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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710423232.1 (22)申请日 2017.06.07 (71)申请人 湖南惠益森细胞基因工程有限公司 地址 410008 湖南省长沙市开福区芙蓉北 路街道迎霞路96号和平苑13栋 (72)发明人 李志远 杨雅评 邓思浩 汤沙 严波 王利群 郭海江 (51)Int.Cl. A01N 1/02(2006.01) (54)发明名称 一种脐带间充质干细胞冻存液及其使用方 法 (57)摘要 本发明公开了一种脐带间充质干细胞冻存 液及其使用方法。 该冻存液是在DMEM/F-12。
2、中含 有二甲基亚砜， 碱性成纤维细胞生长因子， 表皮 生长因子， UltroserTMG血清替代物， L-谷氨酰 胺， 右旋糖酐-40。 该冻存液不仅成本低， 而且解 决了间充质干细胞冻存后复苏率低的问题， 提高 了间充质干细胞的冻存复苏率。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 107006453 A 2017.08.04 CN 107006453 A 1.一种脐带间充质干细胞冻存液， 其特征在于， 是在DMEM/F-12培养基中含有 2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞冻存液， 其特征在于， 是在DMEM/F-12培养 基中含有 3.根据权利要求2所述的脐带间充质干细胞冻存液的使。
3、用方法， 其特征在于， 取培养 12-15d生长良好的细胞瓶， 将培养液倒入离心管中， 作为终止液， 然后用胰酶消化5min使细 胞悬浮， 再加入终止液终止消化， 离心后弃去上清， 再加入生理盐水洗涤后， 再次离心， 得到 所述的脐带间充质干细胞冻存液冻存获得的细胞， 按冻存细胞数所需浓度为2107个细 胞/ml冻存液， 定量加入预冷的所述的神经干细胞冻存液， 充分混匀后， 将此细胞悬液转移 至冻存管中， 每管1ml， 封口， 标记冻存日期， 放于程序降温盒中； 分级冷冻细胞： 4， 40min； -20， 30min； -80， 过夜； 次日缓降至液氮表面直至投入液氮保存。 4.根据权利要求。
4、3所述的脐带间充质干细胞冻存液的使用方法， 其特征在于， 使用的胰 酶浓度为0.125含EDTA的胰酶37消化5min。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107006453 A 2 一种脐带间充质干细胞冻存液及其使用方法 技术领域 0001 本发明属于细胞生物学、 生物医学技术领域， 具体涉及一种脐带间充质干细胞冻 存液及其使用方法。 背景技术 0002 脐带是连于胚胎脐部与胎盘间的索状结构， 外覆羊膜， 内含静脉， 脐动脉和来自中 胚层的胶样粘液性结缔组织即沃顿氏胶。 大量研究证实脐带沃顿氏胶中富含丰富的间充质 干细胞。 0003 脐带间充质干细胞(MSCs)具有较高的分化潜能， 。
5、可向多个方向进行分化。 它在骨、 软骨、 肌肉、 肌腱、 韧带、 神经、 肝、 内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景； 具 有较强的免疫调节作用， 可用于治疗红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病， 降低细胞或器 官移植后的免疫排斥反应， 提高细胞或器官移植的成功率； 能促进造血恢复功能， 与单一造 血干细胞移植比较， 间充质干细胞和造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等 疾病的治疗效果； 能修复损伤或病变的组织器官， 用于治疗骨和肌肉衰退性疾病、 心脑血管 疾病、 肝病、 脑及脊髓神经损伤和老年痴呆等。 0004 细胞冻存在不加保护条件下直接冻存细胞时， 细胞内和外环境中的水会形。
6、成冰 晶， 能导致细胞内发生一系列的变化， 如机械损伤、 电解质浓度升高、 渗透压改变、 脱水、 pH 值改变、 蛋白质变性等， 能引起细胞死亡。 但如向培养基中加入保护剂(甘油或DMSO)， 可使 冰点降低， 在缓慢的冻存条件下， 能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。 储存在-130度以下 低温中能加水冰晶的形成。 溶解细胞时， 速度要快， 使之迅速通过细胞最易受损的-50摄 氏度后， 细胞仍能生长， 活力不受任何损害。 当前使用的保护剂为DMSO和甘油， 它们对细胞 无毒性， 分子量小， 溶解度大， 易穿透细胞， 使用浓度范围在510之间， 常用10。 0005 为保护细胞最大存活率， 通常。
7、用细胞培养基作为溶剂， 除二甲基亚砜外， 还添加各 种细胞保护及营养物质， 以提高细胞活率； 为获得来源方便的脐带间充质干细胞， 提高细胞 活率， 开展有效的干细胞移植及建立干细胞库， 改进干细胞冻存复苏技术， 为建立一种长期 低温保存干细胞的方法的研究和应用具有重大意义。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种脐带间充质干细胞冻存液及其使用方法， 使用本发明提 供的细胞冻存液长时间冻存后的细胞复苏活率较高。 0007 一种脐带间充质干细胞冻存液， 是在DMEM/F-12培养基中含有 说 明 书 1/5 页 3 CN 107006453 A 3 0008 0009 所述的脐带间充质干细胞冻。
8、存液， 优选地是在DMEM/F-12培养基中含有 0010 0011 所述的脐带间充质干细胞冻存液的使用方法， 是取培养12-15d生长良好的细胞 瓶， 将培养液倒入离心管中， 做为终止液， 然后用胰酶消化5min使细胞悬浮， 再加入终止液 终止消化， 离心后弃去上清， 再加入生理盐水洗涤后， 再次离心， 得到所述的脐带间充质干 细胞冻存液冻存获得的细胞， 按冻存细胞数所需浓度为2107个细胞/ml冻存液， 定量加入 预冷的所述的神经干细胞冻存液， 充分混匀后， 将此细胞悬液转移至冻存管中， 每管1ml， 封 口， 标记冻存日期， 放于程序降温盒中； 分级冷冻细胞： 4， 40min； -20。
9、， 30min； -80， 过 夜； 次日缓降至液氮表面直至投入液氮保存。 0012 上述的脐带间充质干细胞冻存液的使用方法， 是使用的胰酶浓度为0.125含 EDTA的胰酶37消化5min。 0013 本发明采用UltroserTMG血清替代物代替胎牛血清作为细胞的营养来源， UltroserTMG包含6类真核生物细胞生长所必须的营养物质， 包括粘附因子， 结合蛋白， 生长 因子， 微量矿物元素， 荷尔蒙， 维生素等； 与胎牛血清相比， 它的生物活性是胎牛血清的5倍， 营养成分更为丰富， 提高间充质干细胞冻存复苏率， 使用浓度低， 节约了成本； 而右旋糖酐- 40可以很好的维持渗透压， 在温。
10、度下降过程中， 仍能维持良好的渗透压环境， 避免了细胞因 温度下降， 渗透压改变而出现细胞死亡的现象， 从而提高了间充质干细胞冻存复苏率。 附图说明 0014 图1为使用不同脐带间充质干细胞冻存液冻存的细胞复苏后细胞的生长状态。 0015 图2为使用本发明脐带间充质干细胞冻存液冻存的细胞复苏后的流式细胞检测结 果。 具体实施方式 说 明 书 2/5 页 4 CN 107006453 A 4 0016 以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明， 而非限制本发明。 0017 1)脐带间充质干细胞冻存液的配制： 0018 10ml间充质干细胞冻存液中含有以下组分： 0019 0020 碱性成纤维细胞。
11、生长因子bFGF(母液浓度为50ug/ml)10ul(终浓度50ng/ml)， 0021 表皮生长因子EGF(母液浓度为50ug/ml)10ul(终浓度50ng/ml)， 0022 先配制好母液， -20保存， 然后每次配制的时候再加到终浓度。 0023 2)脐带间充质干细胞冻存 0024 P1传P2后的第3天， 细胞融合达85-90时， 将培养瓶从培养箱中取出放入洁净 工作台， 将培养瓶中培养液倒到新的T175培养瓶中， 作为终止液。 0025 往每个培养瓶中加入10ml生理盐水轻轻冲洗细胞瓶一遍， 然后倒掉洗涤后的生理 盐水。 0026 每个培养瓶中加入胰酶工作液5ml， 摇匀消化， 在倒。
12、置显微镜下观察见大部分贴壁 的梭形细胞开始脱落呈圆形漂浮着即可， 消化约5min， 再往每个培养瓶中加入7ml终止液， 终止消化， 然后将消化后的细胞悬液倒出到空的50ml离心管中(一般4瓶倒入1个50ml离心 管中)。 0027 用约50ml生理盐水洗涤一遍培养瓶， 将洗涤后的生理盐水也倒入空离心管中， 210g离心10min。 0028 离心结束后， 倒掉上清液， 将细胞合并成数管(一般5管合一管)， 用止血钳把筛网 倾斜放置在离心管上， 然后用5ml移液管将细胞悬液通过筛网过滤到新的50ml离心管中。 0029 离心结束后， 倒掉上清， 将细胞重悬合并到一个50ml离心管中， 定容至45。
13、ml， 取样 1.5ml送检支原体检测、 细胞计数、 细胞活率检测， 流式细胞表型检测。 然后再次用210g离心 10min。 0030 离心结束后， 收集30ml上清液送无菌检测。 0031 根据所需要冻存不同密度的目的细胞， 加入适量的完全培养液重悬细胞， 最终使 细胞密度调整为冻存目的密度的2倍。 0032 加冻存工作液， 向细胞悬液中沿管壁缓慢加入等体积的细胞冻存工作液， 轻轻吹 打均匀， 是细胞密度与指定要求一致。 0033 按要求分装到冻存管中， 并贴上对应的细胞标签。 0034 将需冻存的细胞置于装有异丙醇的程序降温盒中， 4， 40min； -20， 30min； -80 ， 。
14、过夜； 次日缓降至液氮表面直至投入液氮保存。 0035 3)脐带间充质干细胞复苏 0036 将冻存细胞管迅速从液氮转入到40恒温水浴锅中， 冷冻管的顶部保持在水面以 上避免污染。 1min内快速复温。 融化后立即移入离心管， 加入5ml4预冷间充质干细胞完全 说 明 书 3/5 页 5 CN 107006453 A 5 培养液吹吸均匀。 0037 4)脐带间充质干细胞计数 0038 采用Countess II自动化细胞计数仪， 根据间充质干细胞大小， 圆度， 亮度设门， 通 过自动聚焦和计数算法得出细胞活率及数量。 取10ul细胞悬浮液与10ull台盼蓝液等体积 混合均匀于1.5ml小离心管中。
15、， 然后取10ul置于特定载玻片内， 插入计数仪中， 按事先设好 门限计数细胞， 得出细胞复苏率。 0039 5)脐带间充质干细胞流式检测 0040 准备复苏后的脐带间充质干细胞， PBS洗涤后对细胞进行抗体标记， 标记抗体分别 是PE-CD73， PE-CD105， PE-CD90， PE-CD34， FITC-CD45， FITC-HLA-Dr， PE-CD44， PE-Mouse IgG1和FITC-Mouse IgG1。 经孵育洗涤后， 上机检测， 0041 结果见图2。 其中CD73， CD105， CD90， CD44和CD29阳性率大于95， CD34， CD45和 HLA-Dr。
16、阳性率小于2， 从流式结果来看， 本方法分离得到的细胞符合MSC鉴定标准。 0042 6)为验证本发明与传统冻存液(胎牛血清10， DMSO10， DMEM/F12)的冻存复苏 率的区别， 特培养同一批细胞， 然后采用本发明冻存液冻存细胞和采用传统冻存液冻存细 胞； 同时复苏本发明冻存液冻存细胞和采用传统冻存液冻存细胞， 两组细胞进行培养， 培养 3天后在显微镜下观察并拍照。 0043 结果： 0044 使用本发明脐带间充质干细胞冻存液冻存的细胞复苏率明显高于传统冻存液(胎 牛血清10， DMSO10， DMEM/F12)的冻存复苏率， 活细胞数量增多， 能更好的维持细胞的活 性， 细胞状态更。
17、好。 图1A为使用本发明脐带间充质干细胞冻存液冻存复苏培养3天后的细胞 生长状态； 图1B则为传统冻存液复苏培养3天后的细胞生长状态。 0045 7)为对本发明实例中的技术方案进行清楚的描述， 对本发明采用单因素实验。 0046 分别采用不同组分的冻存保护液冻存脐带间充质干细胞， 比较不同的冻存保护液 冻存复苏后细胞活率情况。 0047 表1为不同组分的冻存保护液冻存脐带间充质干细胞冻存保护液及冻存复苏率。 0048 表1 0049 说 明 书 4/5 页 6 CN 107006453 A 6 0050 0051 由表1可知冻存液组分为DMEM/F12+1UltroserTMG+1谷氨酰胺时，。
18、 复苏率仅为 50.434.21， 然后把UltroserTMG浓度换为2时， 发现细胞复苏后活细胞数上升， 但是复苏 率仍然只有60.353.24。 接着在DMEM/F12+2UltroserTMG+1谷氨酰胺的基础上加入 50ng/ml EGF， 细胞复苏率提高到72.562.37； 随后将50ng/ml EGF换成50ng/ml bEGF， 发 现细胞复苏率相差无几， 为73.692.89； 再将50ng/ml EGF以及50ng/ml bEGF同时加入 DMEM/F12+2UltroserTMG+1谷氨酰胺， 发现细胞复苏率提高到85.423.41， 最后在 DMEM/F12+2UltroserTMG+1谷氨酰胺+50ng/ml bEGF+50ng/ml EGF的基础上加入0.5 右旋糖酐-40， 发现复苏率提高到92.452.49， 然后将右旋糖酐-40的浓度提高到1， 发现 细胞复苏率提高到98.344.47。 由此可见使用本发明脐带间充质干细胞冻存液的细胞复 苏率明显高于传统冻存液的冻存复苏率， 细胞大小均匀， 细胞轮廓清晰完整， 折光度好。 说 明 书 5/5 页 7 CN 107006453 A 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 8 CN 107006453 A 8 。