局对于处方药批准的标志或者是已批准产品插页 (product insert)。
本文所述多肽能够结合到趋化因子上， 因而具有与至少一些趋化因子的结构互补 的结构。因为趋化因子受体也具有与趋化因子互补的结构， 所以期望本文所述的至少一些 多肽的结构域趋化因子受体的结构具有显著的相似性。 该多肽因而可以在一些应用中代替 趋化因子受体， 例如， 当产生能够结合到趋化因子受体上的抗体时。
因此， 在本发明实施方式的另一方面， 提供了能够识别趋化因子受体至少一部分 的抗体。该抗体可选地通过利用生产抗体的标准技术， 生产对抗本文所述多肽的抗体来制 取。
本文也提供了包含本文所述多肽， 用于产生自身抗体的疫苗。该疫苗设计用于在 受验者中产生对抗该多肽的抗体， 其中该抗体将进一步识别和结合到受验者至少一种趋化 因子受体的至少一部分上。 该疫苗可选地包括可以容易地由本领域技术人员选择的任何合 适的疫苗载体， 包括但不局限于， 佐剂、 载体等。
制备免疫原或疫苗组合物的一般方法描述在雷明顿药物科学 (Remington ′ s Pharmaceutical Science)， Mack Publishing Company Easton， Pa.( 最新版 ) 中。为了增 大免疫原性， 可以使本发明多肽吸附或结合到珠粒如胶乳或金珠、 ISCOM 等上。免疫原性组合物可以包含佐剂， 该佐剂为可以添加到免疫原或疫苗制剂中从而增强免疫原性部分的免 疫刺激特性的物质。脂质体也视为佐剂 (Gregoriades， G 等人， Immunological Adjuvants and Vaccines， Plenum Press， New York， 1989)。可以增加多肽免疫原功效的佐剂或药剂 实例包括氢氧化铝、 磷酸铝、 硫酸铝钾 ( 明矾 )、 硫酸铍、 二氧化硅、 高岭土、 碳、 油包水型乳 液和水包油型乳液。优选的一类佐剂是胞壁酰二肽 (muramyl dipeptide， MDP) 以及各种 MDP 衍生物和制剂， 例如， N- 乙酰基 -D- 葡萄糖氨基 -(β-1-4)-N- 乙酰基胞壁酰 -L- 丙氨 酰 -D- 异谷酰胺 (GMDP)(Hornung， R L 等人， Ther Immunol 19952 ： 7-14) 或 ISAF-1( 在含 有 0.4mg 苏氨酰 - 胞壁酰二肽的磷酸盐缓冲溶液中的 5％鲨烯、 2.5％ pluronic L121、 0.2％ 吐温 80 ； 参见例如 Kwak， L W 等人， (1992)N.Engl.J.Med.， 327 ： 1209-1238)。其它有用的 佐剂为， 或者基于霍乱毒素、 细菌性内毒素、 脂质 X、 细菌痤疮丙酸杆菌 (Propionobacterium acnes) 或百日咳鲍特菌 (Bordetella pertussis) 的完整生物体或亚细胞部分、 多聚核 糖核苷酸、 藻酸钠、 羊毛脂、 溶血卵磷脂、 维生素 A、 皂甙和皂甙衍生物如现已用于临床 (Helling， F 等 人， (1995)Cancer Res.， 55 ： 2783-2788 ； Davis， T A 等 人， (1997)Blood， 90 ： 509) 的 QS21(White， A.C. 等人， (1991)Adv.Exp.Med.Biol.， 303 ： 207-210)、 左旋咪唑、 DEAE- 葡聚糖、 阻断共聚物或其它合成佐剂。许多佐剂可以从各种来源商购获得， 例如， Merck 佐剂 65(Merck and Company 有限公司， Rahway， N.J.)， 或弗氏不完全佐剂和完全佐 剂 (Difco Laboratories， Detroit， Mich.)、 Amphigen( 水包油 )、 Alhydrogel( 氢氧化铝 )， 或者 Amphigen 和 Alhydrogel 的混合物。铝已被批准用于人用。
如本文使用的术语 “约” 是指 ±10％。
术语 “包 含” 、 “包 含 的” 、 “包 括” 、 “包 括 的” 、 “具 有” ， 和它们的词形变化形式 (conjugates) 意思是指 “包括但是不限于” 。
术语 “由……组成” 是指 “包括但是不限于” 。
本文使用的术语 “示例” 是指 “用作实例、 例证， 或图例” 。被描述为 “示例” 的任 何实施方式不必解读为优选的或比其它实施方式有利， 和 / 或排除其它实施方式并入的特 征。
本文使用的术语 “可选地” 是指 “提供在一些实施方式中， 而没有提供在其它实施 方式中” 。本发明任何特定实施方式均可包括多个 “可选的” 特征， 除非此类特征相冲突。
如本文使用的， 单数形式 “一个” 、 “一” 和 “该” 包括复数指代， 除非上下文另有明确 规定。例如， 术语 “一种化合物” 或 “至少一种化合物” 可包括多种化合物， 包括其混合物。
在整篇专利申请中， 本发明的各种实施方式可以范围形式呈现。应当理解范围形 式的描述仅是为了方便和简洁， 而不应该解读为对本发明范围的硬性限制。 因此， 范围的描 述应视为已具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的各个数值。例如， 如从 1 至 6 的范围描述应视为已具体地公开了诸如从 1 至 3、 从 1 至 4、 从 1 至 5、 从 2 至 4、 从 2 至 6、 从 3 至 6 等的子范围， 以及在此范围中的各个数值， 例如， 1、 2、 3、 4、 5， 和 6。 不论范围宽度如 何， 这都能适用。
当本文中指出了数值范围时， 其意在包括在所指范围内的任何提及数字。本文中 的表达在第一个指定数和第二个指定数之间的 “范围” 与从第一个指定数 “至” 第二个指定 数的 “范围” 可互换使用， 意在包括第一和第二个指定数及其间的所有数字。
应理解， 为清楚起见而在单独实施方式的上下文中描述的本发明某些特征， 也可结合提供在单个实施方式中。相反， 为简洁起见而在单个实施方式的上下文中描述的本发 明的多种特征， 也可单独地或以任何合适的子组合形式， 或作为适合于本发明的任何其它 被描述的实施方式提供。 在各个实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是这些实 施方式的实质特征， 除非这些实施方式没有这些元素时是不能实施的 (inoperative)。
如上文所描绘的和如下面权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方式和 方面将在下面的实例中找到实验支持。
实施例
现在参考下面的实施例， 结合上面的描述以非限制方式阐述本发明的一些实施方 式。
材料和方法
材料 ：
扩增缓冲液 (X10) 从 Invitrogen 获得 ；
葡聚糖 T-500 从 Pharmacosmos A/S(Denmark) 获得 ；
Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 (DMEM) 从 Biological Industries(Beit Haemek， Israel) 获得 ；
ECL 溶液从 Amersham Biosciences 获得 ；
EcoRI 从 New England Biolabs 获得 ；
增强子溶液 (X10) 从 Invitrogen 获得 ；
嗜酸性粒细胞趋化因子 (Eotaxin)( 人 ) 从 PeproTech(Rocky Hill， NJ， USA) 获 得；
EX-CELL 293 培养基从 SAFC Biosciences 获得 ；
胎牛血清 (FCS) 从 Biological Industries(Beit Haemek， Israel) 获得 ；
聚蔗糖 (Ficoll)1077 从 Sigma 获得 ；
弗氏完全佐剂从 Sigma 或 Difco 获得 ；
FuGENE 6 从 Roche 获得 ；
IP-10( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
IL-8( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
I-TAC( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
MCP-1( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
甲基化牛血清白蛋白 (mBSA) 从 Sigma 获得 ；
MIG( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
NotI 从 New England Biolabs 获得 ；
NuPAGE Bis Tris gels 从 Invitrogen 获得 ；
pIRESpuro3 载体从 BD Biosciences Clontech 获得 ；
蛋白质 A-Sepharose 珠从 Amersham 获得 ；
RANTES( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
RPMI 培养基从 Biological Industries(Beit Haemek， Israel) 获得 ；
SDF-1α( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
Taq 聚合酶 (Platinum Pfx DNA 聚合酶 ) 从 Invitrogen 获得 ； 和VCAM-1( 人 ) 从 R&D Systems， Inc.(Minneapolis， MN) 获得。
所有趋化因子都按照供应商的建议制备。
获取 IL6-BKT 肽 DNA 片段的两步 PCR
在第一 PCR 步骤中， 将 IL6 信号肽 DNA 序列 (SEQ ID NO ： 166) 添加到与每个 BKT 肽的前 9 种氨基酸对应的 DNA 序列中。这个 PCR 反应的产物在第二 PCR 步骤中用作模板从 而添加与 BKT 肽剩余的 3 种氨基酸对应的 DNA 序列、 间隔子序列 (SEQ ID NO ： 167)， 和 3’ 端 的 BstBI 限制性位点。
IL6-Fc pIRES puro DNA 用作第一 PCR 步骤的所有三个 PCR 反应的 NDA 模板。 所有 三个 PCR 反应利用同一正向引物 (T7 引物， SEQ ID NO ： 170) 完成。使用通用的 T7 引物， 形 成 PCR 产物， 该 PCR 产物在 5’ 端包含多个克隆位点， 包括后来用于亚克隆的 NheI 位点。该 反向引物对每个肽均有特异性， SEQ ID NO ： 171 用于 BKT-P2， SEQ ID NO ： 172 用于 BKT-P46。
该 PCR 反应条件如下 ： 20ng DNA 模板、 5μl 扩增 X10 缓冲液、 0.2mM 的每种脱氧核 糖核苷酸 (dNTP)、 0.5mM MgSO4、 5μl 增强子溶液 X10、 0.2μM 的每种引物、 2.5 单位的 Taq 聚合酶， 其中水添加到 50μl 总反应体积。
扩增用起始变性步骤执行， 该起始变性步骤在 94 ℃下执行 3 分钟， 接着执行在 94℃下 30 秒、 52℃下 30 秒， 和 72℃下 30 秒的 30 个循环， 然后 72℃下 10 分钟。
PCR 扩增结束时， 在用溴化乙锭染色和用 UV 光显现的 2％琼脂糖凝胶上分析 5μl 的每种反应混合物。
通过上述程序获得的 PCR 产物用作第二 PCR 步骤的模板。上述 T7 引物用作所有 三个反应的正向引物， 而反向引物对每个肽具有特异性 ； SEQ ID NO ： 173 用于 BKT-P2， SEQ ID NO ： 174 用于 BKT-P46。每种反向引物均编码期望肽的氨基酸 10-12， 和六肽间隔子序列 (SEQ ID NO ： 162)， 并包括 BstB1 限制性位点。
PCR 反应条件如下 ： 0.5μl DNA 模板、 5μl 扩增 X10 缓冲液、 0.2mM 的每种 dNTP、 0.5μM MgSO4、 5μl 增强子溶液 X10、 0.2μM 的每种引物、 2.5 单位的 Taq 聚合酶 ； 其中水添 加至 50μl 总反应体积。
按照上面针对第一 PCR 步骤描述的方法进行扩增和对 PCR 产物进行分析。该 PCR 产物是利用 QiaQuickTM 凝胶提取试剂盒 (QiagenTM) 从凝胶中提取的。
IL6-BKT 肽 DNA 片段与 Fc 序列的连接 (ligation) ：
提取的 IL6-BKT 肽 DNA 产物用 NheI 和 BstBI 进行消化， 按照上面详细描述的从琼 脂糖凝胶中纯化， 并使其连接到之前用相同酶消化的 FcN297ApIRESpuro3 中。 用于编码 SEQ ID NO ： 158 和 159 的载体的图谱分别在图 1A 和 1B 示出。将该连接混合物转化到 DH5a 感 受态细胞中。筛选抗氨必西林的转化体， 并通过克隆 PCR 进一步分析阳性克隆。
从抗氨必西林的克隆中提取 DNA， 并用 EcoRI 和 NotI 限制酶在 37℃下消化 2 小时。 在琼脂糖凝胶上分离反应物。预期阳性克隆可以产生 5123bp 和 868bp 的两条带。该阳性 克隆通过 DNA 测序进行证实。
Western 印迹 ：
收集细胞样品的培养基， 并进行离心 (1000 转 / 分钟， 7 分钟 )。将 1ml 去除细胞 的培养基 (cell-deprived medium) 与 50μl 蛋白质 A-Sepharose 珠一起在室温下温育 45 分钟。温育时间结束时， 用包含 100mM 柠檬酸盐磷酸盐缓冲液 (pH 3.5) 和 10mM DTT( 二硫苏糖醇 ) 的 50μl 样品缓冲液从该珠粒上洗脱蛋白质。将该样品煮沸 3 分钟， 然后将 25μl 样品装到 12％ NuPAGE Bis Tris 凝胶上。将该蛋白质转移到硝化纤维素膜中， 并 用在 PBST( 补充有 0.05％吐温 -20 的 PBS) 中的 10％低脂牛奶封闭。然后在室温下以在封 闭溶液中的 1 ∶ 40,000 浓度， 用人抗 IgG Fc 片段抗体， 接着用结合到 HRP( 辣根过氧化物 酶 ) 上的山羊抗人抗体印迹 (blot) 该膜 1 小时。在与 ECL 溶液一起温育之后， 将该膜暴露 于胶片 (film) 下。
表面等离子共振 (SPR) ：
在覆盖有羧甲基葡聚糖的腔室中， 肽或多肽通常经由赖氨酸残基的氨基或 N 末端 共价结合到该腔室上。通过该腔室以增加的浓度注射趋化因子。
从该表面反射的光线变化与结合蛋白质的量成比例， 并可以通过检测器检测。
对在不同浓度的趋化因子下结合的蛋白量作图， 使得离解系数 (dissociation coefficient) 的计算成为可能。
新鲜血液中的 T- 细胞纯化 ：
将 50ml 血液添加到 10ml 葡聚糖 T-500(6％ w/v) 在 PBS( 磷酸盐缓冲盐水 ) 中的 溶液， 和 7ml 柠檬酸盐缓冲液 (25 克柠檬酸盐、 8 克柠檬酸在 500ml PBS 中 ) 中。将该溶液 在 25℃下温育 30 分钟。将 10ml 聚蔗糖 (Ficoll)1077 添加到该管子底部。然后将该管子 在 18℃下在 2,000 转 / 分钟下离心 30 分钟 ( 以制动离心停止模式 )。收集中间相， 用含有 5％ FCS( 胎牛血清 ) 的 8ml PBS 洗涤两次， 接着在 18℃下在 1,400 转 / 分钟下离心 5 分钟。 8 将该细胞以小于 10 /ml 的浓度重悬在含有 5％ FCS 的 PBS 中。将 2ml 细胞溶液施加在预先 浸渍在 PBS-5％ FCS 中的聚 ( 甲基丙烯酸甲酯 ) 尼龙毛柱中， 然后在 25℃下温育 45 分钟。 每个柱子均用 8ml PBS-5％ FCS 洗涤， 并通过 50ml 5mM 在 PBS 中的 EDTA( 乙二胺四乙酸 ) 洗脱细胞 (T- 细胞和红细胞 )。通过在 4℃下在 1,400 转 / 分钟下离心 ( 开启制动 )5 分钟 获得红色球团 ( 红色细胞沉淀， red pellet)。
为了执行红细胞的裂解， 将该红色球团重悬在 5ml 裂解缓冲液 (155mM NH4Cl、 10mM KHCO3、 0.1mM EDTA、 X0.1PBS) 中 4 分钟， 接着立即加入 50ml 含有 EDTA 的 PBS。在 4℃下在 1,400 转 / 分钟下离心 5 分钟之后， 再次用 50ml PBS-EDTA 洗涤该球团， 并在相同条件下进 6 行再离心。获得白色球团， 将其以 3x10 个细胞 /ml 的浓度重悬在含有 10％ FACS、 L- 谷氨 酰胺、 丙酮酸钠和抗生素的 RPMI 培养基中。将该细胞在 37℃下温育 2 小时， 接着收集未粘 附细胞。该细胞在 37℃下温育过夜之后就已准备就绪可用于实验中。
体外 T 细胞粘附分析 ：
将 10μg/ml 人 VCAM-1 和 2μg/ml 趋 化 因 子 ( 完 整 MIG、 IP-10、 I-TAC、 MCP-1、 RANTES、 SDF-1( 基质细胞衍生因子 -1)、 BCA-1(B- 淋巴细胞趋化因子 -1)、 IL-8( 白介素 -8) 或嗜酸性粒细胞趋化因子， 或作为对照的热灭活 SDF-1) 溶解在由 20mM 碳酸氢盐 (pH 8.5) 缓冲制成的 PBS 中， 并在聚苯乙烯板中在 4℃下温育过夜。替换地， 使用 10μg/ml 趋化因 子， 并将该板在室温下温育 30 分钟。然后洗涤该板 3 次， 并通过与 20mg/ml 在 PBS 中的人 血清白蛋白一起在 37℃下温育 2 小时来进行封闭。
然后将该板装配成平行壁流动腔室的底壁 (lower wall) 并安装在倒置显微镜 镜台上。将 10μg/ml 测试肽在 37 ℃下安放在基质包被的腔室壁 ( 基质涂覆的腔室壁， substrate-coated chamber wall) 上 10 分钟， 然后洗涤。按如上所述的从新鲜血液中纯化出 T 细胞 (5x106/ml， 纯度＞ 98％ )， 使其悬浮在结合缓冲液中， 灌注到腔室中， 并将其在 37℃下安放在基质包被的腔室壁上 1 分钟。启动流动， 并每 5 秒增大 2 ～ 2.5 倍， 在该壁上 产生受控剪切应力。在倒置相差 Diaphot 显微镜 (Nikon) 的 20x 物镜下观察细胞， 并用连 接到 AG-6730S-VHS 录像机 (Panasonic) 上的长积分 LIS-700CCD 摄像机 (Applitech， 以色 列 ) 拍照。在每个间隔后通过分析录制的细胞图像确定可抵抗剪切应力增大造成的分离的 粘附细胞数目， 并表示成初始沉积细胞的百分数。所有粘附实验在多个试区 ( 测试区， test field) 上进行至少三次。
实验自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) ：
在雌性 SJL 和 C57BL/6 小鼠中诱导 EAE。 分别在小鼠侧腹皮下给予 100μg PLP139-151 肽或 250μg MOG35-55 肽 ( 第 0 天 ) 免疫该小鼠。 使 PLP 和 MOG 肽乳化在等体积的含有 800μg 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)H37RA(Difco， Detroit， MI) 的完全弗氏佐剂 (CFA) 中。还在第 0 天和 2 天给小鼠腹膜内注射 300ng 百日咳毒素 (pertussis toxin)。
在免疫后第 9 天， 给小鼠静脉注射 BKT-P2-FC 或 BKT-P46-FC(50μg/ 小鼠 )。在一 些实验中， 当给小鼠静脉注射 BKT-P2-FC 或 BKT-P46-FC 时， 在疾病的高峰期时， 疾病诱导之 后的 14 天对小鼠进行处理。
在 疾 病 诱 导 后 的 30 天 收 集 脊 髓 组 织 样 品，固 定 在 4 ％ 多 聚 甲 醛 (paraformaldehyde) 中， 并脱水和包埋在石蜡中。切出 6μm 脊髓切片， 并经加工用于通 过用苏木精和曙红 (H&E) 染色进行组织学分析从而评价免疫细胞浸润， 并用勒克司坚牢蓝 (luxol fast blue) 标记脱髓鞘区域。
免疫后 30 天收集血液样品， 提取血清用于细胞因子分析。根据制造商说明书通过 小鼠 Th1/Th2 细胞因子试剂盒 -BD 流式微珠阵列 (cytometric bead array， CBA)， 评价细 胞因子水平。
通过监测动物受验者的 EAE 临床得分， 确定 BKT-P2-FC 和 BKT-P46-FC 多肽的作 用。 EAE 临床得分根据下面的标准确定 ： 0- 无疾病 ； 1- 尾巴健康状况 ( 尾音， tail tone) 下 降； 2- 后肢无力或部分麻痹 ； 3- 后肢完全麻痹 ； 4- 前后肢麻痹 ； 5- 垂死状态。通过在实验 结束时合计实验组所有动物的所有结果， 计算累积分数。
对于所有 EAE 实验， 每组均有 10 ～ 12 只小鼠。
实施例 1
制备多肽
将 BKT-P2 肽 (SEQ ID NO ： 101) 和 BKT-P46 肽 (SEQ ID NO ： 76)( 在本文称为 “BKT 肽” ) 用作制备具有融合到分泌的非糖基化人 IgG1Fc(Fc N297A)N’ 末端上的 BKT 肽的多肽 的基础。
为了使 DNA 克隆进行， 使 BKT-P2 和 BKT-P46 肽序列反向翻译成 DNA 序列。每个 BKT 肽序列均融合到编码人 IL6 信号肽的 DNA 序列上以便使哺乳动物系统能够分泌蛋白质。 这个程序通过上文所述的两步 PCR 执行。然后， 使用上文所述的程序， 对通过 PCR 获得的 IL6-BKT 肽 DNA 片段进行消化， 使其框内连接到非糖基化 Fc 序列 ( 含有点突变 N297A) 上， 从而产生称为 IL6-P2-Fc N297A(SEQ ID NO ： 168) 和 IL6-P46-Fc N297A(SEQ ID NO ： 169) 的片段。
然后使用 FuGENE 6 转染试剂， 将 IL6-BKT 肽 -Fc DNA 构建体转染到 HEK-293T细胞中。将每个构建体均转染到 6- 孔板的两个孔中。一个孔专用于 Western 印迹 (WB) 分 析， 第二孔专用于确定稳定池。将该细胞以 500,000 个细胞 / 孔的浓度置于 6 孔板中。1 天 后， 用 6μl FuGENE 和 2μg DNA( 比例为 3 ∶ 1) 转染该细胞。
在专用于 WB 分析的孔中， 24 小时后将该培养基替换成无血清培养基， 并在 48 小时 后收集该培养基。通过使用抗 -Fc 抗体的 Western 印迹分析， 分析短暂转染的细胞， 发现该 细胞可以表达称为 BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 和 BKT-P46-FC(SEQ ID NO ： 159) 的期望多 肽 ( 数据未给出 )。
在 另 一 个 孔 中， 24 小 时 后 将 该 培 养 基 替 换 成 含 有 10 ％ FCS( 胎 牛 血 清 ) 的 DMEM(Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 )， 48 小时后使该细胞胰蛋白酶化并将其转移到含有选 择培养基 ( 含有 10％ FCS 和 5μg/ml 嘌呤霉素的 DMEM) 的 T75 烧瓶中以便获得稳定的克 隆。
使从嘌呤霉素选择 ( 稳定池 ) 中存活的细胞群体繁殖， 并如上文所述的通过 Western 印迹分析来分析该细胞群体的培养基， 以便证实期望多肽的表达。
如图 2 所示， 期望 BKT-P2-FC 和 BKT-P46-FC 多肽表达在所有所测试的细胞培养物 中。 另外， 通过针对 Fc 片段的 ELISA 测试上述池的上清液， 结果指示期望 BKT-P2-FC 或 BKT-P46-FC 多肽表达在所有所测试的细胞培养物中 ( 数据未给出 )。
为了验证细胞的同一性， 执行基因组 PCR， 结果指示正确序列整合在细胞基因组中 ( 数据未给出 )。
将表达期望多肽的每个池的数个等分试样 (aliquot) 冷冻保存在液氮下。数天 后， 使来自每个原液 (stock) 的一个安瓿融化以便证实细胞活力。
然后， 在悬浮液中生长的哺乳动物培养物中生产 BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 和 BKT-P46-FC(SEQ ID NO ： 159) 多肽。将所转染细胞的一个 T175 烧瓶保持在含有选择抗生 素 (5μg/ml 嘌呤霉素 )、 补充有 10％血清的培养基中， 并在 5％ CO2 中在 37℃下进行温育。 胰酶消化之后， 将该细胞转移到补充有 4mM 谷氨酰胺和选择抗生素 (1μg/ml 嘌呤霉素 ) 的 无血清培养基 (EX-CELL 293 培养基 ) 中， 进一步在烧瓶中在 5％ CO2， 37℃下进行温育。3 天后， 在 37℃下将该细胞转移到摇瓶中， 该摇瓶的搅拌速度为 125 转 / 分钟。 当细胞密度达 6 到 2.0-3.5x 10 个细胞 /ml 时， 通过在两个旋转烧瓶中连续稀释使培养物体积增大到多达 4 升。将一个含有 200ml 培养物的摇瓶作为备份保存。
在 4 天的生产期之后， 两个旋转烧瓶的培养物分别达到 3.7x 106 个细胞 /ml， 活力 6 为 91％， 和 4.0x 10 个细胞 /ml， 活力为 92％。通过离心 (5000 转 / 分钟， 15 分钟 ) 从该两 个旋转烧瓶中收获培养基和从该摇瓶中收获 200ml。 共收获 3.5 升， 通过 0.22μm 过滤器过 滤， 并保存在 -80℃ ( 取出两个 1.5ml 样品 )。在蛋白质 A 柱上进一步纯化该多肽 (SEQ ID NO ： 158 或 SEQ ID NO ： 159)。
实施例 2
多肽与趋化因子的亲和力
通过材料和方法部分中描述的表面等离子体共振技术 (SPR)， 测定实施例 1 描述 的多肽与趋化因子的亲和力。结果概括在下表 3 中。
如表 3 所示， 该多肽以可感知程度结合到趋化因子 I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸
性粒细胞趋化因子和 RANTES 中的每个上。
表3： 多肽与趋化因子的结合的解离常数 (Kd)
实施例 3
多肽的体外活性
利用上文描述的体外粘附分析， 将趋化因子结合肽 BKT-P2(SEQ ID NO ： 101) 和 BKT-P46(SEQ ID NO ： 76) 对 T 细胞与 VCAM-1 的粘附的影响与包含前述趋化因子结合肽序 列之一的实施例 1 所述的那些多肽进行比较。前述肽和多肽抑制 T 细胞与 VCAM-1 的粘附 的能力概括在下表 4 中。
表4： 肽对趋化因子依赖性 T 细胞粘附的抑制
++ ＝ 100％抑制
- ＝无抑制 N.D. ＝未测定
如表 4 和图 3A、 3B 和 3C 所示， 该肽 BKT-P2 抑制了 IP-10、 I-TAC、 MCP-1、 RANTES 和 嗜酸性粒细胞趋化因子诱导的 T 细胞粘附， 但不能抑制 MIG 诱导的 T 细胞粘附。
如表 4 和图 4A、 4B 和 4C 所示， 多肽 BKT-P2-FC 抑制了 MIG 诱导的 T 细胞粘附， 以 及 IP-10、 I-TAC、 MCP-1、 RANTES 和嗜酸性粒细胞趋化因子诱导的粘附。
如图 4 中进一步所示的， 肽 BKT-P46 抑制了 I-TAC、 MIG、 MCP-1 和 RANTES 诱导的 T 细胞粘附， 但不能诱导嗜酸性粒细胞趋化因子诱导的粘附， 而多肽 BKT-P46-FC 抑制了嗜酸 性粒细胞趋化因子， 以及 I-TAC、 MIG、 MCP-1 和 RANTES 诱导的 T 细胞粘附。
上面的结果表明， 该多肽调节趋化因子活性的能力相比相应趋化因子结合肽调节 趋化因子活性的能力增强。这可能是由于寿命延长和该多肽相对于该肽的稳定性增强， 和 / 或由于它们三级构象发生变化引起的。
实施例 4
多肽对实验自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 的体内作用
利用材料和方法部分中描述的体内实验自身免疫性脑脊髓炎模型， 测试实施例 1 描述的 BKT-P2-FC 和 BKT-P46-FC 多肽对脑部炎症的作用并进行评分。
如图 5A 和 5B 所示， BKT-P46-FC 多肽大大降低了实验持续期间 ( 到 55 天 )PLP 来 源的 EAE 平均临床得分和累积临床得分 ( 累计临床得分， accumulating clinical score)。
在 该 实 验 第 37 天， 13 只 对 照 小 鼠 中 的 6 只 的 EAE 临 床 得 分 至 少 为 2， 而接受 BKT-P46-FC 多肽的所有 10 只小鼠的 EAE 临床得分都为 0。
另外， 如图 6A 和 6B 所示， BKT-P46-FC 和 BKT-P2-FC 多肽都降低了实验持续期间 ( 到 33 天 )PLP 来源的 EAE 平均临床得分和累积临床得分。
在该实验的第 27 天， 10 只对照小鼠中的 8 只的 EAE 临床得分至少为 2， 而接受 BKT-P2-FC 多肽的 10 只小鼠中的 9 只的 EAE 临床得分为 0， 接受 BKT-P46-FC 多肽的 10 只 小鼠中的 8 只的 EAE 临床得分 0。
类似地， 如图 7 所示， BKT-P46-FC 和 BKT-P2-FC 多肽都降低了实验持续期间 ( 到 55 天 )MOG- 来源的 EAE 临床得分 ( 到 55 天 )。
这些结果表明该多肽对抑制小鼠脑部中的炎性反应， 如 EAE， 多发性硬化模型的炎 性反应有效。
实施例 5
多肽对关节炎的体内作用
利用体内小鼠诱导的关节炎模型， 测试了实施例 1 描述的 BKT-P2-FC 多肽对关节 炎的作用。该分析按照 Coelho 等人 [Arthritis Rheum 2008， 58 ： 2329-2337]， Grespan 等 人， [Arthritis Rheum 2008， 58 ： 2030-2040]and Lemos 等人， [PNAS 2009， 106 ： 5954-5959] 描述的执行。
在第 0 天， 在小鼠尾巴底部真皮内给予含 500μg 甲基化牛血清白蛋白 (mBSA) 的 100μl 盐水乳液和等体积弗氏完全佐剂 (CFA)， 免疫该小鼠。在第 11 天， 按 2mg/kg 的剂量 给予 BKT-P2-FC 多肽。 24 小时后， 对小鼠进行抗原激发。 每只小鼠的左膝关节均接受 10μg mBSA 注射液 ( 在 10μl 无菌盐水中的注射液 )。给予该多肽 48 小时后， 处死该小鼠， 用 PBS 洗涤膝关节腔， 并通过利用荧光激活细胞分选术 (FACS) 计数白细胞， 确定组织中白细胞的 数目。
如图 8A 和 8B 所示， BKT-P2-FC 多肽大大地减少了关节炎膝关节腔内的中性粒细 胞数目， 和单核细胞数目。
这些结果表明， 该多肽对抑制炎性反应， 如类风湿性关节炎的炎性反应有效。
实施例 6多肽对迟发型超敏反应 (DTH) 的体内作用
利用体内迟发型超敏反应小鼠模型， 进一步测试实施例 1 描述的 BKT-P2-FC 和 BKT-P46-FC 多肽对免疫反应的作用。
在第 0 天， 在小鼠尾巴底部真皮内给予含 500μg 甲基化牛血清白蛋白 (mBSA) 的 100μl 盐水乳液和等体积弗氏完全佐剂 (CFA)， 免疫该小鼠 (8 至 10 周龄雄性 C57BL/6 小 鼠 )。12 天后， 对小鼠进行抗原激发。每只小鼠的左膝关节均接受 10μg mBSA 注射液 ( 在 10μl 无菌盐水中的注射液 )， 如 Coelho 等人 [Arthritis Rheum 2008， 58 ： 2329-2337] 和 Healy 等人 [J Immunol 2006， 177 ： 1886-1893] 描述的。在一些小鼠中， 在激发 24 时前， 静 脉注射 BKT-P2-FC(50μg/ 小鼠 )。用 PBS 伪免疫激发的空白小鼠 ( mice) 用作对照 小鼠。抗原激发 24 小时后， 处死小鼠。
如图 9 所示， 上述多肽都抑制迟发型超敏反应， BKT-P2-FC 的效力比 BKT-P46-FC 的 强。
这些结果表明， 该多肽对抑制迟发型超敏反应的炎性反应有效。
实施例 7
多肽的药物动力学
在静脉注射 50μg/ 小鼠的 BKT-P46-FC(SEQ ID NO ： 159) 或 BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 多肽的 C57BL 小鼠中， 测定多肽在小鼠中的药物动力学。
在注射后 2 小时、 24 小时， 5 和 11 天给该小鼠抽血， 并取出血清。根据制造商说明 书利用人总 IgG ELISA 试剂盒 (ICL) 测试血清中多肽的水平。
甚至在注射 11 天后仍可以在血液中检测到该多肽。
这些结果表明， 该多肽具有相当大的体内稳定性。
虽然本发明已结合其特定的实施方式进行描述， 但显然， 对于本领域技术人员而 言， 许多替换、 修改和变更都是很明显的。因此， 本发明旨在包括落在附属权利要求的精神 和宽范围内的所有此类替换、 修改和变更。
本说明书中提到的所有出版物、 专利和专利申请都通过引用完整地合并在本说明 书中， 如同每篇单独的出版物、 专利或专利申请单独地明确被指出通过引用合并在此。另 外， 本申请中任何参考文献的引用或列出不应该被解释为承认此类参考文献是本发明的现 有技术。对于使用的章节标题， 它们不应该被解释为限制性的。
表5： 趋化因子结合肽
趋化因子结合肽名称 BKT-P50 BKT-P10 BKT-P17 BKT-P58 SEQ ID NO ： 1 2 3 4 肽的序列 CAHLSPHKC CDIPWRNEC CDPLRQHSC CDSLGHWLC36CN 102482324 A BKT-P15 BKT-P59 BKT-P56 BKT-P60 BKT-P61 BKT-P62 BKT-P63 BKT-P64 BKT-P65 BKT-P66 BKT-P67 BKT-P68 BKT-P69 BKT-P70 BKT-P57 BKT-P71 BKT-P72 BKT-P73 BKT-P14 BKT-P74 BKT-P75 BKT-P76 BKT-P77 BKT-P16说5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28明书CDYTTRHSC CHGTLNPEC CHHNLSWEC CHIWTLASC CHNTFSPRC CIPLHASLC CITTTSLSC CKLTTCKDC CKNHTTFWC CLKLLSRSC CLLKAHPSC CLNQLKQAC CMNFPSPHC CPQSPTYTC CPSSAIHTC CPTSTARIC CQASSFPSC CQPYFWYRC CQTLTPSIC CSKLGHLWC CSKTPERIX CSNNNRMTC CSPILSLSC CSPTNFTRC33/39 页37CN 102482324 A BKT-P78 BKT-P79 BKT-P80 BKT-P81 BKT-P13 BKT-P82 BKT-P83 BKT-P84 BKT-P85 BKT-P86 BKT-P87
趋化因子结合肽名称 BKT-P88 BKT-P12 BKT-P89 BKT-P90 BKT-P48 BKT-P91 BKT-P44 BKT-P92 BKT-P93 BKT-P94 BKT-P95说29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39明书CSRPAMNVC CSTKAYPNC CSTSSCGSC CSYWGHRDC CTAHDANAC CTANSEKTC CTHPKASMC CTKTINGKC CTNMQSPLC CTPFTKLPC CTPTTDSIC34/39 页SEQ ID NO ： 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50肽的序列 CTQQNGHPC ACTTPSKHQC CTYNVAKPC ACAPLMFSQC ACHASLKHRC AHFSPNLLLGG AHSLKSITNHGL AKTLMPSPFPRT ASAVGSLSIRWQ/L/G ASWVDSRQPSAA CPQLTVGQHRT38CN 102482324 A BKT-P8 BKT-P96 BKT-P97 BKT-P51 BKT-P98 BKT-P99 BKT-P9 BKT-P100 BKT-P27 BKT-P28 BKT-P33 BKT-P101 BKT-P102 BKT-P45 BKT-P55 BKT-P54 BKT-P103 BKT-P104 BKT-P49 BKT-P105 BKT-P6 BKT-P106 BKT-P107 BKT-P108说51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74明书DLPPTLHTTGSP DSSNPIFWRPSS EFLGVPASLVNP ESDLTHALHWLG EVHSTDRYRSIP FGLQPTGDIARR FSMDDPERVRSP FSPLHTSTYRPS GDFNSGHHTTTR GPSNNLPWSNTP GVHKHFYSRWLG HAPLTRSPAPNL HGSLTTLF/LRYEP HHFHLPKLRPPV HHTWDTRIWQAF HPTTPFIHMPNF HRDPXS(P)PSAA/GRP HNVTTRTQRLMP HSACHASLKHRC HSACKLTTCKDG HSACLSTKTNIC IAHVPETRLAQM IFSMGTALARPL INKHPQQVSTLL35/39 页39CN 102482324 A BKT-P7 BKT-P46 BKT-21
趋化因子结合肽名称 BKT-P22/38 BKT-P37 BKT-P109 BKT-P110 BKT-P111 BKT-P112 BKT-P113 BKT-P114 BKT-P42 BKT-P23 BKT-P24 BKT-P115 BKT-P116 BKT-P117 BKT-P118 BKT-P119 BKT-P120 BKT-P39 BKT-P40说75 76 77明书ISPSHSQAQADL LDYPIPQTVLHH LFAAVPSTQFFR36/39 页SEQ ID NO ： 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96肽的序列 LGFDPTSTRFYT LLADTTHHRPWP LPWAPNLPDSTA LQPSQPQRFAPT LSPPMQLQPTYS MHNVSDSNDSAI NSSMLGMLPSSF NTSSSQGTQRLG PGQWPSSLTLYK QIPQMRILHPYG QIQKPPRTPPSL QLTQTMWKDTTL QNLPPERYSEAT QSLSFAGPPAWQ QTTMTPLWPSFS RCMSEVISFNCP RSPYYNKWSSKF SAGHIHEAHRPL SAISDHRAHRSH40CN 102482324 A BKT-P121 BKT-P32 BKT-P31 BKT-P3 BKT-P2 BKT-P122 BKT-P123 BKT-P29 BKT-P124 BKT-P125 BKT-P126 BKT-P127 BKT-P1 BKT-P128 BKT-P129 BKT-P4 BKT-P34 BKT-P130
趋化因子结合肽名称 BKT-P131 BKT-P132 BKT-P133 BKT-P5说97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114明书SEPTYWRPNMSG SFAPDIKYPVPS SFWHHHSPRSPL SIFAHQTPTHKN SIPSHSIHSAKA SIRTSMNPPNLL SLPHYIDNPFRQ SLSKANILHLYG SLVTADASFTPS SMVYGNRLPSAL SPSLMARSSPYW SPNLPWSKLSAY SQTLPYSNAPSP SSTQAHPFAPQL STPNSYSLPQAR STVVMQPPPRPA SVQTRPLFHSHF SVSVGMKPSPRP37/39 页SEQ ID NO ： 115 116 117 118肽的序列 SYIDSMVPSTQT SYKTTDSDTSPL TAAASNLRAVPP TAPLSHPPRPGA41CN 102482324 A BKT-P134 BKT-P135 BKT-P30 BKT-P25 BKT-P136 BKT-P137 BKT-P47 BKT-P138 BKT-P139 BKT-P140 BKT-P141 BKT-P142 BKT-P143 BKT-P144 BKT-P26 BKT-P35 BKT-P145 BKT-P146 BKT-P147 BKT-P148 BKT-P149 BKT-P43 BKT-P150 BKT-P151说119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142明书TGLLPNSSGAGI TGPPSRQPAPLH TLSNGHRYLELL TPSPKLLQVFQA TPSTGLGMSPAV TPVYSLKLGPWP TRLVPSRYYHHP TSPIPQMRTVPP TTNSSMTMQLQR TTTLPVQPTLRN TTTWTTTARWPL TVAQMPPHWQLT TWNSNSTQYGNR TWTLPAMHPRPA VHTSLLQKHPLP VLPNIYMTLSA VMDFASPAHVLP VNQEYWFFPRRP VYSSPLSQLPR VPPIS(R)TFLF(L)ST(K)S VPPLHPALSRXN VSPFLSPTPLLF VSRLGTPSMHPS WPFNHFPWWNVP38/39 页42CN 102482324 A BKT-P52 BKT-P152 BKT-P53 BKT-P153 BKT-P154 BKT-P155 BKT-P156 BKT-P157 BKT-P158 BKT-P36 BKT-P41 BKT-P159
趋化因子结合肽名称 BKT-P6 BKT-P16 BKT-P11说143 144 145 146 149 148 149 150 151 152 153 154明书WSAHIVPYSHKP WWPNSLNWVPRP YATQHNWRLKHE YCPMRLCTDC YGKGFSPYFHVT YPHYSLPGSSTL YPSLLKMQPQFS YQPRPFVTTSPM YSAPLARSNVVM YTRLSHNPYTLS YTTHVLPFAPSS YTWQTIREQYEM39/39 页SEQ ID NO ： 155 156 157肽的序列 CLSTKTNIC ACLSTKTNIC CTTPSKHQC43CN 102482324 A
序列表1/37 页
44CN 102482324 A序列表2/37 页
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50CN 102482324 A序列表8/37 页
51CN 102482324 A序列表9/37 页
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了本文所述多肽在制造用于治疗选自以下 的病症的药物中的用途 ： 炎症、 过敏症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫反应 (non-optimal immune response)、 细胞迁移异常 ( 异常的细胞迁移， abnormal cell migration)、 自身免 疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥 (allograft rejection)、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银 屑病、 动脉硬化 (atherosclerosis)、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了治疗选自以下的病症的方法 ： 炎症、 过敏 症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺 血， 该方法包括向需要其的受验者给予本文所述多肽， 从而调节和 / 或抑制趋化因子的生 物效应。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了编码本文所述多肽的分离多核苷酸。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含本文所述多核苷酸的核酸构建体。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含上述核酸构建体的细胞。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了制取 ( 制备、 生成， generate) 多肽的方 法， 该方法包括培养上述细胞， 和分离该多肽。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含附接到水溶性聚合物上的本文所述 多肽的结合物 (conjugate)。
根据本发明一些实施方式， 该多肽进一步包含接头。
根据本发明一些实施方式， 该接头是氨基酸接头。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域选自 IgG Fc 结构域、 IgA Fc 结构域、 IgD Fc 结构域、 IgE Fc 结构域， 和 IgM Fc 结构域。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽附接在 Fc 结构域或其片段的 N 末端 上。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽附接在 Fc 结构域或其片段的 C 末端 上。
根据本发明一些实施方式， 该接头由 4 ～ 10 个氨基酸组成。
根据本发明一些实施方式， 该接头是六肽。
根据本发明一些实施方式， 该接头是如 SEQ ID NO ： 162 中列出的肽。
根据本发明一些实施方式， 该多肽进一步包含信号肽。
根据本发明一些实施方式， 该信号肽在该多肽的 N- 末端。
根据本发明一些实施方式， 该多肽具有下式 ：
W-X-Y-Z
其中 ：
W 是信号肽 ；X 是趋化因子结合肽 (chemokine-binding peptide) ；
Y 是接头 ； 且
Z 是 Fc 结构域或其片段。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽长度为 10 ～ 20 个氨基酸。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽长度为 12 ～ 13 个氨基酸。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽的特征是具有结合到至少一种选 自 I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞趋化因子 ( 嗜酸粒细胞趋化蛋白， eotaxin) 和 RANTES 的趋化因子上的能力。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽选自 SEQ ID NO ： 1-157。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽选自 BKT-P2(SEQ ID NO ： 101) 和 BKT-P46(SEQ ID NO ： 76)。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽具有表现出与选自 SEQ ID NO ： 1-157 的氨基酸序列具有至少 90％序列同源性 (sequence homology) 的氨基酸序列。
根据本发明一些实施方式， 上述序列同源性为至少 95％。
根据本发明一些实施方式， 该信号肽包含 IL-6 信号肽。 根据本发明一些实施方式， 该信号肽具有 SEQ ID NO ： 161。
根据本发明一些实施方式， 该信号肽具有表现出与 SEQ ID NO ： 161 具有至少 90％ 序列同源性的氨基酸序列。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域是人 Fc 结构域。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域是 IgG Fc 结构域。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域是 IgG1 结构域。
根 据 本 发 明 一 些 实 施 方 式，该 Fc 结 构 域 或 其 片 段 是 非 糖 基 化 的 (non-glycosylated)。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域或其片段具有 SEQ ID NO ： 160。
根据本发明一些实施方式， 该多肽的特征是具有抑制至少一种趋化因子与趋化因 子受体 (chemokine receptor) 结合的能力。
根据本发明一些实施方式， 该多肽的特征是具有增强至少一种趋化因子与趋化因 子受体结合的能力。
根据本发明一些实施方式， 该药物组合物包装在包装材料中， 并在包装材料中或 包装材料上标识用于调节趋化因子的生物效应。
根据本发明一些实施方式， 该药物组合物包装在包装材料中， 并在包装材料中或 包装材料上标识用于治疗选自以下的病症 ： 炎症、 过敏症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫 反应、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排 斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动 脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
根据本发明一些实施方式， 该药物组合物调配用于静脉给予、 口服给予、 皮下给 予、 局部给予 (topical administration) 和 / 或鼻内给予。
根据本发明一些实施方式， 该药物调配用于静脉给予、 口服给予、 皮下给予、 局部 给予和 / 或鼻内给予。
根据本发明一些实施方式， 给予包括静脉给予、 口服给予、 皮下给予、 局部给予和 / 或鼻内给予。
根据本发明一些实施方式， 调节包括抑制。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子选自 I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细 胞趋化因子和 RANTES。
根据本发明一些实施方式， 该生物效应选自炎性效应、 细胞迁移、 肿瘤生长和癌转 移 (cancer metastasis)。
根据本发明一些实施方式， 该多肽用于治疗选自以下的病症 ： 炎症、 过敏症、 迟发 型超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红 斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感 染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
根据本发明一些实施方式， 该分离多核苷酸具有选自 SEQ ID NO ： 168 和 SEQ ID NO ： 169 的核酸序列。
根据本发明一些实施方式， 该水溶性聚合物是聚乙二醇。
除非另有限定， 否则本文使用的所有技术和 / 或科学术语的含义都与本发明所属 领域普通技术人员通常理解的相同。虽然下面描述了示例方法和 / 或材料， 但本发明实施 方式的实施或试验中可使用与本文所述的那些相似或者等同的方法和 / 或材料。如有冲 突， 以专利说明书为准， 包括定义。另外， 材料、 方法和实例仅为了说明， 而不旨在进行不必 要的限制。 附图说明 本文仅参考附图通过实例说明本发明的一些实施方式。关于下面详细讨论的附 图， 要强调的是， 所示细节仅为了举例， 用于示意性地讨论本发明的实施方式。 就此而言， 参 考附图所作的描述将使本领域技术人员明了本发明实施方式可以如何实施。
在该图中 ：
图 1A 和 1B 是载体的载体图谱 (vector maps)， 该载体用于编码根据本发明一些 实施方式的多肽， 即， SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC， 图 1A) 和 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC， 图 1B)， 并进一步编码对氨必西林 ( 氨苄青霉素， ampicillin)(Amp) 和嘌呤霉素 (puromycin) (Puro) 具有抗性的基因 ；
图 2 是 Western 印迹 ( 蛋白杂交印迹， Western blot) 图像， 示出遗传加工 ( 基因 设计， genetically engineered) 用于产生示例多肽 SEQ ID NO ： 158( 泳道 1 和 2) 和 SEQ ID NO ： 159( 泳道 3-5) 的 HEK 293T 细胞池中的 IgG Fc， 以及 50ng( 泳道 6)、 100ng( 泳道 7)、 200ng( 泳道 8) 和 300ng( 泳道 9) 的对照 IgG Fc 的表达 ；
图 3A ～ 3C 是 示 出 在 暴 露 于 肽 BKT-P2(SEQ ID NO ： 101) 前 后， IP-10( 图 3A)、 I-TAC( 图 3B) 和 MIG( 图 3C) 诱导的 T 细胞与 VCAM-1 的粘附随剪切流 (shear flow) 的变 化 ( 在热灭活的 SDF-1 细胞因子存在下情况的 T 细胞粘附示为对照 ) 的图表 ；
图 4A ～ 4C 是示出在暴露于根据本发明一些实施方式的多肽， BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 前后， IP-10( 图 4A)、 I-TAC( 图 4B) 和 MIG( 图 4C) 诱导的 T 细胞与 VCAM-1 的粘 附随剪切流的变化 ( 在热灭活的 SDF-1 细胞因子存在情况下的 T 细胞粘附示为对照 (den))
的图表 ；
图 5A 和 5B 是示出对照小鼠以及用具有 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC) 的示例多 肽处理的小鼠的 EAE( 实验自身免疫性脑脊髓炎 ) 平均临床得分随着用 PLP( 蛋白脂质蛋白 质 ) 免疫从而诱导急性疾病后的时间的变化 ( 图 5A)， 和 EAE 平均累积临床得分 ( 图 5B) 的 图表 ；
图 6A 和 6B 是示出对照小鼠以及用具有 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC) 或 SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC) 的示例多肽处理的小鼠的 EAE( 实验自身免疫性脑脊髓炎 ) 平均临床 得分随着用 PLP( 蛋白脂质蛋白质 ) 免疫从而诱导急性疾病后的时间的变化 ( 图 6A)， 和 EAE 平均累积临床得分 ( 图 6B) 的图表 ；
图 7 是示出对照小鼠以及用具有 SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC) 或 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC) 的示例多肽处理的小鼠的 EAE( 实验自身免疫性脑脊髓炎 ) 平均临床得分 随着用 MOG 肽免疫从而诱导慢性疾病后的时间的变化的图表 ；
图 8A 和 8B 是示出健康小鼠 ( 阴性 CTRL)、 关节炎小鼠 ( 阳性 CTRL) 以及用具有 SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC) 的示例多肽处理的关节炎小鼠的膝关节腔 (knee cavity) 中 的嗜中性粒细胞 ( 图 8A) 和单核细胞 ( 图 8B) 的水平的图表 ； 以及 图 9 是具有 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC) 和 SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC) 的示例 多肽对迟发型超敏反应的抑制 ( 示出地塞米松 (Dex.) 的抑制用于比较 ) 的图表。
具体实施方式
本发明公开了能够结合趋化因子的新型多肽， 更特别地但不排它地， 涉及能够调 节趋化因子依赖性过程如自身免疫、 炎症和癌症的多肽。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前， 应理解本发明的应用不必局限于下 面的说明所列出的或通过实施例列举的细节。本发明能够有其它实施方式， 或能够以多种 方式实施或实现。
如上面背景部分所述的， 已描述了 ( 例如， 在国际专利申请 PCT/IL03/00155( 以 WO 03/072599 公开 ) 和美国专利 No.7,488,717) 能够结合到趋化因子上并能够调节它们的生 物功能的肽和结构相关的化合物。此种肽的实例在 SEQ ID NO ： 1-157 中列出。由于其能 够调节趋化因子功能的能力， 此种肽具有多种治疗应用。 然而， 此种肽的治疗益处典型地受 到， 例如肽在体内的短半衰期的限制。
当试图制取具有改进特性的趋化因子结合肽时， 本发明人将趋化因子结合肽附接 ( 连接， attach) 到 Fc 结构域片段上。
如下面实施例部分证明的， 简化本发明实践的同时， 发现包含趋化因子结合肽和 Fc 结构域片段的多肽惊人地表现出改进的趋化因子结合能力。进一步发现， 该多肽表现出 改进的治疗免疫相关性疾病和障碍如多发性硬化、 关节炎和迟发型超敏反应的体内功效， 以及长的循环寿命 (circulation lifetime)。
现参考附图和表格， 图 1A 和 1B 示出用于表达根据本发明一些实施方式的示例多 肽的示例 DNA 构建体， 该示例多肽称为 BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 和 BKT-P46-FC(SEQ ID NO ： 159)。图 2 示出前述示例多肽在细胞培养物中的表达， 如通过 Western 印迹检测的。
“BKT-P2-FC” 和 “BKT-P46-FC” 是本发明所有者 (owners) 所有的商标。BKT-P2-FC是 指 还 在 临 时 专 利 申 请 No.61/213,493 中 称 为 “IL6 信 号 肽 -BKT-P2- 间 隔 子 -FC” 、 “P2-Fc” 、 “BKT-Fc-2” 、 “BKT-Fc-P2” 、 “IL6-P2-Fc” 、 “IL6-P2-Fc N297A” 和 “IL6-BioPep1-Fc N297A”的 多 肽。BKT-P46-FC 是 指 还 在 临 时 专 利 申 请 No.61/213,493 中 称 为 “IL6 信 号 肽 -BKT-P46- 间 隔 子 -FC” 、 “BKT-Fc-46” 、 BKT-FC-46” 、 “P46-FC” 、 IL6-P46-Fc” 、 “IL6-P46-Fc N297A” 和 “IL6-BioPep2-Fc N297A” 的多肽。
表 3 示 出 前 述 示 例 多 肽 与 多 种 趋 化 因 子 的 结 合 的 解 离 常 数 (dissociation constants)。
图 4A-4C 示出示例多肽 (SEQ ID NO ： 158) 对一些趋化因子生物活性 ( 诱导 T 细胞 粘附 ) 的抑制作用。 作为比较， 图 3A-3C 示出该多肽所基于的趋化因子结合肽 (SEQ ID NO ： 101) 对相同活性的抑制作用。表 4 概述了示例多肽 (SEQ ID NO ： 158 和 SEQ ID NO ： 159) 以及它们所基于的趋化因子结合肽 ( 分别为 SEQ ID NO ： 101 和 SEQ ID NO ： 76) 抑制多种趋 化因子活性的能力。
图 5A、 5B、 6 和 7 示出根据本发明一些实施方式的示例多肽对抗小鼠 EAE( 实验自 身免疫性脑脊髓炎 ) 进展的功效。图 8A 和 8B 示出示例多肽对抗小鼠关节炎的功效。图 9 示出示例多肽对抗迟发型超敏反应的功效。
表 5 给出可以包括在根据本发明实施方式的多肽中的趋化因子结合肽。
因而， 本文给出的实验结果表明， 根据本发明实施方式的多肽能够结合到趋化因 子上 ( 参见例如表 3)， 是甚至比相应趋化因子结合肽更有效的趋化因子活性调节剂 ( 参见， 例如表 4 和图 3A、 3B、 4A 和 4B)， 可以治疗有效地治疗多种病症 ( 参见例如图 5A-9)。
因此， 根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含至少一种附接到抗体 (e.g.、 IgG、 IgA、 IgD、 IgE、 IgM 抗 体 )Fc 结 构 域 或 Fc 结 构 域 片 段 上 的 趋 化 因 子 结 合 肽 的 分 离多肽。包含附接到 Fc 结构域或其片段上的肽的分子在本文中可称为 “肽体 ( 多肽， peptibodies)” 。
在一些实施方式中， 该多肽包含单个趋化因子结合肽。
替换地， 该多肽包含多于一个的趋化因子结合肽 ( 例如， 2、 3、 4 或 5 个趋化因子结 合肽 )。该趋化因子结合肽可以彼此相同或不同。
如本文使用的术语 “趋化因子结合肽” 是指任何特征为具有结合到溶液中至少一 种趋化因子上的能力的肽 ( 例如， 多达 20 个氨基酸残基的肽 )。示例趋化因子包括， 但不 局限于， CCL1( 其中 CCL 是趋化因子 (C-C 基序 ) 配体的简称 )、 MCP-1( 本领域中也称为 CCL2)、 MIP-1( 包括 MIP-1α 和 / 或 MIP-1β)、 RANTES( 本领域中也称为 CCL5)、 CCL6、 CCL7、 CCL8、 CCL9、 嗜酸性粒细胞趋化因子 ( 本领域中也称为 CCL11)、 CCL12、 CCL13、 CCL14、 CCL15、 CCL16、 CCL17、 CCL18、 CCL19、 CCL20、 CCL21、 CCL22、 CCL23、 CCL24、 CCL25、 CCL26、 CCL27、 CCL28、 CXCL1( 其中 CXCL 是趋化因子 (C-X-C 基序 ) 配体的简称 )、 CXCL2、 CXCL3、 CXCL4、 CXCL5、 CXCL6、 CXCL7、 白介素 (interleukin)-8( 本领域中也称为 CXCL8)、 MIG( 本领域中也 称为 CXCL9)、 IP-10( 本领域中也称为 CXCL10)、 I-TAC( 本领域中也称为 CXCL11)、 SDF-1( 本 领域中也称为 CXCL12)、 BCA-1( 本领域中也称为 CXCL13)、 CXCL14、 CXCL15、 CXCL16、 CXCL17、 XCL1、 XCL2 和 CX3CL1。根据一个实施方式， 该肽可以结合到至少一种选自以下的趋化因子 上： I-TAC( 干扰素可诱导的 T 细胞 α 化学引诱物 )、 IP-10(10kDa 干扰素 γ- 可诱导的蛋 白 )、 MIG(γ 干扰素诱导的单核因子 (monokine))、 MCP-1( 单核细胞趋化蛋白 -1)、 嗜酸性粒细胞趋化因子和 RANTES( 活化后调节的、 正常 T 细胞表达与分泌的 )。
与趋化因子的结合可以通过本领域中已知的任何合适的技术 ( 例如， ELISA) 测 定。 可选地， 该结合是这样的， 以便该肽与趋化因子的结合的解离常数 (Kd) 小于 10-4M， 可选 -5 -6 地小于 10 M， 并可选地小于 10 M。测定解离常数的合适的技术是技术人员已知的。
可以根据本发明实施方式使用的趋化因子结合肽描述在国际专利申请 PCT/ IL03/00155( 以 WO 03/072599 公开 ) 和美国专利 No.7,488,717 中。
在一些实施方式中， 该趋化因子结合肽的长度为 5 ～ 50 个氨基酸， 可选地 5 ～ 40 个氨基酸， 可选地 5 ～ 30 个氨基酸， 可选地 7 ～ 20 个氨基酸， 可选地 9 ～ 20 个氨基酸， 并 可选地为 10 ～ 20 个氨基酸。根据示例实施方式， 该趋化因子结合肽的长度为约 12 个氨基 酸。
可选地， 该趋化因子结合肽选自 SEQ ID NO ： 1 ～ 157。
在一些实施方式中， 该趋化因子结合肽的特征是存在至少 2 个组氨酸残基和整体 带正电荷 (overall positive charge)( 例如， 带正电荷的氨基酸数目多于带负电荷的氨基 酸 )， 其中该肽主要由选自 H、 S、 A、 L、 I、 K、 R、 T 和 P 的氨基酸组成 ( 例如， 该肽的至少 40％， 并可选地至少 50％由前述氨基酸组成 )。 具 有 前 述 特 征 的 肽 实 例 包 括， 但 不 局 限 于， SIFAHQTPTHKN(SEQ ID NO ： 100)、 SIPSHSIHSAKA(SEQ ID NO ： 101)、 SAISDHRAHRSH(SEQ ID NO ： 96)、 SAGHIHEAHRPL(SEQ ID NO ： 95)、 ACHASLKHRC(SEQ ID NO ： 44)、 AHSLKSITNHGL(SEQ ID NO ： 46)、 ESDLTHALHWLG(SEQ ID NO ： 54) 、HSACHASLKHRC(SEQ ID NO ： 69) 、WSAHIVPYSHKP(SEQ ID NO ： 143) 、 YATQHNWRLKHE(SEQ ID NO ： 145)、 CAHLSPHKC(SEQ ID NO ： 1)、 GVHKHFYSRWLG(SEQ ID NO ： 61)、 HPTTPIHMPNF(SEQ ID NO ： 66)、 SVQTRPLFHSHF(SEQ ID NO ： 113)， 和 VHTSLLQKHPLP(SEQ ID NO ： 133)。SIPSHSIHSAKA(SEQ ID NO ： 101)， 在本文称为 “BKT-P2” ， 是示例趋化因子结合 肽。
在一些实施方式中， 该趋化因子结合肽的特征是存在至少 2 个相邻的 ( 邻近的， adjacent) 组氨酸残基和整体带正电荷 ( 例如， 带正电荷的氨基酸数目多于带负电荷的氨 基酸 )， 其中该肽主要由选自 H、 P、 T、 L、 R、 W 和 F 的氨基酸组成 ( 例如， 该肽的至少 40％， 并 可选地至少 50％由前述氨基酸组成 )。
具 有 前 述 特 征 的 肽 实 例 包 括， 但 不 局 限 于， GDFNSGHHTTTR(SEQ ID NO ： 59)、 HHFHLPKLRPPV(SEQ ID NO ： 64)、 HHTWDTRIWQAF(SEQ ID NO ： 65)、 LDYPIPQTVLHH(SEQ ID NO ： 76)、 LLADTTHHRPWP(SEQ ID NO ： 79)、 TRLVPSRYYHHP(SEQ ID NO ： 125)、 CHHNLSWEC(SEQ ID NO ： 7) 和 SFWHHHSPRSPL(SEQ ID NO ： 99)。LDYPIPQTVLHH(SEQ ID NO ： 76) 在本文称为 “BKT-P46” ， 是示例趋化因子结合肽。
可选地， 该趋化因子结合肽具有表现出与选自 SEQ ID NO ： 1 ～ 157( 例如， SEQ ID NO ： 76 和 101) 的氨基酸序列具有至少 70％， 至少 80％， 至少 90％序列同源性的氨基酸序 列。可选地， 该序列同源性至少为 95％。可选地， 该序列同源性为 100％。
同源性可以利用国家生物技术信息中心 (NCBI)BlastP 软件用缺省参数测定。同 源性也可以指缺失、 插入或替换 (substitution) 变体， 包括其氨基酸替换及其具有生物活 性的多肽片段。
如本文使用的 “Fc 结构域” 是指抗体重链区， 典型地包含该重链的至少两个恒定结
构域 (CH2 和 CH3 结构域， 如同本领域中定义的这些术语 )。该 Fc 结构域可以例如以二聚 体形式， 通过用木瓜蛋白酶消化抗体获得。通过二硫键相连的 Fc 结构域多肽的二聚体形成 抗体的 “尾部” 区。如本领域众所周知的， 这些类别的抗体的 Fc 结构域可以是多聚体形式。 因而， 该 Fc 结构域可选地为单聚体， 可选地为二聚体， 并可选地为多聚体。可选地， 本文所 述的多肽是二聚体形式， 该多肽包含 Fc 二聚体， 或者为多聚体形式， 该多肽包含 Fc 多聚体。
该 Fc 结构域可以包括天然 Fc 结构域 ( 即， 抗体中天然存在的结构域 ) 的修饰 形式， 例如， 与天然 Fc 结构域具有至少 90％同源性， 可选地至少 95％同源性， 和可选地至 少 98 ％同源性的多肽。修饰的 Fc 结构域描述在例如国际专利申请 WO 97/34631 和 WO 96/32478 中。
可选地， 对天然 Fc 进行修饰以便除去提供本发明实施方式不需要的结构特征或 生物活性的位点。 此种位点的实例包括， 影响或参与二硫键形成、 与所选宿主细胞的不相容 性、 在所选宿主细胞中表达后 N 末端异质性 (N-terminal heterogeneity)、 糖基化、 与补体 的相互作用、 与 Fc 受体 ( 除了新生儿 Fc 受体 (neonatal Fc receptor)) 的结合， 和 / 或抗 体依赖性细胞毒性的残基。
根据本发明实施方式的多肽也可以包含 Fc 结构域的片段。可选地， 该片段包含如 上文定义的 Fc 结构域的至少 20％， 可选地至少 50％， 和可选地至少 80％。 该 Fc 结构域或其片段可选地包括新生儿 Fc 受体 (FcRn) 的结合位点。
如下面实施例部分中列举的， 根据本发明实施方式的多肽在血液循环中具有相对 长的寿命， 给予后显著水平的多肽在血液中保持至少 11 天。
根据一个实施方式， Fc 结构域或其片段与趋化因子结合肽附接形成体内半衰期比 单独趋化因子结合肽长的多肽。这可能是由于 Fc 结构域的血清半衰期长 ( 这可能是由于 Fc 通过结合到 FcRn 上而被再利用 (salvage))， 和 / 或由于该多肽的尺寸大于该趋化因子 结合肽， 这可以减少肾小球过滤 (glomerular filtration) 对血流的清除 (clearance)。 根 据另一个实施方式， 所形成的多肽与单独趋化因子结合肽相比免疫原性降低。
根据可选的实施方式， 该 Fc 结构域或其片段是人 Fc 结构域 ( 例如， 源自人抗体 ) 或其片段。
根据示例实施方式， 该 Fc 结构域 ( 或其片段 ) 是 IgG( 例如 IgG1)Fc 结构域 ( 或 其片段 )。可选地， 该 Fc 结构域、 或其片段是非糖基化的。
根据示例实施方式， 该 Fc 片段具有与带有 N297A 突变的人 IgG1 Fc 片段相对应的 SEQ ID NO ： 160。
可选地， 该 Fc 结构域 ( 或其片段 ) 的 N 末端附接 ( 直接或通过接头 ) 到趋化因子 结合肽上。该 N 末端可选地附接到至少一个趋化因子结合肽上， 例如， 通过附接到包含至少 一个趋化因子结合肽的序列上。
替换地或另外地， 该 Fc 结构域 ( 或其片段 ) 的 C 末端， 直接或通过接头 ( 例如氨基 酸接头 ) 附接到趋化因子结合肽上。该 C 末端可选地附接到至少一个趋化因子结合肽上。
除了本文所述的趋化因子结合肽和 Fc 结构域或片段之外， 本文所述的多肽可以 进一步包含一个或多个另外的肽序列。此种序列可以可选地选择， 以便提供期望的生物活 性或结构特征， 例如， 可改进该多肽的治疗功效或使该多肽容易生产的活性或特征。
因而， 例如， 该多肽可选地包含至少一个所选的能够指导该多肽的运送 ( 转运，
transport) 的信号肽。
可选地， 选择能够促进表达该多肽的细胞 ( 例如， 哺乳动物细胞 ) 分泌该多肽的信 号肽。
可选地， 包括空泡信号序列 (vacuolar signal sequence)( 针对植物转染产生的 多肽 )。
在示例实施方式中， 该多肽包含 IL-6( 白介素 -6) 信号肽 ( 例如 SEQ ID NO ： 161)， 或具有表现出与 IL-6 信号肽具有至少 90％同源性 ( 可选地至少 95％同源性 ) 的氨基酸序 列的信号肽。
上述另外的肽序列 ( 例如， 信号肽 ) 可以存在于该多肽的 N 末端， 或该多肽的 C 末 端， 或者该多肽的中间 ( 例如， 在 Fc 结构域或片段和趋化因子结合肽之间， 或者在两个趋化 因子结合肽之间 )。
因而， 本文所述的 Fc 结构域或片段、 一个趋化因子结合肽 ( 或多个趋化因子结合 肽 ) 和任意一个另外的肽 ( 或任意多个另外的肽 )( 如果存在 ) 可以在该多肽内以任何顺 序彼此附接。
该 Fc 结构域或片段、 一个趋化因子结合肽 ( 或多个趋化因子结合肽 ) 和任意一个 另外的肽 ( 或任意多个另外的肽 )( 如果存在 ) 直接或通过接头 ( 例如氨基酸接头 ) 独立 地彼此附接。 然而， 一些信号肽的活性取决于所处在多肽内的特定区域 ( 例如， N 末端、 C 末端 )。 因此， 根据一些实施方式， 信号肽位于该多肽内特定区域处。
根据示例实施方式， 该信号肽 ( 例如， IL-6 信号肽 ) 在该多肽的 N 末端。N 末端具 有信号肽的多肽实例包括下式多肽 ：
W-X-Z、 W-X-Y-Z、 W-Y-X-Z、 W-Y-X-Y-Z、 W-Z-X、 W-Z-Y-X、 W-Y-Z-X 和 W-Y-Z-Y-X，
其中 W 是信号肽， X 是趋化因子结合肽， Y 是接头 ( 例如， 氨基酸接头 )， Z 是 Fc 结 构域或片段。根据示例实施方式， 该多肽具有上式 W-X-Y-Z。
该接头 ( 也称为 “间隔子” ) 可选地为包含氨基酸、 二肽、 三肽， 或 4 个或更多氨基 酸的氨基酸接头。此种接头是有利的， 因为它们使该多肽能够包含单个连续 (contiguous) 多肽链， 该单个连续多肽链容易作为融合蛋白生产。 该接头典型地这样选择， 以便它不干扰 趋化因子结合肽与其靶趋化因子的结合。可选地， 该接头是由 4 ～ 10 个氨基酸组成的肽 ( 例如， 六肽 )。根据示例实施方式， 该接头是 SEQ ID NO ： 162 中列出的肽。在包含多于一 个的接头的实施方式中， 该接头可以彼此相同或不同。
根据本发明优选的实施方式， 该多肽能够结合到至少一个趋化因子上 ( 例如， 经 由该多肽中的趋化因子结合肽与该趋化因子的相互作用 )。多肽与趋化因子的结合在许多 情况下都会影响趋化因子 ( 例如， I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞趋化因子和 / 或 RANTES) 结合到趋化因子受体上的能力。
因此， 在一些实施方式中， 该多肽的特征是具有能够抑制至少一种趋化因子与趋 化因子受体结合的能力。可选地， 结合的抑制是这样的， 即， 在存在该多肽的情况下的解离 常数 ( 针对趋化因子与受体的结合 ) 比在缺少该多肽的情况下的解离常数高至少 10％， 可 选地至少 100％。
在一些实施方式中， 该多肽的特征是具有能够增强至少一种趋化因子与趋化因子
受体结合的能力。可选地， 结合的增强是这样的， 即， 在存在该多肽的情况下的解离常数 ( 针对趋化因子与受体的结合 ) 比在缺少该多肽的情况下的解离常数低至少 10％， 可选地 至少 50％。
应理解， 根据本发明实施方式的多肽可以可选地抑制至少一种趋化因子与趋化因 子受体结合， 也可以增强至少一种其它趋化因子与趋化因子受体结合。
如本文使用的术语 “多肽” 包括天然多肽 ( 例如， 降解产物、 以合成方式合成的多 肽或重组多肽 ) 和模拟肽 ( 典型地为以合成方式合成的 )， 以及类肽 (peptoids) 或半类肽 (semipeptoids)， 类肽或半类肽是多肽类似物， 可以具有例如使该多肽在身体内更稳定或 更能够透入细胞中的修饰。 此种修饰包括， 但不局限于， N′末端修饰， C′末端修饰， 多肽键 修饰， 包括但不局限于， CH2-NH、 CH2-S、 CH2-S ＝ O、 O ＝ C-NH、 CH2-O、 CH2-CH2、 S ＝ C-NH、 CH ＝ CH 或 CF ＝ CH， 主链修饰和残基修饰。 制备模拟肽化合物的方法在本领域中是熟知的， 明确说明在例如 Quantitative Drug Design， C.A.Ramsden Gd.， Chapter 17.2， F.Choplin Pergamon Press(1992) 中。
该 多 肽 内 的 多 肽 键 (-CO-NH-) 可 以 被 例 如 N- 甲 基 化 键 (-N(CH3)-CO-)、 酯键 (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、 酮 亚 甲 基 键 (-CO-CH2-)、 α- 氮 杂 键 (-NH-N(R)-CO-) 替 换， 其 中 R 是 任 何 烷 基， 例 如， 甲 基、 carba 键 (-CH2-NH-)、 羟 基 亚 乙 基 键 (-CH(OH)-CH2-)、 硫 代 酰 胺 键 (-CS-NH-)、 烯 烃 双 键 (-CH ＝ CH-)、 逆 向 酰 胺 键 (-NH-CO-)、 多肽衍生物 (-N(R)-CH2-CO-)， 其中 R 是天然出现在碳原子上的 “正 (normal)” 侧链。
这些修饰可以发生在沿着多肽链的任何键上， 甚至同时出现在数个 ( 例如 2-3 个 ) 键上。
可以用天然芳香族氨基酸， Trp、 Tyr 和 Phe 替换合成的非天然酸如苯基甘氨酸、 1， 2， 3， 4- 四氢异喹啉 -3- 羧酸 (TIC)、 萘基丙氨酸 (Nal)、 Phe 的环甲基化衍生物、 Phe 的卤化 衍生物或 o- 甲基 -Tyr。
本文所述的天然存在的肽和多肽 ( 例如， Fc 结构域序列、 信号肽 ) 的氨基酸序列， 可以是天然存在的蛋白质中多肽的氨基酸序列或者包含保守性或非保守性替换的那些。
如本文使用的 “保守性替换” 是指用天然或非天然存在的氨基酸或具有相似空间 特性 (steric properties) 的模拟肽替换该肽天然序列中存在的氨基酸。如果待替换天然 氨基酸的侧链是极性或疏水性的， 那么保守性替换应当用也是极性或疏水性的 ( 除了具有 与被替换氨基酸侧链具有相同的空间特性之外 ) 天然存在的氨基酸、 非天然存在的氨基酸 或模拟肽部分进行替换。
因为天然存在的氨基酸通常是根据它们的特性分类的， 所以容易确定用天然存在 的氨基酸进行的保守性替换， 只要记住按照本发明带电氨基酸被空间上类似的不带电氨基 酸的替换被认为是保守性替换。
对于用非天然存在的氨基酸进行保守性替换， 也可以使用本领域熟知的氨基酸类 似物 ( 合成氨基酸 )。天然存在的氨基酸的模拟肽明确记载在技术人员已知的文献中。
当进行保守性替换时， 替换氨基酸的侧链上应当具有与原始氨基酸侧链的相同或 相似的官能团。
如本文使用的术语 “非保守性替换”是指用另一种具有不同电化学和 / 或空 间特性的天然存在或非天然存在的氨基酸替换如亲本序列 (parent sequence) 中存在的氨基酸。因而， 替换氨基酸的侧链可以显著地大于 ( 或小于 ) 被替换天然氨基酸的 侧链， 和 / 或可以具有电特性显著地不同于被替换氨基酸的官能团。这类非保守性替 换的实例包括用苯丙氨酸或环己基甲基甘氨酸替换丙氨酸、 用异亮氨酸替换甘氨酸， 或 用 -NH-CH[(-CH2)5COOH]-CO- 替换天冬氨酸。 落在本发明范围内的那些非保守性替换， 是还 构成具有天然肽活性的肽或多肽的那些 ( 例如， Fc 结构域序列、 信号肽 )。
如本说明书和下面权利要求部分中使用的， 术语 “一种氨基酸” 或 “多种氨基酸” 应理解成包括 20 种天然存在的氨基酸 ； 体内翻译后通常被修饰的那些氨基酸， 包括， 例如， 羟基脯氨酸、 磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸 ； 以及其它不寻常氨基酸， 包括但不局限于， 2- 氨基 己二酸、 羟基赖氨酸、 异锁链素 (isodesmosine)、 正缬氨酸 (nor-valine)、 正亮氨酸和鸟氨 酸。此外， 术语 “氨基酸” 包括 D- 和 L- 氨基酸。
下表 1 和 2 列出可以与本发明一起使用的天然存在的氨基酸 ( 表 1) 和非常规或 修饰的氨基酸 ( 表 2)。
表1
氨基酸 丙氨酸 精氨酸 天冬酰胺 天冬氨酸 半胱氨酸 谷氨酰胺 谷氨酸 甘氨酸 组氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 赖氨酸 蛋氨酸 苯丙氨酸 三个字母的缩写 Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Iie Leu Lys Met Phe 单字母符号 A R N D C Q E G H I L K M F15CN 102482324 A 脯氨酸 丝氨酸 苏氨酸 色氨酸 酪氨酸 缬氨酸 任何上述氨基酸
说Pro Ser Thr Trp Tyr Val Xaa明书P S T W Y V X12/39 页表2
优选利用重组技术制取本发明多肽， 因为这些技术更适合于制取相对长的多 肽 ( 例如， 长于 20 个氨基酸 ) 以及它的大批量生产。此种重组技术描述在下列文献中 ：
Bitter 等人， (1987)Methods in Enzymol.153 ： 516-544， Studier 等人 (1990)Methods in Enzymol.185 ： 60-89， Brisson 等 人 (1984)Nature 310 ： 511-514， Takamatsu 等 人 (1987) EMBO J.6 ： 307-311， Coruzzi 等 人 (1984)EMBO J.3 ： 1671-1680， Brogli 等 人， (1984) Science 224 ： 838-843， Gurley 等人 (1986)Mol.Cell.Biol.6 ： 559-565 and Weissbach & Weissbach， 1988， Methods for Plant Molecular Biology， Academic Press， NY， Section VIII， pp 421-463。
为了利用重组技术生产本发明多肽， 将编码本发明多肽的多核苷酸连接到核酸表 达载体中， 该核酸表达载体包含在适合于指导本发明多肽在宿主细胞中的组成型、 组织特 异性或诱导型转录的顺式调节序列 ( 例如， 启动子序列 ) 的转录调控下的多核苷酸序列。
可用于表达趋化因子结合肽的分离多核苷酸实例在 SEQ ID NO ： 163 和 164 中列 出。可用于表达 Fc 片段的分离多核苷酸序列实例为如 SEQ ID NO ： 165 中所列出的。可用 于表达 IL-6 信号肽的分离多核苷酸实例在 SEQ ID NO ： 166 中列出。可用于表达接头的分 离多核苷酸实例在 SEQ ID NO ： 167 中列出。
可用于表达根据本发明一些实施方式的多肽的示例多核苷酸序列在 SEQ ID NO ： 168 和 169 中列出。
短语 “分离多核苷酸 ( 分离的多核苷酸， isolated polynucleotide)” 是指分离并 以 RNA 序列、 互补多核苷酸序列 (cDNA)、 基因组多核苷酸序列和 / 或复合多核苷酸序列 ( 例 如， 上述组合 ) 形式提供的单链或双链核酸序列。
如本文使用的， 短语 “互补多核苷酸序列” 是指利用逆转录酶或任何其它 DNA- 依 赖性 DNA 聚合酶使信使 RNA 逆转录形成的序列。此种序列随后可以利用 DAN 依赖性 DNA 聚 合酶在体内或体外扩增。
如本文使用的， 短语 “基因组多核苷酸序列” 是指从染色体中衍生 ( 分离 ) 的序列， 因而代表染色体的连续部分 (contiguous portion)。
如 本 文 使 用 的，短 语 “复 合 多 核 苷 酸 序 列 (composite polynucleotide sequence)” 是指至少部分互补和至少部分基因组的序列。 复合序列可以包括编码本发明多 肽所需的一些外显子 (exonal) 序列， 以及介于其间的内含子序列。该内含子序列可以是任 何来源的， 包括其它基因， 典型地包括保守性剪接信号序列。 此种内含子序列可以进一步包 括顺式作用的表达调节元件。
如所述的， 本发明实施方式的多核苷酸可以进一步包含编码针对多肽分泌的信号 肽 ( 如上文所讨论的 ) 的信号序列。
在表达和分泌之后， 可选地从形成成熟多肽的前体蛋白中除去信号肽。
本发明多核苷酸可以利用例如本文下面实施例 1 中描述的 PCR 技术， 或本领域中 已知的用于连接两种不同 DNA 序列的任何其它方法或程序 ( 步骤， procedure) 制备。参 见， 例如， “Current Protocols in Molecular Biology” ， eds.Ausubel 等人， John Wiley & Sons， 1992。
如上文所述的， 本发明多核苷酸序列典型地插入在表达载体 ( 即， 核酸构建体 ) 中 从而使重组多肽能被表达。本发明实施方式的表达载体包括使这种载体适合于在原核生 物、 真核生物， 或优选二者 ( 例如， 穿梭载体 (shuttle vectors)) 中复制和整合的另外序 列。典型的克隆载体包含转录和翻译起始序列 ( 例如， 启动子、 增强子 ) 以及转录和翻译终止子 ( 例如， 多聚腺苷化信号 )。
真核启动子典型地包含两类识别序列， TATA 框和上游启动子元件。TATA 框位于转 录起始点上游 25 ～ 30 个碱基对处， 被认为参与指导 RNA 聚合酶开始 RNA 的合成。其它上 游启动子元件决定转录起始速率。
与同源或异源启动子连接时， 增强子元件可促进转录提升至 1,000 倍。增强子 在处于转录起始点上游或者下游的时候是具有活性的。源自病毒的许多增强子元件具有 宽广的宿主范围， 并在多种组织中具有活性。例如， SV40 早期基因增强子适合于许多细胞 类型。适合于本发明的其它增强子 / 启动子组合包括来源于多瘤病毒 (polyoma virus)、 人或鼠巨细胞病毒 (cytomegalovirus， CMV) 的那些， 以及来自各种逆转录病毒如鼠白血 病病毒、 鼠或 Rous 肉瘤病毒和 HIV 的长末端重复序列。参见 Enhancers and Eukaryotic Expression， Cold Spring Harbor Press， Cold Spring Harbor， N.Y.1983， 该文献通过引 用合并在此。
在构建表达载体时， 优选将启动子设置成与异源转录起始位点的距离和它在自然 环境下与转录起始位点的距离近似相同。 然而， 如本领域众所周知的， 在不损坏启动子功能 的情况下可以对这个距离的各种变化进行调节。
除了已描述的元件以外， 本发明的表达载体还可典型地包含其它旨在提高克隆核 酸的表达水平或使携带重组 DNA 的细胞的鉴定易于进行的特定元件。例如， 许多动物病毒 包含促进病毒基因组在允许的细胞类型中进行额外染色体复制的 DNA 序列。携载这些病毒 复制子的质粒可以游离地复制 ( 作为附加体地复制， replicated episomally)， 只要质粒上 携带的基因或宿主细胞基因组的基因能够提供合适的因子即可。
该载体可以包括或可以不包括真核复制子。如果存在真核复制子， 则该载体可利 用合适的可选标记 (selectable marker) 在真核细胞中扩增。如果该载体不包含真核复制 子， 则无法进行游离型扩增 (episomal amplification)。 相反， 重组 DNA 整合到工程细胞的 基因组中， 其中启动子指导期望核酸的表达。
本发明的表达载体可以进一步包括， 另外的允许例如从单一 mRNA 如内核糖体进 入位点 (internal ribosome entry site， IRES) 翻译数种蛋白质的多核苷酸序列和供启动 子嵌合多肽基因组整合用的序列。
哺 乳 动 物 表 达 载 体 的 实 例 包 括， 但 不 限 于， 可 从 Invitrogen 获 得 的 pcDNA3、 pcDNA3.1(+/-)、 pGL3、 pZeoSV2(+/-)、 pSecTag2、 pDisplay、 pEF/myc/cyto、 pCMV/myc/cyto、 pCR3.1、 pSinRep5、 DH26S、 DHBB、 pNMT1、 pNMT41、 pNMT81， 可从 Promega 获得的 pCI， 可从 Strategene 获得的 pMbac、 pPbac、 pBK-RSV 和 pBK-CMV， 可从 Clontech 获得的 pTRES， 和它 们的衍生物。
也可以使用包含来自于真核病毒如逆转录病毒的调节元件的表达载体。 SV40 载体 包括 pSVT7 和 pMT2。源于牛乳头瘤病毒的载体包括 pBV-1MTHA， 源于艾伯斯坦 - 巴尔病毒 + 的载体包括 pHEBO 和 p2O5。其它示例载体包括 pMSG、 pAV009/A 、 pMTO10/A+、 pMAMneo-5、 杆 状病毒 pDSVE， 和任何其它允许蛋白表达在 SV-40 早期启动子、 SV-40 晚期启动子、 金属硫蛋 白启动子 (metallothionein promoter)、 鼠乳腺肿瘤病毒启动子、 Rous 肉瘤病毒启动子、 多 角体蛋白启动子 (polyhedrin promoter) 或其它对真核细胞的表达有效的启动子的指导下 进行的载体。病毒是非常专一的感染原， 它们已在许多情况下发生演变 ( 进化， evolve) 从而 逃避宿主防御机制。典型地， 病毒感染特定细胞类型并在其中繁殖。病毒载体的靶向特异 性利用它的天然特异性而特异性地靶向预定细胞类型， 从而将重组基因导入到受感染细胞 中。因此本发明使用的载体类型将取决于转化的细胞类型。
重组病毒载体对本发明实施方式的多肽表达有用， 因为它们具有诸如横向感染 (lateral infection) 的优点。横向感染是例如逆转录病毒生命周期中固有的， 是单一受 感染细胞产生很多可出芽并感染邻近细胞的子代病毒粒子的过程。结果是大面积迅速受 到感染， 其大部分最初并不是通过原始病毒颗粒感染的。这与纵向型感染 (vertical-type infection) 形成对比， 在纵向型感染中感染原仅通过母系子代 (daughter progeny) 传播。 也可生产不可横向传播的病毒载体。 如果期望目的是将特定基因导入到有限数目的靶细胞 中， 则这种性质可能是有用的。
多种原核或真核细胞可用作表达本发明多肽的宿主表达系统。这些包括， 但不限 于， 微生物， 如用包含多肽编码序列的重组细菌噬菌体 DNA、 质粒 DNA 或粘粒 DNA 表达载体转 化的细菌 ( 例如， 大肠杆菌， 包括但不局限于大肠杆菌菌株 BL21(DE3)plysS、 BL21， (DE3)RP * 和 BL21 以及枯草杆菌 )， 用包含多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母， 用包含多 肽编码序列的重组病毒表达载体 ( 如花椰菜花叶病毒， CaMV ； 烟草花叶病毒， TMV) 感染或用 包含多肽编码序列的重组质粒表达载体如 Ti 质粒转化的植物细胞系统。
有多种方法可以用来将本发明表达载体导入到宿主表达系统细胞中。 此种方法一 般地描述在以下文献中 ： Sambrook 等人， Molecular Cloning ： ALaboratory Manual， Cold Springs Harbor Laboratory， New York(1989， 1992)， in Ausubel 等人， Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley and Sons， Baltimore， Md.(1989)， Chang 等 人， Somatic Gene Therapy， CRC Press， Ann Arbor， Mich.(1995)， Vega 等人， Gene Targeting， CRC Press， Ann Arbor Mich.(1995)， Vectors ： A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses， Butterworths， Boston Mass.(1988)and Gilboa et at.[Biotechniques 4(6) ： 504-512， 1986]， 并包括例如， 用重组病毒载体进行的稳定或短暂转染、 脂质转染、 电 穿孔和感染。另外， 对于正 - 负选择方法参见美国专利 No.5,464,764 和 5,487,992。
通过病毒感染导入核酸具有优于其它方法如脂质转染和电穿孔的数个优点， 因为 病毒的感染性质而可以获得更高的转染效率。
本发明多肽的核酸序列可以针对在特定宿主细胞中的表达进行优化。 此种序列修 饰的实例包括， 但不局限于， 改变 G/C 含量至更接近感兴趣物种中通常发现的， 和除去非典 型地在物种中发现的密码子， 通常称为密码子优化。
短语 “密码子优化” 是指选择合适的 DNA 核苷酸用于接近感兴趣物种内密码子使 用的结构基因或其片段内。因此， 优化的基因或核酸序列是指为了利用所选物种内统计 学上优选或统计学上偏好的密码子已经将其中天然或天然产生的基因的核苷酸序列进行 修饰的基因。通常在 DNA 水平上检测核苷酸序列， 并使用任何合适的程序测定针对在物 种中的表达进行优化的编码区， 这些方法如 Sardana 等 (1996， Plant Cell Reports 15 ： 677-681) 中所述的。 在这种方法中， 可以计算密码子使用的标准偏差， 密码子偏好的量度标 准， 首先发现天然基因每个密码子的使用相对于所选物种高度表达的基因的比例方差， 接 着计算均方差。所用公式是 ： 1SDCU ＝ n ＝ 1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N， 其中 Xn 是指高度表达的基因中的密码子的使用频率 n， 其中 Yn 是指目标基因中的密码子的使用频率 n， N 是指感兴趣 基因中的密码子总数。
根据特定细胞类型的优选密码子使用， 优化核酸序列的一种方法是基于密码子 优化表的直接使用， 无需进行任何额外的统计学计算， 密码子优化表为， 例如通过日本的 NIAS( 农业生物科学研究所 )DNA 库在密码子使用数据库在线提供的那些 (http://www. kazusa.or.jp/condon/)。 密码子使用数据库含有供许多不同物种用的密码子使用表， 已经 基于 Genbank 中呈现的数据在统计学上测定了每个密码子使用表。
通过使用上述表来测定特定物种中每个氨基酸的最优选或最偏好的密码子， 编码 感兴趣蛋白的天然存在的核苷酸序列对于该特定物种是密码子优化的。 这可以通过用关于 氨基酸在统计学上更偏好的相应密码子替代特定物种基因组中具有低统计学发生率的密 码子来实现。 然而， 可以选择一个或多个不太偏好的密码子来删除现有的限制位点， 从而在 潜在有用的连接处 (5’ 和 3′端从而添加信号肽或终止盒 (termination cassettes)， 可以 用来切割或剪接片段来产生正确全长序列的内部位点 ) 创建新的限制位点， 或除去负面影 响 mRNA 稳定性或表达的核苷酸序列。
在任何修饰之前， 天然存在的编码核苷酸序列可能已经含有许多对应于特定物种 中统计学上偏好的密码子。因此， 天然核苷酸序列的密码子优化可以包括测定天然核苷酸 序列内哪个密码子对于特定物种不是统计学上偏好的， 和根据特定物种的密码子使用表对 这些密码子进行修饰从而产生密码子优化的衍生物。 修饰核苷酸序列对于特定物种的密码 子使用可以是全部或部分优化的， 只要修饰核苷酸序列编码的蛋白质是以高于相应天然存 在的或天然的基因编码的蛋白质的水平产生的即可。 通过改变密码子使用构建合成基因描 述于例如 PCT 专利申请 93/07278 中。
因此， 本发明包括上文所述的核酸序列、 其片段、 可与其杂交的序列、 与其同源的 序列、 与其直系同源 (orthologous) 的序列、 编码具有不同密码子使用的相似多肽的序列、 特征在于突变的改变序列， 该突变为， 例如一个或多个核苷酸的缺失， 插入或替换， 其是天 然发生的或人工诱导的， 随机或以有目标的方式进行的。
独立于宿主细胞系统， 应理解除了包含用于转录和翻译所插入编码序列 ( 编码该 多肽 ) 的必需元件， 本发明表达构建体还可以包括设计用于优化所表达多肽的稳定性、 生 产、 纯化、 产率或活性的序列。
在允许表达大量重组多肽的有效条件下培养所转化细胞。有效培养条件包括， 但 不局限于， 允许生产蛋白质的有效培养基、 生物反应器、 温度、 pH 和氧气条件。有效培养基 是指可培养细胞生产本发明重组多肽的任何培养基。此种培养基典型地包括具有可同化 碳、 氮和磷酸酯来源， 以及适当的盐、 矿物质、 金属和其它营养物如维生素的水溶液。 本发明 细胞可以在常规发酵生物反应器、 摇瓶、 试管、 微量滴定盘 (microtiter dishes) 和培养皿 (petri plates) 中培养。培养可以在适合于重组细胞的温度、 pH 和氧含量条件下执行。此 种培养条件在技术人员的技能范围内。
根据用于生产的载体和宿主系统， 本发明所得多肽可以保留在重组细胞中、 分 泌 到 发 酵 培 养 基 中、 分 泌 到 两 个 细 胞 膜 之 间 的 间 隙， 如大肠杆菌的细胞周质间隙 (periplasmic space) 中， 或者保留在细胞或病毒膜表面上。
培养预定时间之后， 对重组多肽进行回收。本文使用的短语 “回收重组多肽” 是指收集包含多肽的全部发酵培养基， 并不意味 着需要额外的分离或纯化步骤。
因而， 本发明多肽可利用多种标准蛋白纯化技术进行纯化， 如， 但不限于， 亲 和 色 谱 法、 离 子 交 换 色 谱 法、 过 滤、 电 泳、 疏 水 作 用 色 谱 法 (hydrophobic interaction chromatography)、 凝胶过滤色谱法、 反相色谱法、 伴刀豆球蛋白 A 色谱法 (concanavalin A chromatography)、 色谱聚焦和差别溶解 (differential solubilization)。
本实施方式的多肽可以通过亲和色谱法常规纯化。蛋白质 A 作为亲和配体的适 合性取决于物种和用在嵌合体中的免疫球蛋白 Fc 结构域的同种型 (isotype)。蛋白质 A 可以用于纯化基于人 γ1、 γ2 或 γ4 重链的嵌合分子 [Lindmark 等人， J.Immunol.Meth.， 62 ： 1-13(1983)].Protein G is preferably used for all mouse isotypes and for humanγ3[Guss 等人， EMBO J.， 5： 1567-1575(1986)]。亲和配体附着的固体载体最经常为 琼脂糖， 但也可以利用其它固体载体。机械稳定的固体载体， 如可控多孔玻璃 (controlled pore glass) 或聚 ( 苯乙烯二乙烯基 ) 苯， 可以获得较琼脂糖可以实现的更快的流速和更 短的加工时间。使嵌合分子结合到蛋白质 A 或 G 亲和柱上的条件完全由 Fc 结构域的特性， 即， 它的物种和同种型控制。一般地， 当选择适当的配体时， 高效结合直接在非条件培养液 中进行。本发明这个方面的结合多肽可以在酸性 pH(3.0 或高于 3.0) 下， 或在含有温和离 液盐 (chaotropic salt) 的中性 pH 缓冲液中高效地洗脱。这个亲和色谱分离步骤可以使 多肽制品纯度＞ 95％。 可以针对蛋白质 A 或 G 使用本领域中已知的其它方法代替亲和色谱法， 或与亲 和色谱法一并纯化本发明实施方式的多肽。例如， 预期该多肽的性质类似于亲硫凝胶色 谱 (thiophilic gel chromatography) 分离的抗体 [Hutchens 等人， Anal.Biochem.， 159 ： 217-226(1986)]and immobilized metal chelate chromatography[Al-Mashikhi et al.， J.Dairy Sci.， 71 ： 1756-1763(1988)]。
为了便于回收， 可以将所表达的编码序列设计成编码本发明多肽和融合的可切割 部分， 例如组氨酸。 此种融合蛋白可以设计成这样的， 以便该多肽可以容易地通过亲和色谱 分离， 例如， 通过固定在对可切割部分有特异性的柱子上。
如果切割位点设计在多肽和可切割部分之间， 那么通过用特异性切割这个位 点 处的融 合 蛋 白 的 适当的 酶或药 剂进行处理可 以使该色 谱柱释放该多 肽 [ 例如， 参 见 Booth 等 人， Immunol.Lett.19 ： 65-70(1988) ； 和 Gardella 等 人， J.Biol.Chem.265 ： 15854-15859(1990)]。
本发明多肽优选以 “基本纯” 的形式收回。
如本文使用的短语 “基本纯” 是指允许该多肽有效地用于本文所述的应用中的纯 度。
除了可以在宿主细胞中合成之外， 本发明多肽也可以利用体外表达系统合成。这 些方法是本领域熟知的， 并且该系统的组分是可商购获得的。
该多肽可以按原样使用， 或进一步修饰。
例如， 可以通过将水溶性聚合物 ( 例如， 聚乙二醇 ) 附接到该多肽上， 对该多肽进 行修饰。 此种水溶性聚合物的附接可以改进该多肽的生物活性， 例如， 通过提高该多肽的溶 解性， 降低该多肽的毒性， 延长该多肽的循环半衰期 ( 例如， 通过降低肾小球过滤 )， 和/或
保护该多肽免受蛋白水解降解进行。
因此， 根据本发明的可选实施方式， 将本文所述的多肽附接到水溶性聚合物上。 聚 乙二醇是合适的水溶性聚合物。适合 ( 例如， 无毒 ) 附接到用于药物给予的多肽上的另外 水溶性聚合物对于本领域技术人员而言是明显的。
该水溶性聚合物可以附接到该多肽的任何部分上 ( 直接或经由接头 )。 可选地， 该 水溶性聚合物附接到除趋化因子结合肽以外的多肽部分上， 以便不干扰其趋化因子结合活 性。
如本文所述和下面实施例部分列举的， 本文所述的多肽对调节趋化因子活性有 效， 其可以具有许多有利的治疗应用。因而， 本文提供了用于调节趋化因子活性和 / 或治疗 多种医学病症的新型高效方法。
因此， 在本发明实施方式的一个方面， 提供了调节趋化因子 ( 例如， I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞趋化因子和 / 或 RANTES) 的生物效应的方法， 该方法包括向需要 其的受验者给予治疗有效量的本文所述的多肽 ( 例如， 本文所述的修饰或未修饰多肽 )。
如本文使用的术语 “方法” 是指用于完成给定任务的方式、 方法、 技术和程序， 包括 但不限于， 化学、 药学、 生物学、 生物化学和医学领域技术人员已知， 或易于从已知方式、 方 法、 技术和程序开发出的那些方式、 方法、 技术和程序。
如下面实施例部分证明的， 本文所述的多肽可以用于治疗多种医学病症。可以通 过包含向需要其的受验者给予本文所述的多肽 ( 例如， 本文所述的修饰或未修饰多肽 ) 的 方法， 治疗该病症。 可以根据本发明实施方式治疗的病症实例包括， 但不局限于， 炎症、 过敏 症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺 血。
可选地， 给予包含静脉给予、 口服给予、 皮下给予、 局部给予和 / 或鼻内给予。
应理解， 本文所述的多肽的 Fc 结构域或片段与单独的趋化因子结合肽相比可以 提供较长的多肽循环半衰期。由于半衰期较长， 所以可以以较小的给予频率在体内维持治 疗有效水平的多肽。
因此， 根据一些实施方式， 给予每周进行不多于一次， 可选地每月进行不多于两 次， 可选地每月进行不多于一次， 可选地每两个月进行不多于一次， 可选地每三个月进行不 多于一次， 和可选地每六个月进行不多于一次。
在替换实施方式中， 单次给予足以获得期望的治疗效果。
类似地， 根据本发明一些实施方式的方面， 提供了如本文所述的多肽 ( 例如， 本文 所述的修饰或未修饰多肽 ) 在制造用于调节 ( 例如， 如本文所述的抑制和 / 或增强 ) 趋化 因子 ( 例如， I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞趋化因子和 / 或 RANTES) 生物效应的 药物中的用途。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了本文所述的多肽 ( 例如， 本文所述的修 饰或未修饰多肽 ) 在制造用于治疗选自以下的病症的药物中的用途 ： 炎症、 过敏症、 迟发型 超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑 狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
如本文使用的， 术语 “治疗” 包括阻断、 基本抑制、 慢化 ( 减缓， slowing) 或逆转病 症的进展， 基本改善病症的临床或美学 (aesthetical) 症状， 或者基本阻止病症的临床或 美学症状出现。
待治疗受验者可以是人或非人动物。优选地， 该受验者是哺乳动物。在一些实施 方式中， 该受验者是人。
利用如本文所述的多肽进行的治疗可以单独提供， 或者与已知对治疗特定疾病有 用的其它药剂一起提供。 本文所述的药物和药物组合物可以可选地进一步包含一种或多种 此类药剂。
可选地， 本文所述的药剂调配用于静脉、 口服、 皮下、 局部给予和 / 或鼻内给予。
可以根据本文所述的本发明实施方式调节的趋化因子的生物效应的实例包括， 但 不局限于， 炎性效应、 细胞迁移、 肿瘤生长和癌转移。
在本文所述的本发明任何方面， 调节生物效应可以包含抑制或增强生物效应。在 示例实施方式中， 调节包含抑制。可选地， 抑制至少一种趋化因子的生物效应， 并增强另外 的趋化因子的生物效应。
在本文所述的方法和用途的任何一个中， 该多肽可以单独使用， 或者， 优选地， 用 作进一步包含药学可接受载体的药物组合物的一部分。
因而， 根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含如本文所述的多肽和药学可 接受载体的药物组合物。
在一些实施方式中， 该组合物包装在包装材料中， 并以印刷形式在该包装材料中 或上标识用于调节如本文所述的趋化因子 ( 例如， I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞 趋化因子和 / 或 RANTES) 的生物效应。
在一些实施方式中， 该组合物包装在包装材料中， 并以印刷形式在该包装材料中 或上标识用于治疗选自以下的病症 ： 炎症、 过敏症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体 移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑 病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
在本发明各个方面， 本文所述的多肽可以照原样或以其药学可接受盐形式给予或 以其它方式利用。
短语 “药学可接受盐” 是指带电荷的母体化合物和其反离子， 其典型地用于改进母 体化合物的溶解性和 / 或降低母体化合物对生物体造成的任何显著刺激， 同时不阻断所给 予化合物的生物活性和特性。
合适的给予途径可以， 例如包括吸入、 口服、 颊部、 直肠、 经粘膜、 经真皮、 真皮内、 经鼻、 肠和 / 或肠胃外途径， 肌内、 皮下和 / 或髓内注射途径， 鞘内、 直接心室内、 静脉、 腹膜 内、 鼻内和 / 或眼内注射途径， 和 / 或直接注入受验者组织区域的途径。 在可选实施方式中， 使用静脉途径、 口服途径、 皮下途径、 局部途径和 / 或鼻内途径。
对于皮肤疾病和障碍 ( 例如， 银屑病、 皮肤过敏症、 皮肤超敏反应 )， 可选地使用局 部给予， 例如， 利用调配用于局部给予的乳膏、 洗液、 凝胶或粉末。
本文所述的方法、 组合物和用途利用治疗有效量的多肽。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
对于用在本发明方法和用途中的任何制剂， 治疗有效量或剂量可以根据体外试验 进行初始估计。 例如， 可以在动物模型中调配剂量， 此种信息可以用于更准确地确定对人有 用的剂量。
本文描述的活性成分的毒性和治疗效能可通过体外、 细胞培养物或实验动物中的 标准药物程序来确定。可利用从这些体外和细胞培养物分析及动物研究中获得的数据， 调 配用于人的剂量范围。该剂量可随着采用的剂型和利用的给予途径而改变。确切的制剂、 给予途径和剂量可由个人医生根据患者的病症加以选择 ( 参见如 Fingl 等人， 1975， ″ The Pharmacological Basis of Therapeutics″， Ch.1 p.1)。
给药可以是单次给予或多次给予， 如本文所述的。
如本文所述的包含一种或多种多肽的药物组合物可以通过本领域熟知的工艺制 造， 如通过常规的混合、 溶解、 造粒、 包糖衣 (dragee-making)、 研粉 (levigating)、 乳化、 作 成胶囊 ( 囊封， encapsulating)、 包埋 (entrapping) 或冷冻干燥工艺。
根据本发明实施方式使用的药物组合物可用常规方法利用一种或多种使活 性成分容易加工成可以药用的制剂的生理可接受载体 ( 包含赋形剂和辅助物 ( 辅剂， auxiliaries)) 调配。合适的剂型取决于所选的给予途径。
对于注射， 该活性成分可以调配在水溶液中， 优选在生理相容性缓冲液如汉克斯 溶液 (Hank’ s 溶液 )、 林格溶液 (Ringer’ s 溶液 )， 或生理盐缓冲液中。
对于口服给予， 该化合物可以容易地通过将活性化合物与本领域熟知的药学可接 受载体相结合而调配。 此类载体使本发明化合物能够调配成供患者口服摄取的片剂、 丸剂、 糖衣丸、 胶囊、 液体、 凝胶、 糖浆剂、 浆液、 混悬剂等。 口服使用的药物制剂可利用固体赋形剂 制造， 可选地研磨所得混合物， 需要时可加入合适的辅助物并在此后对颗粒混合物进行加 工， 从而获得片剂或糖衣核 (dragee cores)。 合适的赋形剂为， 特别是， 填充剂如糖类， 包括 乳糖、 蔗糖、 甘露醇或山梨醇， 纤维素制品如， 玉米淀粉、 小麦淀粉、 大米淀粉、 马铃薯淀粉、 明胶、 黄蓍树胶、 甲基纤维素、 羟丙甲基纤维素、 羧甲基纤维素钠， 和 / 或生理上可接受的聚 合物如聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)。如果需要， 可加入崩解剂， 如交联的聚乙烯吡咯烷酮、 琼脂， 或海藻酸或其盐如海藻酸钠。
糖衣核具有合适的包衣。为此目的， 可使用浓缩的糖溶液， 其可以可选地包含阿 拉伯树胶、 滑石粉、 聚乙烯吡咯烷酮、 卡波姆凝胶、 聚乙二醇、 二氧化钛、 漆溶液 (lacquer solutions) 和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素加入到片剂或糖衣丸包衣 中， 以便鉴定或表征不同的活性化合物剂量组合。
可口服使用的药物组合物， 包括明胶制成的推入配合胶囊 (push-fit capsule)， 以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。 推入配合胶囊可包含与填充剂如 乳糖、 粘合剂如淀粉、 润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁， 和可选的稳定剂混合的活性成分。在软 胶囊中， 活性成分溶解于或悬浮于合适的液体中， 如脂肪油、 液体石蜡， 或液体聚乙二醇。 另 外， 可加入稳定剂。所有用于口服给予的制剂剂量应适合所选的给予途径。
对于颊部给予， 该组合物可采用用常规方法调配的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻吸入给予， 根据本发明使用的活性成分可以所呈现的气溶胶喷雾形 式， 从利用合适的推进剂如二氟二氯甲烷、 三氯氟甲烷、 二氯四氟乙烷， 或二氧化碳的加压包装或喷雾器中方便地递送。在加压气溶胶的情况下， 剂量单位可通过提供用于递送计量 的量的阀门确定。可将用在分配器中的如明胶胶囊和药筒， 调配成包含该化合物与合适的 粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文所述的制剂可以调配用于肠胃外给予， 如通过推注或连续输注给予。注射用 制剂可以单位剂量的形式呈现， 如， 在安瓿或在多剂量容器中， 其中可选地加入防腐剂。该 组合物可以是油性或水性媒介物中的悬浮液、 溶液， 或乳液， 并可含有调配剂如悬浮剂、 稳 定剂， 和 / 或分散剂。
用于肠胃外给予的药物组合物包括水溶性形式活性制剂的水溶液。另外， 可将该 活性成分的悬浮液配制成适当的油性或基于水的注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介物 (vehicles) 包括脂肪油如芝麻油， 或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、 甘油三酯或脂质体。水 性注射悬浮液可包含增大悬浮液粘度的物质， 如羧甲基纤维素钠、 山梨醇， 或葡聚糖。可选 地， 该悬浮液还可包含合适的稳定剂或增大活性成分的溶解度从而允许制备高度浓缩的溶 液的试剂。
替换地， 该活性成分可以是粉末形式， 在使用前用合适的媒介物如无菌的基于无 热源水的溶液进行配制。
根 据 本 发 明 实 施 方 式 的 制 剂 还 可 利 用 如 常 规 栓 剂 基 质 如 可 可 豆 油 (cocoa butter) 或其它甘油酯， 调配成直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂 (retention enemas)。
当然， 该组合物的给予量将取决于受治疗对象、 疼痛严重性、 给予方式， 处方医生 的判断等。
本发明组合物如果需要可放在包装或分配装置中， 如 FDA 批准的试剂盒， 其可 包含含有活性成分的一种或多种单位位剂量形式。该包装可包含， 例如， 玻璃或塑料箔 (plastic foil)， 如泡罩包装 (blister pack)。该包装或分配装置还可附有给予说明。该 包装或分配器还可提供与所含物相关的由管理药物制造、 使用或销售的政府部门所规定的 形式的公告， 该公告反映该部门批准了该组合物形式或人用或兽用。此公告， 例如， 可以是 美国食品和药物管理局对于处方药批准的标志或者是已批准产品插页 (product insert)。
本文所述多肽能够结合到趋化因子上， 因而具有与至少一些趋化因子的结构互补 的结构。因为趋化因子受体也具有与趋化因子互补的结构， 所以期望本文所述的至少一些 多肽的结构域趋化因子受体的结构具有显著的相似性。 该多肽因而可以在一些应用中代替 趋化因子受体， 例如， 当产生能够结合到趋化因子受体上的抗体时。
因此， 在本发明实施方式的另一方面， 提供了能够识别趋化因子受体至少一部分 的抗体。该抗体可选地通过利用生产抗体的标准技术， 生产对抗本文所述多肽的抗体来制 取。
本文也提供了包含本文所述多肽， 用于产生自身抗体的疫苗。该疫苗设计用于在 受验者中产生对抗该多肽的抗体， 其中该抗体将进一步识别和结合到受验者至少一种趋化 因子受体的至少一部分上。 该疫苗可选地包括可以容易地由本领域技术人员选择的任何合 适的疫苗载体， 包括但不局限于， 佐剂、 载体等。
制备免疫原或疫苗组合物的一般方法描述在雷明顿药物科学 (Remington ′ s Pharmaceutical Science)， Mack Publishing Company Easton， Pa.( 最新版 ) 中。为了增 大免疫原性， 可以使本发明多肽吸附或结合到珠粒如胶乳或金珠、 ISCOM 等上。免疫原性组合物可以包含佐剂， 该佐剂为可以添加到免疫原或疫苗制剂中从而增强免疫原性部分的免 疫刺激特性的物质。脂质体也视为佐剂 (Gregoriades， G 等人， Immunological Adjuvants and Vaccines， Plenum Press， New York， 1989)。可以增加多肽免疫原功效的佐剂或药剂 实例包括氢氧化铝、 磷酸铝、 硫酸铝钾 ( 明矾 )、 硫酸铍、 二氧化硅、 高岭土、 碳、 油包水型乳 液和水包油型乳液。优选的一类佐剂是胞壁酰二肽 (muramyl dipeptide， MDP) 以及各种 MDP 衍生物和制剂， 例如， N- 乙酰基 -D- 葡萄糖氨基 -(β-1-4)-N- 乙酰基胞壁酰 -L- 丙氨 酰 -D- 异谷酰胺 (GMDP)(Hornung， R L 等人， Ther Immunol 19952 ： 7-14) 或 ISAF-1( 在含 有 0.4mg 苏氨酰 - 胞壁酰二肽的磷酸盐缓冲溶液中的 5％鲨烯、 2.5％ pluronic L121、 0.2％ 吐温 80 ； 参见例如 Kwak， L W 等人， (1992)N.Engl.J.Med.， 327 ： 1209-1238)。其它有用的 佐剂为， 或者基于霍乱毒素、 细菌性内毒素、 脂质 X、 细菌痤疮丙酸杆菌 (Propionobacterium acnes) 或百日咳鲍特菌 (Bordetella pertussis) 的完整生物体或亚细胞部分、 多聚核 糖核苷酸、 藻酸钠、 羊毛脂、 溶血卵磷脂、 维生素 A、 皂甙和皂甙衍生物如现已用于临床 (Helling， F 等 人， (1995)Cancer Res.， 55 ： 2783-2788 ； Davis， T A 等 人， (1997)Blood， 90 ： 509) 的 QS21(White， A.C. 等人， (1991)Adv.Exp.Med.Biol.， 303 ： 207-210)、 左旋咪唑、 DEAE- 葡聚糖、 阻断共聚物或其它合成佐剂。许多佐剂可以从各种来源商购获得， 例如， Merck 佐剂 65(Merck and Company 有限公司， Rahway， N.J.)， 或弗氏不完全佐剂和完全佐 剂 (Difco Laboratories， Detroit， Mich.)、 Amphigen( 水包油 )、 Alhydrogel( 氢氧化铝 )， 或者 Amphigen 和 Alhydrogel 的混合物。铝已被批准用于人用。
如本文使用的术语 “约” 是指 ±10％。
术语 “包 含” 、 “包 含 的” 、 “包 括” 、 “包 括 的” 、 “具 有” ， 和它们的词形变化形式 (conjugates) 意思是指 “包括但是不限于” 。
术语 “由……组成” 是指 “包括但是不限于” 。
本文使用的术语 “示例” 是指 “用作实例、 例证， 或图例” 。被描述为 “示例” 的任 何实施方式不必解读为优选的或比其它实施方式有利， 和 / 或排除其它实施方式并入的特 征。
本文使用的术语 “可选地” 是指 “提供在一些实施方式中， 而没有提供在其它实施 方式中” 。本发明任何特定实施方式均可包括多个 “可选的” 特征， 除非此类特征相冲突。
如本文使用的， 单数形式 “一个” 、 “一” 和 “该” 包括复数指代， 除非上下文另有明确 规定。例如， 术语 “一种化合物” 或 “至少一种化合物” 可包括多种化合物， 包括其混合物。
在整篇专利申请中， 本发明的各种实施方式可以范围形式呈现。应当理解范围形 式的描述仅是为了方便和简洁， 而不应该解读为对本发明范围的硬性限制。 因此， 范围的描 述应视为已具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的各个数值。例如， 如从 1 至 6 的范围描述应视为已具体地公开了诸如从 1 至 3、 从 1 至 4、 从 1 至 5、 从 2 至 4、 从 2 至 6、 从 3 至 6 等的子范围， 以及在此范围中的各个数值， 例如， 1、 2、 3、 4、 5， 和 6。 不论范围宽度如 何， 这都能适用。
当本文中指出了数值范围时， 其意在包括在所指范围内的任何提及数字。本文中 的表达在第一个指定数和第二个指定数之间的 “范围” 与从第一个指定数 “至” 第二个指定 数的 “范围” 可互换使用， 意在包括第一和第二个指定数及其间的所有数字。
应理解， 为清楚起见而在单独实施方式的上下文中描述的本发明某些特征， 也可结合提供在单个实施方式中。相反， 为简洁起见而在单个实施方式的上下文中描述的本发 明的多种特征， 也可单独地或以任何合适的子组合形式， 或作为适合于本发明的任何其它 被描述的实施方式提供。 在各个实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是这些实 施方式的实质特征， 除非这些实施方式没有这些元素时是不能实施的 (inoperative)。
如上文所描绘的和如下面权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方式和 方面将在下面的实例中找到实验支持。
实施例
现在参考下面的实施例， 结合上面的描述以非限制方式阐述本发明的一些实施方 式。
材料和方法
材料 ：
扩增缓冲液 (X10) 从 Invitrogen 获得 ；
葡聚糖 T-500 从 Pharmacosmos A/S(Denmark) 获得 ；
Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 (DMEM) 从 Biological Industries(Beit Haemek， Israel) 获得 ；
ECL 溶液从 Amersham Biosciences 获得 ；
EcoRI 从 New England Biolabs 获得 ；
增强子溶液 (X10) 从 Invitrogen 获得 ；
嗜酸性粒细胞趋化因子 (Eotaxin)( 人 ) 从 PeproTech(Rocky Hill， NJ， USA) 获 得；
EX-CELL 293 培养基从 SAFC Biosciences 获得 ；
胎牛血清 (FCS) 从 Biological Industries(Beit Haemek， Israel) 获得 ；
聚蔗糖 (Ficoll)1077 从 Sigma 获得 ；
弗氏完全佐剂从 Sigma 或 Difco 获得 ；
FuGENE 6 从 Roche 获得 ；
IP-10( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
IL-8( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
I-TAC( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
MCP-1( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
甲基化牛血清白蛋白 (mBSA) 从 Sigma 获得 ；
MIG( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
NotI 从 New England Biolabs 获得 ；
NuPAGE Bis Tris gels 从 Invitrogen 获得 ；
pIRESpuro3 载体从 BD Biosciences Clontech 获得 ；
蛋白质 A-Sepharose 珠从 Amersham 获得 ；
RANTES( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
RPMI 培养基从 Biological Industries(Beit Haemek， Israel) 获得 ；
SDF-1α( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
Taq 聚合酶 (Platinum Pfx DNA 聚合酶 ) 从 Invitrogen 获得 ； 和VCAM-1( 人 ) 从 R&D Systems， Inc.(Minneapolis， MN) 获得。
所有趋化因子都按照供应商的建议制备。
获取 IL6-BKT 肽 DNA 片段的两步 PCR
在第一 PCR 步骤中， 将 IL6 信号肽 DNA 序列 (SEQ ID NO ： 166) 添加到与每个 BKT 肽的前 9 种氨基酸对应的 DNA 序列中。这个 PCR 反应的产物在第二 PCR 步骤中用作模板从 而添加与 BKT 肽剩余的 3 种氨基酸对应的 DNA 序列、 间隔子序列 (SEQ ID NO ： 167)， 和 3’ 端 的 BstBI 限制性位点。
IL6-Fc pIRES puro DNA 用作第一 PCR 步骤的所有三个 PCR 反应的 NDA 模板。 所有 三个 PCR 反应利用同一正向引物 (T7 引物， SEQ ID NO ： 170) 完成。使用通用的 T7 引物， 形 成 PCR 产物， 该 PCR 产物在 5’ 端包含多个克隆位点， 包括后来用于亚克隆的 NheI 位点。该 反向引物对每个肽均有特异性， SEQ ID NO ： 171 用于 BKT-P2， SEQ ID NO ： 172 用于 BKT-P46。
该 PCR 反应条件如下 ： 20ng DNA 模板、 5μl 扩增 X10 缓冲液、 0.2mM 的每种脱氧核 糖核苷酸 (dNTP)、 0.5mM MgSO4、 5μl 增强子溶液 X10、 0.2μM 的每种引物、 2.5 单位的 Taq 聚合酶， 其中水添加到 50μl 总反应体积。
扩增用起始变性步骤执行， 该起始变性步骤在 94 ℃下执行 3 分钟， 接着执行在 94℃下 30 秒、 52℃下 30 秒， 和 72℃下 30 秒的 30 个循环， 然后 72℃下 10 分钟。
PCR 扩增结束时， 在用溴化乙锭染色和用 UV 光显现的 2％琼脂糖凝胶上分析 5μl 的每种反应混合物。
通过上述程序获得的 PCR 产物用作第二 PCR 步骤的模板。上述 T7 引物用作所有 三个反应的正向引物， 而反向引物对每个肽具有特异性 ； SEQ ID NO ： 173 用于 BKT-P2， SEQ ID NO ： 174 用于 BKT-P46。每种反向引物均编码期望肽的氨基酸 10-12， 和六肽间隔子序列 (SEQ ID NO ： 162)， 并包括 BstB1 限制性位点。
PCR 反应条件如下 ： 0.5μl DNA 模板、 5μl 扩增 X10 缓冲液、 0.2mM 的每种 dNTP、 0.5μM MgSO4、 5μl 增强子溶液 X10、 0.2μM 的每种引物、 2.5 单位的 Taq 聚合酶 ； 其中水添 加至 50μl 总反应体积。
按照上面针对第一 PCR 步骤描述的方法进行扩增和对 PCR 产物进行分析。该 PCR 产物是利用 QiaQuickTM 凝胶提取试剂盒 (QiagenTM) 从凝胶中提取的。
IL6-BKT 肽 DNA 片段与 Fc 序列的连接 (ligation) ：
提取的 IL6-BKT 肽 DNA 产物用 NheI 和 BstBI 进行消化， 按照上面详细描述的从琼 脂糖凝胶中纯化， 并使其连接到之前用相同酶消化的 FcN297ApIRESpuro3 中。 用于编码 SEQ ID NO ： 158 和 159 的载体的图谱分别在图 1A 和 1B 示出。将该连接混合物转化到 DH5a 感 受态细胞中。筛选抗氨必西林的转化体， 并通过克隆 PCR 进一步分析阳性克隆。
从抗氨必西林的克隆中提取 DNA， 并用 EcoRI 和 NotI 限制酶在 37℃下消化 2 小时。 在琼脂糖凝胶上分离反应物。预期阳性克隆可以产生 5123bp 和 868bp 的两条带。该阳性 克隆通过 DNA 测序进行证实。
Western 印迹 ：
收集细胞样品的培养基， 并进行离心 (1000 转 / 分钟， 7 分钟 )。将 1ml 去除细胞 的培养基 (cell-deprived medium) 与 50μl 蛋白质 A-Sepharose 珠一起在室温下温育 45 分钟。温育时间结束时， 用包含 100mM 柠檬酸盐磷酸盐缓冲液 (pH 3.5) 和 10mM DTT( 二硫苏糖醇 ) 的 50μl 样品缓冲液从该珠粒上洗脱蛋白质。将该样品煮沸 3 分钟， 然后将 25μl 样品装到 12％ NuPAGE Bis Tris 凝胶上。将该蛋白质转移到硝化纤维素膜中， 并 用在 PBST( 补充有 0.05％吐温 -20 的 PBS) 中的 10％低脂牛奶封闭。然后在室温下以在封 闭溶液中的 1 ∶ 40,000 浓度， 用人抗 IgG Fc 片段抗体， 接着用结合到 HRP( 辣根过氧化物 酶 ) 上的山羊抗人抗体印迹 (blot) 该膜 1 小时。在与 ECL 溶液一起温育之后， 将该膜暴露 于胶片 (film) 下。
表面等离子共振 (SPR) ：
在覆盖有羧甲基葡聚糖的腔室中， 肽或多肽通常经由赖氨酸残基的氨基或 N 末端 共价结合到该腔室上。通过该腔室以增加的浓度注射趋化因子。
从该表面反射的光线变化与结合蛋白质的量成比例， 并可以通过检测器检测。
对在不同浓度的趋化因子下结合的蛋白量作图， 使得离解系数 (dissociation coefficient) 的计算成为可能。
新鲜血液中的 T- 细胞纯化 ：
将 50ml 血液添加到 10ml 葡聚糖 T-500(6％ w/v) 在 PBS( 磷酸盐缓冲盐水 ) 中的 溶液， 和 7ml 柠檬酸盐缓冲液 (25 克柠檬酸盐、 8 克柠檬酸在 500ml PBS 中 ) 中。将该溶液 在 25℃下温育 30 分钟。将 10ml 聚蔗糖 (Ficoll)1077 添加到该管子底部。然后将该管子 在 18℃下在 2,000 转 / 分钟下离心 30 分钟 ( 以制动离心停止模式 )。收集中间相， 用含有 5％ FCS( 胎牛血清 ) 的 8ml PBS 洗涤两次， 接着在 18℃下在 1,400 转 / 分钟下离心 5 分钟。 8 将该细胞以小于 10 /ml 的浓度重悬在含有 5％ FCS 的 PBS 中。将 2ml 细胞溶液施加在预先 浸渍在 PBS-5％ FCS 中的聚 ( 甲基丙烯酸甲酯 ) 尼龙毛柱中， 然后在 25℃下温育 45 分钟。 每个柱子均用 8ml PBS-5％ FCS 洗涤， 并通过 50ml 5mM 在 PBS 中的 EDTA( 乙二胺四乙酸 ) 洗脱细胞 (T- 细胞和红细胞 )。通过在 4℃下在 1,400 转 / 分钟下离心 ( 开启制动 )5 分钟 获得红色球团 ( 红色细胞沉淀， red pellet)。
为了执行红细胞的裂解， 将该红色球团重悬在 5ml 裂解缓冲液 (155mM NH4Cl、 10mM KHCO3、 0.1mM EDTA、 X0.1PBS) 中 4 分钟， 接着立即加入 50ml 含有 EDTA 的 PBS。在 4℃下在 1,400 转 / 分钟下离心 5 分钟之后， 再次用 50ml PBS-EDTA 洗涤该球团， 并在相同条件下进 6 行再离心。获得白色球团， 将其以 3x10 个细胞 /ml 的浓度重悬在含有 10％ FACS、 L- 谷氨 酰胺、 丙酮酸钠和抗生素的 RPMI 培养基中。将该细胞在 37℃下温育 2 小时， 接着收集未粘 附细胞。该细胞在 37℃下温育过夜之后就已准备就绪可用于实验中。
体外 T 细胞粘附分析 ：
将 10μg/ml 人 VCAM-1 和 2μg/ml 趋 化 因 子 ( 完 整 MIG、 IP-10、 I-TAC、 MCP-1、 RANTES、 SDF-1( 基质细胞衍生因子 -1)、 BCA-1(B- 淋巴细胞趋化因子 -1)、 IL-8( 白介素 -8) 或嗜酸性粒细胞趋化因子， 或作为对照的热灭活 SDF-1) 溶解在由 20mM 碳酸氢盐 (pH 8.5) 缓冲制成的 PBS 中， 并在聚苯乙烯板中在 4℃下温育过夜。替换地， 使用 10μg/ml 趋化因 子， 并将该板在室温下温育 30 分钟。然后洗涤该板 3 次， 并通过与 20mg/ml 在 PBS 中的人 血清白蛋白一起在 37℃下温育 2 小时来进行封闭。
然后将该板装配成平行壁流动腔室的底壁 (lower wall) 并安装在倒置显微镜 镜台上。将 10μg/ml 测试肽在 37 ℃下安放在基质包被的腔室壁 ( 基质涂覆的腔室壁， substrate-coated chamber wall) 上 10 分钟， 然后洗涤。按如上所述的从新鲜血液中纯化出 T 细胞 (5x106/ml， 纯度＞ 98％ )， 使其悬浮在结合缓冲液中， 灌注到腔室中， 并将其在 37℃下安放在基质包被的腔室壁上 1 分钟。启动流动， 并每 5 秒增大 2 ～ 2.5 倍， 在该壁上 产生受控剪切应力。在倒置相差 Diaphot 显微镜 (Nikon) 的 20x 物镜下观察细胞， 并用连 接到 AG-6730S-VHS 录像机 (Panasonic) 上的长积分 LIS-700CCD 摄像机 (Applitech， 以色 列 ) 拍照。在每个间隔后通过分析录制的细胞图像确定可抵抗剪切应力增大造成的分离的 粘附细胞数目， 并表示成初始沉积细胞的百分数。所有粘附实验在多个试区 ( 测试区， test field) 上进行至少三次。
实验自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) ：
在雌性 SJL 和 C57BL/6 小鼠中诱导 EAE。 分别在小鼠侧腹皮下给予 100μg PLP139-151 肽或 250μg MOG35-55 肽 ( 第 0 天 ) 免疫该小鼠。 使 PLP 和 MOG 肽乳化在等体积的含有 800μg 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)H37RA(Difco， Detroit， MI) 的完全弗氏佐剂 (CFA) 中。还在第 0 天和 2 天给小鼠腹膜内注射 300ng 百日咳毒素 (pertussis toxin)。
在免疫后第 9 天， 给小鼠静脉注射 BKT-P2-FC 或 BKT-P46-FC(50μg/ 小鼠 )。在一 些实验中， 当给小鼠静脉注射 BKT-P2-FC 或 BKT-P46-FC 时， 在疾病的高峰期时， 疾病诱导之 后的 14 天对小鼠进行处理。
在 疾 病 诱 导 后 的 30 天 收 集 脊 髓 组 织 样 品，固 定 在 4 ％ 多 聚 甲 醛 (paraformaldehyde) 中， 并脱水和包埋在石蜡中。切出 6μm 脊髓切片， 并经加工用于通 过用苏木精和曙红 (H&E) 染色进行组织学分析从而评价免疫细胞浸润， 并用勒克司坚牢蓝 (luxol fast blue) 标记脱髓鞘区域。
免疫后 30 天收集血液样品， 提取血清用于细胞因子分析。根据制造商说明书通过 小鼠 Th1/Th2 细胞因子试剂盒 -BD 流式微珠阵列 (cytometric bead array， CBA)， 评价细 胞因子水平。
通过监测动物受验者的 EAE 临床得分， 确定 BKT-P2-FC 和 BKT-P46-FC 多肽的作 用。 EAE 临床得分根据下面的标准确定 ： 0- 无疾病 ； 1- 尾巴健康状况 ( 尾音， tail tone) 下 降； 2- 后肢无力或部分麻痹 ； 3- 后肢完全麻痹 ； 4- 前后肢麻痹 ； 5- 垂死状态。通过在实验 结束时合计实验组所有动物的所有结果， 计算累积分数。
对于所有 EAE 实验， 每组均有 10 ～ 12 只小鼠。
实施例 1
制备多肽
将 BKT-P2 肽 (SEQ ID NO ： 101) 和 BKT-P46 肽 (SEQ ID NO ： 76)( 在本文称为 “BKT 肽” ) 用作制备具有融合到分泌的非糖基化人 IgG1Fc(Fc N297A)N’ 末端上的 BKT 肽的多肽 的基础。
为了使 DNA 克隆进行， 使 BKT-P2 和 BKT-P46 肽序列反向翻译成 DNA 序列。每个 BKT 肽序列均融合到编码人 IL6 信号肽的 DNA 序列上以便使哺乳动物系统能够分泌蛋白质。 这个程序通过上文所述的两步 PCR 执行。然后， 使用上文所述的程序， 对通过 PCR 获得的 IL6-BKT 肽 DNA 片段进行消化， 使其框内连接到非糖基化 Fc 序列 ( 含有点突变 N297A) 上， 从而产生称为 IL6-P2-Fc N297A(SEQ ID NO ： 168) 和 IL6-P46-Fc N297A(SEQ ID NO ： 169) 的片段。
然后使用 FuGENE 6 转染试剂， 将 IL6-BKT 肽 -Fc DNA 构建体转染到 HEK-293T细胞中。将每个构建体均转染到 6- 孔板的两个孔中。一个孔专用于 Western 印迹 (WB) 分 析， 第二孔专用于确定稳定池。将该细胞以 500,000 个细胞 / 孔的浓度置于 6 孔板中。1 天 后， 用 6μl FuGENE 和 2μg DNA( 比例为 3 ∶ 1) 转染该细胞。
在专用于 WB 分析的孔中， 24 小时后将该培养基替换成无血清培养基， 并在 48 小时 后收集该培养基。通过使用抗 -Fc 抗体的 Western 印迹分析， 分析短暂转染的细胞， 发现该 细胞可以表达称为 BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 和 BKT-P46-FC(SEQ ID NO ： 159) 的期望多 肽 ( 数据未给出 )。
在 另 一 个 孔 中， 24 小 时 后 将 该 培 养 基 替 换 成 含 有 10 ％ FCS( 胎 牛 血 清 ) 的 DMEM(Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 )， 48 小时后使该细胞胰蛋白酶化并将其转移到含有选 择培养基 ( 含有 10％ FCS 和 5μg/ml 嘌呤霉素的 DMEM) 的 T75 烧瓶中以便获得稳定的克 隆。
使从嘌呤霉素选择 ( 稳定池 ) 中存活的细胞群体繁殖， 并如上文所述的通过 Western 印迹分析来分析该细胞群体的培养基， 以便证实期望多肽的表达。
如图 2 所示， 期望 BKT-P2-FC 和 BKT-P46-FC 多肽表达在所有所测试的细胞培养物 中。 另外， 通过针对 Fc 片段的 ELISA 测试上述池的上清液， 结果指示期望 BKT-P2-FC 或 BKT-P46-FC 多肽表达在所有所测试的细胞培养物中 ( 数据未给出 )。
为了验证细胞的同一性， 执行基因组 PCR， 结果指示正确序列整合在细胞基因组中 ( 数据未给出 )。
将表达期望多肽的每个池的数个等分试样 (aliquot) 冷冻保存在液氮下。数天 后， 使来自每个原液 (stock) 的一个安瓿融化以便证实细胞活力。
然后， 在悬浮液中生长的哺乳动物培养物中生产 BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 和 BKT-P46-FC(SEQ ID NO ： 159) 多肽。将所转染细胞的一个 T175 烧瓶保持在含有选择抗生 素 (5μg/ml 嘌呤霉素 )、 补充有 10％血清的培养基中， 并在 5％ CO2 中在 37℃下进行温育。 胰酶消化之后， 将该细胞转移到补充有 4mM 谷氨酰胺和选择抗生素 (1μg/ml 嘌呤霉素 ) 的 无血清培养基 (EX-CELL 293 培养基 ) 中， 进一步在烧瓶中在 5％ CO2， 37℃下进行温育。3 天后， 在 37℃下将该细胞转移到摇瓶中， 该摇瓶的搅拌速度为 125 转 / 分钟。 当细胞密度达 6 到 2.0-3.5x 10 个细胞 /ml 时， 通过在两个旋转烧瓶中连续稀释使培养物体积增大到多达 4 升。将一个含有 200ml 培养物的摇瓶作为备份保存。
在 4 天的生产期之后， 两个旋转烧瓶的培养物分别达到 3.7x 106 个细胞 /ml， 活力 6 为 91％， 和 4.0x 10 个细胞 /ml， 活力为 92％。通过离心 (5000 转 / 分钟， 15 分钟 ) 从该两 个旋转烧瓶中收获培养基和从该摇瓶中收获 200ml。 共收获 3.5 升， 通过 0.22μm 过滤器过 滤， 并保存在 -80℃ ( 取出两个 1.5ml 样品 )。在蛋白质 A 柱上进一步纯化该多肽 (SEQ ID NO ： 158 或 SEQ ID NO ： 159)。
实施例 2
多肽与趋化因子的亲和力
通过材料和方法部分中描述的表面等离子体共振技术 (SPR)， 测定实施例 1 描述 的多肽与趋化因子的亲和力。结果概括在下表 3 中。
如表 3 所示， 该多肽以可感知程度结合到趋化因子 I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸
性粒细胞趋化因子和 RANTES 中的每个上。
表3： 多肽与趋化因子的结合的解离常数 (Kd)
实施例 3
多肽的体外活性
利用上文描述的体外粘附分析， 将趋化因子结合肽 BKT-P2(SEQ ID NO ： 101) 和 BKT-P46(SEQ ID NO ： 76) 对 T 细胞与 VCAM-1 的粘附的影响与包含前述趋化因子结合肽序 列之一的实施例 1 所述的那些多肽进行比较。前述肽和多肽抑制 T 细胞与 VCAM-1 的粘附 的能力概括在下表 4 中。
表4： 肽对趋化因子依赖性 T 细胞粘附的抑制
++ ＝ 100％抑制
- ＝无抑制 N.D. ＝未测定
如表 4 和图 3A、 3B 和 3C 所示， 该肽 BKT-P2 抑制了 IP-10、 I-TAC、 MCP-1、 RANTES 和 嗜酸性粒细胞趋化因子诱导的 T 细胞粘附， 但不能抑制 MIG 诱导的 T 细胞粘附。
如表 4 和图 4A、 4B 和 4C 所示， 多肽 BKT-P2-FC 抑制了 MIG 诱导的 T 细胞粘附， 以 及 IP-10、 I-TAC、 MCP-1、 RANTES 和嗜酸性粒细胞趋化因子诱导的粘附。
如图 4 中进一步所示的， 肽 BKT-P46 抑制了 I-TAC、 MIG、 MCP-1 和 RANTES 诱导的 T 细胞粘附， 但不能诱导嗜酸性粒细胞趋化因子诱导的粘附， 而多肽 BKT-P46-FC 抑制了嗜酸 性粒细胞趋化因子， 以及 I-TAC、 MIG、 MCP-1 和 RANTES 诱导的 T 细胞粘附。
上面的结果表明， 该多肽调节趋化因子活性的能力相比相应趋化因子结合肽调节 趋化因子活性的能力增强。这可能是由于寿命延长和该多肽相对于该肽的稳定性增强， 和 / 或由于它们三级构象发生变化引起的。
实施例 4
多肽对实验自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 的体内作用
利用材料和方法部分中描述的体内实验自身免疫性脑脊髓炎模型， 测试实施例 1 描述的 BKT-P2-FC 和 BKT-P46-FC 多肽对脑部炎症的作用并进行评分。
如图 5A 和 5B 所示， BKT-P46-FC 多肽大大降低了实验持续期间 ( 到 55 天 )PLP 来 源的 EAE 平均临床得分和累积临床得分 ( 累计临床得分， accumulating clinical score)。
在 该 实 验 第 37 天， 13 只 对 照 小 鼠 中 的 6 只 的 EAE 临 床 得 分 至 少 为 2， 而接受 BKT-P46-FC 多肽的所有 10 只小鼠的 EAE 临床得分都为 0。
另外， 如图 6A 和 6B 所示， BKT-P46-FC 和 BKT-P2-FC 多肽都降低了实验持续期间 ( 到 33 天 )PLP 来源的 EAE 平均临床得分和累积临床得分。
在该实验的第 27 天， 10 只对照小鼠中的 8 只的 EAE 临床得分至少为 2， 而接受 BKT-P2-FC 多肽的 10 只小鼠中的 9 只的 EAE 临床得分为 0， 接受 BKT-P46-FC 多肽的 10 只 小鼠中的 8 只的 EAE 临床得分 0。
类似地， 如图 7 所示， BKT-P46-FC 和 BKT-P2-FC 多肽都降低了实验持续期间 ( 到 55 天 )MOG- 来源的 EAE 临床得分 ( 到 55 天 )。
这些结果表明该多肽对抑制小鼠脑部中的炎性反应， 如 EAE， 多发性硬化模型的炎 性反应有效。
实施例 5
多肽对关节炎的体内作用
利用体内小鼠诱导的关节炎模型， 测试了实施例 1 描述的 BKT-P2-FC 多肽对关节 炎的作用。该分析按照 Coelho 等人 [Arthritis Rheum 2008， 58 ： 2329-2337]， Grespan 等 人， [Arthritis Rheum 2008， 58 ： 2030-2040]and Lemos 等人， [PNAS 2009， 106 ： 5954-5959] 描述的执行。
在第 0 天， 在小鼠尾巴底部真皮内给予含 500μg 甲基化牛血清白蛋白 (mBSA) 的 100μl 盐水乳液和等体积弗氏完全佐剂 (CFA)， 免疫该小鼠。在第 11 天， 按 2mg/kg 的剂量 给予 BKT-P2-FC 多肽。 24 小时后， 对小鼠进行抗原激发。 每只小鼠的左膝关节均接受 10μg mBSA 注射液 ( 在 10μl 无菌盐水中的注射液 )。给予该多肽 48 小时后， 处死该小鼠， 用 PBS 洗涤膝关节腔， 并通过利用荧光激活细胞分选术 (FACS) 计数白细胞， 确定组织中白细胞的 数目。
如图 8A 和 8B 所示， BKT-P2-FC 多肽大大地减少了关节炎膝关节腔内的中性粒细 胞数目， 和单核细胞数目。
这些结果表明， 该多肽对抑制炎性反应， 如类风湿性关节炎的炎性反应有效。
实施例 6多肽对迟发型超敏反应 (DTH) 的体内作用
利用体内迟发型超敏反应小鼠模型， 进一步测试实施例 1 描述的 BKT-P2-FC 和 BKT-P46-FC 多肽对免疫反应的作用。
在第 0 天， 在小鼠尾巴底部真皮内给予含 500μg 甲基化牛血清白蛋白 (mBSA) 的 100μl 盐水乳液和等体积弗氏完全佐剂 (CFA)， 免疫该小鼠 (8 至 10 周龄雄性 C57BL/6 小 鼠 )。12 天后， 对小鼠进行抗原激发。每只小鼠的左膝关节均接受 10μg mBSA 注射液 ( 在 10μl 无菌盐水中的注射液 )， 如 Coelho 等人 [Arthritis Rheum 2008， 58 ： 2329-2337] 和 Healy 等人 [J Immunol 2006， 177 ： 1886-1893] 描述的。在一些小鼠中， 在激发 24 时前， 静 脉注射 BKT-P2-FC(50μg/ 小鼠 )。用 PBS 伪免疫激发的空白小鼠 ( mice) 用作对照 小鼠。抗原激发 24 小时后， 处死小鼠。
如图 9 所示， 上述多肽都抑制迟发型超敏反应， BKT-P2-FC 的效力比 BKT-P46-FC 的 强。
这些结果表明， 该多肽对抑制迟发型超敏反应的炎性反应有效。
实施例 7
多肽的药物动力学
在静脉注射 50μg/ 小鼠的 BKT-P46-FC(SEQ ID NO ： 159) 或 BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 多肽的 C57BL 小鼠中， 测定多肽在小鼠中的药物动力学。
在注射后 2 小时、 24 小时， 5 和 11 天给该小鼠抽血， 并取出血清。根据制造商说明 书利用人总 IgG ELISA 试剂盒 (ICL) 测试血清中多肽的水平。
甚至在注射 11 天后仍可以在血液中检测到该多肽。
这些结果表明， 该多肽具有相当大的体内稳定性。
虽然本发明已结合其特定的实施方式进行描述， 但显然， 对于本领域技术人员而 言， 许多替换、 修改和变更都是很明显的。因此， 本发明旨在包括落在附属权利要求的精神 和宽范围内的所有此类替换、 修改和变更。
本说明书中提到的所有出版物、 专利和专利申请都通过引用完整地合并在本说明 书中， 如同每篇单独的出版物、 专利或专利申请单独地明确被指出通过引用合并在此。另 外， 本申请中任何参考文献的引用或列出不应该被解释为承认此类参考文献是本发明的现 有技术。对于使用的章节标题， 它们不应该被解释为限制性的。
表5： 趋化因子结合肽
趋化因子结合肽名称 BKT-P50 BKT-P10 BKT-P17 BKT-P58 SEQ ID NO ： 1 2 3 4 肽的序列 CAHLSPHKC CDIPWRNEC CDPLRQHSC CDSLGHWLC36CN 102482324 A BKT-P15 BKT-P59 BKT-P56 BKT-P60 BKT-P61 BKT-P62 BKT-P63 BKT-P64 BKT-P65 BKT-P66 BKT-P67 BKT-P68 BKT-P69 BKT-P70 BKT-P57 BKT-P71 BKT-P72 BKT-P73 BKT-P14 BKT-P74 BKT-P75 BKT-P76 BKT-P77 BKT-P16说5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28明书CDYTTRHSC CHGTLNPEC CHHNLSWEC CHIWTLASC CHNTFSPRC CIPLHASLC CITTTSLSC CKLTTCKDC CKNHTTFWC CLKLLSRSC CLLKAHPSC CLNQLKQAC CMNFPSPHC CPQSPTYTC CPSSAIHTC CPTSTARIC CQASSFPSC CQPYFWYRC CQTLTPSIC CSKLGHLWC CSKTPERIX CSNNNRMTC CSPILSLSC CSPTNFTRC33/39 页37CN 102482324 A BKT-P78 BKT-P79 BKT-P80 BKT-P81 BKT-P13 BKT-P82 BKT-P83 BKT-P84 BKT-P85 BKT-P86 BKT-P87
趋化因子结合肽名称 BKT-P88 BKT-P12 BKT-P89 BKT-P90 BKT-P48 BKT-P91 BKT-P44 BKT-P92 BKT-P93 BKT-P94 BKT-P95说29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39明书CSRPAMNVC CSTKAYPNC CSTSSCGSC CSYWGHRDC CTAHDANAC CTANSEKTC CTHPKASMC CTKTINGKC CTNMQSPLC CTPFTKLPC CTPTTDSIC34/39 页SEQ ID NO ： 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50肽的序列 CTQQNGHPC ACTTPSKHQC CTYNVAKPC ACAPLMFSQC ACHASLKHRC AHFSPNLLLGG AHSLKSITNHGL AKTLMPSPFPRT ASAVGSLSIRWQ/L/G ASWVDSRQPSAA CPQLTVGQHRT38CN 102482324 A BKT-P8 BKT-P96 BKT-P97 BKT-P51 BKT-P98 BKT-P99 BKT-P9 BKT-P100 BKT-P27 BKT-P28 BKT-P33 BKT-P101 BKT-P102 BKT-P45 BKT-P55 BKT-P54 BKT-P103 BKT-P104 BKT-P49 BKT-P105 BKT-P6 BKT-P106 BKT-P107 BKT-P108说51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74明书DLPPTLHTTGSP DSSNPIFWRPSS EFLGVPASLVNP ESDLTHALHWLG EVHSTDRYRSIP FGLQPTGDIARR FSMDDPERVRSP FSPLHTSTYRPS GDFNSGHHTTTR GPSNNLPWSNTP GVHKHFYSRWLG HAPLTRSPAPNL HGSLTTLF/LRYEP HHFHLPKLRPPV HHTWDTRIWQAF HPTTPFIHMPNF HRDPXS(P)PSAA/GRP HNVTTRTQRLMP HSACHASLKHRC HSACKLTTCKDG HSACLSTKTNIC IAHVPETRLAQM IFSMGTALARPL INKHPQQVSTLL35/39 页39CN 102482324 A BKT-P7 BKT-P46 BKT-21
趋化因子结合肽名称 BKT-P22/38 BKT-P37 BKT-P109 BKT-P110 BKT-P111 BKT-P112 BKT-P113 BKT-P114 BKT-P42 BKT-P23 BKT-P24 BKT-P115 BKT-P116 BKT-P117 BKT-P118 BKT-P119 BKT-P120 BKT-P39 BKT-P40说75 76 77明书ISPSHSQAQADL LDYPIPQTVLHH LFAAVPSTQFFR36/39 页SEQ ID NO ： 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96肽的序列 LGFDPTSTRFYT LLADTTHHRPWP LPWAPNLPDSTA LQPSQPQRFAPT LSPPMQLQPTYS MHNVSDSNDSAI NSSMLGMLPSSF NTSSSQGTQRLG PGQWPSSLTLYK QIPQMRILHPYG QIQKPPRTPPSL QLTQTMWKDTTL QNLPPERYSEAT QSLSFAGPPAWQ QTTMTPLWPSFS RCMSEVISFNCP RSPYYNKWSSKF SAGHIHEAHRPL SAISDHRAHRSH40CN 102482324 A BKT-P121 BKT-P32 BKT-P31 BKT-P3 BKT-P2 BKT-P122 BKT-P123 BKT-P29 BKT-P124 BKT-P125 BKT-P126 BKT-P127 BKT-P1 BKT-P128 BKT-P129 BKT-P4 BKT-P34 BKT-P130
趋化因子结合肽名称 BKT-P131 BKT-P132 BKT-P133 BKT-P5说97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114明书SEPTYWRPNMSG SFAPDIKYPVPS SFWHHHSPRSPL SIFAHQTPTHKN SIPSHSIHSAKA SIRTSMNPPNLL SLPHYIDNPFRQ SLSKANILHLYG SLVTADASFTPS SMVYGNRLPSAL SPSLMARSSPYW SPNLPWSKLSAY SQTLPYSNAPSP SSTQAHPFAPQL STPNSYSLPQAR STVVMQPPPRPA SVQTRPLFHSHF SVSVGMKPSPRP37/39 页SEQ ID NO ： 115 116 117 118肽的序列 SYIDSMVPSTQT SYKTTDSDTSPL TAAASNLRAVPP TAPLSHPPRPGA41CN 102482324 A BKT-P134 BKT-P135 BKT-P30 BKT-P25 BKT-P136 BKT-P137 BKT-P47 BKT-P138 BKT-P139 BKT-P140 BKT-P141 BKT-P142 BKT-P143 BKT-P144 BKT-P26 BKT-P35 BKT-P145 BKT-P146 BKT-P147 BKT-P148 BKT-P149 BKT-P43 BKT-P150 BKT-P151说119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142明书TGLLPNSSGAGI TGPPSRQPAPLH TLSNGHRYLELL TPSPKLLQVFQA TPSTGLGMSPAV TPVYSLKLGPWP TRLVPSRYYHHP TSPIPQMRTVPP TTNSSMTMQLQR TTTLPVQPTLRN TTTWTTTARWPL TVAQMPPHWQLT TWNSNSTQYGNR TWTLPAMHPRPA VHTSLLQKHPLP VLPNIYMTLSA VMDFASPAHVLP VNQEYWFFPRRP VYSSPLSQLPR VPPIS(R)TFLF(L)ST(K)S VPPLHPALSRXN VSPFLSPTPLLF VSRLGTPSMHPS WPFNHFPWWNVP38/39 页42CN 102482324 A BKT-P52 BKT-P152 BKT-P53 BKT-P153 BKT-P154 BKT-P155 BKT-P156 BKT-P157 BKT-P158 BKT-P36 BKT-P41 BKT-P159
趋化因子结合肽名称 BKT-P6 BKT-P16 BKT-P11说143 144 145 146 149 148 149 150 151 152 153 154明书WSAHIVPYSHKP WWPNSLNWVPRP YATQHNWRLKHE YCPMRLCTDC YGKGFSPYFHVT YPHYSLPGSSTL YPSLLKMQPQFS YQPRPFVTTSPM YSAPLARSNVVM YTRLSHNPYTLS YTTHVLPFAPSS YTWQTIREQYEM39/39 页SEQ ID NO ： 155 156 157肽的序列 CLSTKTNIC ACLSTKTNIC CTTPSKHQC43CN 102482324 A
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Y 是接头 ； 且
Z 是 Fc 结构域或其片段。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽长度为 10 ～ 20 个氨基酸。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽长度为 12 ～ 13 个氨基酸。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽的特征是具有结合到至少一种选 自 I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞趋化因子 ( 嗜酸粒细胞趋化蛋白， eotaxin) 和 RANTES 的趋化因子上的能力。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽选自 SEQ ID NO ： 1-157。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽选自 BKT-P2(SEQ ID NO ： 101) 和 BKT-P46(SEQ ID NO ： 76)。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子结合肽具有表现出与选自 SEQ ID NO ： 1-157 的氨基酸序列具有至少 90％序列同源性 (sequence homology) 的氨基酸序列。
根据本发明一些实施方式， 上述序列同源性为至少 95％。
根据本发明一些实施方式， 该信号肽包含 IL-6 信号肽。 根据本发明一些实施方式， 该信号肽具有 SEQ ID NO ： 161。
根据本发明一些实施方式， 该信号肽具有表现出与 SEQ ID NO ： 161 具有至少 90％ 序列同源性的氨基酸序列。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域是人 Fc 结构域。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域是 IgG Fc 结构域。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域是 IgG1 结构域。
根 据 本 发 明 一 些 实 施 方 式，该 Fc 结 构 域 或 其 片 段 是 非 糖 基 化 的 (non-glycosylated)。
根据本发明一些实施方式， 该 Fc 结构域或其片段具有 SEQ ID NO ： 160。
根据本发明一些实施方式， 该多肽的特征是具有抑制至少一种趋化因子与趋化因 子受体 (chemokine receptor) 结合的能力。
根据本发明一些实施方式， 该多肽的特征是具有增强至少一种趋化因子与趋化因 子受体结合的能力。
根据本发明一些实施方式， 该药物组合物包装在包装材料中， 并在包装材料中或 包装材料上标识用于调节趋化因子的生物效应。
根据本发明一些实施方式， 该药物组合物包装在包装材料中， 并在包装材料中或 包装材料上标识用于治疗选自以下的病症 ： 炎症、 过敏症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫 反应、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排 斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动 脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
根据本发明一些实施方式， 该药物组合物调配用于静脉给予、 口服给予、 皮下给 予、 局部给予 (topical administration) 和 / 或鼻内给予。
根据本发明一些实施方式， 该药物调配用于静脉给予、 口服给予、 皮下给予、 局部 给予和 / 或鼻内给予。
根据本发明一些实施方式， 给予包括静脉给予、 口服给予、 皮下给予、 局部给予和 / 或鼻内给予。
根据本发明一些实施方式， 调节包括抑制。
根据本发明一些实施方式， 该趋化因子选自 I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细 胞趋化因子和 RANTES。
根据本发明一些实施方式， 该生物效应选自炎性效应、 细胞迁移、 肿瘤生长和癌转 移 (cancer metastasis)。
根据本发明一些实施方式， 该多肽用于治疗选自以下的病症 ： 炎症、 过敏症、 迟发 型超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红 斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感 染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
根据本发明一些实施方式， 该分离多核苷酸具有选自 SEQ ID NO ： 168 和 SEQ ID NO ： 169 的核酸序列。
根据本发明一些实施方式， 该水溶性聚合物是聚乙二醇。
除非另有限定， 否则本文使用的所有技术和 / 或科学术语的含义都与本发明所属 领域普通技术人员通常理解的相同。虽然下面描述了示例方法和 / 或材料， 但本发明实施 方式的实施或试验中可使用与本文所述的那些相似或者等同的方法和 / 或材料。如有冲 突， 以专利说明书为准， 包括定义。另外， 材料、 方法和实例仅为了说明， 而不旨在进行不必 要的限制。 附图说明 本文仅参考附图通过实例说明本发明的一些实施方式。关于下面详细讨论的附 图， 要强调的是， 所示细节仅为了举例， 用于示意性地讨论本发明的实施方式。 就此而言， 参 考附图所作的描述将使本领域技术人员明了本发明实施方式可以如何实施。
在该图中 ：
图 1A 和 1B 是载体的载体图谱 (vector maps)， 该载体用于编码根据本发明一些 实施方式的多肽， 即， SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC， 图 1A) 和 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC， 图 1B)， 并进一步编码对氨必西林 ( 氨苄青霉素， ampicillin)(Amp) 和嘌呤霉素 (puromycin) (Puro) 具有抗性的基因 ；
图 2 是 Western 印迹 ( 蛋白杂交印迹， Western blot) 图像， 示出遗传加工 ( 基因 设计， genetically engineered) 用于产生示例多肽 SEQ ID NO ： 158( 泳道 1 和 2) 和 SEQ ID NO ： 159( 泳道 3-5) 的 HEK 293T 细胞池中的 IgG Fc， 以及 50ng( 泳道 6)、 100ng( 泳道 7)、 200ng( 泳道 8) 和 300ng( 泳道 9) 的对照 IgG Fc 的表达 ；
图 3A ～ 3C 是 示 出 在 暴 露 于 肽 BKT-P2(SEQ ID NO ： 101) 前 后， IP-10( 图 3A)、 I-TAC( 图 3B) 和 MIG( 图 3C) 诱导的 T 细胞与 VCAM-1 的粘附随剪切流 (shear flow) 的变 化 ( 在热灭活的 SDF-1 细胞因子存在下情况的 T 细胞粘附示为对照 ) 的图表 ；
图 4A ～ 4C 是示出在暴露于根据本发明一些实施方式的多肽， BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 前后， IP-10( 图 4A)、 I-TAC( 图 4B) 和 MIG( 图 4C) 诱导的 T 细胞与 VCAM-1 的粘 附随剪切流的变化 ( 在热灭活的 SDF-1 细胞因子存在情况下的 T 细胞粘附示为对照 (den))
的图表 ；
图 5A 和 5B 是示出对照小鼠以及用具有 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC) 的示例多 肽处理的小鼠的 EAE( 实验自身免疫性脑脊髓炎 ) 平均临床得分随着用 PLP( 蛋白脂质蛋白 质 ) 免疫从而诱导急性疾病后的时间的变化 ( 图 5A)， 和 EAE 平均累积临床得分 ( 图 5B) 的 图表 ；
图 6A 和 6B 是示出对照小鼠以及用具有 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC) 或 SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC) 的示例多肽处理的小鼠的 EAE( 实验自身免疫性脑脊髓炎 ) 平均临床 得分随着用 PLP( 蛋白脂质蛋白质 ) 免疫从而诱导急性疾病后的时间的变化 ( 图 6A)， 和 EAE 平均累积临床得分 ( 图 6B) 的图表 ；
图 7 是示出对照小鼠以及用具有 SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC) 或 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC) 的示例多肽处理的小鼠的 EAE( 实验自身免疫性脑脊髓炎 ) 平均临床得分 随着用 MOG 肽免疫从而诱导慢性疾病后的时间的变化的图表 ；
图 8A 和 8B 是示出健康小鼠 ( 阴性 CTRL)、 关节炎小鼠 ( 阳性 CTRL) 以及用具有 SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC) 的示例多肽处理的关节炎小鼠的膝关节腔 (knee cavity) 中 的嗜中性粒细胞 ( 图 8A) 和单核细胞 ( 图 8B) 的水平的图表 ； 以及 图 9 是具有 SEQ ID NO ： 159(BKT-P46-FC) 和 SEQ ID NO ： 158(BKT-P2-FC) 的示例 多肽对迟发型超敏反应的抑制 ( 示出地塞米松 (Dex.) 的抑制用于比较 ) 的图表。
具体实施方式
本发明公开了能够结合趋化因子的新型多肽， 更特别地但不排它地， 涉及能够调 节趋化因子依赖性过程如自身免疫、 炎症和癌症的多肽。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前， 应理解本发明的应用不必局限于下 面的说明所列出的或通过实施例列举的细节。本发明能够有其它实施方式， 或能够以多种 方式实施或实现。
如上面背景部分所述的， 已描述了 ( 例如， 在国际专利申请 PCT/IL03/00155( 以 WO 03/072599 公开 ) 和美国专利 No.7,488,717) 能够结合到趋化因子上并能够调节它们的生 物功能的肽和结构相关的化合物。此种肽的实例在 SEQ ID NO ： 1-157 中列出。由于其能 够调节趋化因子功能的能力， 此种肽具有多种治疗应用。 然而， 此种肽的治疗益处典型地受 到， 例如肽在体内的短半衰期的限制。
当试图制取具有改进特性的趋化因子结合肽时， 本发明人将趋化因子结合肽附接 ( 连接， attach) 到 Fc 结构域片段上。
如下面实施例部分证明的， 简化本发明实践的同时， 发现包含趋化因子结合肽和 Fc 结构域片段的多肽惊人地表现出改进的趋化因子结合能力。进一步发现， 该多肽表现出 改进的治疗免疫相关性疾病和障碍如多发性硬化、 关节炎和迟发型超敏反应的体内功效， 以及长的循环寿命 (circulation lifetime)。
现参考附图和表格， 图 1A 和 1B 示出用于表达根据本发明一些实施方式的示例多 肽的示例 DNA 构建体， 该示例多肽称为 BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 和 BKT-P46-FC(SEQ ID NO ： 159)。图 2 示出前述示例多肽在细胞培养物中的表达， 如通过 Western 印迹检测的。
“BKT-P2-FC” 和 “BKT-P46-FC” 是本发明所有者 (owners) 所有的商标。BKT-P2-FC是 指 还 在 临 时 专 利 申 请 No.61/213,493 中 称 为 “IL6 信 号 肽 -BKT-P2- 间 隔 子 -FC” 、 “P2-Fc” 、 “BKT-Fc-2” 、 “BKT-Fc-P2” 、 “IL6-P2-Fc” 、 “IL6-P2-Fc N297A” 和 “IL6-BioPep1-Fc N297A”的 多 肽。BKT-P46-FC 是 指 还 在 临 时 专 利 申 请 No.61/213,493 中 称 为 “IL6 信 号 肽 -BKT-P46- 间 隔 子 -FC” 、 “BKT-Fc-46” 、 BKT-FC-46” 、 “P46-FC” 、 IL6-P46-Fc” 、 “IL6-P46-Fc N297A” 和 “IL6-BioPep2-Fc N297A” 的多肽。
表 3 示 出 前 述 示 例 多 肽 与 多 种 趋 化 因 子 的 结 合 的 解 离 常 数 (dissociation constants)。
图 4A-4C 示出示例多肽 (SEQ ID NO ： 158) 对一些趋化因子生物活性 ( 诱导 T 细胞 粘附 ) 的抑制作用。 作为比较， 图 3A-3C 示出该多肽所基于的趋化因子结合肽 (SEQ ID NO ： 101) 对相同活性的抑制作用。表 4 概述了示例多肽 (SEQ ID NO ： 158 和 SEQ ID NO ： 159) 以及它们所基于的趋化因子结合肽 ( 分别为 SEQ ID NO ： 101 和 SEQ ID NO ： 76) 抑制多种趋 化因子活性的能力。
图 5A、 5B、 6 和 7 示出根据本发明一些实施方式的示例多肽对抗小鼠 EAE( 实验自 身免疫性脑脊髓炎 ) 进展的功效。图 8A 和 8B 示出示例多肽对抗小鼠关节炎的功效。图 9 示出示例多肽对抗迟发型超敏反应的功效。
表 5 给出可以包括在根据本发明实施方式的多肽中的趋化因子结合肽。
因而， 本文给出的实验结果表明， 根据本发明实施方式的多肽能够结合到趋化因 子上 ( 参见例如表 3)， 是甚至比相应趋化因子结合肽更有效的趋化因子活性调节剂 ( 参见， 例如表 4 和图 3A、 3B、 4A 和 4B)， 可以治疗有效地治疗多种病症 ( 参见例如图 5A-9)。
因此， 根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含至少一种附接到抗体 (e.g.、 IgG、 IgA、 IgD、 IgE、 IgM 抗 体 )Fc 结 构 域 或 Fc 结 构 域 片 段 上 的 趋 化 因 子 结 合 肽 的 分 离多肽。包含附接到 Fc 结构域或其片段上的肽的分子在本文中可称为 “肽体 ( 多肽， peptibodies)” 。
在一些实施方式中， 该多肽包含单个趋化因子结合肽。
替换地， 该多肽包含多于一个的趋化因子结合肽 ( 例如， 2、 3、 4 或 5 个趋化因子结 合肽 )。该趋化因子结合肽可以彼此相同或不同。
如本文使用的术语 “趋化因子结合肽” 是指任何特征为具有结合到溶液中至少一 种趋化因子上的能力的肽 ( 例如， 多达 20 个氨基酸残基的肽 )。示例趋化因子包括， 但不 局限于， CCL1( 其中 CCL 是趋化因子 (C-C 基序 ) 配体的简称 )、 MCP-1( 本领域中也称为 CCL2)、 MIP-1( 包括 MIP-1α 和 / 或 MIP-1β)、 RANTES( 本领域中也称为 CCL5)、 CCL6、 CCL7、 CCL8、 CCL9、 嗜酸性粒细胞趋化因子 ( 本领域中也称为 CCL11)、 CCL12、 CCL13、 CCL14、 CCL15、 CCL16、 CCL17、 CCL18、 CCL19、 CCL20、 CCL21、 CCL22、 CCL23、 CCL24、 CCL25、 CCL26、 CCL27、 CCL28、 CXCL1( 其中 CXCL 是趋化因子 (C-X-C 基序 ) 配体的简称 )、 CXCL2、 CXCL3、 CXCL4、 CXCL5、 CXCL6、 CXCL7、 白介素 (interleukin)-8( 本领域中也称为 CXCL8)、 MIG( 本领域中也 称为 CXCL9)、 IP-10( 本领域中也称为 CXCL10)、 I-TAC( 本领域中也称为 CXCL11)、 SDF-1( 本 领域中也称为 CXCL12)、 BCA-1( 本领域中也称为 CXCL13)、 CXCL14、 CXCL15、 CXCL16、 CXCL17、 XCL1、 XCL2 和 CX3CL1。根据一个实施方式， 该肽可以结合到至少一种选自以下的趋化因子 上： I-TAC( 干扰素可诱导的 T 细胞 α 化学引诱物 )、 IP-10(10kDa 干扰素 γ- 可诱导的蛋 白 )、 MIG(γ 干扰素诱导的单核因子 (monokine))、 MCP-1( 单核细胞趋化蛋白 -1)、 嗜酸性粒细胞趋化因子和 RANTES( 活化后调节的、 正常 T 细胞表达与分泌的 )。
与趋化因子的结合可以通过本领域中已知的任何合适的技术 ( 例如， ELISA) 测 定。 可选地， 该结合是这样的， 以便该肽与趋化因子的结合的解离常数 (Kd) 小于 10-4M， 可选 -5 -6 地小于 10 M， 并可选地小于 10 M。测定解离常数的合适的技术是技术人员已知的。
可以根据本发明实施方式使用的趋化因子结合肽描述在国际专利申请 PCT/ IL03/00155( 以 WO 03/072599 公开 ) 和美国专利 No.7,488,717 中。
在一些实施方式中， 该趋化因子结合肽的长度为 5 ～ 50 个氨基酸， 可选地 5 ～ 40 个氨基酸， 可选地 5 ～ 30 个氨基酸， 可选地 7 ～ 20 个氨基酸， 可选地 9 ～ 20 个氨基酸， 并 可选地为 10 ～ 20 个氨基酸。根据示例实施方式， 该趋化因子结合肽的长度为约 12 个氨基 酸。
可选地， 该趋化因子结合肽选自 SEQ ID NO ： 1 ～ 157。
在一些实施方式中， 该趋化因子结合肽的特征是存在至少 2 个组氨酸残基和整体 带正电荷 (overall positive charge)( 例如， 带正电荷的氨基酸数目多于带负电荷的氨基 酸 )， 其中该肽主要由选自 H、 S、 A、 L、 I、 K、 R、 T 和 P 的氨基酸组成 ( 例如， 该肽的至少 40％， 并可选地至少 50％由前述氨基酸组成 )。 具 有 前 述 特 征 的 肽 实 例 包 括， 但 不 局 限 于， SIFAHQTPTHKN(SEQ ID NO ： 100)、 SIPSHSIHSAKA(SEQ ID NO ： 101)、 SAISDHRAHRSH(SEQ ID NO ： 96)、 SAGHIHEAHRPL(SEQ ID NO ： 95)、 ACHASLKHRC(SEQ ID NO ： 44)、 AHSLKSITNHGL(SEQ ID NO ： 46)、 ESDLTHALHWLG(SEQ ID NO ： 54) 、HSACHASLKHRC(SEQ ID NO ： 69) 、WSAHIVPYSHKP(SEQ ID NO ： 143) 、 YATQHNWRLKHE(SEQ ID NO ： 145)、 CAHLSPHKC(SEQ ID NO ： 1)、 GVHKHFYSRWLG(SEQ ID NO ： 61)、 HPTTPIHMPNF(SEQ ID NO ： 66)、 SVQTRPLFHSHF(SEQ ID NO ： 113)， 和 VHTSLLQKHPLP(SEQ ID NO ： 133)。SIPSHSIHSAKA(SEQ ID NO ： 101)， 在本文称为 “BKT-P2” ， 是示例趋化因子结合 肽。
在一些实施方式中， 该趋化因子结合肽的特征是存在至少 2 个相邻的 ( 邻近的， adjacent) 组氨酸残基和整体带正电荷 ( 例如， 带正电荷的氨基酸数目多于带负电荷的氨 基酸 )， 其中该肽主要由选自 H、 P、 T、 L、 R、 W 和 F 的氨基酸组成 ( 例如， 该肽的至少 40％， 并 可选地至少 50％由前述氨基酸组成 )。
具 有 前 述 特 征 的 肽 实 例 包 括， 但 不 局 限 于， GDFNSGHHTTTR(SEQ ID NO ： 59)、 HHFHLPKLRPPV(SEQ ID NO ： 64)、 HHTWDTRIWQAF(SEQ ID NO ： 65)、 LDYPIPQTVLHH(SEQ ID NO ： 76)、 LLADTTHHRPWP(SEQ ID NO ： 79)、 TRLVPSRYYHHP(SEQ ID NO ： 125)、 CHHNLSWEC(SEQ ID NO ： 7) 和 SFWHHHSPRSPL(SEQ ID NO ： 99)。LDYPIPQTVLHH(SEQ ID NO ： 76) 在本文称为 “BKT-P46” ， 是示例趋化因子结合肽。
可选地， 该趋化因子结合肽具有表现出与选自 SEQ ID NO ： 1 ～ 157( 例如， SEQ ID NO ： 76 和 101) 的氨基酸序列具有至少 70％， 至少 80％， 至少 90％序列同源性的氨基酸序 列。可选地， 该序列同源性至少为 95％。可选地， 该序列同源性为 100％。
同源性可以利用国家生物技术信息中心 (NCBI)BlastP 软件用缺省参数测定。同 源性也可以指缺失、 插入或替换 (substitution) 变体， 包括其氨基酸替换及其具有生物活 性的多肽片段。
如本文使用的 “Fc 结构域” 是指抗体重链区， 典型地包含该重链的至少两个恒定结
构域 (CH2 和 CH3 结构域， 如同本领域中定义的这些术语 )。该 Fc 结构域可以例如以二聚 体形式， 通过用木瓜蛋白酶消化抗体获得。通过二硫键相连的 Fc 结构域多肽的二聚体形成 抗体的 “尾部” 区。如本领域众所周知的， 这些类别的抗体的 Fc 结构域可以是多聚体形式。 因而， 该 Fc 结构域可选地为单聚体， 可选地为二聚体， 并可选地为多聚体。可选地， 本文所 述的多肽是二聚体形式， 该多肽包含 Fc 二聚体， 或者为多聚体形式， 该多肽包含 Fc 多聚体。
该 Fc 结构域可以包括天然 Fc 结构域 ( 即， 抗体中天然存在的结构域 ) 的修饰 形式， 例如， 与天然 Fc 结构域具有至少 90％同源性， 可选地至少 95％同源性， 和可选地至 少 98 ％同源性的多肽。修饰的 Fc 结构域描述在例如国际专利申请 WO 97/34631 和 WO 96/32478 中。
可选地， 对天然 Fc 进行修饰以便除去提供本发明实施方式不需要的结构特征或 生物活性的位点。 此种位点的实例包括， 影响或参与二硫键形成、 与所选宿主细胞的不相容 性、 在所选宿主细胞中表达后 N 末端异质性 (N-terminal heterogeneity)、 糖基化、 与补体 的相互作用、 与 Fc 受体 ( 除了新生儿 Fc 受体 (neonatal Fc receptor)) 的结合， 和 / 或抗 体依赖性细胞毒性的残基。
根据本发明实施方式的多肽也可以包含 Fc 结构域的片段。可选地， 该片段包含如 上文定义的 Fc 结构域的至少 20％， 可选地至少 50％， 和可选地至少 80％。 该 Fc 结构域或其片段可选地包括新生儿 Fc 受体 (FcRn) 的结合位点。
如下面实施例部分中列举的， 根据本发明实施方式的多肽在血液循环中具有相对 长的寿命， 给予后显著水平的多肽在血液中保持至少 11 天。
根据一个实施方式， Fc 结构域或其片段与趋化因子结合肽附接形成体内半衰期比 单独趋化因子结合肽长的多肽。这可能是由于 Fc 结构域的血清半衰期长 ( 这可能是由于 Fc 通过结合到 FcRn 上而被再利用 (salvage))， 和 / 或由于该多肽的尺寸大于该趋化因子 结合肽， 这可以减少肾小球过滤 (glomerular filtration) 对血流的清除 (clearance)。 根 据另一个实施方式， 所形成的多肽与单独趋化因子结合肽相比免疫原性降低。
根据可选的实施方式， 该 Fc 结构域或其片段是人 Fc 结构域 ( 例如， 源自人抗体 ) 或其片段。
根据示例实施方式， 该 Fc 结构域 ( 或其片段 ) 是 IgG( 例如 IgG1)Fc 结构域 ( 或 其片段 )。可选地， 该 Fc 结构域、 或其片段是非糖基化的。
根据示例实施方式， 该 Fc 片段具有与带有 N297A 突变的人 IgG1 Fc 片段相对应的 SEQ ID NO ： 160。
可选地， 该 Fc 结构域 ( 或其片段 ) 的 N 末端附接 ( 直接或通过接头 ) 到趋化因子 结合肽上。该 N 末端可选地附接到至少一个趋化因子结合肽上， 例如， 通过附接到包含至少 一个趋化因子结合肽的序列上。
替换地或另外地， 该 Fc 结构域 ( 或其片段 ) 的 C 末端， 直接或通过接头 ( 例如氨基 酸接头 ) 附接到趋化因子结合肽上。该 C 末端可选地附接到至少一个趋化因子结合肽上。
除了本文所述的趋化因子结合肽和 Fc 结构域或片段之外， 本文所述的多肽可以 进一步包含一个或多个另外的肽序列。此种序列可以可选地选择， 以便提供期望的生物活 性或结构特征， 例如， 可改进该多肽的治疗功效或使该多肽容易生产的活性或特征。
因而， 例如， 该多肽可选地包含至少一个所选的能够指导该多肽的运送 ( 转运，
transport) 的信号肽。
可选地， 选择能够促进表达该多肽的细胞 ( 例如， 哺乳动物细胞 ) 分泌该多肽的信 号肽。
可选地， 包括空泡信号序列 (vacuolar signal sequence)( 针对植物转染产生的 多肽 )。
在示例实施方式中， 该多肽包含 IL-6( 白介素 -6) 信号肽 ( 例如 SEQ ID NO ： 161)， 或具有表现出与 IL-6 信号肽具有至少 90％同源性 ( 可选地至少 95％同源性 ) 的氨基酸序 列的信号肽。
上述另外的肽序列 ( 例如， 信号肽 ) 可以存在于该多肽的 N 末端， 或该多肽的 C 末 端， 或者该多肽的中间 ( 例如， 在 Fc 结构域或片段和趋化因子结合肽之间， 或者在两个趋化 因子结合肽之间 )。
因而， 本文所述的 Fc 结构域或片段、 一个趋化因子结合肽 ( 或多个趋化因子结合 肽 ) 和任意一个另外的肽 ( 或任意多个另外的肽 )( 如果存在 ) 可以在该多肽内以任何顺 序彼此附接。
该 Fc 结构域或片段、 一个趋化因子结合肽 ( 或多个趋化因子结合肽 ) 和任意一个 另外的肽 ( 或任意多个另外的肽 )( 如果存在 ) 直接或通过接头 ( 例如氨基酸接头 ) 独立 地彼此附接。 然而， 一些信号肽的活性取决于所处在多肽内的特定区域 ( 例如， N 末端、 C 末端 )。 因此， 根据一些实施方式， 信号肽位于该多肽内特定区域处。
根据示例实施方式， 该信号肽 ( 例如， IL-6 信号肽 ) 在该多肽的 N 末端。N 末端具 有信号肽的多肽实例包括下式多肽 ：
W-X-Z、 W-X-Y-Z、 W-Y-X-Z、 W-Y-X-Y-Z、 W-Z-X、 W-Z-Y-X、 W-Y-Z-X 和 W-Y-Z-Y-X，
其中 W 是信号肽， X 是趋化因子结合肽， Y 是接头 ( 例如， 氨基酸接头 )， Z 是 Fc 结 构域或片段。根据示例实施方式， 该多肽具有上式 W-X-Y-Z。
该接头 ( 也称为 “间隔子” ) 可选地为包含氨基酸、 二肽、 三肽， 或 4 个或更多氨基 酸的氨基酸接头。此种接头是有利的， 因为它们使该多肽能够包含单个连续 (contiguous) 多肽链， 该单个连续多肽链容易作为融合蛋白生产。 该接头典型地这样选择， 以便它不干扰 趋化因子结合肽与其靶趋化因子的结合。可选地， 该接头是由 4 ～ 10 个氨基酸组成的肽 ( 例如， 六肽 )。根据示例实施方式， 该接头是 SEQ ID NO ： 162 中列出的肽。在包含多于一 个的接头的实施方式中， 该接头可以彼此相同或不同。
根据本发明优选的实施方式， 该多肽能够结合到至少一个趋化因子上 ( 例如， 经 由该多肽中的趋化因子结合肽与该趋化因子的相互作用 )。多肽与趋化因子的结合在许多 情况下都会影响趋化因子 ( 例如， I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞趋化因子和 / 或 RANTES) 结合到趋化因子受体上的能力。
因此， 在一些实施方式中， 该多肽的特征是具有能够抑制至少一种趋化因子与趋 化因子受体结合的能力。可选地， 结合的抑制是这样的， 即， 在存在该多肽的情况下的解离 常数 ( 针对趋化因子与受体的结合 ) 比在缺少该多肽的情况下的解离常数高至少 10％， 可 选地至少 100％。
在一些实施方式中， 该多肽的特征是具有能够增强至少一种趋化因子与趋化因子
受体结合的能力。可选地， 结合的增强是这样的， 即， 在存在该多肽的情况下的解离常数 ( 针对趋化因子与受体的结合 ) 比在缺少该多肽的情况下的解离常数低至少 10％， 可选地 至少 50％。
应理解， 根据本发明实施方式的多肽可以可选地抑制至少一种趋化因子与趋化因 子受体结合， 也可以增强至少一种其它趋化因子与趋化因子受体结合。
如本文使用的术语 “多肽” 包括天然多肽 ( 例如， 降解产物、 以合成方式合成的多 肽或重组多肽 ) 和模拟肽 ( 典型地为以合成方式合成的 )， 以及类肽 (peptoids) 或半类肽 (semipeptoids)， 类肽或半类肽是多肽类似物， 可以具有例如使该多肽在身体内更稳定或 更能够透入细胞中的修饰。 此种修饰包括， 但不局限于， N′末端修饰， C′末端修饰， 多肽键 修饰， 包括但不局限于， CH2-NH、 CH2-S、 CH2-S ＝ O、 O ＝ C-NH、 CH2-O、 CH2-CH2、 S ＝ C-NH、 CH ＝ CH 或 CF ＝ CH， 主链修饰和残基修饰。 制备模拟肽化合物的方法在本领域中是熟知的， 明确说明在例如 Quantitative Drug Design， C.A.Ramsden Gd.， Chapter 17.2， F.Choplin Pergamon Press(1992) 中。
该 多 肽 内 的 多 肽 键 (-CO-NH-) 可 以 被 例 如 N- 甲 基 化 键 (-N(CH3)-CO-)、 酯键 (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、 酮 亚 甲 基 键 (-CO-CH2-)、 α- 氮 杂 键 (-NH-N(R)-CO-) 替 换， 其 中 R 是 任 何 烷 基， 例 如， 甲 基、 carba 键 (-CH2-NH-)、 羟 基 亚 乙 基 键 (-CH(OH)-CH2-)、 硫 代 酰 胺 键 (-CS-NH-)、 烯 烃 双 键 (-CH ＝ CH-)、 逆 向 酰 胺 键 (-NH-CO-)、 多肽衍生物 (-N(R)-CH2-CO-)， 其中 R 是天然出现在碳原子上的 “正 (normal)” 侧链。
这些修饰可以发生在沿着多肽链的任何键上， 甚至同时出现在数个 ( 例如 2-3 个 ) 键上。
可以用天然芳香族氨基酸， Trp、 Tyr 和 Phe 替换合成的非天然酸如苯基甘氨酸、 1， 2， 3， 4- 四氢异喹啉 -3- 羧酸 (TIC)、 萘基丙氨酸 (Nal)、 Phe 的环甲基化衍生物、 Phe 的卤化 衍生物或 o- 甲基 -Tyr。
本文所述的天然存在的肽和多肽 ( 例如， Fc 结构域序列、 信号肽 ) 的氨基酸序列， 可以是天然存在的蛋白质中多肽的氨基酸序列或者包含保守性或非保守性替换的那些。
如本文使用的 “保守性替换” 是指用天然或非天然存在的氨基酸或具有相似空间 特性 (steric properties) 的模拟肽替换该肽天然序列中存在的氨基酸。如果待替换天然 氨基酸的侧链是极性或疏水性的， 那么保守性替换应当用也是极性或疏水性的 ( 除了具有 与被替换氨基酸侧链具有相同的空间特性之外 ) 天然存在的氨基酸、 非天然存在的氨基酸 或模拟肽部分进行替换。
因为天然存在的氨基酸通常是根据它们的特性分类的， 所以容易确定用天然存在 的氨基酸进行的保守性替换， 只要记住按照本发明带电氨基酸被空间上类似的不带电氨基 酸的替换被认为是保守性替换。
对于用非天然存在的氨基酸进行保守性替换， 也可以使用本领域熟知的氨基酸类 似物 ( 合成氨基酸 )。天然存在的氨基酸的模拟肽明确记载在技术人员已知的文献中。
当进行保守性替换时， 替换氨基酸的侧链上应当具有与原始氨基酸侧链的相同或 相似的官能团。
如本文使用的术语 “非保守性替换”是指用另一种具有不同电化学和 / 或空 间特性的天然存在或非天然存在的氨基酸替换如亲本序列 (parent sequence) 中存在的氨基酸。因而， 替换氨基酸的侧链可以显著地大于 ( 或小于 ) 被替换天然氨基酸的 侧链， 和 / 或可以具有电特性显著地不同于被替换氨基酸的官能团。这类非保守性替 换的实例包括用苯丙氨酸或环己基甲基甘氨酸替换丙氨酸、 用异亮氨酸替换甘氨酸， 或 用 -NH-CH[(-CH2)5COOH]-CO- 替换天冬氨酸。 落在本发明范围内的那些非保守性替换， 是还 构成具有天然肽活性的肽或多肽的那些 ( 例如， Fc 结构域序列、 信号肽 )。
如本说明书和下面权利要求部分中使用的， 术语 “一种氨基酸” 或 “多种氨基酸” 应理解成包括 20 种天然存在的氨基酸 ； 体内翻译后通常被修饰的那些氨基酸， 包括， 例如， 羟基脯氨酸、 磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸 ； 以及其它不寻常氨基酸， 包括但不局限于， 2- 氨基 己二酸、 羟基赖氨酸、 异锁链素 (isodesmosine)、 正缬氨酸 (nor-valine)、 正亮氨酸和鸟氨 酸。此外， 术语 “氨基酸” 包括 D- 和 L- 氨基酸。
下表 1 和 2 列出可以与本发明一起使用的天然存在的氨基酸 ( 表 1) 和非常规或 修饰的氨基酸 ( 表 2)。
表1
氨基酸 丙氨酸 精氨酸 天冬酰胺 天冬氨酸 半胱氨酸 谷氨酰胺 谷氨酸 甘氨酸 组氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 赖氨酸 蛋氨酸 苯丙氨酸 三个字母的缩写 Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Iie Leu Lys Met Phe 单字母符号 A R N D C Q E G H I L K M F15CN 102482324 A 脯氨酸 丝氨酸 苏氨酸 色氨酸 酪氨酸 缬氨酸 任何上述氨基酸
说Pro Ser Thr Trp Tyr Val Xaa明书P S T W Y V X12/39 页表2
优选利用重组技术制取本发明多肽， 因为这些技术更适合于制取相对长的多 肽 ( 例如， 长于 20 个氨基酸 ) 以及它的大批量生产。此种重组技术描述在下列文献中 ：
Bitter 等人， (1987)Methods in Enzymol.153 ： 516-544， Studier 等人 (1990)Methods in Enzymol.185 ： 60-89， Brisson 等 人 (1984)Nature 310 ： 511-514， Takamatsu 等 人 (1987) EMBO J.6 ： 307-311， Coruzzi 等 人 (1984)EMBO J.3 ： 1671-1680， Brogli 等 人， (1984) Science 224 ： 838-843， Gurley 等人 (1986)Mol.Cell.Biol.6 ： 559-565 and Weissbach & Weissbach， 1988， Methods for Plant Molecular Biology， Academic Press， NY， Section VIII， pp 421-463。
为了利用重组技术生产本发明多肽， 将编码本发明多肽的多核苷酸连接到核酸表 达载体中， 该核酸表达载体包含在适合于指导本发明多肽在宿主细胞中的组成型、 组织特 异性或诱导型转录的顺式调节序列 ( 例如， 启动子序列 ) 的转录调控下的多核苷酸序列。
可用于表达趋化因子结合肽的分离多核苷酸实例在 SEQ ID NO ： 163 和 164 中列 出。可用于表达 Fc 片段的分离多核苷酸序列实例为如 SEQ ID NO ： 165 中所列出的。可用 于表达 IL-6 信号肽的分离多核苷酸实例在 SEQ ID NO ： 166 中列出。可用于表达接头的分 离多核苷酸实例在 SEQ ID NO ： 167 中列出。
可用于表达根据本发明一些实施方式的多肽的示例多核苷酸序列在 SEQ ID NO ： 168 和 169 中列出。
短语 “分离多核苷酸 ( 分离的多核苷酸， isolated polynucleotide)” 是指分离并 以 RNA 序列、 互补多核苷酸序列 (cDNA)、 基因组多核苷酸序列和 / 或复合多核苷酸序列 ( 例 如， 上述组合 ) 形式提供的单链或双链核酸序列。
如本文使用的， 短语 “互补多核苷酸序列” 是指利用逆转录酶或任何其它 DNA- 依 赖性 DNA 聚合酶使信使 RNA 逆转录形成的序列。此种序列随后可以利用 DAN 依赖性 DNA 聚 合酶在体内或体外扩增。
如本文使用的， 短语 “基因组多核苷酸序列” 是指从染色体中衍生 ( 分离 ) 的序列， 因而代表染色体的连续部分 (contiguous portion)。
如 本 文 使 用 的，短 语 “复 合 多 核 苷 酸 序 列 (composite polynucleotide sequence)” 是指至少部分互补和至少部分基因组的序列。 复合序列可以包括编码本发明多 肽所需的一些外显子 (exonal) 序列， 以及介于其间的内含子序列。该内含子序列可以是任 何来源的， 包括其它基因， 典型地包括保守性剪接信号序列。 此种内含子序列可以进一步包 括顺式作用的表达调节元件。
如所述的， 本发明实施方式的多核苷酸可以进一步包含编码针对多肽分泌的信号 肽 ( 如上文所讨论的 ) 的信号序列。
在表达和分泌之后， 可选地从形成成熟多肽的前体蛋白中除去信号肽。
本发明多核苷酸可以利用例如本文下面实施例 1 中描述的 PCR 技术， 或本领域中 已知的用于连接两种不同 DNA 序列的任何其它方法或程序 ( 步骤， procedure) 制备。参 见， 例如， “Current Protocols in Molecular Biology” ， eds.Ausubel 等人， John Wiley & Sons， 1992。
如上文所述的， 本发明多核苷酸序列典型地插入在表达载体 ( 即， 核酸构建体 ) 中 从而使重组多肽能被表达。本发明实施方式的表达载体包括使这种载体适合于在原核生 物、 真核生物， 或优选二者 ( 例如， 穿梭载体 (shuttle vectors)) 中复制和整合的另外序 列。典型的克隆载体包含转录和翻译起始序列 ( 例如， 启动子、 增强子 ) 以及转录和翻译终止子 ( 例如， 多聚腺苷化信号 )。
真核启动子典型地包含两类识别序列， TATA 框和上游启动子元件。TATA 框位于转 录起始点上游 25 ～ 30 个碱基对处， 被认为参与指导 RNA 聚合酶开始 RNA 的合成。其它上 游启动子元件决定转录起始速率。
与同源或异源启动子连接时， 增强子元件可促进转录提升至 1,000 倍。增强子 在处于转录起始点上游或者下游的时候是具有活性的。源自病毒的许多增强子元件具有 宽广的宿主范围， 并在多种组织中具有活性。例如， SV40 早期基因增强子适合于许多细胞 类型。适合于本发明的其它增强子 / 启动子组合包括来源于多瘤病毒 (polyoma virus)、 人或鼠巨细胞病毒 (cytomegalovirus， CMV) 的那些， 以及来自各种逆转录病毒如鼠白血 病病毒、 鼠或 Rous 肉瘤病毒和 HIV 的长末端重复序列。参见 Enhancers and Eukaryotic Expression， Cold Spring Harbor Press， Cold Spring Harbor， N.Y.1983， 该文献通过引 用合并在此。
在构建表达载体时， 优选将启动子设置成与异源转录起始位点的距离和它在自然 环境下与转录起始位点的距离近似相同。 然而， 如本领域众所周知的， 在不损坏启动子功能 的情况下可以对这个距离的各种变化进行调节。
除了已描述的元件以外， 本发明的表达载体还可典型地包含其它旨在提高克隆核 酸的表达水平或使携带重组 DNA 的细胞的鉴定易于进行的特定元件。例如， 许多动物病毒 包含促进病毒基因组在允许的细胞类型中进行额外染色体复制的 DNA 序列。携载这些病毒 复制子的质粒可以游离地复制 ( 作为附加体地复制， replicated episomally)， 只要质粒上 携带的基因或宿主细胞基因组的基因能够提供合适的因子即可。
该载体可以包括或可以不包括真核复制子。如果存在真核复制子， 则该载体可利 用合适的可选标记 (selectable marker) 在真核细胞中扩增。如果该载体不包含真核复制 子， 则无法进行游离型扩增 (episomal amplification)。 相反， 重组 DNA 整合到工程细胞的 基因组中， 其中启动子指导期望核酸的表达。
本发明的表达载体可以进一步包括， 另外的允许例如从单一 mRNA 如内核糖体进 入位点 (internal ribosome entry site， IRES) 翻译数种蛋白质的多核苷酸序列和供启动 子嵌合多肽基因组整合用的序列。
哺 乳 动 物 表 达 载 体 的 实 例 包 括， 但 不 限 于， 可 从 Invitrogen 获 得 的 pcDNA3、 pcDNA3.1(+/-)、 pGL3、 pZeoSV2(+/-)、 pSecTag2、 pDisplay、 pEF/myc/cyto、 pCMV/myc/cyto、 pCR3.1、 pSinRep5、 DH26S、 DHBB、 pNMT1、 pNMT41、 pNMT81， 可从 Promega 获得的 pCI， 可从 Strategene 获得的 pMbac、 pPbac、 pBK-RSV 和 pBK-CMV， 可从 Clontech 获得的 pTRES， 和它 们的衍生物。
也可以使用包含来自于真核病毒如逆转录病毒的调节元件的表达载体。 SV40 载体 包括 pSVT7 和 pMT2。源于牛乳头瘤病毒的载体包括 pBV-1MTHA， 源于艾伯斯坦 - 巴尔病毒 + 的载体包括 pHEBO 和 p2O5。其它示例载体包括 pMSG、 pAV009/A 、 pMTO10/A+、 pMAMneo-5、 杆 状病毒 pDSVE， 和任何其它允许蛋白表达在 SV-40 早期启动子、 SV-40 晚期启动子、 金属硫蛋 白启动子 (metallothionein promoter)、 鼠乳腺肿瘤病毒启动子、 Rous 肉瘤病毒启动子、 多 角体蛋白启动子 (polyhedrin promoter) 或其它对真核细胞的表达有效的启动子的指导下 进行的载体。病毒是非常专一的感染原， 它们已在许多情况下发生演变 ( 进化， evolve) 从而 逃避宿主防御机制。典型地， 病毒感染特定细胞类型并在其中繁殖。病毒载体的靶向特异 性利用它的天然特异性而特异性地靶向预定细胞类型， 从而将重组基因导入到受感染细胞 中。因此本发明使用的载体类型将取决于转化的细胞类型。
重组病毒载体对本发明实施方式的多肽表达有用， 因为它们具有诸如横向感染 (lateral infection) 的优点。横向感染是例如逆转录病毒生命周期中固有的， 是单一受 感染细胞产生很多可出芽并感染邻近细胞的子代病毒粒子的过程。结果是大面积迅速受 到感染， 其大部分最初并不是通过原始病毒颗粒感染的。这与纵向型感染 (vertical-type infection) 形成对比， 在纵向型感染中感染原仅通过母系子代 (daughter progeny) 传播。 也可生产不可横向传播的病毒载体。 如果期望目的是将特定基因导入到有限数目的靶细胞 中， 则这种性质可能是有用的。
多种原核或真核细胞可用作表达本发明多肽的宿主表达系统。这些包括， 但不限 于， 微生物， 如用包含多肽编码序列的重组细菌噬菌体 DNA、 质粒 DNA 或粘粒 DNA 表达载体转 化的细菌 ( 例如， 大肠杆菌， 包括但不局限于大肠杆菌菌株 BL21(DE3)plysS、 BL21， (DE3)RP * 和 BL21 以及枯草杆菌 )， 用包含多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母， 用包含多 肽编码序列的重组病毒表达载体 ( 如花椰菜花叶病毒， CaMV ； 烟草花叶病毒， TMV) 感染或用 包含多肽编码序列的重组质粒表达载体如 Ti 质粒转化的植物细胞系统。
有多种方法可以用来将本发明表达载体导入到宿主表达系统细胞中。 此种方法一 般地描述在以下文献中 ： Sambrook 等人， Molecular Cloning ： ALaboratory Manual， Cold Springs Harbor Laboratory， New York(1989， 1992)， in Ausubel 等人， Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley and Sons， Baltimore， Md.(1989)， Chang 等 人， Somatic Gene Therapy， CRC Press， Ann Arbor， Mich.(1995)， Vega 等人， Gene Targeting， CRC Press， Ann Arbor Mich.(1995)， Vectors ： A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses， Butterworths， Boston Mass.(1988)and Gilboa et at.[Biotechniques 4(6) ： 504-512， 1986]， 并包括例如， 用重组病毒载体进行的稳定或短暂转染、 脂质转染、 电 穿孔和感染。另外， 对于正 - 负选择方法参见美国专利 No.5,464,764 和 5,487,992。
通过病毒感染导入核酸具有优于其它方法如脂质转染和电穿孔的数个优点， 因为 病毒的感染性质而可以获得更高的转染效率。
本发明多肽的核酸序列可以针对在特定宿主细胞中的表达进行优化。 此种序列修 饰的实例包括， 但不局限于， 改变 G/C 含量至更接近感兴趣物种中通常发现的， 和除去非典 型地在物种中发现的密码子， 通常称为密码子优化。
短语 “密码子优化” 是指选择合适的 DNA 核苷酸用于接近感兴趣物种内密码子使 用的结构基因或其片段内。因此， 优化的基因或核酸序列是指为了利用所选物种内统计 学上优选或统计学上偏好的密码子已经将其中天然或天然产生的基因的核苷酸序列进行 修饰的基因。通常在 DNA 水平上检测核苷酸序列， 并使用任何合适的程序测定针对在物 种中的表达进行优化的编码区， 这些方法如 Sardana 等 (1996， Plant Cell Reports 15 ： 677-681) 中所述的。 在这种方法中， 可以计算密码子使用的标准偏差， 密码子偏好的量度标 准， 首先发现天然基因每个密码子的使用相对于所选物种高度表达的基因的比例方差， 接 着计算均方差。所用公式是 ： 1SDCU ＝ n ＝ 1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N， 其中 Xn 是指高度表达的基因中的密码子的使用频率 n， 其中 Yn 是指目标基因中的密码子的使用频率 n， N 是指感兴趣 基因中的密码子总数。
根据特定细胞类型的优选密码子使用， 优化核酸序列的一种方法是基于密码子 优化表的直接使用， 无需进行任何额外的统计学计算， 密码子优化表为， 例如通过日本的 NIAS( 农业生物科学研究所 )DNA 库在密码子使用数据库在线提供的那些 (http://www. kazusa.or.jp/condon/)。 密码子使用数据库含有供许多不同物种用的密码子使用表， 已经 基于 Genbank 中呈现的数据在统计学上测定了每个密码子使用表。
通过使用上述表来测定特定物种中每个氨基酸的最优选或最偏好的密码子， 编码 感兴趣蛋白的天然存在的核苷酸序列对于该特定物种是密码子优化的。 这可以通过用关于 氨基酸在统计学上更偏好的相应密码子替代特定物种基因组中具有低统计学发生率的密 码子来实现。 然而， 可以选择一个或多个不太偏好的密码子来删除现有的限制位点， 从而在 潜在有用的连接处 (5’ 和 3′端从而添加信号肽或终止盒 (termination cassettes)， 可以 用来切割或剪接片段来产生正确全长序列的内部位点 ) 创建新的限制位点， 或除去负面影 响 mRNA 稳定性或表达的核苷酸序列。
在任何修饰之前， 天然存在的编码核苷酸序列可能已经含有许多对应于特定物种 中统计学上偏好的密码子。因此， 天然核苷酸序列的密码子优化可以包括测定天然核苷酸 序列内哪个密码子对于特定物种不是统计学上偏好的， 和根据特定物种的密码子使用表对 这些密码子进行修饰从而产生密码子优化的衍生物。 修饰核苷酸序列对于特定物种的密码 子使用可以是全部或部分优化的， 只要修饰核苷酸序列编码的蛋白质是以高于相应天然存 在的或天然的基因编码的蛋白质的水平产生的即可。 通过改变密码子使用构建合成基因描 述于例如 PCT 专利申请 93/07278 中。
因此， 本发明包括上文所述的核酸序列、 其片段、 可与其杂交的序列、 与其同源的 序列、 与其直系同源 (orthologous) 的序列、 编码具有不同密码子使用的相似多肽的序列、 特征在于突变的改变序列， 该突变为， 例如一个或多个核苷酸的缺失， 插入或替换， 其是天 然发生的或人工诱导的， 随机或以有目标的方式进行的。
独立于宿主细胞系统， 应理解除了包含用于转录和翻译所插入编码序列 ( 编码该 多肽 ) 的必需元件， 本发明表达构建体还可以包括设计用于优化所表达多肽的稳定性、 生 产、 纯化、 产率或活性的序列。
在允许表达大量重组多肽的有效条件下培养所转化细胞。有效培养条件包括， 但 不局限于， 允许生产蛋白质的有效培养基、 生物反应器、 温度、 pH 和氧气条件。有效培养基 是指可培养细胞生产本发明重组多肽的任何培养基。此种培养基典型地包括具有可同化 碳、 氮和磷酸酯来源， 以及适当的盐、 矿物质、 金属和其它营养物如维生素的水溶液。 本发明 细胞可以在常规发酵生物反应器、 摇瓶、 试管、 微量滴定盘 (microtiter dishes) 和培养皿 (petri plates) 中培养。培养可以在适合于重组细胞的温度、 pH 和氧含量条件下执行。此 种培养条件在技术人员的技能范围内。
根据用于生产的载体和宿主系统， 本发明所得多肽可以保留在重组细胞中、 分 泌 到 发 酵 培 养 基 中、 分 泌 到 两 个 细 胞 膜 之 间 的 间 隙， 如大肠杆菌的细胞周质间隙 (periplasmic space) 中， 或者保留在细胞或病毒膜表面上。
培养预定时间之后， 对重组多肽进行回收。本文使用的短语 “回收重组多肽” 是指收集包含多肽的全部发酵培养基， 并不意味 着需要额外的分离或纯化步骤。
因而， 本发明多肽可利用多种标准蛋白纯化技术进行纯化， 如， 但不限于， 亲 和 色 谱 法、 离 子 交 换 色 谱 法、 过 滤、 电 泳、 疏 水 作 用 色 谱 法 (hydrophobic interaction chromatography)、 凝胶过滤色谱法、 反相色谱法、 伴刀豆球蛋白 A 色谱法 (concanavalin A chromatography)、 色谱聚焦和差别溶解 (differential solubilization)。
本实施方式的多肽可以通过亲和色谱法常规纯化。蛋白质 A 作为亲和配体的适 合性取决于物种和用在嵌合体中的免疫球蛋白 Fc 结构域的同种型 (isotype)。蛋白质 A 可以用于纯化基于人 γ1、 γ2 或 γ4 重链的嵌合分子 [Lindmark 等人， J.Immunol.Meth.， 62 ： 1-13(1983)].Protein G is preferably used for all mouse isotypes and for humanγ3[Guss 等人， EMBO J.， 5： 1567-1575(1986)]。亲和配体附着的固体载体最经常为 琼脂糖， 但也可以利用其它固体载体。机械稳定的固体载体， 如可控多孔玻璃 (controlled pore glass) 或聚 ( 苯乙烯二乙烯基 ) 苯， 可以获得较琼脂糖可以实现的更快的流速和更 短的加工时间。使嵌合分子结合到蛋白质 A 或 G 亲和柱上的条件完全由 Fc 结构域的特性， 即， 它的物种和同种型控制。一般地， 当选择适当的配体时， 高效结合直接在非条件培养液 中进行。本发明这个方面的结合多肽可以在酸性 pH(3.0 或高于 3.0) 下， 或在含有温和离 液盐 (chaotropic salt) 的中性 pH 缓冲液中高效地洗脱。这个亲和色谱分离步骤可以使 多肽制品纯度＞ 95％。 可以针对蛋白质 A 或 G 使用本领域中已知的其它方法代替亲和色谱法， 或与亲 和色谱法一并纯化本发明实施方式的多肽。例如， 预期该多肽的性质类似于亲硫凝胶色 谱 (thiophilic gel chromatography) 分离的抗体 [Hutchens 等人， Anal.Biochem.， 159 ： 217-226(1986)]and immobilized metal chelate chromatography[Al-Mashikhi et al.， J.Dairy Sci.， 71 ： 1756-1763(1988)]。
为了便于回收， 可以将所表达的编码序列设计成编码本发明多肽和融合的可切割 部分， 例如组氨酸。 此种融合蛋白可以设计成这样的， 以便该多肽可以容易地通过亲和色谱 分离， 例如， 通过固定在对可切割部分有特异性的柱子上。
如果切割位点设计在多肽和可切割部分之间， 那么通过用特异性切割这个位 点 处的融 合 蛋 白 的 适当的 酶或药 剂进行处理可 以使该色 谱柱释放该多 肽 [ 例如， 参 见 Booth 等 人， Immunol.Lett.19 ： 65-70(1988) ； 和 Gardella 等 人， J.Biol.Chem.265 ： 15854-15859(1990)]。
本发明多肽优选以 “基本纯” 的形式收回。
如本文使用的短语 “基本纯” 是指允许该多肽有效地用于本文所述的应用中的纯 度。
除了可以在宿主细胞中合成之外， 本发明多肽也可以利用体外表达系统合成。这 些方法是本领域熟知的， 并且该系统的组分是可商购获得的。
该多肽可以按原样使用， 或进一步修饰。
例如， 可以通过将水溶性聚合物 ( 例如， 聚乙二醇 ) 附接到该多肽上， 对该多肽进 行修饰。 此种水溶性聚合物的附接可以改进该多肽的生物活性， 例如， 通过提高该多肽的溶 解性， 降低该多肽的毒性， 延长该多肽的循环半衰期 ( 例如， 通过降低肾小球过滤 )， 和/或
保护该多肽免受蛋白水解降解进行。
因此， 根据本发明的可选实施方式， 将本文所述的多肽附接到水溶性聚合物上。 聚 乙二醇是合适的水溶性聚合物。适合 ( 例如， 无毒 ) 附接到用于药物给予的多肽上的另外 水溶性聚合物对于本领域技术人员而言是明显的。
该水溶性聚合物可以附接到该多肽的任何部分上 ( 直接或经由接头 )。 可选地， 该 水溶性聚合物附接到除趋化因子结合肽以外的多肽部分上， 以便不干扰其趋化因子结合活 性。
如本文所述和下面实施例部分列举的， 本文所述的多肽对调节趋化因子活性有 效， 其可以具有许多有利的治疗应用。因而， 本文提供了用于调节趋化因子活性和 / 或治疗 多种医学病症的新型高效方法。
因此， 在本发明实施方式的一个方面， 提供了调节趋化因子 ( 例如， I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞趋化因子和 / 或 RANTES) 的生物效应的方法， 该方法包括向需要 其的受验者给予治疗有效量的本文所述的多肽 ( 例如， 本文所述的修饰或未修饰多肽 )。
如本文使用的术语 “方法” 是指用于完成给定任务的方式、 方法、 技术和程序， 包括 但不限于， 化学、 药学、 生物学、 生物化学和医学领域技术人员已知， 或易于从已知方式、 方 法、 技术和程序开发出的那些方式、 方法、 技术和程序。
如下面实施例部分证明的， 本文所述的多肽可以用于治疗多种医学病症。可以通 过包含向需要其的受验者给予本文所述的多肽 ( 例如， 本文所述的修饰或未修饰多肽 ) 的 方法， 治疗该病症。 可以根据本发明实施方式治疗的病症实例包括， 但不局限于， 炎症、 过敏 症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺 血。
可选地， 给予包含静脉给予、 口服给予、 皮下给予、 局部给予和 / 或鼻内给予。
应理解， 本文所述的多肽的 Fc 结构域或片段与单独的趋化因子结合肽相比可以 提供较长的多肽循环半衰期。由于半衰期较长， 所以可以以较小的给予频率在体内维持治 疗有效水平的多肽。
因此， 根据一些实施方式， 给予每周进行不多于一次， 可选地每月进行不多于两 次， 可选地每月进行不多于一次， 可选地每两个月进行不多于一次， 可选地每三个月进行不 多于一次， 和可选地每六个月进行不多于一次。
在替换实施方式中， 单次给予足以获得期望的治疗效果。
类似地， 根据本发明一些实施方式的方面， 提供了如本文所述的多肽 ( 例如， 本文 所述的修饰或未修饰多肽 ) 在制造用于调节 ( 例如， 如本文所述的抑制和 / 或增强 ) 趋化 因子 ( 例如， I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞趋化因子和 / 或 RANTES) 生物效应的 药物中的用途。
根据本发明一些实施方式的方面， 提供了本文所述的多肽 ( 例如， 本文所述的修 饰或未修饰多肽 ) 在制造用于治疗选自以下的病症的药物中的用途 ： 炎症、 过敏症、 迟发型 超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑 狼疮、 多发性硬化症、 同种异体移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
如本文使用的， 术语 “治疗” 包括阻断、 基本抑制、 慢化 ( 减缓， slowing) 或逆转病 症的进展， 基本改善病症的临床或美学 (aesthetical) 症状， 或者基本阻止病症的临床或 美学症状出现。
待治疗受验者可以是人或非人动物。优选地， 该受验者是哺乳动物。在一些实施 方式中， 该受验者是人。
利用如本文所述的多肽进行的治疗可以单独提供， 或者与已知对治疗特定疾病有 用的其它药剂一起提供。 本文所述的药物和药物组合物可以可选地进一步包含一种或多种 此类药剂。
可选地， 本文所述的药剂调配用于静脉、 口服、 皮下、 局部给予和 / 或鼻内给予。
可以根据本文所述的本发明实施方式调节的趋化因子的生物效应的实例包括， 但 不局限于， 炎性效应、 细胞迁移、 肿瘤生长和癌转移。
在本文所述的本发明任何方面， 调节生物效应可以包含抑制或增强生物效应。在 示例实施方式中， 调节包含抑制。可选地， 抑制至少一种趋化因子的生物效应， 并增强另外 的趋化因子的生物效应。
在本文所述的方法和用途的任何一个中， 该多肽可以单独使用， 或者， 优选地， 用 作进一步包含药学可接受载体的药物组合物的一部分。
因而， 根据本发明一些实施方式的方面， 提供了包含如本文所述的多肽和药学可 接受载体的药物组合物。
在一些实施方式中， 该组合物包装在包装材料中， 并以印刷形式在该包装材料中 或上标识用于调节如本文所述的趋化因子 ( 例如， I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸性粒细胞 趋化因子和 / 或 RANTES) 的生物效应。
在一些实施方式中， 该组合物包装在包装材料中， 并以印刷形式在该包装材料中 或上标识用于治疗选自以下的病症 ： 炎症、 过敏症、 迟发型超敏反应、 非最佳的免疫反应、 细胞迁移异常、 自身免疫反应、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、 同种异体 移植排斥、 糖尿病、 败血症、 癌症、 恶性细胞生长、 细菌感染、 病毒感染、 关节炎、 结肠炎、 银屑 病、 动脉硬化、 高血压、 重症肌无力和再灌注缺血。
在本发明各个方面， 本文所述的多肽可以照原样或以其药学可接受盐形式给予或 以其它方式利用。
短语 “药学可接受盐” 是指带电荷的母体化合物和其反离子， 其典型地用于改进母 体化合物的溶解性和 / 或降低母体化合物对生物体造成的任何显著刺激， 同时不阻断所给 予化合物的生物活性和特性。
合适的给予途径可以， 例如包括吸入、 口服、 颊部、 直肠、 经粘膜、 经真皮、 真皮内、 经鼻、 肠和 / 或肠胃外途径， 肌内、 皮下和 / 或髓内注射途径， 鞘内、 直接心室内、 静脉、 腹膜 内、 鼻内和 / 或眼内注射途径， 和 / 或直接注入受验者组织区域的途径。 在可选实施方式中， 使用静脉途径、 口服途径、 皮下途径、 局部途径和 / 或鼻内途径。
对于皮肤疾病和障碍 ( 例如， 银屑病、 皮肤过敏症、 皮肤超敏反应 )， 可选地使用局 部给予， 例如， 利用调配用于局部给予的乳膏、 洗液、 凝胶或粉末。
本文所述的方法、 组合物和用途利用治疗有效量的多肽。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
对于用在本发明方法和用途中的任何制剂， 治疗有效量或剂量可以根据体外试验 进行初始估计。 例如， 可以在动物模型中调配剂量， 此种信息可以用于更准确地确定对人有 用的剂量。
本文描述的活性成分的毒性和治疗效能可通过体外、 细胞培养物或实验动物中的 标准药物程序来确定。可利用从这些体外和细胞培养物分析及动物研究中获得的数据， 调 配用于人的剂量范围。该剂量可随着采用的剂型和利用的给予途径而改变。确切的制剂、 给予途径和剂量可由个人医生根据患者的病症加以选择 ( 参见如 Fingl 等人， 1975， ″ The Pharmacological Basis of Therapeutics″， Ch.1 p.1)。
给药可以是单次给予或多次给予， 如本文所述的。
如本文所述的包含一种或多种多肽的药物组合物可以通过本领域熟知的工艺制 造， 如通过常规的混合、 溶解、 造粒、 包糖衣 (dragee-making)、 研粉 (levigating)、 乳化、 作 成胶囊 ( 囊封， encapsulating)、 包埋 (entrapping) 或冷冻干燥工艺。
根据本发明实施方式使用的药物组合物可用常规方法利用一种或多种使活 性成分容易加工成可以药用的制剂的生理可接受载体 ( 包含赋形剂和辅助物 ( 辅剂， auxiliaries)) 调配。合适的剂型取决于所选的给予途径。
对于注射， 该活性成分可以调配在水溶液中， 优选在生理相容性缓冲液如汉克斯 溶液 (Hank’ s 溶液 )、 林格溶液 (Ringer’ s 溶液 )， 或生理盐缓冲液中。
对于口服给予， 该化合物可以容易地通过将活性化合物与本领域熟知的药学可接 受载体相结合而调配。 此类载体使本发明化合物能够调配成供患者口服摄取的片剂、 丸剂、 糖衣丸、 胶囊、 液体、 凝胶、 糖浆剂、 浆液、 混悬剂等。 口服使用的药物制剂可利用固体赋形剂 制造， 可选地研磨所得混合物， 需要时可加入合适的辅助物并在此后对颗粒混合物进行加 工， 从而获得片剂或糖衣核 (dragee cores)。 合适的赋形剂为， 特别是， 填充剂如糖类， 包括 乳糖、 蔗糖、 甘露醇或山梨醇， 纤维素制品如， 玉米淀粉、 小麦淀粉、 大米淀粉、 马铃薯淀粉、 明胶、 黄蓍树胶、 甲基纤维素、 羟丙甲基纤维素、 羧甲基纤维素钠， 和 / 或生理上可接受的聚 合物如聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)。如果需要， 可加入崩解剂， 如交联的聚乙烯吡咯烷酮、 琼脂， 或海藻酸或其盐如海藻酸钠。
糖衣核具有合适的包衣。为此目的， 可使用浓缩的糖溶液， 其可以可选地包含阿 拉伯树胶、 滑石粉、 聚乙烯吡咯烷酮、 卡波姆凝胶、 聚乙二醇、 二氧化钛、 漆溶液 (lacquer solutions) 和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素加入到片剂或糖衣丸包衣 中， 以便鉴定或表征不同的活性化合物剂量组合。
可口服使用的药物组合物， 包括明胶制成的推入配合胶囊 (push-fit capsule)， 以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。 推入配合胶囊可包含与填充剂如 乳糖、 粘合剂如淀粉、 润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁， 和可选的稳定剂混合的活性成分。在软 胶囊中， 活性成分溶解于或悬浮于合适的液体中， 如脂肪油、 液体石蜡， 或液体聚乙二醇。 另 外， 可加入稳定剂。所有用于口服给予的制剂剂量应适合所选的给予途径。
对于颊部给予， 该组合物可采用用常规方法调配的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻吸入给予， 根据本发明使用的活性成分可以所呈现的气溶胶喷雾形 式， 从利用合适的推进剂如二氟二氯甲烷、 三氯氟甲烷、 二氯四氟乙烷， 或二氧化碳的加压包装或喷雾器中方便地递送。在加压气溶胶的情况下， 剂量单位可通过提供用于递送计量 的量的阀门确定。可将用在分配器中的如明胶胶囊和药筒， 调配成包含该化合物与合适的 粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文所述的制剂可以调配用于肠胃外给予， 如通过推注或连续输注给予。注射用 制剂可以单位剂量的形式呈现， 如， 在安瓿或在多剂量容器中， 其中可选地加入防腐剂。该 组合物可以是油性或水性媒介物中的悬浮液、 溶液， 或乳液， 并可含有调配剂如悬浮剂、 稳 定剂， 和 / 或分散剂。
用于肠胃外给予的药物组合物包括水溶性形式活性制剂的水溶液。另外， 可将该 活性成分的悬浮液配制成适当的油性或基于水的注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介物 (vehicles) 包括脂肪油如芝麻油， 或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、 甘油三酯或脂质体。水 性注射悬浮液可包含增大悬浮液粘度的物质， 如羧甲基纤维素钠、 山梨醇， 或葡聚糖。可选 地， 该悬浮液还可包含合适的稳定剂或增大活性成分的溶解度从而允许制备高度浓缩的溶 液的试剂。
替换地， 该活性成分可以是粉末形式， 在使用前用合适的媒介物如无菌的基于无 热源水的溶液进行配制。
根 据 本 发 明 实 施 方 式 的 制 剂 还 可 利 用 如 常 规 栓 剂 基 质 如 可 可 豆 油 (cocoa butter) 或其它甘油酯， 调配成直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂 (retention enemas)。
当然， 该组合物的给予量将取决于受治疗对象、 疼痛严重性、 给予方式， 处方医生 的判断等。
本发明组合物如果需要可放在包装或分配装置中， 如 FDA 批准的试剂盒， 其可 包含含有活性成分的一种或多种单位位剂量形式。该包装可包含， 例如， 玻璃或塑料箔 (plastic foil)， 如泡罩包装 (blister pack)。该包装或分配装置还可附有给予说明。该 包装或分配器还可提供与所含物相关的由管理药物制造、 使用或销售的政府部门所规定的 形式的公告， 该公告反映该部门批准了该组合物形式或人用或兽用。此公告， 例如， 可以是 美国食品和药物管理局对于处方药批准的标志或者是已批准产品插页 (product insert)。
本文所述多肽能够结合到趋化因子上， 因而具有与至少一些趋化因子的结构互补 的结构。因为趋化因子受体也具有与趋化因子互补的结构， 所以期望本文所述的至少一些 多肽的结构域趋化因子受体的结构具有显著的相似性。 该多肽因而可以在一些应用中代替 趋化因子受体， 例如， 当产生能够结合到趋化因子受体上的抗体时。
因此， 在本发明实施方式的另一方面， 提供了能够识别趋化因子受体至少一部分 的抗体。该抗体可选地通过利用生产抗体的标准技术， 生产对抗本文所述多肽的抗体来制 取。
本文也提供了包含本文所述多肽， 用于产生自身抗体的疫苗。该疫苗设计用于在 受验者中产生对抗该多肽的抗体， 其中该抗体将进一步识别和结合到受验者至少一种趋化 因子受体的至少一部分上。 该疫苗可选地包括可以容易地由本领域技术人员选择的任何合 适的疫苗载体， 包括但不局限于， 佐剂、 载体等。
制备免疫原或疫苗组合物的一般方法描述在雷明顿药物科学 (Remington ′ s Pharmaceutical Science)， Mack Publishing Company Easton， Pa.( 最新版 ) 中。为了增 大免疫原性， 可以使本发明多肽吸附或结合到珠粒如胶乳或金珠、 ISCOM 等上。免疫原性组合物可以包含佐剂， 该佐剂为可以添加到免疫原或疫苗制剂中从而增强免疫原性部分的免 疫刺激特性的物质。脂质体也视为佐剂 (Gregoriades， G 等人， Immunological Adjuvants and Vaccines， Plenum Press， New York， 1989)。可以增加多肽免疫原功效的佐剂或药剂 实例包括氢氧化铝、 磷酸铝、 硫酸铝钾 ( 明矾 )、 硫酸铍、 二氧化硅、 高岭土、 碳、 油包水型乳 液和水包油型乳液。优选的一类佐剂是胞壁酰二肽 (muramyl dipeptide， MDP) 以及各种 MDP 衍生物和制剂， 例如， N- 乙酰基 -D- 葡萄糖氨基 -(β-1-4)-N- 乙酰基胞壁酰 -L- 丙氨 酰 -D- 异谷酰胺 (GMDP)(Hornung， R L 等人， Ther Immunol 19952 ： 7-14) 或 ISAF-1( 在含 有 0.4mg 苏氨酰 - 胞壁酰二肽的磷酸盐缓冲溶液中的 5％鲨烯、 2.5％ pluronic L121、 0.2％ 吐温 80 ； 参见例如 Kwak， L W 等人， (1992)N.Engl.J.Med.， 327 ： 1209-1238)。其它有用的 佐剂为， 或者基于霍乱毒素、 细菌性内毒素、 脂质 X、 细菌痤疮丙酸杆菌 (Propionobacterium acnes) 或百日咳鲍特菌 (Bordetella pertussis) 的完整生物体或亚细胞部分、 多聚核 糖核苷酸、 藻酸钠、 羊毛脂、 溶血卵磷脂、 维生素 A、 皂甙和皂甙衍生物如现已用于临床 (Helling， F 等 人， (1995)Cancer Res.， 55 ： 2783-2788 ； Davis， T A 等 人， (1997)Blood， 90 ： 509) 的 QS21(White， A.C. 等人， (1991)Adv.Exp.Med.Biol.， 303 ： 207-210)、 左旋咪唑、 DEAE- 葡聚糖、 阻断共聚物或其它合成佐剂。许多佐剂可以从各种来源商购获得， 例如， Merck 佐剂 65(Merck and Company 有限公司， Rahway， N.J.)， 或弗氏不完全佐剂和完全佐 剂 (Difco Laboratories， Detroit， Mich.)、 Amphigen( 水包油 )、 Alhydrogel( 氢氧化铝 )， 或者 Amphigen 和 Alhydrogel 的混合物。铝已被批准用于人用。
如本文使用的术语 “约” 是指 ±10％。
术语 “包 含” 、 “包 含 的” 、 “包 括” 、 “包 括 的” 、 “具 有” ， 和它们的词形变化形式 (conjugates) 意思是指 “包括但是不限于” 。
术语 “由……组成” 是指 “包括但是不限于” 。
本文使用的术语 “示例” 是指 “用作实例、 例证， 或图例” 。被描述为 “示例” 的任 何实施方式不必解读为优选的或比其它实施方式有利， 和 / 或排除其它实施方式并入的特 征。
本文使用的术语 “可选地” 是指 “提供在一些实施方式中， 而没有提供在其它实施 方式中” 。本发明任何特定实施方式均可包括多个 “可选的” 特征， 除非此类特征相冲突。
如本文使用的， 单数形式 “一个” 、 “一” 和 “该” 包括复数指代， 除非上下文另有明确 规定。例如， 术语 “一种化合物” 或 “至少一种化合物” 可包括多种化合物， 包括其混合物。
在整篇专利申请中， 本发明的各种实施方式可以范围形式呈现。应当理解范围形 式的描述仅是为了方便和简洁， 而不应该解读为对本发明范围的硬性限制。 因此， 范围的描 述应视为已具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的各个数值。例如， 如从 1 至 6 的范围描述应视为已具体地公开了诸如从 1 至 3、 从 1 至 4、 从 1 至 5、 从 2 至 4、 从 2 至 6、 从 3 至 6 等的子范围， 以及在此范围中的各个数值， 例如， 1、 2、 3、 4、 5， 和 6。 不论范围宽度如 何， 这都能适用。
当本文中指出了数值范围时， 其意在包括在所指范围内的任何提及数字。本文中 的表达在第一个指定数和第二个指定数之间的 “范围” 与从第一个指定数 “至” 第二个指定 数的 “范围” 可互换使用， 意在包括第一和第二个指定数及其间的所有数字。
应理解， 为清楚起见而在单独实施方式的上下文中描述的本发明某些特征， 也可结合提供在单个实施方式中。相反， 为简洁起见而在单个实施方式的上下文中描述的本发 明的多种特征， 也可单独地或以任何合适的子组合形式， 或作为适合于本发明的任何其它 被描述的实施方式提供。 在各个实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是这些实 施方式的实质特征， 除非这些实施方式没有这些元素时是不能实施的 (inoperative)。
如上文所描绘的和如下面权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方式和 方面将在下面的实例中找到实验支持。
实施例
现在参考下面的实施例， 结合上面的描述以非限制方式阐述本发明的一些实施方 式。
材料和方法
材料 ：
扩增缓冲液 (X10) 从 Invitrogen 获得 ；
葡聚糖 T-500 从 Pharmacosmos A/S(Denmark) 获得 ；
Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 (DMEM) 从 Biological Industries(Beit Haemek， Israel) 获得 ；
ECL 溶液从 Amersham Biosciences 获得 ；
EcoRI 从 New England Biolabs 获得 ；
增强子溶液 (X10) 从 Invitrogen 获得 ；
嗜酸性粒细胞趋化因子 (Eotaxin)( 人 ) 从 PeproTech(Rocky Hill， NJ， USA) 获 得；
EX-CELL 293 培养基从 SAFC Biosciences 获得 ；
胎牛血清 (FCS) 从 Biological Industries(Beit Haemek， Israel) 获得 ；
聚蔗糖 (Ficoll)1077 从 Sigma 获得 ；
弗氏完全佐剂从 Sigma 或 Difco 获得 ；
FuGENE 6 从 Roche 获得 ；
IP-10( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
IL-8( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
I-TAC( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
MCP-1( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
甲基化牛血清白蛋白 (mBSA) 从 Sigma 获得 ；
MIG( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
NotI 从 New England Biolabs 获得 ；
NuPAGE Bis Tris gels 从 Invitrogen 获得 ；
pIRESpuro3 载体从 BD Biosciences Clontech 获得 ；
蛋白质 A-Sepharose 珠从 Amersham 获得 ；
RANTES( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
RPMI 培养基从 Biological Industries(Beit Haemek， Israel) 获得 ；
SDF-1α( 人 ) 从 PeproTech 获得 ；
Taq 聚合酶 (Platinum Pfx DNA 聚合酶 ) 从 Invitrogen 获得 ； 和VCAM-1( 人 ) 从 R&D Systems， Inc.(Minneapolis， MN) 获得。
所有趋化因子都按照供应商的建议制备。
获取 IL6-BKT 肽 DNA 片段的两步 PCR
在第一 PCR 步骤中， 将 IL6 信号肽 DNA 序列 (SEQ ID NO ： 166) 添加到与每个 BKT 肽的前 9 种氨基酸对应的 DNA 序列中。这个 PCR 反应的产物在第二 PCR 步骤中用作模板从 而添加与 BKT 肽剩余的 3 种氨基酸对应的 DNA 序列、 间隔子序列 (SEQ ID NO ： 167)， 和 3’ 端 的 BstBI 限制性位点。
IL6-Fc pIRES puro DNA 用作第一 PCR 步骤的所有三个 PCR 反应的 NDA 模板。 所有 三个 PCR 反应利用同一正向引物 (T7 引物， SEQ ID NO ： 170) 完成。使用通用的 T7 引物， 形 成 PCR 产物， 该 PCR 产物在 5’ 端包含多个克隆位点， 包括后来用于亚克隆的 NheI 位点。该 反向引物对每个肽均有特异性， SEQ ID NO ： 171 用于 BKT-P2， SEQ ID NO ： 172 用于 BKT-P46。
该 PCR 反应条件如下 ： 20ng DNA 模板、 5μl 扩增 X10 缓冲液、 0.2mM 的每种脱氧核 糖核苷酸 (dNTP)、 0.5mM MgSO4、 5μl 增强子溶液 X10、 0.2μM 的每种引物、 2.5 单位的 Taq 聚合酶， 其中水添加到 50μl 总反应体积。
扩增用起始变性步骤执行， 该起始变性步骤在 94 ℃下执行 3 分钟， 接着执行在 94℃下 30 秒、 52℃下 30 秒， 和 72℃下 30 秒的 30 个循环， 然后 72℃下 10 分钟。
PCR 扩增结束时， 在用溴化乙锭染色和用 UV 光显现的 2％琼脂糖凝胶上分析 5μl 的每种反应混合物。
通过上述程序获得的 PCR 产物用作第二 PCR 步骤的模板。上述 T7 引物用作所有 三个反应的正向引物， 而反向引物对每个肽具有特异性 ； SEQ ID NO ： 173 用于 BKT-P2， SEQ ID NO ： 174 用于 BKT-P46。每种反向引物均编码期望肽的氨基酸 10-12， 和六肽间隔子序列 (SEQ ID NO ： 162)， 并包括 BstB1 限制性位点。
PCR 反应条件如下 ： 0.5μl DNA 模板、 5μl 扩增 X10 缓冲液、 0.2mM 的每种 dNTP、 0.5μM MgSO4、 5μl 增强子溶液 X10、 0.2μM 的每种引物、 2.5 单位的 Taq 聚合酶 ； 其中水添 加至 50μl 总反应体积。
按照上面针对第一 PCR 步骤描述的方法进行扩增和对 PCR 产物进行分析。该 PCR 产物是利用 QiaQuickTM 凝胶提取试剂盒 (QiagenTM) 从凝胶中提取的。
IL6-BKT 肽 DNA 片段与 Fc 序列的连接 (ligation) ：
提取的 IL6-BKT 肽 DNA 产物用 NheI 和 BstBI 进行消化， 按照上面详细描述的从琼 脂糖凝胶中纯化， 并使其连接到之前用相同酶消化的 FcN297ApIRESpuro3 中。 用于编码 SEQ ID NO ： 158 和 159 的载体的图谱分别在图 1A 和 1B 示出。将该连接混合物转化到 DH5a 感 受态细胞中。筛选抗氨必西林的转化体， 并通过克隆 PCR 进一步分析阳性克隆。
从抗氨必西林的克隆中提取 DNA， 并用 EcoRI 和 NotI 限制酶在 37℃下消化 2 小时。 在琼脂糖凝胶上分离反应物。预期阳性克隆可以产生 5123bp 和 868bp 的两条带。该阳性 克隆通过 DNA 测序进行证实。
Western 印迹 ：
收集细胞样品的培养基， 并进行离心 (1000 转 / 分钟， 7 分钟 )。将 1ml 去除细胞 的培养基 (cell-deprived medium) 与 50μl 蛋白质 A-Sepharose 珠一起在室温下温育 45 分钟。温育时间结束时， 用包含 100mM 柠檬酸盐磷酸盐缓冲液 (pH 3.5) 和 10mM DTT( 二硫苏糖醇 ) 的 50μl 样品缓冲液从该珠粒上洗脱蛋白质。将该样品煮沸 3 分钟， 然后将 25μl 样品装到 12％ NuPAGE Bis Tris 凝胶上。将该蛋白质转移到硝化纤维素膜中， 并 用在 PBST( 补充有 0.05％吐温 -20 的 PBS) 中的 10％低脂牛奶封闭。然后在室温下以在封 闭溶液中的 1 ∶ 40,000 浓度， 用人抗 IgG Fc 片段抗体， 接着用结合到 HRP( 辣根过氧化物 酶 ) 上的山羊抗人抗体印迹 (blot) 该膜 1 小时。在与 ECL 溶液一起温育之后， 将该膜暴露 于胶片 (film) 下。
表面等离子共振 (SPR) ：
在覆盖有羧甲基葡聚糖的腔室中， 肽或多肽通常经由赖氨酸残基的氨基或 N 末端 共价结合到该腔室上。通过该腔室以增加的浓度注射趋化因子。
从该表面反射的光线变化与结合蛋白质的量成比例， 并可以通过检测器检测。
对在不同浓度的趋化因子下结合的蛋白量作图， 使得离解系数 (dissociation coefficient) 的计算成为可能。
新鲜血液中的 T- 细胞纯化 ：
将 50ml 血液添加到 10ml 葡聚糖 T-500(6％ w/v) 在 PBS( 磷酸盐缓冲盐水 ) 中的 溶液， 和 7ml 柠檬酸盐缓冲液 (25 克柠檬酸盐、 8 克柠檬酸在 500ml PBS 中 ) 中。将该溶液 在 25℃下温育 30 分钟。将 10ml 聚蔗糖 (Ficoll)1077 添加到该管子底部。然后将该管子 在 18℃下在 2,000 转 / 分钟下离心 30 分钟 ( 以制动离心停止模式 )。收集中间相， 用含有 5％ FCS( 胎牛血清 ) 的 8ml PBS 洗涤两次， 接着在 18℃下在 1,400 转 / 分钟下离心 5 分钟。 8 将该细胞以小于 10 /ml 的浓度重悬在含有 5％ FCS 的 PBS 中。将 2ml 细胞溶液施加在预先 浸渍在 PBS-5％ FCS 中的聚 ( 甲基丙烯酸甲酯 ) 尼龙毛柱中， 然后在 25℃下温育 45 分钟。 每个柱子均用 8ml PBS-5％ FCS 洗涤， 并通过 50ml 5mM 在 PBS 中的 EDTA( 乙二胺四乙酸 ) 洗脱细胞 (T- 细胞和红细胞 )。通过在 4℃下在 1,400 转 / 分钟下离心 ( 开启制动 )5 分钟 获得红色球团 ( 红色细胞沉淀， red pellet)。
为了执行红细胞的裂解， 将该红色球团重悬在 5ml 裂解缓冲液 (155mM NH4Cl、 10mM KHCO3、 0.1mM EDTA、 X0.1PBS) 中 4 分钟， 接着立即加入 50ml 含有 EDTA 的 PBS。在 4℃下在 1,400 转 / 分钟下离心 5 分钟之后， 再次用 50ml PBS-EDTA 洗涤该球团， 并在相同条件下进 6 行再离心。获得白色球团， 将其以 3x10 个细胞 /ml 的浓度重悬在含有 10％ FACS、 L- 谷氨 酰胺、 丙酮酸钠和抗生素的 RPMI 培养基中。将该细胞在 37℃下温育 2 小时， 接着收集未粘 附细胞。该细胞在 37℃下温育过夜之后就已准备就绪可用于实验中。
体外 T 细胞粘附分析 ：
将 10μg/ml 人 VCAM-1 和 2μg/ml 趋 化 因 子 ( 完 整 MIG、 IP-10、 I-TAC、 MCP-1、 RANTES、 SDF-1( 基质细胞衍生因子 -1)、 BCA-1(B- 淋巴细胞趋化因子 -1)、 IL-8( 白介素 -8) 或嗜酸性粒细胞趋化因子， 或作为对照的热灭活 SDF-1) 溶解在由 20mM 碳酸氢盐 (pH 8.5) 缓冲制成的 PBS 中， 并在聚苯乙烯板中在 4℃下温育过夜。替换地， 使用 10μg/ml 趋化因 子， 并将该板在室温下温育 30 分钟。然后洗涤该板 3 次， 并通过与 20mg/ml 在 PBS 中的人 血清白蛋白一起在 37℃下温育 2 小时来进行封闭。
然后将该板装配成平行壁流动腔室的底壁 (lower wall) 并安装在倒置显微镜 镜台上。将 10μg/ml 测试肽在 37 ℃下安放在基质包被的腔室壁 ( 基质涂覆的腔室壁， substrate-coated chamber wall) 上 10 分钟， 然后洗涤。按如上所述的从新鲜血液中纯化出 T 细胞 (5x106/ml， 纯度＞ 98％ )， 使其悬浮在结合缓冲液中， 灌注到腔室中， 并将其在 37℃下安放在基质包被的腔室壁上 1 分钟。启动流动， 并每 5 秒增大 2 ～ 2.5 倍， 在该壁上 产生受控剪切应力。在倒置相差 Diaphot 显微镜 (Nikon) 的 20x 物镜下观察细胞， 并用连 接到 AG-6730S-VHS 录像机 (Panasonic) 上的长积分 LIS-700CCD 摄像机 (Applitech， 以色 列 ) 拍照。在每个间隔后通过分析录制的细胞图像确定可抵抗剪切应力增大造成的分离的 粘附细胞数目， 并表示成初始沉积细胞的百分数。所有粘附实验在多个试区 ( 测试区， test field) 上进行至少三次。
实验自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) ：
在雌性 SJL 和 C57BL/6 小鼠中诱导 EAE。 分别在小鼠侧腹皮下给予 100μg PLP139-151 肽或 250μg MOG35-55 肽 ( 第 0 天 ) 免疫该小鼠。 使 PLP 和 MOG 肽乳化在等体积的含有 800μg 结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)H37RA(Difco， Detroit， MI) 的完全弗氏佐剂 (CFA) 中。还在第 0 天和 2 天给小鼠腹膜内注射 300ng 百日咳毒素 (pertussis toxin)。
在免疫后第 9 天， 给小鼠静脉注射 BKT-P2-FC 或 BKT-P46-FC(50μg/ 小鼠 )。在一 些实验中， 当给小鼠静脉注射 BKT-P2-FC 或 BKT-P46-FC 时， 在疾病的高峰期时， 疾病诱导之 后的 14 天对小鼠进行处理。
在 疾 病 诱 导 后 的 30 天 收 集 脊 髓 组 织 样 品，固 定 在 4 ％ 多 聚 甲 醛 (paraformaldehyde) 中， 并脱水和包埋在石蜡中。切出 6μm 脊髓切片， 并经加工用于通 过用苏木精和曙红 (H&E) 染色进行组织学分析从而评价免疫细胞浸润， 并用勒克司坚牢蓝 (luxol fast blue) 标记脱髓鞘区域。
免疫后 30 天收集血液样品， 提取血清用于细胞因子分析。根据制造商说明书通过 小鼠 Th1/Th2 细胞因子试剂盒 -BD 流式微珠阵列 (cytometric bead array， CBA)， 评价细 胞因子水平。
通过监测动物受验者的 EAE 临床得分， 确定 BKT-P2-FC 和 BKT-P46-FC 多肽的作 用。 EAE 临床得分根据下面的标准确定 ： 0- 无疾病 ； 1- 尾巴健康状况 ( 尾音， tail tone) 下 降； 2- 后肢无力或部分麻痹 ； 3- 后肢完全麻痹 ； 4- 前后肢麻痹 ； 5- 垂死状态。通过在实验 结束时合计实验组所有动物的所有结果， 计算累积分数。
对于所有 EAE 实验， 每组均有 10 ～ 12 只小鼠。
实施例 1
制备多肽
将 BKT-P2 肽 (SEQ ID NO ： 101) 和 BKT-P46 肽 (SEQ ID NO ： 76)( 在本文称为 “BKT 肽” ) 用作制备具有融合到分泌的非糖基化人 IgG1Fc(Fc N297A)N’ 末端上的 BKT 肽的多肽 的基础。
为了使 DNA 克隆进行， 使 BKT-P2 和 BKT-P46 肽序列反向翻译成 DNA 序列。每个 BKT 肽序列均融合到编码人 IL6 信号肽的 DNA 序列上以便使哺乳动物系统能够分泌蛋白质。 这个程序通过上文所述的两步 PCR 执行。然后， 使用上文所述的程序， 对通过 PCR 获得的 IL6-BKT 肽 DNA 片段进行消化， 使其框内连接到非糖基化 Fc 序列 ( 含有点突变 N297A) 上， 从而产生称为 IL6-P2-Fc N297A(SEQ ID NO ： 168) 和 IL6-P46-Fc N297A(SEQ ID NO ： 169) 的片段。
然后使用 FuGENE 6 转染试剂， 将 IL6-BKT 肽 -Fc DNA 构建体转染到 HEK-293T细胞中。将每个构建体均转染到 6- 孔板的两个孔中。一个孔专用于 Western 印迹 (WB) 分 析， 第二孔专用于确定稳定池。将该细胞以 500,000 个细胞 / 孔的浓度置于 6 孔板中。1 天 后， 用 6μl FuGENE 和 2μg DNA( 比例为 3 ∶ 1) 转染该细胞。
在专用于 WB 分析的孔中， 24 小时后将该培养基替换成无血清培养基， 并在 48 小时 后收集该培养基。通过使用抗 -Fc 抗体的 Western 印迹分析， 分析短暂转染的细胞， 发现该 细胞可以表达称为 BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 和 BKT-P46-FC(SEQ ID NO ： 159) 的期望多 肽 ( 数据未给出 )。
在 另 一 个 孔 中， 24 小 时 后 将 该 培 养 基 替 换 成 含 有 10 ％ FCS( 胎 牛 血 清 ) 的 DMEM(Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 )， 48 小时后使该细胞胰蛋白酶化并将其转移到含有选 择培养基 ( 含有 10％ FCS 和 5μg/ml 嘌呤霉素的 DMEM) 的 T75 烧瓶中以便获得稳定的克 隆。
使从嘌呤霉素选择 ( 稳定池 ) 中存活的细胞群体繁殖， 并如上文所述的通过 Western 印迹分析来分析该细胞群体的培养基， 以便证实期望多肽的表达。
如图 2 所示， 期望 BKT-P2-FC 和 BKT-P46-FC 多肽表达在所有所测试的细胞培养物 中。 另外， 通过针对 Fc 片段的 ELISA 测试上述池的上清液， 结果指示期望 BKT-P2-FC 或 BKT-P46-FC 多肽表达在所有所测试的细胞培养物中 ( 数据未给出 )。
为了验证细胞的同一性， 执行基因组 PCR， 结果指示正确序列整合在细胞基因组中 ( 数据未给出 )。
将表达期望多肽的每个池的数个等分试样 (aliquot) 冷冻保存在液氮下。数天 后， 使来自每个原液 (stock) 的一个安瓿融化以便证实细胞活力。
然后， 在悬浮液中生长的哺乳动物培养物中生产 BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 和 BKT-P46-FC(SEQ ID NO ： 159) 多肽。将所转染细胞的一个 T175 烧瓶保持在含有选择抗生 素 (5μg/ml 嘌呤霉素 )、 补充有 10％血清的培养基中， 并在 5％ CO2 中在 37℃下进行温育。 胰酶消化之后， 将该细胞转移到补充有 4mM 谷氨酰胺和选择抗生素 (1μg/ml 嘌呤霉素 ) 的 无血清培养基 (EX-CELL 293 培养基 ) 中， 进一步在烧瓶中在 5％ CO2， 37℃下进行温育。3 天后， 在 37℃下将该细胞转移到摇瓶中， 该摇瓶的搅拌速度为 125 转 / 分钟。 当细胞密度达 6 到 2.0-3.5x 10 个细胞 /ml 时， 通过在两个旋转烧瓶中连续稀释使培养物体积增大到多达 4 升。将一个含有 200ml 培养物的摇瓶作为备份保存。
在 4 天的生产期之后， 两个旋转烧瓶的培养物分别达到 3.7x 106 个细胞 /ml， 活力 6 为 91％， 和 4.0x 10 个细胞 /ml， 活力为 92％。通过离心 (5000 转 / 分钟， 15 分钟 ) 从该两 个旋转烧瓶中收获培养基和从该摇瓶中收获 200ml。 共收获 3.5 升， 通过 0.22μm 过滤器过 滤， 并保存在 -80℃ ( 取出两个 1.5ml 样品 )。在蛋白质 A 柱上进一步纯化该多肽 (SEQ ID NO ： 158 或 SEQ ID NO ： 159)。
实施例 2
多肽与趋化因子的亲和力
通过材料和方法部分中描述的表面等离子体共振技术 (SPR)， 测定实施例 1 描述 的多肽与趋化因子的亲和力。结果概括在下表 3 中。
如表 3 所示， 该多肽以可感知程度结合到趋化因子 I-TAC、 IP-10、 MIG、 MCP-1、 嗜酸
性粒细胞趋化因子和 RANTES 中的每个上。
表3： 多肽与趋化因子的结合的解离常数 (Kd)
实施例 3
多肽的体外活性
利用上文描述的体外粘附分析， 将趋化因子结合肽 BKT-P2(SEQ ID NO ： 101) 和 BKT-P46(SEQ ID NO ： 76) 对 T 细胞与 VCAM-1 的粘附的影响与包含前述趋化因子结合肽序 列之一的实施例 1 所述的那些多肽进行比较。前述肽和多肽抑制 T 细胞与 VCAM-1 的粘附 的能力概括在下表 4 中。
表4： 肽对趋化因子依赖性 T 细胞粘附的抑制
++ ＝ 100％抑制
- ＝无抑制 N.D. ＝未测定
如表 4 和图 3A、 3B 和 3C 所示， 该肽 BKT-P2 抑制了 IP-10、 I-TAC、 MCP-1、 RANTES 和 嗜酸性粒细胞趋化因子诱导的 T 细胞粘附， 但不能抑制 MIG 诱导的 T 细胞粘附。
如表 4 和图 4A、 4B 和 4C 所示， 多肽 BKT-P2-FC 抑制了 MIG 诱导的 T 细胞粘附， 以 及 IP-10、 I-TAC、 MCP-1、 RANTES 和嗜酸性粒细胞趋化因子诱导的粘附。
如图 4 中进一步所示的， 肽 BKT-P46 抑制了 I-TAC、 MIG、 MCP-1 和 RANTES 诱导的 T 细胞粘附， 但不能诱导嗜酸性粒细胞趋化因子诱导的粘附， 而多肽 BKT-P46-FC 抑制了嗜酸 性粒细胞趋化因子， 以及 I-TAC、 MIG、 MCP-1 和 RANTES 诱导的 T 细胞粘附。
上面的结果表明， 该多肽调节趋化因子活性的能力相比相应趋化因子结合肽调节 趋化因子活性的能力增强。这可能是由于寿命延长和该多肽相对于该肽的稳定性增强， 和 / 或由于它们三级构象发生变化引起的。
实施例 4
多肽对实验自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 的体内作用
利用材料和方法部分中描述的体内实验自身免疫性脑脊髓炎模型， 测试实施例 1 描述的 BKT-P2-FC 和 BKT-P46-FC 多肽对脑部炎症的作用并进行评分。
如图 5A 和 5B 所示， BKT-P46-FC 多肽大大降低了实验持续期间 ( 到 55 天 )PLP 来 源的 EAE 平均临床得分和累积临床得分 ( 累计临床得分， accumulating clinical score)。
在 该 实 验 第 37 天， 13 只 对 照 小 鼠 中 的 6 只 的 EAE 临 床 得 分 至 少 为 2， 而接受 BKT-P46-FC 多肽的所有 10 只小鼠的 EAE 临床得分都为 0。
另外， 如图 6A 和 6B 所示， BKT-P46-FC 和 BKT-P2-FC 多肽都降低了实验持续期间 ( 到 33 天 )PLP 来源的 EAE 平均临床得分和累积临床得分。
在该实验的第 27 天， 10 只对照小鼠中的 8 只的 EAE 临床得分至少为 2， 而接受 BKT-P2-FC 多肽的 10 只小鼠中的 9 只的 EAE 临床得分为 0， 接受 BKT-P46-FC 多肽的 10 只 小鼠中的 8 只的 EAE 临床得分 0。
类似地， 如图 7 所示， BKT-P46-FC 和 BKT-P2-FC 多肽都降低了实验持续期间 ( 到 55 天 )MOG- 来源的 EAE 临床得分 ( 到 55 天 )。
这些结果表明该多肽对抑制小鼠脑部中的炎性反应， 如 EAE， 多发性硬化模型的炎 性反应有效。
实施例 5
多肽对关节炎的体内作用
利用体内小鼠诱导的关节炎模型， 测试了实施例 1 描述的 BKT-P2-FC 多肽对关节 炎的作用。该分析按照 Coelho 等人 [Arthritis Rheum 2008， 58 ： 2329-2337]， Grespan 等 人， [Arthritis Rheum 2008， 58 ： 2030-2040]and Lemos 等人， [PNAS 2009， 106 ： 5954-5959] 描述的执行。
在第 0 天， 在小鼠尾巴底部真皮内给予含 500μg 甲基化牛血清白蛋白 (mBSA) 的 100μl 盐水乳液和等体积弗氏完全佐剂 (CFA)， 免疫该小鼠。在第 11 天， 按 2mg/kg 的剂量 给予 BKT-P2-FC 多肽。 24 小时后， 对小鼠进行抗原激发。 每只小鼠的左膝关节均接受 10μg mBSA 注射液 ( 在 10μl 无菌盐水中的注射液 )。给予该多肽 48 小时后， 处死该小鼠， 用 PBS 洗涤膝关节腔， 并通过利用荧光激活细胞分选术 (FACS) 计数白细胞， 确定组织中白细胞的 数目。
如图 8A 和 8B 所示， BKT-P2-FC 多肽大大地减少了关节炎膝关节腔内的中性粒细 胞数目， 和单核细胞数目。
这些结果表明， 该多肽对抑制炎性反应， 如类风湿性关节炎的炎性反应有效。
实施例 6多肽对迟发型超敏反应 (DTH) 的体内作用
利用体内迟发型超敏反应小鼠模型， 进一步测试实施例 1 描述的 BKT-P2-FC 和 BKT-P46-FC 多肽对免疫反应的作用。
在第 0 天， 在小鼠尾巴底部真皮内给予含 500μg 甲基化牛血清白蛋白 (mBSA) 的 100μl 盐水乳液和等体积弗氏完全佐剂 (CFA)， 免疫该小鼠 (8 至 10 周龄雄性 C57BL/6 小 鼠 )。12 天后， 对小鼠进行抗原激发。每只小鼠的左膝关节均接受 10μg mBSA 注射液 ( 在 10μl 无菌盐水中的注射液 )， 如 Coelho 等人 [Arthritis Rheum 2008， 58 ： 2329-2337] 和 Healy 等人 [J Immunol 2006， 177 ： 1886-1893] 描述的。在一些小鼠中， 在激发 24 时前， 静 脉注射 BKT-P2-FC(50μg/ 小鼠 )。用 PBS 伪免疫激发的空白小鼠 ( mice) 用作对照 小鼠。抗原激发 24 小时后， 处死小鼠。
如图 9 所示， 上述多肽都抑制迟发型超敏反应， BKT-P2-FC 的效力比 BKT-P46-FC 的 强。
这些结果表明， 该多肽对抑制迟发型超敏反应的炎性反应有效。
实施例 7
多肽的药物动力学
在静脉注射 50μg/ 小鼠的 BKT-P46-FC(SEQ ID NO ： 159) 或 BKT-P2-FC(SEQ ID NO ： 158) 多肽的 C57BL 小鼠中， 测定多肽在小鼠中的药物动力学。
在注射后 2 小时、 24 小时， 5 和 11 天给该小鼠抽血， 并取出血清。根据制造商说明 书利用人总 IgG ELISA 试剂盒 (ICL) 测试血清中多肽的水平。
甚至在注射 11 天后仍可以在血液中检测到该多肽。
这些结果表明， 该多肽具有相当大的体内稳定性。
虽然本发明已结合其特定的实施方式进行描述， 但显然， 对于本领域技术人员而 言， 许多替换、 修改和变更都是很明显的。因此， 本发明旨在包括落在附属权利要求的精神 和宽范围内的所有此类替换、 修改和变更。
本说明书中提到的所有出版物、 专利和专利申请都通过引用完整地合并在本说明 书中， 如同每篇单独的出版物、 专利或专利申请单独地明确被指出通过引用合并在此。另 外， 本申请中任何参考文献的引用或列出不应该被解释为承认此类参考文献是本发明的现 有技术。对于使用的章节标题， 它们不应该被解释为限制性的。
表5： 趋化因子结合肽
趋化因子结合肽名称 BKT-P50 BKT-P10 BKT-P17 BKT-P58 SEQ ID NO ： 1 2 3 4 肽的序列 CAHLSPHKC CDIPWRNEC CDPLRQHSC CDSLGHWLC36CN 102482324 A BKT-P15 BKT-P59 BKT-P56 BKT-P60 BKT-P61 BKT-P62 BKT-P63 BKT-P64 BKT-P65 BKT-P66 BKT-P67 BKT-P68 BKT-P69 BKT-P70 BKT-P57 BKT-P71 BKT-P72 BKT-P73 BKT-P14 BKT-P74 BKT-P75 BKT-P76 BKT-P77 BKT-P16说5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28明书CDYTTRHSC CHGTLNPEC CHHNLSWEC CHIWTLASC CHNTFSPRC CIPLHASLC CITTTSLSC CKLTTCKDC CKNHTTFWC CLKLLSRSC CLLKAHPSC CLNQLKQAC CMNFPSPHC CPQSPTYTC CPSSAIHTC CPTSTARIC CQASSFPSC CQPYFWYRC CQTLTPSIC CSKLGHLWC CSKTPERIX CSNNNRMTC CSPILSLSC CSPTNFTRC33/39 页37CN 102482324 A BKT-P78 BKT-P79 BKT-P80 BKT-P81 BKT-P13 BKT-P82 BKT-P83 BKT-P84 BKT-P85 BKT-P86 BKT-P87
趋化因子结合肽名称 BKT-P88 BKT-P12 BKT-P89 BKT-P90 BKT-P48 BKT-P91 BKT-P44 BKT-P92 BKT-P93 BKT-P94 BKT-P95说29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39明书CSRPAMNVC CSTKAYPNC CSTSSCGSC CSYWGHRDC CTAHDANAC CTANSEKTC CTHPKASMC CTKTINGKC CTNMQSPLC CTPFTKLPC CTPTTDSIC34/39 页SEQ ID NO ： 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50肽的序列 CTQQNGHPC ACTTPSKHQC CTYNVAKPC ACAPLMFSQC ACHASLKHRC AHFSPNLLLGG AHSLKSITNHGL AKTLMPSPFPRT ASAVGSLSIRWQ/L/G ASWVDSRQPSAA CPQLTVGQHRT38CN 102482324 A BKT-P8 BKT-P96 BKT-P97 BKT-P51 BKT-P98 BKT-P99 BKT-P9 BKT-P100 BKT-P27 BKT-P28 BKT-P33 BKT-P101 BKT-P102 BKT-P45 BKT-P55 BKT-P54 BKT-P103 BKT-P104 BKT-P49 BKT-P105 BKT-P6 BKT-P106 BKT-P107 BKT-P108说51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74明书DLPPTLHTTGSP DSSNPIFWRPSS EFLGVPASLVNP ESDLTHALHWLG EVHSTDRYRSIP FGLQPTGDIARR FSMDDPERVRSP FSPLHTSTYRPS GDFNSGHHTTTR GPSNNLPWSNTP GVHKHFYSRWLG HAPLTRSPAPNL HGSLTTLF/LRYEP HHFHLPKLRPPV HHTWDTRIWQAF HPTTPFIHMPNF HRDPXS(P)PSAA/GRP HNVTTRTQRLMP HSACHASLKHRC HSACKLTTCKDG HSACLSTKTNIC IAHVPETRLAQM IFSMGTALARPL INKHPQQVSTLL35/39 页39CN 102482324 A BKT-P7 BKT-P46 BKT-21
趋化因子结合肽名称 BKT-P22/38 BKT-P37 BKT-P109 BKT-P110 BKT-P111 BKT-P112 BKT-P113 BKT-P114 BKT-P42 BKT-P23 BKT-P24 BKT-P115 BKT-P116 BKT-P117 BKT-P118 BKT-P119 BKT-P120 BKT-P39 BKT-P40说75 76 77明书ISPSHSQAQADL LDYPIPQTVLHH LFAAVPSTQFFR36/39 页SEQ ID NO ： 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96肽的序列 LGFDPTSTRFYT LLADTTHHRPWP LPWAPNLPDSTA LQPSQPQRFAPT LSPPMQLQPTYS MHNVSDSNDSAI NSSMLGMLPSSF NTSSSQGTQRLG PGQWPSSLTLYK QIPQMRILHPYG QIQKPPRTPPSL QLTQTMWKDTTL QNLPPERYSEAT QSLSFAGPPAWQ QTTMTPLWPSFS RCMSEVISFNCP RSPYYNKWSSKF SAGHIHEAHRPL SAISDHRAHRSH40CN 102482324 A BKT-P121 BKT-P32 BKT-P31 BKT-P3 BKT-P2 BKT-P122 BKT-P123 BKT-P29 BKT-P124 BKT-P125 BKT-P126 BKT-P127 BKT-P1 BKT-P128 BKT-P129 BKT-P4 BKT-P34 BKT-P130
趋化因子结合肽名称 BKT-P131 BKT-P132 BKT-P133 BKT-P5说97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114明书SEPTYWRPNMSG SFAPDIKYPVPS SFWHHHSPRSPL SIFAHQTPTHKN SIPSHSIHSAKA SIRTSMNPPNLL SLPHYIDNPFRQ SLSKANILHLYG SLVTADASFTPS SMVYGNRLPSAL SPSLMARSSPYW SPNLPWSKLSAY SQTLPYSNAPSP SSTQAHPFAPQL STPNSYSLPQAR STVVMQPPPRPA SVQTRPLFHSHF SVSVGMKPSPRP37/39 页SEQ ID NO ： 115 116 117 118肽的序列 SYIDSMVPSTQT SYKTTDSDTSPL TAAASNLRAVPP TAPLSHPPRPGA41CN 102482324 A BKT-P134 BKT-P135 BKT-P30 BKT-P25 BKT-P136 BKT-P137 BKT-P47 BKT-P138 BKT-P139 BKT-P140 BKT-P141 BKT-P142 BKT-P143 BKT-P144 BKT-P26 BKT-P35 BKT-P145 BKT-P146 BKT-P147 BKT-P148 BKT-P149 BKT-P43 BKT-P150 BKT-P151说119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142明书TGLLPNSSGAGI TGPPSRQPAPLH TLSNGHRYLELL TPSPKLLQVFQA TPSTGLGMSPAV TPVYSLKLGPWP TRLVPSRYYHHP TSPIPQMRTVPP TTNSSMTMQLQR TTTLPVQPTLRN TTTWTTTARWPL TVAQMPPHWQLT TWNSNSTQYGNR TWTLPAMHPRPA VHTSLLQKHPLP VLPNIYMTLSA VMDFASPAHVLP VNQEYWFFPRRP VYSSPLSQLPR VPPIS(R)TFLF(L)ST(K)S VPPLHPALSRXN VSPFLSPTPLLF VSRLGTPSMHPS WPFNHFPWWNVP38/39 页42CN 102482324 A BKT-P52 BKT-P152 BKT-P53 BKT-P153 BKT-P154 BKT-P155 BKT-P156 BKT-P157 BKT-P158 BKT-P36 BKT-P41 BKT-P159
趋化因子结合肽名称 BKT-P6 BKT-P16 BKT-P11说143 144 145 146 149 148 149 150 151 152 153 154明书WSAHIVPYSHKP WWPNSLNWVPRP YATQHNWRLKHE YCPMRLCTDC YGKGFSPYFHVT YPHYSLPGSSTL YPSLLKMQPQFS YQPRPFVTTSPM YSAPLARSNVVM YTRLSHNPYTLS YTTHVLPFAPSS YTWQTIREQYEM39/39 页SEQ ID NO ： 155 156 157肽的序列 CLSTKTNIC ACLSTKTNIC CTTPSKHQC43CN 102482324 A
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