交叉引用
本申请要求2013年4月30日提交的美国临时申请系列No.61/817596 和2014年2月12日提交的No.61/938851的优先权，每一份申请的全部 内容均以引用方式并入本文。
背景技术
多种损害的结果都可以导致眼睛损伤，包括手术干预、化学暴露、创 伤、感染或者通过外来物体对眼睛的损伤。如果这些损伤全部地治愈，并 且持续的损伤是感染以及可以导致视觉灵敏度损失或失明的其他污染的 入口，则其极其缓慢地治愈。
发明概述
在第一个方面中，本发明提供了用于治疗研究损伤的方法，其包括向 患有眼睛损伤的受试对象给予能够有效治疗眼睛损伤的量的血管紧缩素 肽。在一个实施方案中，眼睛损伤是由创伤、光/辐射或化学品暴露、疾病 或手术过程引起的。在另一个实施方案中，眼睛损伤包括选自手术后发炎、 术后纤维化、术后眼内压升高、角膜损伤、白内障切口、准分子激光原位 角膜磨镶术(LASIK)伤口、干眼症和激光光学角膜切削术(PRK)伤口的损 伤。
在另一个实施方案中，眼睛损伤为角膜损伤，其中角膜损伤包括角膜 上皮细胞,角膜内皮细胞,角膜前弹力层,角膜后弹力层和/或角膜基质前 部的渗透。在另一个实施方案中，角膜损伤包括角膜擦伤或角膜撕裂伤。 在另一个实施方案中，所述的治疗包括降低症状的发展和/或严重性，其中 所述的症状选自：纤维化,炎症,水肿,眼内压升高,目痛,眼泪比正常增 多,视力模糊,对光敏感,视敏度改变和感觉有异物粘在眼睛中。在另一个 实施方案中，所述的治疗包括与对照相比，角膜治愈和/或前房形成的时间 减短。
在一个实施方案中，眼睛损伤包括干眼症。在另一个实施方案中，所 述的治疗包括降低症状的发展和/或严重性，其中所述的症状选自：眼刺激, 刺伤,发红,沙砾的感觉,擦伤,烧伤,结膜分泌物,感觉眼中有异物,眼 泪过多和视力模糊。
在另一个实施方案中，眼睛损伤是眼科手术造成的。在多个实施方案 中，眼科手术选自：角膜磨镶术,准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK),自 动化角膜层状切削术(ALK),准分子激光上皮下角膜磨镶术(LASEK),屈 光性角膜切削术(PRK),激光角膜热成形术(LTK),传导性角膜成形术(CK), 角膜缘松解切口(LRI),散光角膜切开术(AK),放射状角膜切开术(RK),微 小不对称放射状角膜切开术(M.A.R.K.),六角角膜切开术(HK),可植入式 隐形眼镜,老视逆转术,前睫状巩膜切开术(ACS),激光老视逆转手术 (LRP),巩膜膨胀带,Karmrainlay,巩膜加固术,角膜移植手术,穿透角膜 移植术(PK),人工角膜植入术(KPro),白内障手术,眼内镜插入术,光治疗 性角膜切除术(PTK),翼状胬肉单纯切除术,角膜染色术,玻璃体切除术, 全视网膜光凝术(PRP),视网膜脱离修复术,激光光凝术,注气性视网膜固 定术,视网膜冷凝术,黄斑裂孔修复术,部分板层巩膜葡萄膜切除术,部 分薄层巩膜手术切除术(partiallamellarsclerocyclochoroidectomy),部分 薄层巩膜手术切开术(partiallamellarsclerochoroidectomy),后巩膜切开术, 放射状视神经切断术,色素膜肿物切除术,眼外肌手术,眼整形术以及用 于治疗白内障、青光眼和糖尿病视网膜病的手术。
在另一个实施方案中，所述的治疗包括降低症状的发展和/或严重性， 所述的症状选自：术后纤维化,术后炎症,术后眼内压升高,撕裂,结膜分 泌物,刺伤,目痛,眼泪比正常增多,视力模糊,对光敏感,视敏度改变和 感觉有异物粘在眼睛中。
在一个实施方案中，血管紧缩素肽包含或者由Nle3A(1-7)(SEQIDNO: 14)组成。在另一个实施方案中，血管紧缩素肽基于重量(mg)/体积(ml)或重 量/重量(mg)以大约0.01％至大约1％的浓度给予，或者基于重量(mg)/体积 (ml)或重量/重量(mg)以大约0.03％至大约0.3％的浓度给予。在另一个实施 方案中，血管紧缩素肽以局部配制物给予。在多个实施方案中，局部配制 物选自：水凝胶,乳膏,粘弹剂,软膏,糊剂,滴剂,纳米颗粒,聚合物基配 制物和洗剂。在另一个实施方案中，所述的配制物通过传递助剂给予，其 中所述的传递助剂选自：绷带型角膜接触镜,角膜接触镜,formix-基移植术, 眼贴或贴眼剂,压敏贴剂和眼罩。在另一个实施方案中，局部配制物基于 重量(mg)/体积(ml)或重量/重量(mg)，包含大约0.5％至大约4％(或者大约 1％至大约3％)羟乙基纤维素(HEC)。
在另一个实施方案中，所述的方法进一步包括向受试对象给予能够有 效治疗眼睛损伤的量的活性试剂，该活性试剂选自：人工泪液,抗生素,抗 病毒药品,抗真菌药品,止痛剂和抗炎药品。
在第二个方面中，本发明提供了药物组合物，其包括：
(a)血管紧缩素肽；
(b)活性试剂，其选自：人工泪液,抗生素,抗病毒药品,抗真菌药品,止 痛剂和抗炎药品；以及
(c)药物可接受的载体。
在一个实施方案中，活性试剂包括人工泪液。在另一个实施方案中， 血管紧缩素肽包含或者由Nle3A(1-7)(SEQIDNO:14)组成。在另一个实施 方案中，血管紧缩素肽基于重量(mg)/体积(ml)或重量/重量(mg)以大约 0.01％至大约1％(或者大约0.03％至大约0.3％)的浓度给予。
在另一个实施方案中，药物组合物以局部配制物的形式提供。在一个 实施方案中，局部配制物选自：水凝胶,乳膏,粘弹剂,软膏,糊剂,滴剂, 纳米颗粒,聚合物基配制物和洗剂。在另一个实施方案中，局部配制物在 传递助剂上提供，其中所述的传递助剂选自：绷带型角膜接触镜,角膜接 触镜,formix-基移植术,眼贴或贴眼剂,压敏贴剂和眼罩。在另一个实施方 案中，局部配制物基于重量(mg)/体积(ml)或重量/重量(mg)，包含大约0.5％ 至大约4％(或者大约1％至大约3％)羟乙基纤维素(HEC)。
附图简述
图1.与媒介物对照(面板B)相比，使用Nle3-A(1-7)(面板C)进 行活性处理后的角膜切口位点的苏木精和伊红染色显示正常的结构，并且 纤维化降低。在面板A中未显示切口对照。
图2.共聚焦显微成像显示与经历1个月每天处理的媒介物组中所见 的粗糙且杂乱的排列相比，在2个Nle3-A(1-7)处理组中，在角膜伤口附近， 胶原蛋白基质片层呈现规则的排列。
发明详述
如本文所用，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指示物，除非 内容中明确地作出另外的说明。如本文所用，“和”可以与“或”交换使 用，除非明确地作出另外的陈述。
在本发明的不同方面中以及不同方面之间的所有实施方案可以结合， 除非内容中明确地作为另外的说明。
如本文所用，术语“大约”是指相关测量或单位的+/-5％。
在第一个方面中，本发明提供了用于治疗眼睛损伤的方法，其包括向 受试对象给予能够有效治疗眼睛损伤的量的血管紧缩素肽。
本发明人发现血管紧缩素肽(如下文所定义)可以用于治疗多种眼睛 损伤，从而治愈具有有限的角膜浑浊或不具有角膜浑浊的多种眼睛损伤。 目前，在接近眼睛附近发展的损伤下，仅有的模式是缝合、粘合或胶合。 这些都不能促进治愈，并且一旦除去所述的装置，便不再有效。
尽管不想被任何作用机制所束缚，但是本发明人认为由于组织损伤的 治愈总是与血管治愈过程(即，由红细胞和白细胞、以及内皮或血管通道 所介导的)有关，所以本发明的方法会促进眼睛损伤的血管治愈，这是本 领域那些技术人员未意料到的。本发明的方法会加速眼睛治愈而未产生新 血管形成或视觉扭曲，并且会降低炎症和水肿。
所述的受试对象可以为遭受眼睛损伤的任何受试对象，包括但不限于 人类或其他灵长动物、山羊、狗、猫、马、牛、绵羊、猪和其他哺乳动物。
如本文所用，“眼睛损伤”为会导致眼睛损害的任何损伤，所述的眼 睛的损害使得视敏度降低、角膜浑浊、炎症和/或治愈延迟。所述的方法可 以用于任何此类的眼睛损伤，包括但不限于：眼睛组织的撕裂,眼睛组织 的渗透,术后炎症,术后纤维化,术后眼内压升高,角膜损伤,白内障切口, 角膜浑浊,准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)伤口,屈光性角膜切削术 (PRK)伤口,辐射或化学品暴露,角膜移植,干眼症或眼睛感染。
眼睛损伤可以由任何手段所导致，包括但不限于：手术过程,创伤(空 气中的沙子,玻璃,木材,沙子,泥土,军用炮弹,金属,石头或其他材料； 高速物体，例如篮球、网球、拳头、BB、鞭炮等),化学品或辐射暴露,感 染,溃疡,干燥性角膜结膜炎(KCS),疾病,自身免疫紊乱,老龄化和/或炎 症。
在另一个实施方案中，眼睛损伤包括角膜损伤。如本文所用，“角膜 损伤”是指角膜的任何损伤。角膜是覆盖眼睛前房的透明组织。其与眼睛 的晶状体一起工作从而将图像聚焦在视网膜上。任何角膜损伤都可以通过 本发明的方法来治疗，包括但不限于角膜损伤，包括角膜上皮细胞,角膜 前弹力层,角膜内皮,角膜后弹力层和/或角膜基质的前部的渗透。角膜治 愈不仅对于重建保护性上皮细胞是重要的，而且对于恢复角膜透明且清晰 的视觉也是重要的。角膜治愈反应取决于多种因素，包括：损伤的类型、 大小和程度；损伤试剂的性质；眼睛的状态；以及受试对象的一般状态。 最普通的角膜损伤涉及上皮细胞(包括切口、切除以及擦伤)、前弹力层 和基质前部的表面渗透。表面角膜缺陷可以与创伤或疾病(例如营养不良, 神经营养,毒性或感染的角膜炎，包括细菌、真菌或病毒)有关，而且还 取决于手术过程，例如上皮清创术,光性治疗性角膜切除术,光性屈光性 角膜切削术或准分子激光原位磨镶术。
在另一个示例性实施方案中，角膜损伤包括角膜擦伤或角膜撕裂伤。 角膜擦伤或撕裂伤可以由任何原因所导致，包括但不限于：化学品刺激, 角膜接触镜的过度使用或使用不合适的角膜接触镜,擦伤,眼睛中的外来 物体,感染或基于光的角膜擦伤(日光,日光灯,雪或水对光的反射,电弧 焊等)。
角膜损伤可以是由于手术干预或通过外来物体对眼睛的损伤而造成 的。如果这些损伤全部地治愈，并且持续的损伤是感染以及可以导致视觉 灵敏度损失或失明的其他污染的入口，则其极其缓慢地治愈。
在一个实施方案中，眼睛损伤是眼科手术造成的。所述的方法可以用 于治疗由任何眼科手术造成的眼睛损伤，包括但不限于屈光手术(包括但 不限于角膜磨镶术,准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK),自动化角膜层 状切削术(ALK),准分子激光上皮下角膜磨镶术(LASEK),屈光性角膜切 削术(PRK),激光角膜热成形术(LTK),传导性角膜成形术(CK),角膜缘松 解切口(LRI),散光角膜切开术(AK),放射状角膜切开术(RK),微小不对称 放射状角膜切开术(M.A.R.K.),六角角膜切开术(HK),可植入式隐形眼镜, 老视逆转术,前睫状巩膜切开术(ACS),激光老视逆转手术(LRP),巩膜膨 胀带,Karmrainlay和巩膜加固术)；角膜手术(包括但不限于上述的屈光 手术和角膜移植手术,穿透角膜移植术(PK),人工角膜植入术(KPro),白内 障手术,眼内镜插入术,光治疗性角膜切除术(PTK),翼状胬肉单纯切除术 和角膜染色术)；玻璃体视网膜手术(包括但不限于玻璃体切除术,全视网 膜光凝术(PRP),视网膜脱离修复术,激光光凝术,注气性视网膜固定术, 视网膜冷凝术,黄斑裂孔修复术,部分板层巩膜葡萄膜切除术,部分薄层 巩膜手术切除术,部分薄层巩膜手术切开术,后巩膜切开术,放射状视神 经切断术和色素膜肿物切除术)；眼外肌手术,眼整形术以及用于治疗白内 障,青光眼和糖尿病视网膜病的手术。
在另一个实施方案中，眼睛损伤为干眼症。患有干眼症的人们可以经 历刺痛,刺伤,发红,沙砾的感觉,擦伤或烧伤的眼睛,感觉眼中有异物, 眼泪过多和视力模糊。如果不进行治疗，则这种状况可以导致角膜的疼痛、 溃疡或瘢痕。干眼症更倾向于细菌感染或炎症。晚期的干眼症可以损害眼 睛的前表面并损伤视觉。在不同的实施方案中，干眼症可以是手术,干燥 性角膜结膜炎(KCS),自身免疫疾病,老龄化,和/或炎症,和/或不能合适 地产生足够的眼泪或者当眼泪不能完全连贯的且很快蒸发时所导致。
在一个实施方案中，用于本发明的血管紧缩素肽包含或者由通式I的 序列中基团R1-R8的至少4个连续氨基酸的序列组成：
R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8(SEQIDNO:1)
其中R1选自：H,Asp,Glu,Asn,Acpc(1-氨基环戊烷羧酸),Ala,Me2Gly,Pro, Bet,Glu(NH2),Gly,Asp(NH2)和Suc，或者缺乏；
R2选自：Arg,Lys,Ala,Cit,Orn,Ser(Ac),Sar,D-Arg和D-Lys；
R3选自：Val,Ala,Leu,norLeu,Ile,Gly,Lys,Pro,Aib,Acpc和Tyr；
R4选自：Tyr,Tyr(PO3)2,Thr,Ser,homoSer,azaTyr和Ala；
R5选自：Ile,Ala,Leu,norLeu,Val和Gly；
R6选自：His,Arg或6-NH2-Phe；
R7选自：Pro或Ala；以及
R8选自：Phe,Phe(Br),Ile和Tyr，
其中排除包含R4的序列，其中所述的R4以Tyr作为末端基团。
用于实施本发明的示例性AT2激动剂包括上述主题列出的AII类似 物，其限定在于R6为p-NH2-Phe。
在上述实施方案的一个实施方案的另一个优选的实施方案(SEQID NO:15)中，
R1选自：Asp和Glu，或者缺乏；
R2选自：Arg,Lys和Ala；
R3选自：Val,Ala,Leu,norLeu,Ile,Gly,Lys和Pro；
R4选自：Tyr和homoSer；
R5选自：Ile,Ala,Leu,norLeu,Val和Gly；
R5选自：Ile,Ala,Leu,norLeu,Val和Gly；
R6选自：His和Arg；
R7选自：Pro或Ala；以及
R8选自：Phe,Ile，或者缺乏。
用于本发明的其他AT2激动剂包括Wallinder,C,2008.Design, Synthesis,andBiologicalEvaluationofSelectiveNonpeptideAT2Receptor AgonistsandAntagonists.ActaUniversitatisUpsaliensis.Digital ComprehensiveSummariesofUppsalaDissertationsfromtheFacultyof Pharmacy78.96pp.UPPSALA.ISBN978-91-554-7263-4中公开的那些。
在备选的实施方案中，血管紧缩素肽包含或者由通式I的序列中基团 R1-R8的至少5、6、7或8个连续的氨基酸组成。在另一个备选的实施方案 中，血管紧缩素肽基本上由通式I的序列中基团R1-R8的至少4、5、6、7 或8个连续的氨基酸组成。
R1和R2的特别优选的组合为Asp-Arg,Asp-Lys,Glu-Arg和Glu-Lys。 这类型中特别优选的实施方案包括如下：AIII或AII(2-8), Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe[SEQIDNO:2]；AII(3-8),还称为des1-AIII或 AIV,Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe[SEQIDNO:3]；AII(1-7), Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro[SEQIDNO:4]；AII(2-7), Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro[SEQIDNO:5]；AII(3-7),Val-Tyr-Ile-His-Pro[SEQ IDNO:6]；AII(5-8),Ile-His-Pro-Phe[SEQIDNO:7]；AII(1-6), Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His[SEQIDNO:8]；AII(1-5),Asp-Arg-Val-Tyr-Ile[SEQ IDNO:9]；AII(1-4),Asp-Arg-Val-Tyr[SEQIDNO:10]；和AII(1-3), Asp-Arg-Val。其他优选的实施方案包括：Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe [SEQIDNO:11]和Arg-Val-Tyr-norLeu-His-Pro-Phe[SEQIDNO:12]。涵盖 在本发明的范围内的另一个优选的实施方案为具有序列 Asp-Arg-Pro-Tyr-Ile-His-Pro-Phe[SEQIDNO:13]的肽。
在另一个实施方案中，用于本发明的血管紧缩素肽包含或者由 Nle3-A(1-7)的至少5个连续的氨基酸组成。
Nle3-A(1-7)为由氨基酸序列Asp-Arg-Nle-Tyr-Ile-His-Pro(SEQIDNO: 14)组成的肽。在多个其他的实施方案中，给予受试对象的肽可以为 Asp-Arg-Nle-Tyr-Ile(SEQIDNO:16),Asp-Arg-Nle-Tyr-Ile-His(SEQIDNO: 17),或Asp-Arg-Nle-Tyr-Ile-His-Pro(SEQIDNO:14)。
其他优选的实施方案包含或由以下组成：
Asp-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-PheSEQIDNO:18
Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-PheSEQIDNO:19
Ala-Pro-Gly-Asp-Arg-Ile-Tyr-Val-His-Pro-PheSEQIDNO:20
Glu-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-PheSEQIDNO:21
Asp-Lys-Val-Tyr-Ile-His-Pro-PheSEQIDNO:22
Asp-Arg-Ala-Tyr-Ile-His-Pro-PheSEQIDNO:23
Asp-Arg-Val-Thr-Ile-His-Pro-PheSEQIDNO:24
Asp-Arg-Val-Tyr-Leu-His-Pro-PheSEQIDNO:25
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-Arg-Pro-PheSEQIDNO:26
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Ala-PheSEQIDNO:27
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-TyrSEQIDNO:28
Pro-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-PheSEQIDNO:29
Asp-Arg-Pro-Tyr-Ile-His-Pro-PheSEQIDNO:13
Asp-Arg-Val-Tyr(PO3)2-Ile-His-Pro-PheSEQIDNO:30
Asp-Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro-PheSEQIDNO:31
Asp-Arg-Val-Tyr-norLeu-His-Pro-PheSEQIDNO:32
Asp-Arg-Val-homoSer-Tyr-Ile-His-Pro-PheSEQIDNO:33
根据本发明而特别关注的另一类型的血管紧缩素肽为通式II所示的那 些：
R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8(SEQIDNO:34)
其中R2选自H,Arg,Lys,Ala,Orn,Citron,Ser(Ac),Sar,D-ArgandD-Lys；
R3-R8如上文所定义；以及
其中排除包含R4的序列，其中所述的R4以Tyr作为末端基团。
通式II的化合物的特别优选的亚类具有下式：
R2-R3-Tyr-R5-His-Pro-Phe[SEQIDNO:35]
其中R2,R3和R5如之前所定义。式Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe[SEQID NO:2]的血管紧缩素III是特别优选的。其他优选的化合物包括具有结构 Arg-Val-Tyr-Gly-His-Pro-Phe[SEQIDNO:36]和 Arg-Val-Tyr-Ala-His-Pro-Phe[SEQIDNO:37]的肽。
在上式中，使用用于氨基酸残基的标准的三字母缩写。其他残基缩写 如下：
表1.氨基酸的缩写
Me2Gly N,N-二甲基甘氨酰 Bet 1-羧基-N,N,N-三甲基甲铵氢氧化物内盐(甜菜碱) Suc 琥珀酰 Phe(Br) p-溴-L-苯基丙氨酰基 azaTyr aza-α’-高-L-酪胺酰基 Acpc 1-氨基环戊烷羧酸 Aib 2-氨基异丁酸
Sar N-甲基甘氨酰(肌氨酸) Cit Citron Orn 鸟氨酸 NorLeu(Nle) 正亮氨酸 HomoSer 高丝氨酸(异赤丝藻氨基酸)
特别关注的类似物包括如下：
表2.血管紧缩素II类似物
AII类似物名称 氨基酸序列 氨基酸编号 类似物1 Asp-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe SEQ ID NO:18 类似物2 Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe SEQ ID NO:19 类似物3 Ala-Pro-Gly-Asp-Arg-Ile-Tyr-Val-His-Pro-Phe SEQ ID NO:20 类似物4 Glu-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe SEQ ID NO:21 类似物5 Asp-Lys-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe SEQ ID NO:22 类似物6 Asp-Arg-Ala-Tyr-Ile-His-Pro-Phe SEQ ID NO:23 类似物7 Asp-Arg-Val-Thr-Ile-His-Pro-Phe SEQ ID NO:24 类似物8 Asp-Arg-Val-Tyr-Leu-His-Pro-Phe SEQ ID NO:25 类似物9 Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-Arg-Pro-Phe SEQ ID NO:26 类似物10 Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Ala-Phe SEQ ID NO:27 类似物11 Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Tyr SEQ ID NO:28 类似物12 Pro-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe SEQ ID NO:29 类似物13 Asp-Arg-Pro-Tyr-Ile-His-Pro-Phe SEQ ID NO:13 类似物14 Asp-Arg-Val-Tyr(PO3)2-Ile-His-Pro-Phe SEQ ID NO:30 类似物15 Asp-Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe SEQ ID NO:31 类似物16 Asp-Arg-Val-Tyr-norLeu-His-Pro-Phe SEQ ID NO:32 类似物17 Asp-Arg-Val-homoSer-Tyr-Ile-His-Pro-Phe SEQ ID NO:33
其他特别优选的实施方案包括：
在另一个实施方案中，血管紧缩素肽可以为US20100055146中公开的 的那些的任意一种，所述的文献以引用方式全文并入本文。在多个实施方 案中，所述的多肽为：
血管紧缩素II的4,7-环化类似物(Ang(1-8))，或者本文所公开的其类似物 的任意一种；
血管紧缩素III的4,7-环化类似物(Ang(2-8))，或者本文所公开的其类似 物的任意一种；
血管紧缩素IV的4,7-环化类似物(Ang(3-8))，或者本文所公开的其类似 物的任意一种；或者
Ang(1-7)的4,7-环化类似物，或者本文所公开的其类似物的任意一种。
在另一个实施方案中，所述的方法包括给予MAS受体的激动剂。可 以使用MAS受体的任何合适的多肽或非多肽激动剂，包括但不限于：A(1-7) 及其类似物；A779(D-AlaA(1-7)；得自SigmaChemicalCo.)；以及AVE0991 (例如参见Pinheiroetal.,Hypertension.2004Oct；44(4):490-6.Epub2004 Aug23)。
用于本发明的血管紧缩素肽可以是线性的或者以任何合适的方式环 化的，例如WO2008/018792中所述的那些，包括但不限于在位置4至7 之间或者任何其他的位置上具有硫醚键的多肽。
可以使用任何合适的技术以充足方式表达或以化学方式合成血管紧 缩素肽，这些技术恰好在本领域那些技术人员的水平的范围内。
如本文所用，“治疗(动词词性)”或“治疗(名词词性)”眼睛损伤 是指完成以下的一个或多个：(a)降低眼睛损伤的严重性；(b)限制或预 防待治疗的眼睛损伤的症状特征的发展；(c)抑制待治疗的眼睛损伤的症 状特征的恶化；(d)限制或预防患者中眼睛损伤的复发，其中所述的患者 之前已经患有过所述的紊乱(多种)；以及(e)限制或预防患者中症状的 复发，其中所述的患者之前具有眼睛损伤的症状。例如根据待治疗的眼睛 的损伤，症状可以包括术后纤维化,术后炎症,术后眼内压升高,撕裂,刺 伤,目痛,眼泪比正常增多,视力模糊,对光敏感,视敏度改变和/或感觉 有异物粘在眼睛中。
所述的多肽可以以根据所有相关因素测定的任何合适的剂量给予。在 本发明的所有方面的一个实施方案中，所述的多肽或其盐基于重量(mg)/ 体积(ml)或者基于重量/重量(mg)，以浓度为大约0.001％至大约3％的药物 配制物的形式给予。在多个其他的实施方案中，所述的多肽或其盐均基于 重量(mg)/体积(ml)或者基于重量/重量(mg)，以以下浓度的药物配制物的形 式给予：大约0.005％至大约3％；大约0.01％至大约3％；大约0.05％至大 约3％；大约0.01％至大约3％；大约0.5％至大约3％；大约1％至大约3％； 大约2％至大约3％；大约0.005％至大约2％；大约0.01％至大约2％；大 约0.05％至大约2％；大约0.01％至大约2％；大约0.5％至大约2％；大约 1％至大约2％；大约0.005％至大约1％；大约0.01％至大约1％；大约0.05％ 至大约1％；大约0.01％至大约1％；大约0.5％至大约1％；大约0.005％至 大约0.75％；大约0.01％至大约0.75％；大约0.005％至大约0.75％；大约 0.01％至大约0.75％；大约0.03％至大约1％；大约0.03％至大约0.75％； 大约0.03％至大约0.3％；大约0.03％至大约0.5％；大约0.03％至大约 0.25％；大约0.03％至大约0.1％；大约0.03％至大约0.075％；大约0.03％ 至大约0.05％；以及大约0.03％至大约0.3％；或者大约0.03％或大约0.3％。
在本发明的所有方面中，所述的多肽或其盐可以通过任何合适的途径 给予，例如系统给予(包括口服给药)；优选为通过局部给予，包括但不 限于滴剂(即，处于悬液、溶液或者作为油膏)，使用绷带型角膜接触镜， 通过角膜接触镜而持续地传递，formix-基移植术，或者使用眼贴或贴眼剂。 在一个实施方案中，本发明的方法可以包括如果认为合适可以频繁地给予 局部配制物，即，每天一次，每天两次，每天三次，每天四次等。所述的 方法可以进一步包括如果主治医师认为合适可以长期给予所述的多肽或 其盐。
在本发明的所有方面的一个实施方案中，局部给予包括以配制物形式 给予，所述的配制物选自：水凝胶,乳膏,粘弹剂,软膏,糊剂,滴剂(悬 液或处于溶液中),纳米颗粒,聚合物基配制物和洗剂。所述的配制物可以 以任何合适的方式施加，如果人类患者或护理者认为合适，所述的配制物 可以包含任何传递助剂(包括但不限于绷带型角膜接触镜,角膜接触镜, formix-基移植术,眼贴或贴眼剂,压敏贴剂或眼罩等)。
在本文所述的任何实施方案或实施方案的组合的另一个实施方案中， 血管紧缩素肽可以配制用于技术人员已知的任何合适的方式的缓慢释放 或持续释放。在一个实施方案中，所述的肽可以配制成凝胶、丸剂、纳米 颗粒、聚合物传递、环糊精或者缓慢释放或持续释放配制物的任何形式， 并且可以被放置于用于缓慢释放或持续释放至受试对象中的结膜穹隆中。
在本发明的所有方面的另一个实施方案中，局部配制物基于重量(mg)/ 体积(ml)或者基于体重/体重(mg)可以包含大约1％至大约3％HEC，或者大 约2％HEC。
在本发明的所有方面中，所述的多肽或其盐可以与一种或多种以下的 试剂一起给予：(a)冷冻干燥剂；(b)表面活性剂；(c)膨胀剂；(d)张 力调节剂；(e)稳定剂；(f)防腐剂；和/或(g)缓冲剂。在一些实施方 案中，药物组合物中的缓冲剂为Tris缓冲剂、组氨酸缓冲剂、磷酸盐缓冲 剂、柠檬酸盐缓冲剂或醋酸盐缓冲剂。所述的肽可以与冷冻干燥剂一起给 予，例如蔗糖、山梨醇或海藻糖。在某些实施方案中，所述的肽可以与防 腐剂一起给予，例如杀藻胺,苯乙铵,洗必太,苯酚,间甲酚,苯甲醇,对 羟基苯甲酸甲酯,对羟基苯甲酸丙酯,氯丁醇,邻甲酚,对甲酚,氯甲酚, 硝酸苯汞,硫汞撒,苯甲酸及其多种混合物。在其他的实施方案中，所述 的肽可以与膨胀剂一起给予，例如甘氨酸。在其他的实施方案中，所述的 肽可以与表面活性剂一起给予，例如聚山梨醇酯-20,聚山梨醇酯-40,聚山 梨醇酯-60,聚山梨醇酯-65,聚山梨醇酯-80聚山梨醇酯-85,泊洛沙姆-188, 去水山梨糖醇月桂酸酯,脱水山梨醇单月桂酸酯,脱水山梨醇单硬脂酸酯, 山梨醇单油酸酯,山梨聚糖三月桂酸酯,山梨聚糖三硬脂酸酯,去水山梨 糖醇三油酸酯或它们的组合。所述的肽可以与张力调节剂一起给予，例如 使得所述的配制物与人类血液基本上是等张力的或等渗的化合物。示例性 张力调节剂包括蔗糖,山梨醇,甘氨酸,蛋氨酸,甘露醇,右旋糖,肌醇, 氯化钠,精氨酸和盐酸精氨酸。在其他的实施方案中，所述的肽可以与稳 定剂一起给予，例如当与所述的肽结合时能够基本上防止或降低所关注的 蛋白质(冻干形式或液体形式)的化学和/或物理不稳定性的分子。示例性 的稳定剂包括蔗糖,山梨醇,甘氨酸,肌醇,氯化钠,蛋氨酸,精氨酸,盐 酸精氨酸,对羟基苯甲酸酯,以及对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯 的组合。
在本发明的所有方面和实施方案中，能够与所述的多肽形成盐的合适 的酸包括但不限于：无机酸，例如盐酸,氢溴酸,高氯酸,硝酸,硫氰酸,硫 酸,磷酸等；以及有机酸，例如甲酸,乙酸,丙酸,乙醇酸,乳酸,丙酮酸, 草酸,丙二酸,琥珀酸,马来酸,富马酸,氨茴酸,肉桂酸,萘磺酸,磺胺 酸等。能够与所述的肽形成盐的合适的碱包括但不限于：无机碱，例如氢 氧化钠,氢氧化铵,氢氧化钾等；以及有机碱，例如一,二和三烷基和芳基 胺(例如三乙胺,二异丙基乙胺,甲胺,二甲胺等)和可任选地取代的乙醇 胺(例如乙醇胺,二乙醇胺等)。
所述的肽或其盐可以通过例如与聚乙二醇连接而进一步衍生，从而提 供增长的半衰期。所述的肽或其盐可以包含L-氨基酸、D-氨基酸(其在体 内对L-氨基酸的特异性蛋白酶具有抗性)、D-氨基酸与L-氨基酸的组合、 以及多种“设计”氨基酸(例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、和Nα- 甲基氨基酸等)，从而传输特定的性质。
所述的多肽可以为药物组合物中的单一的活性试剂，或者所述的组合 物可以进一步包含一种或多种适用于所需的治疗的其他活性试剂。此类其 他的活性试剂可以包括但不限于以下的一种或多种：人工泪液(例如羧甲 纤维素,羟乙基纤维素,羟丙甲纤维素,聚乙烯醇,环糊精),抗生素(例 如氯霉素,环丙沙星,庆大霉素,新霉素,多粘菌素B),抗病毒药品(例 如阿昔洛韦),抗真菌药品(例如氟康唑),止痛剂和抗炎药品(例如非 甾类抗炎药品,局部甾类化合物,环孢霉素和抗过敏药品)。
因此，在另一个方面中，本发明提供了药物组合物，其包含：
(a)血管紧缩素肽；
(b)活性试剂，其选自：人工泪液(例如羧甲纤维素,羟乙基纤维素,羟 丙甲纤维素,聚乙烯醇,环糊精),抗生素(例如氯霉素,环丙沙星,庆大 霉素,新霉素,多粘菌素B),抗病毒药品(例如阿昔洛韦),抗真菌药品 (例如氟康唑),止痛剂和抗炎药品(例如非甾类抗炎药品,局部甾类化 合物,环孢霉素和抗过敏药品)；以及
(c)药物可接受的载体。
在一个实施方案中，所述的活性试剂包含人工泪液(例如羧甲纤维素, 羟乙基纤维素,羟丙甲纤维素,聚乙烯醇,环糊精)。在另一个实施方案中， 血管紧缩素肽包含或由Nle3-A(1-7)(SEQIDNO:14)组成。
血管紧缩素肽可以根据所有相应因素测定的任何合适的剂量存在于 药物组合物中，其中所述的因素包括上文中本发明的方法中公开的那些。 药物组合物可以制备成通过任何合适的途径给予，例如系统给予(包括口 服给药)；局部给予，包括但不限于滴剂(即，处于悬液、溶液或者作为 油膏)，使用绷带型角膜接触镜，通过角膜接触镜而持续地传递，formix- 基移植术，或者使用眼贴或贴眼剂。局部药物组合物可以包含例如选自以 下的配制物：水凝胶,乳膏,粘弹剂,软膏,糊剂,滴剂(悬液或处于溶液 中),纳米颗粒,聚合物基配制物和洗剂。药物组合物可以制备成以任何合 适的方式给予，如果人类患者或护理者任何认为合适，则所述的药物组合 物可以包含任何传递助剂(包括但不限于绷带型角膜接触镜,角膜接触镜, formix-基移植术,眼贴或贴眼剂,压敏贴剂或眼罩等)。在一个实施方案 中，药物组合物基于重量(mg)/体积(ml)、或者基于重量/重量(mg)，包含含 有大约0.5％至大约4％羟乙基纤维素(HEC)的局部配制物。在多个其他 的实施方案中，局部配制物基于重量(mg)/体积(ml)、或者基于重量/重量 (mg)，可以包含大约1％至大约3％HEC，或者大约2％HEC。
药物配制物可以包含以下试剂的一种或多种：(a)冷冻干燥剂；(b) 表面活性剂；(c)膨胀剂；(d)张力调节剂；(e)稳定剂；(f)防腐剂； 和/或(g)缓冲剂，例如本发明的方法中本文所述的那些。
所述的方法可以与适用于治疗相关紊乱的其他治疗联合使用。
所述的方法和组合物可以包括以下实施例中公开的任何其他的实施 方案。此类实施方案可以与本发明的方法结合使用，除非内容中明确作出 其他的说明。
实施例
实施例1
角膜治愈不仅对于重建保护性上皮细胞是重要的，而且对于恢复角膜 透明且清晰的视觉也是重要的。角膜治愈反应取决于多种因素，包括：损 伤的类型、大小和程度；损伤试剂的性质；眼睛的状态；以及受试对象的 一般状态。最普通的角膜损伤涉及上皮细胞、前弹力层和基质前部的表面 渗透。表面角膜缺陷可以与创伤或疾病(例如营养不良,神经营养,毒性 或感染的角膜炎)有关，而且还取决于手术过程，例如上皮清创术,光性 治疗性角膜切除术,光性屈光性角膜切削术或准分子激光原位磨镶术。在 所有这些情况下，不管病因如何，主要治疗目标是促进结构恢复，并形成 最小的瘢痕，从而提供最佳可能的视力结果。已经假定并描述了多种用于 角膜治愈的机制，包括不同生长因子、它们的调节剂和受体的作用。不管 损伤的深度如何，其显示，角膜细胞总是与治愈过程有关，并且通过再生 (不形成纤维化)促进治愈仍是一种挑战。由于角膜的暴露位点和薄细性， 所以角膜表面损伤是最普通的眼科诉求，并且在患有表面损伤的患者的亚 群体中，发展成复发性糜烂。本研究的目的在于评价新的题述的药品对角 膜的上皮再形成和基质伤口愈合的作用。
动物的准备和程序：
在各过程之前，采用皮下注射盐酸氯胺酮(50-80mg/kg)和盐酸赛拉嗪 (5-9mg/kg)的混合物来麻醉兔子。准备动物以用于在灭菌条件下实施无菌 手术。使用5％聚维酮碘溶液清洁眶周区域，并将该溶液滴逐渐灌输至穹 窿中，而且使用眼撑保持眼睑张开。使用角膜刀片(角膜刀3.2mm)，按 照与人类晶状体乳化手术中相同的方式形成清晰的角膜全层隧道。为了防 止在角膜隧道形成后眼球塌陷，通过放液穿刺术向前房中注射少量的粘弹 剂。结膜下注射庆大霉素25mg和地塞米松2mg。手术后，给予镇痛。在 整个回访期间，使用1滴(大约50μl)所研究的活性药品(处于2％羟乙 基纤维素的0.03％或0.3％Nle3A(1-7)，处于0.05M磷酸盐缓冲剂中，pH 6.5)对分配至处理组中的动物进行处理，其中所述的活性药品每天逐渐灌 输至结膜囊(使用点滴器)中。另一方面，在整个回访期间，使用媒介物 (2％羟乙基纤维素，处于0.05M磷酸盐缓冲剂中，pH6.5)眼睛滴剂每天 对分配至对照组中的动物进行处理。
回访检查：
在动物如上文所述处于麻醉下时，实施这些眼科回访检查。眼前节成 像包括无红色的照片和眼前节荧光素成像(使用Spectralis(Heildelberg Engineering,Germany))，其中在将一滴10％荧光素(Akorn,AbitSprings,LA) 逐渐灌输至结膜囊中并将眼球施加轻微的压力后，取得连续地的照片。这 更常称为Seidel检验，其中将包含10％荧光素的荧光素条带局部施加在受 影响的区域上，并使用钴蓝滤片进行检查。此时，荧光素显示绿色的颜色。 荧光区域的颜色或表面的任何改变表明存在角膜渗漏。该成像数据用于评 估角膜伤口愈合的程度以及伤口渗漏的程度。使用Tonopen-AVIVA(TPA, ReichertInc.)来测量眼内压。
成像和组织学：
此外，使用涉及HeidelbergRetinaTomograph(HRT)仪器对损伤进行成 像。所述的仪器为共聚焦激光扫描检眼镜，其通过使用额外的显微透镜(其 附着在标准的透镜上)而转变成共聚焦角膜显微镜。这种额外的透镜使 HRT能够对角膜内的细胞和细胞层成像，从而允许在活着时期来评估角膜 的治愈和结构，从而详细地观察角膜的结构和病理学。
结果
在全层损伤的兔子模型中，每天向眼睛施加Nle3-A(1-7)来减少角膜愈 合的时间，如所定义，在媒介物处理的动物中，由第7天开始通过Seidel 检验发现无渗漏，而在使用活性药品(2种浓度)处理的所有动物中，到 第4天开始无渗漏。此外，通过临床观察，在眼睛的测量中，炎症/水肿降 低。当使用媒介物对动物进行处理时，在第7天时炎症/水肿持续中度状态。 在使用较低浓度的Nle3A(1-7)(0.03％)进行处理的情况下，在第7天时水 肿极为轻微。在使用较高浓度的药品(0.3％)进行处理的情况下，在手术后， 仅头5天观察到水肿。这显示出这种活性化合物降低炎症并加速角膜愈合 的独特能力。其还伴有无眼内压变化以及正常的眼底检查和荧光素血管造 影法。
此外，还通过HRT进行切口位点的评价以及组织性评价。在媒介物处 理的动物中，在切口位点处，正常角膜结构纤维化并被破坏。该观察的代 表性实例可见于下文的HRT图像中。在媒介物处理的眼睛的切口位点处， 具有大量的纤维材料沉积，其破坏了角膜的结构。在使用Nle3-A(1-7)进行 处理的条件下，伤口治愈并且所述的组织具有正常的外观和结构。这在尸 体剖检中被进一步证明(第21天)，此时收获组织并将该组织准备用于显 微评价。切口位点的苏木精和伊红染色显示在活性处理的条件下，具有正 常化的结构，并且纤维化降低(图1)。
在全层角膜切口后施加0.3％和0.03％Nle3-A(1-7)，与媒介物对照动物 相比，水肿和炎症更快速地解决，角膜伤口渗漏过程减少，以及具有正常 结构且无纤维化的治愈。更高浓度的0.3％Nle3-A(1-7)使得水肿和炎症过 程更短，并且在2个Nle3-A(1-7)组之间，所有其他参数都是相等的。
实施例2
检验原理：测定处于媒介物(2％羟乙基纤维素(HEC)，处于0.05M 磷酸盐缓冲剂，pH6.5)中的Nle3-A(1-7)对角膜治愈的作用，其中所述的 作用是通过在兔子中全层角膜切口之后，通过斜光检查、Seidel检验、共 聚焦显微镜和体内渗漏压力来测定的。
动物：雌性和雄性，色素性兔子(仅右眼)，5只/组，重5-6lbs。采 用皮下注射盐酸氯胺酮(50-80mg/kg)和盐酸赛拉嗪(5-9mg/kg)的混合物来 麻醉兔子。准备动物以用于在灭菌条件下实施无菌手术。使用5％聚维酮 碘溶液清洁眶周区域，并将该溶液滴逐渐灌输至穹窿中。使用眼撑保持眼 睑张开。使用角膜刀片(角膜刀3.2mm)，形成清晰的角膜全层切口。手 术后，给予镇痛，然后给予检验制品。在大约30分钟至1小时后，给予 抗生素油膏。
检验和参照物质、以及处理时间表：
表1
组 处理组 途径 时间表 持续时间 注意 1 0.3％Nle3-A(1-7)，处于媒介物中 结膜 OD 28天 右眼 2 0.03％Nle3-A(1-7)，处于媒介物中 结膜 OD 28天 右眼 3 媒介物对照 结膜 OD 28天 右眼
评价：
表2
结果
斜光检查：在第2天，所有动物都具有结膜分泌物或严重堵塞的眼睛。 在第4天，排泄物限于0.3％Nle3-A(1-7)组中的1只动物、0.03％Nle3-A(1-7) 组中的1只动物、以及媒介物处理眼睛组中的2只动物。在第4天，首次 在0.3％组中的所有5只高剂量动物中记录到前房(AC)形成，并且在第6 天完全形成AC。在0.03％组中，在第6天，5只动物中的4只动物具有完 全的AC，并且剩余的动物在第8天具有完全形成的AC。在媒介物组中， 在第12天首次记录100％AC的形成，并且在第14天(2周)所有动物形 成AC。
Seidel检验：在第5天，所有动物都具有阳性Seidel检验结构，例外 的是媒介物组中的3只动物，0.3％Nle3-A(1-7)组中的2只动物，以及0.03％ Nle3-A(1-7)组中的1只动物。在第10天，所有Nle3-A(1-7)处理的动物都 具有阴性的Seidel检验，同时所有媒介物处理的动物在压力下都持续具有 渗漏。此外，在第6天进行斜光检查发现在0.3％NorLeu3-A(1-7)组中的任 何动物都未观察到渗漏，并且在0.03％Nle3-A(1-7)组中的3只动物未观察 到渗漏。
体内渗漏压力：由各处理组得到的3只动物都进行了体内压力测量。 接受0.3％或0.03％Nle3-A(1-7)的动物的平均压力分别为79.3±6mmHg和 77.3±3.2mmHg。媒介物处理动物的平均压力为38.7±3.2mmHg。使用 Nle3-A(1-7)进行处理会增加治愈的强度，其取得了媒介物处理伤口的大约 2倍的压力的量，从而使Nle3-A(1-7)处理的伤口渗漏。
共聚焦显微镜(图2)：显示在每天处理1个月后，与媒介物组中所见 的粗糙的且杂乱的排列相比，在2个Nle3-A(1-7)处理组中在角膜伤口的附 近具有胶原蛋白基质片层的规则排列。
讨论和结论
在全层角膜切口后施加0.3％和0.03％Nle3-A(1-7)，比媒介物对照动物 更快地形成前房，分别在第6天、第8天和第14天。在所有的Nle3-A(1-7) 处理的动物中，第10天发生角膜治愈(其是在Seidel检验中通过水性渗 漏测量的)，并且媒介物对照动物均不具有阴性Seidel检验。
与媒介物对照动物相比，在0.3％和0.03％Nle3-A(1-7)处理后，治愈的 强度增加。在Nle3-A(1-7)处理的动物中，角膜细胞和片层的规则分布表明 角膜治愈。