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1、(10)申请公布号 CN 103751269 A (43)申请公布日 2014.04.30 CN 103751269 A (21)申请号 201410009607.6 (22)申请日 2014.01.09 A61K 36/53(2006.01) A61K 31/352(2006.01) A61P 3/10(2006.01) (71)申请人 黄河科技学院 地址 450000 河南省郑州市二七区航海中路 94 号 (72)发明人 李高申 张伟 郭梅珍 彭涛 尹震花 (74)专利代理机构 郑州联科专利事务所 ( 普通 合伙 ) 41104 代理人 郭丽娜 (54) 发明名称 冬凌草提取物在 - 葡萄。
2、糖苷酶抑制剂中的 应用 (57) 摘要 本发明属于中药提取物应用技术领域， 具体 涉及一种冬凌草提取物在- 葡萄糖苷酶抑制剂 中的应用。 本发明发现乙酸乙酯部位、 甲醇部位对 -葡萄糖苷酶均具有一定的抑制作用， 其中乙 酸乙酯部位抑制活性最强， 其次为甲醇部位 ； 有 效成分冬凌草甲素对-葡萄糖苷酶也具有强的 抑制作用， 且属非竞争性抑制。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103751269 A CN 103751269 A 1/。
3、1 页 2 1. 冬凌草提取物在- 葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。 2.如权利要求1所述的冬凌草提取物在-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用， 其特征在于 ： 所述冬凌草提取物为乙酸乙酯部位和 / 或甲醇部位。 3. 如权利要求 1 所述的冬凌草提取物的有效成分在 - 葡萄糖苷酶抑制剂中的应用， 其特征在于 ： 所述冬凌草提取物的有效成分为冬凌草甲素。 4.如权利要求2所述的冬凌草提取物在-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用， 其特征在于 ： 所述乙酸乙酯部位、 甲醇部位是指冬凌草乙醇总浸膏用硅胶拌样， 依次用乙酸乙酯和甲醇 洗脱， 回收溶剂， 所得乙酸乙酯洗脱物即为乙酸乙酯部位， 所得甲醇洗脱物即为甲醇部位。 5.。
4、如权利要求4所述的冬凌草提取物在-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用， 其特征在于 ： 所述冬凌草乙醇总浸膏的制备方法为 ： 冬凌草叶阴干、 粉碎， 用乙醇室温浸提 2-3 次， 每次 2-4 d， 合并浸提液， 减压回收溶剂， 得冬凌草乙醇总浸膏。 6.如权利要求5所述的冬凌草提取物在-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用， 其特征在于 ： 乙醇浓度为 65 80V%。 权 利 要 求 书 CN 103751269 A 2 1/4 页 3 冬凌草提取物在 - 葡萄糖苷酶抑制剂中的应用 0001 技术领域 本发明属于中药提取物应用技术领域， 具体涉及一种冬凌草提取物在- 葡萄糖 苷酶抑制剂中的应用。 0002 背景。
5、技术 冬凌草为唇形科香茶菜属植物碎米桠Rabdosia rubescens (Hemsl.) Hara 的干燥地 上部分， 产于湖北 (又叫野藿香花)、 四川 (又叫破血丹)、 贵州 (又叫山香草、 雪花草和野 藿香 )、 山西、 河南 ( 又叫冰凌草、 六月令和山荏 )、 河北及湖南等地， 生于山坡、 灌木丛、 林 地、 砾石地及路边等向阳处， 海拔 100-2800m。据 中国药典 (2010 版 ) 记载， 其饮片性味 苦、 甘， 微寒， 具有清热解毒、 活血止痛之功效， 可用于治疗咽喉肿痛、 癥瘕痞块、 蛇虫咬伤。 化学研究表明， 冬凌草中含有萜类 (二萜和三萜)、 生物碱、 甾体、 。
6、黄酮、 挥发油、 有机酸等化 学成分。药理研究表明其具有抗肿瘤、 抗菌、 抗炎、 增强免疫、 抗氧化、 抗突变、 降压等药理 作用， 尤其是抗肿瘤， 作用良好， 且研究报道比较多， 毒性不明显， 被誉为 “紫杉醇第二” ， 其 主要抗癌活性成分为冬凌草甲素和冬凌草乙素。 目前未见文献对冬凌草提取物和化合物的 - 葡萄糖苷酶的抑制作用的报道。 0003 冬凌草甲素 (Oridonin) 为冬凌草中的二萜类主要有效成分， 常作为冬凌草质量 的评价的主要指标， 别名 ： 冬凌草素、 延命草宁 ； 分子式 ： C20H28O6； 分子量 ： 364.43 ； CAS 登录 号 ： 28957-04-2。
7、。本品为一种对映 - 贝壳杉烷型二萜类化合物， 味道极苦， 微溶于水， 可溶 于甲醇、 乙酸乙酯、 丙酮等有机溶剂 ； 冬凌草甲素具有多种药理活性， 如抗肿瘤、 抗菌消炎、 杀虫清热解毒、 免疫增强、 抗氧化、 降血压和健胃活血等。 临床实验表明， 冬凌草甲素对多种 肿瘤细胞有明显的抑制或杀伤作用， 有较强的抗菌消炎作用， 毒副作用较小， 但由于其水溶 性差， 口服难以达到有效的血药浓度， 降低了临床疗效， 限制了其临床应用。为寻找具有临 床应用价值的候选药物， 国内外学者对冬凌草甲素进行了结构修饰。未发现冬凌草甲素对 - 葡萄糖苷酶的抑制作用的报道。 0004 - 葡萄糖苷酶抑制剂是七十年代。
8、后期研究开发出的一类新型口服降血糖药物， 其作用机理在于 ： 通过竞争性抑制- 葡萄糖苷酶的活性， 阻滞双糖水解成单糖， 延缓糖的 吸收， 使血糖平稳并缓慢地维持在一定水平。-葡萄糖苷酶抑制剂能够有效控制餐后血糖 的升高， 预防糖尿病的发生， 减少糖尿病并发症， 降低死亡率。-葡萄糖苷酶抑制剂不仅对 糖尿病有确切的疗效， 对肥胖症、 慢性乙肝、 艾滋病也都有一定的治疗作用。 0005 目前， 临床用于- 葡萄糖苷酶抑制剂的此类药物有阿卡波糖、 伏格列波糖和米 格列醇， 天然产物中的- 葡萄糖苷酶抑制剂是近年来研究的热点。研究发现，- 葡萄糖 苷酶抑制剂的主要结构类型为黄酮类、 生物碱类和皂苷类。
9、， 此外还有茶多酚类。 黄酮类化合 物主要是通过多羟基结构发挥抑制作用， 并且羟基组的糖化作用会减弱化合物对- 葡萄 糖苷酶的抑制作用。生物碱类也是多羟基生物碱具有抑制作用。一些中草药的提取物也具 有很好的抑制- 葡萄糖苷酶作用， 如绿茶提取物和大黄、 山茱萸、 赤芍、 五倍子水煮醇沉 提取物， 以及广西血竭全粉和分步提取物、 五味子和虎杖的水提取物等。 然而现有的此类药 物成本较高， 生产厂家很少， 同时伴随有肠道副作用。 说 明 书 CN 103751269 A 3 2/4 页 4 0006 发明内容 本发明的目的在于提供一种冬凌草提取物在- 葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。 0007 本发明采。
10、用以下技术方案 ： 冬凌草提取物在- 葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。 0008 所述冬凌草提取物为乙酸乙酯部位和 / 或甲醇部位。 0009 所述冬凌草提取物的有效成分为冬凌草甲素。 0010 所述乙酸乙酯部位、 甲醇部位是指冬凌草乙醇总浸膏用硅胶拌样， 依次用乙酸乙 酯和甲醇洗脱， 回收溶剂， 所得乙酸乙酯洗脱物即为乙酸乙酯部位， 所得甲醇洗脱物即为甲 醇部位。 0011 所述冬凌草乙醇总浸膏的制备方法为 ： 冬凌草叶阴干、 粉碎， 用乙醇 （65 80V%） 室温浸提 2-3 次， 每次 2-4 d， 合并浸提液， 减压回收溶剂， 得冬凌草乙醇总浸膏。 0012 乙酸乙酯部位或甲醇部位分别通过。
11、反复硅胶柱层析、 Sephadex LH-20 凝胶柱层 析、 高效液相制备色谱、 重结晶等手段分离得到冬凌草甲素。 0013 本发明发现冬凌草的乙酸乙酯部位、 甲醇部位、 冬凌草甲素均有一定的-葡萄 糖苷酶抑制活性， 乙酸乙酯部位、 甲醇部位的 IC50分别为 475.85 和 990.08 g/mL， 且对 - 葡萄糖苷酶的抑制率均呈剂量依赖性， 即随着质量浓度的增加， 抑制率不断增加 ； 冬凌 草的提取物冬凌草甲素也具有很好的-葡萄糖苷酶抑制作用 (IC50为 21.48 g/mL)， 且 属非竞争性抑制， 在一定浓度范围内， 对- 葡萄糖苷酶的抑制率均呈剂量依赖性， 此后再 增加浓度抑。
12、制率变化不大。 0014 附图说明 图1为乙酸乙酯部位、 甲醇部位、 阿卡波糖的-葡萄糖苷酶抑制率随药物浓度的变化 图 ； 图 2 为冬凌草甲素的- 葡萄糖苷酶抑制率随药物浓度的变化图 ； 图 3 为冬凌草甲素-葡萄糖苷酶活性的 Lineweave-Burk 曲线。 0015 具体实施方式 实施例 1 冬凌草叶阴干、 粉碎， 用 65V% 乙醇室温浸提 2 次， 每次 4d， 合并浸提液， 减压回收溶剂， 得冬凌草乙醇总浸膏， 冬凌草乙醇总浸膏用硅胶拌样， 依次用乙酸乙酯和甲醇洗脱， 回收溶 剂， 所得乙酸乙酯洗脱物即为乙酸乙酯部位， 所得甲醇洗脱物即为甲醇部位 ； 乙酸乙酯部位或甲醇部位分别。
13、通过反复硅胶柱层析、 Sephadex LH-20 凝胶柱层析、 高 效液相制备色谱、 重结晶等手段分离得到冬凌草甲素。 0016 冬凌草甲素 : 白色结晶 , mp 245-247。IR (KBr, cm- 1): 3433, 3382, 3304,1711, 1647, 1095, 1080, 1068. 1H-NMR (Acetone-d6) : 6.17, 5.57 ( 各 1H, s, H-17), 5. 04 (1H, s, H-14), 4.38, 4.13 ( 各 1H, d, J=10.0 Hz, H-20), 3.81 ( 1H, d, J = 7.0 Hz, H6), 3。
14、.62 (1H, dd, J= 11.6 Hz, H-1), 1.19, 1.15 ( 各 3H, s, C4-Me2)。13C-NMR (Acetone-d6) : 210 (C-15), 153.8 (C-16), 119.6 (C-17), 98 (C-7), 74.9 (C-6), 74.1 (C-14), 73.8 (C-1), 64.2 (C-20), 63.0 (C-8), 61.2 (C-5), 55.2 (C-9), 44.5 (C-13), 42.3 (C-10), 40.0 (C-3), 34.6 (C-4), 33.6 (C-18), 31.6 (C-12), 30.7。
15、 (C-2), 22.6 (C-19), 20.8 (C-11)。 说 明 书 CN 103751269 A 4 3/4 页 5 0017 实施例 2 与实施例 1 不同的是 ： 乙醇浓度为 75V%， 浸提 3 次， 每次 2d。 0018 实施例 3 与实施例 1 不同的是 ： 乙醇浓度为 80V%， 浸提 3 次， 每次 3d。 0019 效果试验 试验一、 冬凌草乙酸乙酯部位、 甲醇部位、 冬凌草甲素的体外- 葡萄糖苷酶活性试验 1.1 试验方法 ： 微孔板法 1.1.1 原理 ：-葡萄糖苷酶催化水解4-硝基苯-D-吡喃葡萄糖苷 （PNPG） ， 产生硝 基苯酚 （PNP， 黄色物质，。
16、 在 405 nm 有最大吸收） ，- 糖苷酶抑制剂可抑制- 葡萄糖苷酶 与底物结合从而降低 PNP 的释放量， 以一定时间内反应体系中 PNP 的含量变化来计算提取 物的酶抑制活性。 0020 仪器 ： Multiskan MK3 酶标仪 （Thermo Electron） ； LRH-150 恒温培养箱 ( 上海一 恒科技有限公司 ) ； DELTA 320 型 pH 计 （Mettler-Toledo） ； 电子天平 （Mettler-Toledo） ； 旋 转蒸发仪 （Heidolph） 。 0021 试剂 ：- 葡萄糖苷酶 （Sigma 公司， EC 3.2.1.20） ， 4- 硝。
17、基苯基 -D- 吡喃葡萄 糖苷 （PNPG， Sigma 公司， 批号 ： 026K1516） ， 磷酸钾缓冲液 （pH 6.8） ， 阿卡波糖 （卡博平， 杭州 中美华东制药有限公司， 批号 ： 110704） ， 其他试剂均为分析纯。 0022 检测方法及数据处理 样品溶液的配置 ： 乙酸乙酯部位、 甲醇部位、 阿卡波糖 ： 称取一定质量的样品加入一定体积的 DMSO， 配成 浓度为 30 mg/mL 溶液 ； 冬凌草甲素 ： 称取一定质量的冬凌草甲素， 加入一定体积的 DMSO， 配成浓度为 2 mg/mL 溶液。 0023 空白组 ： 8LDMSO+152L 磷酸钾缓冲液， 于 405。
18、 nm 波长下测 OD 值 ； 阴性对照 组 ： 8LDMSO+20L- 葡萄糖苷酶 +112L 磷酸钾缓冲液 +20LPNPG， 于 405 nm 波长下 测 OD 值 ； 样品对照组 ： 8L 样品溶液 +152L 磷酸钾缓冲液， 于 405 nm 波长下测 OD 值 ； 样品 组 ： 8L样品溶液+20L -葡萄糖苷酶+112L磷酸钾缓冲液+20LPNPG， 于405 nm波 长下测OD值。 （具体过程 ： 112 L磷酸钾缓冲液 (pH 6.8)， 加入20 L 0.2 U/mL -葡 萄糖苷酶、 8 L样品溶液， 37恒温15 min， 加入20 L 2.5 mmol/L PNPG，。
19、 37恒温反应 15 min。再加入 80 L 0.2 mol/L 的终止剂 Na2CO3溶液， 于 405 nm 波长下测 OD 值。 ） 同时做相同体系下的阴性对照组、 空白组、 样品组和样品对照组， 按下面方法计算抑制 率， 并用 Origin6.0 软件求出相应 IC50值。 0024 抑制率 分别利用上述方法测定了实施例1中冬凌草有效部位 （乙酸乙酯部位和甲醇部位） 以及 有效成分冬凌草甲素和阳性对照阿卡波糖的 IC50。 0025 试验二、 冬凌草有效成分的体外- 葡萄糖苷酶抑制类型试验 依据试验一的测定， 分别取冬凌草甲素适宜的 2 个不同浓度 （40g/mL、 50g/mL） 。
20、， PNPG 取5个不同浓度(0.625、 1.25、 2.5、 5、 10 mmol/L)， 分别测定反应速度。 按 Lineweave-Burk 说 明 书 CN 103751269 A 5 4/4 页 6 作图法， 以1/S为横坐标， 1/V 为纵坐标， 用Graphpad Prism 5软件绘制出抑制作用动力 学曲线。 0026 实验结果 1.2.1 冬凌草有效部位和有效成分的体外- 葡萄糖苷酶活性结果 表 1 不同样品的-葡萄糖苷酶抑制活性 样品初筛浓度 (g/mL)初筛抑制率 (I%)IC50值 (g/mL) 乙酸乙酯部位1500101.87475.85 甲醇部位150076.34。
21、990.08 冬凌草甲素10095.0921.48 阿卡波糖150052.741358.34 从表 1 可以看出， 冬凌草乙酸乙酯部位、 甲醇部位对-葡萄糖苷酶抑制活性 (IC50分 别为 475.85 和 990.08 g/mL) 均强于阳性对照药阿卡波糖 (IC50为 1358.34 g/mL)， 这 表明从冬凌草中提取出两个活性部位 （乙酸乙酯部位、 甲醇部位） 均具有一定的-葡萄糖 苷酶抑制作用。 其中， 乙酸乙酯部位的IC50值极小， 显示其抑制效果最好， 其次为甲醇部位。 从乙酸乙酯或甲醇有效部位中分离出的冬凌草甲素也具有很好的-葡萄糖苷酶抑制作用 (IC50为 21.48 g/m。
22、L)， 活性强于乙酸乙酯部位、 甲醇部位。 0027 图1显示， 本发明的冬凌草乙酸乙酯部位、 甲醇部位对-葡萄糖苷酶的抑制率均 呈剂量依赖性， 即随着质量浓度的增加， 抑制率不断增加。图 2 显示， 在一定浓度范围内， 有 效成分冬凌草甲素对-葡萄糖苷酶的抑制率均呈剂量依赖性， 当浓度达到25 g/mL时， 其抑制率 83.86%， 此后再增加浓度抑制率变化不大， 浓度增加到 100 mg/mL 时， 其抑制率就 达到了最大值 95.09%。 0028 冬凌草有效成分的体外- 葡萄糖苷酶抑制类型结果 图 3 为冬凌草甲素对-葡萄糖苷酶活性的 Lineweave-Burk 曲线。由图可以看出 。
23、： 冬凌草甲素对-葡萄糖苷酶抑制作用属非竞争性抑制， 反应速度 Vmax随着抑制剂浓度的 增大而变小, 米氏常数Km保持不变。 按非竞争性抑制动力学方程 ： 1/Vmax=1/Vmax(1+I/ Ki)， 可以求出其 Ki值为 ： 5.56g/mL。说明它既可以和酶， 也可以和酶 - 底物复合物结合， 从而降低酶活性， 达到降低血糖作用。 0029 总而言之， 上述体外抑酶活性试验证实， 本发明给出的两组冬凌草有效部位 （乙酸 乙酯部位、 甲醇部位） 对-葡萄糖苷酶均具有一定的抑制作用， 其中乙酸乙酯部位抑制活 性最强， 其次为甲醇部位 ； 有效成分冬凌草甲素对-葡萄糖苷酶也具有强的抑制作用， 且 属非竞争性抑制。 说 明 书 CN 103751269 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103751269 A 7 2/2 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 103751269 A 8 。