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1、10申请公布号CN104212887A43申请公布日20141217CN104212887A21申请号201410400047722申请日20140814C12Q1/68200601C12Q1/1020060171申请人北京市理化分析测试中心地址100089北京市海淀区西三环北路27号72发明人杜美红孙永军许迪莘杨寅陈婷74专利代理机构北京润平知识产权代理有限公司11283代理人李婉婉金迪54发明名称一种快速检测沙门氏菌的方法57摘要本发明公开了一种快速检测沙门氏菌的方法，该方法包括1将免疫磁珠与液体形式的待测样品进行混合，以捕获待测样品中可能存在的沙门氏菌，所述免疫磁珠由抗体与磁球偶联得到；。
2、2将步骤1中可能捕获了沙门氏菌的免疫磁珠与液体培养基混合，并将所得混合物置于能够使沙门氏菌增殖的条件下进行培养；3采用针对沙门氏菌的特异性引物对步骤2经培养获得的菌体进行PCR扩增，根据PCR扩增产物判断待测样品中沙门氏菌的存在。本发明的方法操作简单快捷，所需时间短，具有较高的灵敏度和准确度，适用性强，特别有利于大范围的应用推广，对食品安全监测监管具有重大意义。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表2页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表2页附图2页10申请公布号CN104212887ACN104212887A1/1页21一种快速检测沙门。
3、氏菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤1将免疫磁珠与液体形式的待测样品进行混合，以捕获待测样品中可能存在的沙门氏菌，所述免疫磁珠由抗体与磁球偶联得到；2将步骤1中可能捕获了沙门氏菌的免疫磁珠与液体培养基混合，并将所得混合物置于能够使沙门氏菌增殖的条件下进行培养；3采用针对沙门氏菌的特异性引物对步骤2经培养获得的菌体进行PCR扩增，根据PCR扩增产物判断待测样品中沙门氏菌的存在。2根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗体为编号为LSC103073的LSBIO单克隆抗体和/或编号为019599的KPL多克隆抗体。3根据权利要求1所述的方法，其中，每毫克的磁球上偶联的抗体的量为0052MG。4根。
4、据权利要求1所述的方法，其中，所述磁球为表面修饰有氨基或羧基的超顺磁性FE3O4聚苯乙烯复合微球。5根据权利要求14中任意一项所述的方法，其中，相对于每毫升的液体形式的待测样品，以磁球的重量计，所述免疫磁珠的用量为1025G。6根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1中捕获的条件包括温度为3538，时间为2535MIN。7根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2中培养的时间为48H。8根据权利要求1所述的方法，其中，步骤3中PCR扩增所用的特异性引物为能够特异地扩增沙门氏菌的INVA基因和/或FIMY基因的引物。9根据权利要求1或8所述的方法，其中，PCR扩增所用的特异性引物由序列如SEQIDNO。
5、1所示的正向引物和序列如SEQIDNO2所示的反向引物组成，或者由序列如SEQIDNO3所示的正向引物和序列如SEQIDNO4所示的反向引物组成。权利要求书CN104212887A1/7页3一种快速检测沙门氏菌的方法技术领域0001本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种快速检测沙门氏菌的方法。背景技术0002致病菌PATHOGENICBACTERIA能引起疾病的微生物称为病原微生物或致病菌。病原微生物包括细菌、病毒、螺旋体、立克次氏体、衣原体、支原体、真菌及放线菌等。一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌。细菌的致病性与其毒力、侵入数量及侵入门户有关。虽然绝大多数细菌是无害甚至有益的，但是。
6、相当大一部分可以致病。条件致病菌只在特定条件下致病，如有伤口可以允许细菌进入血液，或者免疫力降低时。例如，金黄色葡萄球菌和链球菌也是正常菌群，常可以存在于体表皮肤，鼻腔而不引起疾病，但可以潜在引起皮肤感染，如肺炎PNEUMONIA、脑膜炎MENINGITIS和败血症SEPSIS等。0003沙门氏菌是一种革兰氏阴性短杆菌，不形成芽胞，临床上可表现为胃肠炎、肠热病、菌血症综合征或局灶性疾病。受此菌威胁最大的是婴幼儿、老人及免疫缺陷个体。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。当前，各国政府和学术研究机构都在致力于食品安全问题的研究，食。
7、品安全问题受到了空前的关注。0004沙门氏菌检测的常规方法是目前国内绝大多数检测机构都在使用的方法，主要步骤为前增菌818H、增菌1824H、平板培养分离1824H、生化试验和血清学鉴定，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。发明内容0005本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够快速检测沙门氏菌的方法。0006为了实现上述目的，本发明的发明人进行了大量的研究，结果发现配合使用免疫磁分离技术与PCR扩增的方法特别有利于实现沙门氏菌的快速特异性检测。因此，本发明提供了一种快速检测沙门氏菌的方法，该方法包括以下步骤00071将免疫磁珠与液体形式的待测样品进。
8、行混合，以捕获待测样品中可能存在的沙门氏菌，所述免疫磁珠由抗体与磁球偶联得到；00082将步骤1中可能捕获了沙门氏菌的免疫磁珠与液体培养基混合，并将所得混合物置于能够使沙门氏菌增殖的条件下进行培养；00093采用针对沙门氏菌的特异性引物对步骤2经培养获得的菌体进行PCR扩增，根据PCR扩增产物判断待测样品中沙门氏菌的存在。0010本发明的方法操作简单快捷，所需时间短，具有较高的灵敏度和准确度，适用性强，特别有利于大范围的应用推广，对食品安全监测监管具有重大意义。0011本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明说明书CN104212887A2/7页40012附图是用。
9、来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中0013图1是实施例1中部分琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，M为MARKER，13为实验组13的电泳结果，4为死菌组4的电泳结果，5为阳性对照组5的电泳结果，6为阴性对照组6的电泳结果；0014图2是实施例1中另一部分琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，M为MARKER，1为阴性对照组7的电泳结果，2为阴性对照组8的电泳结果，3为阴性对照组9的电泳结果，4为阳性对照组5的电泳结果；0015图3是实施例2中琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，M为MARKER，1和2为阴性对照组5和6的电泳结。
10、果，3和4为阳性对照组3和4的电泳结果，5和6为实验组1和2的电泳结果。具体实施方式0016以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。0017在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“免疫磁珠”是指通过偶联反应将抗体结合到磁性微球或磁球的表面上，形成的免疫磁性微球；术语“PCR”是指聚合酶链式反应；术语“引物”包括至少一个上游引物和至少一个下游引物；本发明中使用的液体体积均为20下的数值。0018本发明提供的快速检测沙门氏菌的方法包括以下步骤00191将免疫磁珠与液体形式的待测样品进行混合，以捕获待测样品中可。
11、能存在的沙门氏菌，所述免疫磁珠由抗体与磁球偶联得到；00202将步骤1中可能捕获了沙门氏菌的免疫磁珠与液体培养基混合，并将所得混合物置于能够使沙门氏菌增殖的条件下进行培养；00213采用针对沙门氏菌的特异性引物对步骤2经培养获得的菌体进行PCR扩增，根据PCR扩增产物判断待测样品中沙门氏菌的存在。0022根据本发明，抗体与磁球偶联获得所述免疫磁珠的方法可以为常规方法，例如，可以按照文献刘辉荣等，简便高效分离细胞新型免疫磁珠制备，中国公共卫生，2008,1113491351中的方法进行。0023为了捕获待测样品中的沙门氏菌，所述抗体为能够与沙门氏菌特异性结合的抗体，优选地，所述抗体为编号为LSC。
12、103073的LSBIO单克隆抗体该抗体可以从LSBIO公司商购得到，商品号CAT为LSC103073和/或编号为019599的KPL多克隆抗体该抗体可以从美国KPL公司商购得到，商品号CAT为019599。采用该优选的抗体特别是所述多克隆抗体能够实现沙门氏菌的活菌体检测，进一步提高了本发明的检测方法的实际使用价值。0024优选情况下，每毫克的磁球上偶联的抗体的量为0052MG。0025优选情况下，相对于每毫升的液体形式的待测样品，以磁球的重量计，所述免疫磁珠的用量为1025G。0026所述磁球可以为各种常规用于免疫磁分离的磁球，例如，可以为表面修饰有氨基说明书CN104212887A3/7页。
13、5或羧基的超顺磁性FE3O4聚苯乙烯复合微球。优选情况下，所述磁球的粒径为150200NM。0027根据本发明，利用免疫磁珠捕获沙门氏菌可以借助免疫磁分离系统例如MATRIXPATHATRIX免疫磁分离系统或磁力架进行，对所述捕获的条件没有特别的限定，优选地，步骤1中，捕获的条件包括温度为3538，时间为2535MIN。0028根据本发明，为了准确地检测待测样品中沙门氏菌的存在，需要在免疫磁分离之后对待测样品进行细菌扩增处理，从而扩增待测样品中可能存在的沙门氏菌。所述液体培养基可以为本领域常规用于沙门氏菌培养的培养基，如缓冲蛋白胨水或营养肉汤培养基。培养的温度可以为3538。培养的时间优选为4。
14、8H更优选为46H。可以利用摇床进行所述培养，而摇床的转速通常可以设置为100200RPM。本发明中，经培养步骤获得的培养物即可直接作为PCR扩增的模板。本发明采用先进行免疫磁分离，再增殖培养，在很大程度上减少了检测所需的时间，提高了检测效率。0029根据本发明，PCR扩增所用的特异性引物为能够特异地扩增沙门氏菌的INVA侵袭蛋白A，INVASIONPROTEINA基因例如GENBANKACCESSIONNUMBERM908461和/或FIMY菌毛Y蛋白，MBRIAEYPROTEIN基因例如GENBANKACCESSIONNUMBERJQ6654381的引物。其中，作为本发明特别优选的一种实施。
15、方式，PCR扩增所用的特异性引物由序列如SEQIDNO15TCCTCCGCTCTGTCTACTTA3所示的正向引物和序列如SEQIDNO25ACCGAAATATTCATTGACGTT3所示的反向引物组成，或者由序列如SEQIDNO35GCCGGTAAACTACACGATGA3所示的正向引物和序列如SEQIDNO45GAGTTACTGAACCAACAGCT3所示的反向引物组成。0030本发明中，如果PCR扩增产物中存在特异性引物能够扩增的目的DNA片段，那么说明样品中存在沙门氏菌。可以采用常规的电泳检测方法分析PCR扩增产物中可能存在的DNA片段，从而判断待测样品中是否存在沙门氏菌，例如，琼脂糖。
16、凝胶电泳AGE，电泳的具体条件可以包括电压为315V/CM，时间为2040MIN，PCR扩增产物的上样量为820L。0031根据本发明的方法，其中，待测样品可以为食品、环境用水包括城市废水、工业废水、农业用水、城市用水、特种用水等和药品中的至少一种。具体地，可以按照国家标准GB478912010食品安全国家标准食品微生物学检验总则中的方法取得待测样品。0032以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，缓冲蛋白胨水购自北京路桥技术有限责任公司；使用的菌株均通过商购获得，且分别购自ATCC美国典型菌种保藏中心、CGMCC中国普通微生物菌种保藏管理中心和CMCC中国医学微生物菌种保藏管理中。
17、心；1乙基3二甲氨基丙基碳酰二亚胺EDC和N羟基琥珀酰亚胺NHS购自SIGMA公司；使用的特异性引物委托上海英骏生物技术有限公司合成；磁分离在磁力架上进行；将从LSBIO公司商购得到，商品号CAT为LSC103073的抗体作为特异性抗体。0033制备实施例10034本制备实施例1使用抗体1制备本发明的方法所用的免疫磁珠。0035将通过1乙基33二甲基氨丙基碳化二亚胺EDC和N羟基琥珀酰亚胺NHS活化的表面修饰有羧基的超顺磁性FE3O4聚苯乙烯复合微球购自上海奥润微纳新材料科技有限公司，PM3020型聚合物磁球，浓度为10MG/ML，粒径为180NM，表面修饰有羧基官能团作为磁球使用，取2MG磁。
18、球，分散磷酸缓冲溶液中，分散液中磁球的浓度为2MG/说明书CN104212887A4/7页6ML。取02MG特异性抗体溶于1ML的磷酸缓冲液中与2MG磁球混合，室温下在摇床200R/MIN中保持3H，然后通过磁分离进行清洗，去除未偶联到磁球表面的特异性抗体，采用BIOSPECNANO仪SHIMADZU，日本检测未偶联的微量抗体，且测得未偶联到磁球表面的特异性抗体的量为300NG。接着用浓度为1W/V的牛血清白蛋白溶液溶于磷酸缓冲液，在37下封闭30MIN，然后通过磁分离进行清洗，洗去多余的牛血清白蛋白溶液，即得到免疫磁珠。0036实施例10037本实施例用来说明本发明方法的灵敏度、特异性和准确。
19、度。0038将不同的菌株见表1与2ML的PBS混合得到不同浓度的菌悬液即待测样品，并按照以下方式进行免疫磁珠捕获、细菌培养、PCR扩增和电泳检测，其中，死菌组的待测样品通过将菌悬液置于121、0103MPA的条件下30MIN进行灭活而获得。0039表100400041注“图11”表示图1中的1泳道，依此类推。00421免疫磁珠捕获0043将菌悬液加入到制备实施例1获得的免疫磁珠离心管中，在涡旋混合器上轻轻振荡混匀，放在混匀器或摇床中，室温25旋转或振荡孵育30MIN；放在MATRIXPATHATRIX免疫磁分离系统上，室温25下静置30MIN，小心吸走管中的液体，获得免疫磁珠富集体。说明书CN。
20、104212887A5/7页700442细菌培养0045将免疫磁珠富集体转移到10ML缓冲蛋白胨水中，涡旋混匀，放置到恒温培养箱，于361下培养55H；收集培养液5ML于EPPENDORF管中，12000G离心10MIN，所得沉淀用1ML无菌水打散，并在12000G下离心10MIN，弃上清，沉淀用100L无菌水打散，得到菌体待用作为PCR扩增模板。00463PCR扩增0047使用针对所述沙门氏菌的特异性引物对培养获得的菌体进行PCR扩增。特异性引物能够扩增283BP的INVA基因的序列如下所示0048正向引物INVAF5TCCTCCGCTCTGTCTACTTA3SEQIDNO10049反向引物。
21、INVAR5ACCGAAATATTCATTGACGTT3SEQIDNO20050PCR反应体系见表20051表20052试剂贮备液浓度25L反应体系中加样体积10PCR缓冲液不含MGCL278LDNTP25MMOL/L2LMGCL225MMOL/L15L上游引物20MOL/L03L下游引物20MOL/L03LTAQ酶5U/L02LDNA模板50NG/L10L双蒸水29L0053PCR扩增程序见表30054表300551943MIN29430S35530S47240S5返回第2步30个循环说明书CN104212887A6/7页867210MIN74永久00564PCR扩增产物的电泳检测0057用。
22、电泳缓冲液1TAE制备2的琼脂糖凝胶，58时加入溴化乙锭至终浓度为05MOL/ML；取10L的PCR扩增产物，分别和2L的上样缓冲液混合进行点样，用DNA分子量标记物做参照，在10V/CM恒压下电泳30MIN，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。0058如果AGE电泳结果显示PCR扩增得到了283BP的片段可观察到明显的条带，阳性，那么说明样品中存在沙门氏菌，结果如图1和图2所示实验组13和阳性对照组5均呈现明显的283BP的条带，而死菌组4和阴性对照组69没有明显的条带。0059从图1和图2可以看出，本发明的优选实施方式能够特异地检测沙门氏菌活菌体。0060实施例20061按照实施例1。
23、的方法进行沙门氏菌的检测，不同的是，使用的样品如表4所示，且PCR扩增使用的特异性引物能够扩增526BP的FIMY基因的序列如下所示0062正向引物FIMYF5GCCGGTAAACTACACGATGA3SEQIDNO30063反向引物FIMYR5GAGTTACTGAACCAACAGCT3SEQIDNO40064表400650066注“图31”表示图3中的1泳道，依此类推。0067电泳结果如图3所示实验组12和阳性对照组34呈现明显的526BP的条带，而阴性对照组5和6没有明显的条带。从图3也可以看出，本发明的方法能够用于特异地、准确地检测沙门氏菌。0068实施例30069本实施例用来说明本发明。
24、的方法在检测猪肉样品的实际应用。0070取经国标方法GB/T478942010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验检验证实为三种菌株均为阴性的20份鲜猪肉样品25G，分别按照实施例1中记载的方法进行免疫磁珠捕获、细菌培养、PCR扩增和电泳检测，结果表明，20份沙门氏菌阴性猪肉样品用该发明方法检测结果全部为阴性，与传统培养方法检测结果一致。说明书CN104212887A7/7页90071用鼠伤寒沙门氏菌ATCC1402810CFU污染上述20份鲜猪肉样品，采用实施例1中记载的方法再进行免疫磁珠捕获、细菌培养、PCR扩增和电泳检测，结果全部为阳性。0072实施例40073按照实施例1中记载。
25、的方法进行沙门氏菌的检测，不同的是，将实施例1中使用的待测样品替换为购自北京市各大超市的50份鲜猪肉样品，并采用GB/T478942010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验的方法分别进行验证。0074结果显示，GB方法检出沙门氏菌阳性20例，本发明的方法对此20份样品的检测结果也为阳性，两种方法对其余样品中沙门氏菌的检测结果均为阴性。0075对从北京地区各大超市购买的50份鲜猪肉样品的检测结果显示，相比GB方法，本发明方法针对沙门氏菌的检测具有很高的灵敏度、特异性和准确性。0076实施例50077按照实施例1中记载的方法进行沙门氏菌的检测，不同的是，将实施例1中使用的待测样品替换为购。
26、自北京市各大超市的50份鲜鸡肉样品，并将实施例1中使用的单克隆抗体替换为019599多克隆抗体购自KPL公司，商品号CAT为019599。采用GB/T478942010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验的方法分别进行验证。0078结果显示，GB方法检出沙门氏菌阳性23例，本发明的方法对此23份样品的检测结果也为阳性，两种方法对其余样品中沙门氏菌的检测结果均为阴性。0079对从北京地区各大超市购买的50份鲜鸡肉样品的检测结果也显示，相比GB方法，本发明方法针对沙门氏菌的检测具有很高的灵敏度、特异性和准确性。0080由以上实施例可以看出，本发明的方法能够实现沙门氏菌的快速检测，灵敏度和准。
27、确度均较高。0081以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。0082另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。0083此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。说明书CN104212887A1/2页1000010002序列表CN104212887A102/2页11序列表CN104212887A111/2页12图1图2说明书附图CN104212887A122/2页13图3说明书附图CN104212887A13。