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包括微生物蛋白酶变体的组合物和方法
本申请为2009年6月3日提交的，发明名称为“包括微生物蛋白酶变体的组合物和方法”的PCT申请PCT/US2009/046067的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2011年1月31日，申请号为200980130352.6。
发明领域
本发明提供枯草蛋白酶变体及包含至少一种本文所述枯草蛋白酶变体的组合物，以及使用这些变体和组合物的方法。
发明背景
丝氨酸蛋白酶是包含多种具有广泛特性和生物学功能的酶类别的羰基水解酶的一个亚型。已经对枯草蛋白酶进行了很多研究，这很大程度上是由于它们在清洁及饲料应用中的用途。另外的研究集中在能对这些酶各种应用功能产生不利影响的有害环境条件上(如：暴露于氧化剂、螯合剂、极端温度和/或pH中)。然而，本领域中仍需要能够抵抗这些不利条件并且保持或比本领域已知的那些活性具有改善的活性的酶系统。
发明概要
本发明提供枯草蛋白酶变体及包含至少一种本文所述的枯草蛋白酶变体的组合物，以及使用这些变体和组合物的方法。具体而言，本发明提供了适合于衣物清洁用途的蛋白酶变体。
本发明提供了包含至少一种修饰的枯草蛋白酶变体，其中所述至少一种修饰选自：G100C、S101D、S101H、Q103D、M124G、L126G、S132H、S161N、Q275Z和/或选自下列的至少一组修饰：
A001T/L096V/G097S/A098D/D099I，A001V/G097S/A098R/D099G，V004M/A098D/D099G，
V004M/D099R/G100S/Z100.01L，V004M/G127C/G128S/P129R，V004M/M119C/D120S，
V008I/A098G/D099R，V008I/A098N，V008I/M119C/D120G，Q010L/G097R/A098C/D099S，
K012N/A098R/D099V，K012R/G097D/A098H/D099G，A013T/S101R/Q103S，
A013V/G097N/A098H/D099G/G160S，A013V/G097S/Z097.01R/A098R，A013V/G100R/S101G，
A013V/N118G/M119I，A013V/P129Z/S130H/S132G，P014L/N062D/S101R/Q103S，
P014S/A098S/D099G，A015T/V068N/A069G，L016M/G128R/P129R/Z129.01G，
H017Q/G127R/P129G，H017Y/A098R/D099I，H017Y/A098R/D099Z/S101G，H017Y/P129R，
H017Y/S130Y/G131S/S132L，Q019H/G128R/Z128.01R/P129D，Q019H/Z128.01G/Z128.02G，
G020D/G097R/A098G/D099C，G020D/P129Z/S130G/G131R/S132C，N025Y/S101L/Q103N，
A029V/G097R/A098S，S033I/T066G/H067R/V068D/A216E，S038F/A098R/D099S，
V044I/G097C/A098D/D099G，V044I/G097R/A098R，V044I/G100S/S101G，
A045V/G097C/A098R/D099S，A048V/G097L/A098G/D099S，A048V/G100R/S101G，
A048V/G128S/P129L/Z129.01G，M050I/A098G，S053F/S130I/S132G，S053T/D099H/S101Z，
E054D/A098R/D099G，T055I/S101R/Q103R，T055S/T066I/Z066.01G/Z066.02G，
Q059H/D099S/S101G，Q059H/M119S/D120R，Q059K/M119V/V121C，Q059L/P129G，
N061D/G128R/P129V/Z129.01G，S063T/G097D/A098R/D099S，G065R/Z101.01R/Z101.02G，
T066S/H067S，V068C/A069G，V068C/A069G/H238Q，V068G/A069G，V068G/A069G/V150I，
V068G/A069S，V068I/A069G/A144V，V068I/G097D/A098G/D099Z/G100R，V068L/A069G，
V068L/A069S，V068S/A069G，V068S/A069G/A116T，A069G/T071G，A069G/T071I，
L075G/N076G/N077Z，L075R/N076G/N077Z，N076D/D099R/Z100.01G，I079F/A098G，
V081A/S101R/Q103V，V081I/G097R/A098G/D099C，V084D/G097S/A098G/D099N，
V084I/G127C/P129G，V084I/G127L，A085V/A098G，A085V/G097R/A098S/D099N，
A085V/G128S/P129R/Z129.01G，A085V/N218I，A085V/S101G，A085V/S204P，
A085V/Z099.01H/S101R，P086S/G131D/S132G，P086T/S101D/Q103S/V147I，
A088S/S101R/Q103V，A088T/A098R/D099R，A088T/D099G/Z100.01G，A088T/G127N/P129R，
A088T/G127S/P129R/Q206R/A273S，A088T/P129S/G146D，A088T/S101G，
A088T/S130R/G131H/S132N，A088V/G100Z/S101C/Q103R，A088V/P129Z，A092G/S249R，
A092G/V093C，A092G/V093I，A092G/V093L，A092L/V093G/K094Z，A092S/K094V，
A092S/V093C，A092S/V093G，A092S/V093S，A092V/V093L，V093I/G128D/P129R，V093I/P129Z，
V093R/Z093.01G/K094R，K094E/V095D，K094S/V148I，L096I/N118R/M119C/D120G/A151V，
Z096.01D/A098R，Z096.01H/A098G，Z096.01N/A098H，Z096.01R/A098C，Z096.01R/A098G，
Z096.01R/A098G/V192I，Z096.01R/A098R，Z096.01R/A098R/V192A，Z096.01R/A098S，
Z096.01R/A098S/G157S，Z096.01R/Z096.02G，Z096.01R/Z096.02G/V147I，Z096.01S/A098G，
Z096.01S/A098N，G097C/A098D/D099S，G097C/A098G/D099G，G097C/A098G/D099N，
G097C/A098G/D099S，G097C/A098G/D099S/G100Z，G097C/A098G/D099V，
G097C/A098N/D099S，G097C/A098R，G097C/A098R/D099G，G097C/A098R/D099H，
G097C/A098R/D099H，G097C/A098R/D099N，G097C/A098R/D099R，
G097C/A098R/D099R/N109D/A114S，G097C/A098S/D099H/A151V，G097C/A098V/D099S，
G097C/Z097.01G/A098H/T253I，G097C/Z097.01S/A098G，G097D/A098C，G097D/A098G/D099G，
G097D/A098G/D099R，G097D/A098H/D099R，G097D/A098H/D099V，G097D/A098R/D099G，
G097D/A098R/D099R，G097D/A098R/D099S，G097D/A098R/D099Z，G097D/G100C/S101R，
G097D/G100R/S101G，G097H/A098C/D099G，G097H/A098D/D099N，G097H/A098G，
G097H/A098G/D099G，G097H/A098G/D099R，G097H/A098G/D099Z，
G097H/A098G/D099Z/A151V，G097H/A098G/D099Z/G100R，G097H/A098G/D099Z/G100V，
G097H/A098G/D099Z/S101N/G166S，G097H/A098R，G097H/A098R/D099G，
G097H/A098R/D099L，G097H/A098R/D099N，G097H/A098S/D099G，G097H/A098S/D099I，
G097H/A098S/D099L，G097H/A098S/D099S/K237E，G097L/A098C/D099S，
G097L/A098G/D099S，G097L/A098G/D099S/G100Z，G097L/A098G/D099Z，
G097L/A098H，G097L/A098R/D099N，G097L/A098V，G097N/A098G/D099C，
G097N/A098G/D099R，G097N/A098G/D099R/V270I，G097N/A098G/D099S，
G097N/A098G/D099V，G097N/A098G/D099V/A151V，G097N/A098G/D099V/S101F，
G097N/A098H/D099N，G097N/A098R/D099R，G097N/A098R/D099S，G097N/A098R/D099V，
G097N/A098S/D099S，G097R/A098C，G097R/A098C/D099S，G097R/A098F/A200V，
G097R/A098G，G097R/A098G/D099C，G097R/A098G/D099G，G097R/A098G/D099G/A273T，
G097R/A098G/D099S，G097R/A098G/D099S/A133D，G097R/A098G/D099V，
G097R/A098H/D099C/S182N，G097R/A098H/D099G，G097R/A098N/D099G，
G097R/A098N/D099Z，G097R/A098R，G097R/A098R/D099C，G097R/A098R/D099G，
G097R/A098R/D099S，G097R/A098S/D099C，G097R/A098S/D099G，G097R/A098S/D099L，
G097R/A098S/D099R，G097R/A098S/D099S，G097R/A098S/D099V，G097R/A098V/D099G，
G097R/Z097.01H/A098C，G097R/Z097.01R/A098G，G097R/Z097.01R/A098G/V147I，
G097R/Z097.01R/A098S，G097R/Z097.01R，G097R/Z097.01S/A098G，G097R/Z097.01S/A098R，
G097S/A098C，G097S/A098C/D099G，G097S/A098C/D099H，G097S/A098C/D099L，
G097S/A098C/D099R，G097S/A098C/D099S，G097S/A098C/D099Z，G097S/A098G/D099F，
G097S/A098G/D099G，G097S/A098G/D099G，G097S/A098G/D099S，G097S/A098G/D099Z，
G097S/A098G/D099Z/G100R，G097S/A098H/D099C，G097S/A098H/D099G，
G097S/A098N/D099G，G097S/A098R，G097S/A098R/D099C，G097S/A098R/D099G，
G097S/A098R/D099L，G097S/A098R/D099V，G097S/A098R/D099Y，G097S/A098S/D099G，
G097S/A098S/D099G/A133V/A153V/S236Y，G097S/A098S/D099G/A153V，G097S/A098S/D099Z，
G097S/Z097.01D/A098G/A144T/Q271H，G097S/Z097.01G/A098V，G097S/Z097.01S/A098G，
G097S/Z097.01S/A098G/A273T，G097S/Z097.01Y，G097V/A098R，G097V/A098R/D099G，
G097V/A098S/D099S，G097Y/A098H/D099N，G097Z/A098S/D099H，Z097.01D/A098R/D099G，
Z097.01D/A098S/D099L，Z097.01D/A098V/D099G，Z097.01G，Z097.01G/A098G，
Z097.01G/A098G/D099S，Z097.01G/A098R，Z097.01G/A098R/D099C，Z097.01G/A098R/D099G，
Z097.01G/A098R/D099S，A098C/D099G，A098C/D099G/A116T，A098C/D099H，A098C/D099L，
A098C/D099L/K213R，A098C/D099L，A098C/D099N，A098C/D099R，A098C/D099S，
A098C/D099S/P194L，A098D/D099C，A098D/D099G，A098D/D099G/G100L，
A098D/D099H/G100S，A098D/D099H/H238Y，A098D/D099R，A098D/D099R/G100D，
A098D/D099R/G160S，A098F/D099S/G100L，A098G/D099C，A098G/D099G，
A098G/D099G/A228T，A098G/D099G/G100H，A098G/D099G/N243D，A098G/D099G/S101P，
A098G/D099G/T244S，A098G/D099G，A098G/D099H，A098G/D099L，A098G/D099R，
A098G/D099R/A116T，A098G/D099R/G100D，A098G/D099R/V148I，A098G/D099S，
A098G/D099S/L267M，A098G/D099V，A098G/D099Z，A098H/D099C，A098H/D099G，
A098H/D099G/A216T，A098H/D099G/G100D，A098H/D099G/G100N/L267M，
A098H/D099G/G100S，A098H/D099G/V143I，A098H/D099R，A098H/D099R/G100S，
A098H/D099S/G100C，A098H/D099S/G100N，A098H/D099Y，A098I/D099G，A098I/D099S，
A098L/D099G，A098L/D099S，A098N/D099G，A098N/D099L，A098N/D099S，A098R/A144T，
A098R/A274V，A098R/D099C，A098R/D099G，A098R/D099G/G100C，A098R/D099G/G100D，
A098R/D099G/G100L/S145T，A098R/D099G/G100N，A098R/D099G/G100R，
A098R/D099G/G100S，A098R/D099G/V150I，A098R/D099H，A098R/D099I，A098R/D099L，
A098R/D099N，A098R/D099N/G100L，A098R/D099R，A098R/D099R/G100D，
A098R/D099R/S101Z，A098R/D099R/S130F，A098R/D099R，A098R/D099S，
A098R/D099S/G100L/A153V，A098R/D099S/，A098R/D099V，A098R/D099Z/S101G，
A098R/G100C/A137T，A098R/G100S，A098S/D099C，A098S/D099G，A098S/D099G/G100C，
A098S/D099G/G100D，A098S/D099G/G100R/L250I，A098S/D099G/G100S，
A098S/D099G/Z099.01R，A098S/D099H，A098S/D099H/M124V，
A098S/D099H/Z099.01R/G169A/V180A，A098S/D099R，A098S/D099R/G100L，
A098S/D099R/G154S，A098S/D099R/G166S，A098S/D099R/Z100.01G，A098S/D099S，
A098S/D099S/Z099.01R，A098S/D099V，A098T/P129Z/S130R/S132G，A098T/S101G，
A098V/D099G，A098V/D099G/G100D，A098V/D099G/G100D/A153V，A098V/D099G/G100S，
A098Y/D099R/G100L，A098Y/D099R/G100Z/S101Z/G102D，A098Z/S101R，Z098.01N，Z098.01R，
Z098.01R/G100R，D099C/K136N，D099C/S101D，D099C/S101R，D099C/S101Z，D099C/Z099.01S，
D099C/Z100.01G，D099F/S101Z，D099G/G100C，D099G/G100D/S101R，D099G/G100H，
D099G/G100R/S101V，D099G/G100S/S101R，D099G/S101G，D099G/S101H，D099G/S101V，
D099G/S101Z，D099G/S101Z/N269D，D099G/Z099.01N，D099G/Z099.01R/G100S，
D099G/Z099.01S，D099G/Z100.01G，D099G/Z100.01G/S183N/Q275K，D099H/S101Z，
D099H/S101Z/V150I，D099H/Z100.01G/A273V，D099H/Z100.01G/Z100.02G，D099I/Z099.01S，
D099L/N118D，D099L/S101G，D099L/S101V，D099L/Z100.01G，D099N/A116T，
D099N/G100R/S101V，D099N/S101G，D099N/S101H，D099N/S101Z，D099N/Z099.01S，
D099N/Z100.01G，D099R/S101D，D099R/S101G，D099R/S101V，D099R/S101Z，
D099R/S101Z/A133T，D099R/Z099.01N，D099R/Z099.01S，D099R/Z100.01G，D099R/Z100.01N，
D099S/S101G，D099S/S101I，D099S/S101Z，D099S/Z099.01H，D099S/Z099.01L，
D099S/Z099.01V，D099S/Z100.01G，D099S/Z100.01G/Z100.02G，D099V/S101D，D099V/S101V，
D099V/S101Z，Z099.01H/S101L，Z099.01H/Z099.02R，Z099.01N/S101R，Z099.01S，
Z099.01S/S101V，Z099.01S/Z099.02G/A228T，G100D/S101G，G100D/S101R，G100H/G102V，
G100H/S101G，G100H/S101R，G100L/S101G，G100L/S101R，G100N/S101D，G100N/S101L，
G100N/S101R，G100R/L267R/I268V，G100R/S101G，G100R/S101G/G160S/S182N，
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S101R/Q103G，S101R/Q103G/A116T，S101R/Q103G/V147I/A153V，S101R/Q103G，S101R/Q103L，
S101R/Q103N，S101R/Q103R，S101R/Q103R/S161N，S101R/Q103R/V148I，S101R/Q103S，
S101R/Q103S/L126F，S101R/Q103V，S101V/Q103G，S101V/Q103H，S101V/Q103N/Z275.01K，
S101V/Q103R，S101V/Q103V，S101Y/G102S/Q103R，S101Y/Q103L，S101Y/Q103S，
S101Y/Q103V，S101Z/G102I/Q103H/Y104G/L135F，S101Z/G102V/Q103R/Y104L，S101Z/Q103D，
S101Z/Q103F，S101Z/Q103L，S101Z/Q103R，G102C/Q103L/Y104S，G102R/Q103C/Y104C/V192I，
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Z102.01G/Q103R/L267V，Z102.01G/Z102.02R/Z102.03G，Q103H/Y104N/Q275Z，Q103N/E156D，
Q103R/I122L/N123S/M124V，Q103R/Y104F，Q103Y/S182N，S105G/P129S/S130H/G131H，
W106C/A116D/N117S/N118C，N109S/M119C/D120G/V121L，A116G/N117Z/N118R/M119C，
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N117H/N118G/M119C，N117H/N118G/M119L，N117H/N118G/M119S，N117H/N118G/M119V，
N117H/N118H/M119V，N117H/N118R/M119C，N117H/N118R/M119S，N117H/N118S/M119C，
N117H/N118S/M119S，N117H/N118S/M119V，N117I/N118G/M119V，N117L/N118G/M119V，
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N117R/N118R/M119V，N117R/N118S/M119I，N117R/N118S/M119L，N117S/N118G/M119C，
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N118H/M119N/V148I，N118H/M119S/D120G，N118H/M 119V/D120G，N118R/M119C，
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N118R/M119S/D120R，N118R/M119S/D120S，N118R/M119V/D120C，N118R/M119V/D120G，
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M119V/D120S/V198L，D120G/I122C，D120G/I122C/L217S，D120G/I122G，D120G/I122V，
D120H/I122L，D120H/V121C/I122V，D120N/V121L/I122V，D120R/A151V，D120R/I122V，
D120R/V121I，D120R/V121I/I122C，D120R/V121I/I122C/A228T，D120S/I122C/A133S，
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I122V/S183G，N123C/M124S，N123C/M124V，N123S/M124L，N123S/M124S，M124C/L126S，
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G127N/P129V，G127R/A230V，G127R/P129D，G127R/P129D/L217S，G127R/P129G，
G127R/P129R，G127R/P129S，G127S/P129D，G127S/P129F，G127S/P129G，G127S/P129G/G166D，
G127S/P129G/I175T，G127S/P129R，G127S/P129S，G127S/P129V，G127V/P129G，G127V/P129R，
Z127.01G/Z127.02H/P129D，Z127.01G/Z127.02H/P129G，Z127.01G/Z127.02H/P129R，
Z127.01H/G128C/P129C/A230V，Z127.01H/P129G，Z127.01H/P129G/V148I，Z127.01H/P129R，
Z127.01N/G128C/P129V，Z127.01N/G128S/P129S，Z127.01N/G128S/P129V，Z127.01N/P129R，
Z127.01R/G128S/P129S，Z127.01R/P129G，Z127.01S/P129D，Z127.01S/P129G，Z127.01S/P129R，
G128D/P129G，G128D/P129R/Z129.01R，G 128D/P129S/G154S，G128H/P129C，
G128H/P129H/Z129.01G，G128H/P129H/Z129.01R，G128H/P129R，G128H/P129R/Z129.01G，
G128H/P129R/Z129.01R，G128H/P129S/Z129.01G，G128H/P129S/Z129.01R，
G128H/P129S/Z129.01R/S248N，G128H/P129Y，G128H/Z128.01R/P129D，
G128H/Z128.01R/P129S，G128H/Z128.01R/P129S/A144T，G128H/Z129.01R，
128N/P129R/Z129.01G，G128N/P129R/Z129.01R，G128N/P129S/Z129.01D，
G128N/Z128.01R/P129S，G128R/P129G，G128R/P129H/Z129.01G，G128R/P129L/Z130.01S，
G128R/P129R，G128R/P129R/Z129.01G，G128R/P129R/Z129.01G/A216V，G128R/P129S，
G128R/P129S/Z129.01G，128R/P129Z/S130R/S132G，G128R/Z128.01R/P129D，
G128R/Z128.01R/P129F，G128S/P129C，G128S/P129C/Z129.01R，G128S/P129D，
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G128S/P129H/Z129.01R，G128S/P129R/L209F，G128S/P129R/Z129.01G，G128S/P129S/Z129.01D，
G128S/P129S/Z129.01R，G128S/P129V，G128Y/P129R/Z129.01G，Z128.01G，Z128.01G/P129D，
Z128.01G/P129R，Z128.01G/P129S/A134T，Z128.01G/Z128.02G，Z128.01R/P129D，
Z128.01R/Z128.02G/P129S，Z128.01R/Z128.02H/P129G/G160S，Z128.01R/Z128.02R/P129D，
Z128.01Y/Z128.02H/P129R，P129C/S130C/S132Z，P129D/Z129.01G/Z129.02D/G160D，
P129D/Z129.01G/Z129.02G，P129G/G131Z，P129G/S130G/Z131.01G，P129G/S130H/S132Z，
P129G/S130R/S132Z，P129G/V270I，P129G/Z129.01G，P129G/Z129.01R/Z129.02G，
P129H/G131Z，P129H/G131Z/S132C，P129H/G131Z/S132H，P129H/S132Z，
P129H/Z130.01D/Z130.02S，P129R/G131Z/S132H，P129R/S130D/S132Z，P129R/S130N/G131Z，
P129R/S132T，P129R/S132Z，P129R/Z129.01G，P129R/Z129.01G/Z129.02G，
P129R/Z129.01G/Z129.02G/A144T，P129R/Z129.01G/Z129.02G/G146D，
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P129S/G131ZP129S/S130H/S132Z，P129S/Z129.01C，P129S/Z129.01R/Z129.02S，
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P129Z/S 130G/G131H/S132H，P129Z/S130G/G131V，P129Z/S130H，P129Z/S130H/S132G，
P129Z/S130H/S132N，P129Z/S130L，P129Z/S130R，P129Z/S130R/G131C，P129Z/S130R/G131C，
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S130F/G131S/S132V，S130F/S132V，S130G/G131D/S132C，S130G/G131H/S132D，
S130G/G131S/S132I，S130G/S132G，S130H/G131C/S132G，S130H/G131H/S132R，
S130H/G131R/S132C，S130H/G131S，S130H/G131S/S132C，S130H/S132Z，S130I/G131S/S132H，
S130I/S132G，S130N/G131S/S132C，S130R/G131R/S 132C，S130R/G131S/S132C/S161N，
S130R/S132G，S130R/S132G/S183N，S130R/S132Z，S130V/G131D/S132I，S130V/G131H/S132C，
S130V/S132N，S130V/S132Z，S130Y/G131H/S132C，S130Y/S132G，S130Z/G131H/S132H，
G131H/S132L/W241R，G131N/S132C，G131S/S132G，G131Y/S132G和A142V/G211V，其中这些位置对应于序列为SEQ ID NO：2的BPN’枯草蛋白酶的位置。
本发明也还提供了包含至少一组修饰的枯草蛋白酶变体，其中所述修饰组选自：V072G/G097A/G128A/Y217Q、
G097A/G128S/Y217Q，G097A/G128S/P129D/Y217Q，G097A/G128A/A134T/Y217Q，
M124V/L126A/Y217Q，G097A/G128A/P129D/Y217Q/A232P，G097A/G128A/P129D/Y217Q，
G097A/G128S/P129V/A134T/Y217Q，G097A/G128S/P129V/Y217Q，
V068I/G097A/G128S/P129D/Y217Q，G097A/S101D/G128S/S204F/Y217Q/S236F/T254P，
G097A/S101D/G128S/Y217Q，G097A/G128A/P129V/Y217Q，G097A/S101D/G128A/Y217Q，
G097A/S101D/G128S/P129D/Y217Q，G097A/S101D/G128A/A134T/Y217Q，
G097A/Z099.01S/A114S/G128S/Y217Q，G097A/S101D/G128A/P194L/Y217Q，
G097A/Z099.01S/G128S/Y217Q，G097A/S101D/G128A/P129D/Y217Q，
Q019R/G097A/Z099.01S/G128S/P129D/Y217Q，G097A/G100S/G128S/Y217Q，
G097A/S101D/G128S/P129V/Y217Q，G097A/Z099.01S/G128A/A134T/Y217Q，
G097A/G100S/I107V/G128S/P129D/Y217Q，G097A/G100S/G128S/Y217Q/A230V，
G097A/G100S/G128A/Y217Q/K237N，G097A/Z099.01S/G128S/P129D/Y217Q，
G097A/G100S/G128S/P129D/Y217Q，Z096.01D/G097A/A098R/G128A/Y217Q，
G097A/Z099.01S/I122S/N123G/G128A/Y217Q，
G097A/Z099.01S/I122S/N123G/G128A/Y217Q/T220A/A232T，
P005S/G097A/Z099.01S/S101D/G128A/Y217Q，G097A/S101D/G128A/P129V/Y217Q，
V093Z/K094S/V095C/L096S/G097A/G128A/Y217Q，G097A/G100S/S101D/G128A/Y217Q/A232P，
Z096.01D/G097A/A098R/S101D/G128A/Y217Q，和G097A/Z099.01S/G100S/G128A/Y217Q，
其中这些位置对应于序列SEQ ID NO：2的BPN’枯草蛋白酶的位置。
本发明进一步提供了包含至少一组修饰的枯草蛋白酶变体，其中所述修饰组选自：G097A/G128S/P129T/Y217Q、
G097A/G128A/P129S/Y217Q，G097A/G128S/P129C/Y217Q，G097A/G128S/P129Q/Y217Q，
G097A/G128S/P129E/Y217Q，G097A/P129S/Y217Q，G097A/G128S/P129A/Y217Q，
G097A/G128S/P129K/Y217Q，G097A/P129N/Y217Q，G097A/P129E/Y217Q，
G097A/G128S/P129K/G131S/Y217Q，G097A/G128S/P129R/Y217Q，
G097A/G128S/P129V/Y217Q，G097A/G128S/P129Y/Y217Q，G097A/G128A/P129R/Y217Q，
G097A/G128H/P129S/Y217Q，G097A/G128N/P129S/Y217Q/V270A，
G097A/G128S/P129L/Y217Q，G097A/P129R/Y217Q，G097A/P129W/Y217Q，
G097A/P129Z/S130A/Y217Q，G097A/G128H/P129R/Y217Q，G097A/G128H/P129T/Y217Q，
G097A/P129G/Y217Q，G097A/G128N/P129A/Y217Q，G097A/G128H/Y217Q，
G097A/G128S/P129W/Y217Q，G097A/P129Z/Y217Q，G097A/G128N/Z128.01A/P129S/Y217Q，
G097A/G128N/Y217Q，G097A/G128A/P129L/Y217Q，G097A/G128T/P129N/Y217Q，
G097A/G128H/P129A/Y217Q，G097A/G128M/P129R/Y217Q，G097A/G128Q/P129K/Y217Q，
G097A/G128T/P129Q/Y217Q，G097A/G128T/P129H/Y217Q，G097A/G128T/P129R/Y217Q，
G097A/G128D/P129E/Y217Q，G097A/G128T/P129T/Y217Q，G097A/G128T/P129A/Y217Q，
G097A/G128Z/P129Z/Y217Q，G097A/G128S/Z128.01A/P129S/Y217Q，
G097A/G128N/P129M/Y217Q，G097A/G128N/P129V/Y217Q，G097A/G128E/P129K/Y217Q，
G097A/G128N/Z128.01A/P129F/Y217Q，G097A/G128C/P129R/Y217Q，
G097A/G128T/P129M/Y217Q，G097A/G128R/Z128.01A/P129S/Y217Q，
G097A/G128S/Z128.01A/P129A/Y217Q，G097A/G128D/Y217Q，G097A/G128T/P129Y/Y217Q，
G097A/G128R/P129S/Y217Q，G097A/G128R/Z128.01A/P129T/Y217Q，
G097A/G128R/Z128.01A/P129A/Y217Q，G097A/G128T/P129W/Y217Q，
G097A/G128Y/Z128.01A/P129R/Y217Q，G097A/G128C/P129D/Y217Q，
V084L/G097A/P129Z/Y217Q，G097A/G128R/P129D/Y217Q，
G097A/G128A/Z128.01A/P129H/E195A/Y217Q，G097A/G128S/Z128.01A/P129Y/Y217Q，
G097A/G128N/P129L/Y217Q，G097A/G128C/P129H/Y217Q，
G097A/G128T/Z128.01A/P129T/Y217Q，G097A/G128C/Z128.01A/P129A/Y217Q，
G097A/G128S/Z128.01A/P129I/Y217Q，G097A/G128S/Z128.01A/P129E/Y217Q/Q271H，
G097A/G128S/Z128.01A/P129L/Y217Q，G097A/G128Y/Z128.01A/P129S/Y217Q，
G097A/G128S/Z128.01A/P129M/R186H/Y217Q，G097A/G128E/Z128.01A/P129D/Y217Q，
G097A/G128T/P129L/Y217Q，G097A/G128F/P129D/Y217Q，
G097A/G128V/Z128.01A/P129R/Y217Q，G097A/G128L/Z128.01A/P129S/Y217Q，
G097A/G128Y/P129T/Y217Q，G097A/G128C/P129Y/Y217Q，G097A/G128C/P129T/Y217Q，
其中这些位置对应于序列号为SEQ ID NO：2的BPN’枯草蛋白酶的位置。
本发明还提供了包含至少一组修饰的枯草蛋白酶变体，其中所述修饰组选自：G097A/G128A/Y217Q/M222Q、M124V/L126A/P129V/Y217Q，G128A/P129V/Y217Q，G097A/G128A/P129V/Y217Q，
N123G/P129V/Y217Q，V30I/Z096.01D/G097A/A098R/G128A/Y217Q，
Z096.01D/A098R/G128A/Y217Q，Z096.01D/A098R/M124V/L126A/Y217Q，
G097A/Z098.01S/G128A/Y217Q，Z096.01D/A098R/N123G/Y217Q，
Z096.01D/G097A/A098R/G128A/Y217Q/S236F，Z098.01S/M124V/L126A/Y217Q，
Z098.01S/G128A/Y217Q，Z096.01D/G097A/A098R/G128A/Y217Q，
V093I/Z098.01S/M124V/L126A/Y217Q，A073V/Z098.01S/N123G/Y217Q，
G065D/Z098.01S/G128A/Y217Q，I011L/Z098.01S/G128A/Y217Q，
L082F/Z096.01D/A098R/N123G/Y217Q，Z098.01S/N123G/A138V/Y217Q，和Z098.01S/N123G/Y217Q，其中这些位置对应于序列号为SEQ ID NO：2的BPN’枯草蛋白酶的位置。
本发明还提供了包含取代Y217L和至少一组上述的任一修饰组的枯草蛋白酶变体，其中的位置对应于序列号为SEQ ID NO：2的BPN’枯草蛋白酶中的位置。本发明进一步提供了包含取代G97A/G128A/Y217Q并进一步包含至少一种本文所述修饰组中任一修饰的枯草蛋白酶变体，其中的位置对应于序列号为SEQ ID NO：2的BPN’枯草蛋白酶中的位置。
本发明还提供了包含至少一种本文所述枯草蛋白酶变体的清洁组合物。在一些优选的实施方式中，该清洁组合物是衣物洗涤剂。在一些特别优选的实施方式中，该衣物洗涤剂是一种重垢液体衣物洗涤剂。在一些备选的实施方式中，该清洁组合物是一种餐具洗涤剂。在一些进一步的实施方式中，该清洁组合物进一步包括一种或多种选自下组物质的其它的酶或酶衍生物：半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶(cutinase)、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶(ligninase)、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶(pentosanase)、甘露聚糖酶(malanases)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶，或它们的混合物。在一些另外的实施方式中，该清洁组合物还包括至少一种稳定剂。在另外一些实施方式中，清洁组合物包括至少0.0001wt％的此处提供的任意枯草蛋白酶变体中的至少一种，和可选的至少一种适宜的添加剂成分。
在一些实施方式中，本发明提供了清洁方法，该方法包括如下步骤：使包括织物的表面和/或物品与至少一种本文所述清洁组合物相接触，和可选地洗涤和/或漂洗所述表面或物品。
本发明还提供了包含至少一种本发明所提供的枯草蛋白酶变体的动物饲料，以及包含至少一种本发明提供的枯草蛋白酶变体的食物加工组合物。
附图说明
图1为说明用于制备表达框内缺失和插入的方法的示意图。设计文 库，使其具有33％的克隆具有取代、33％的克隆具有插入、33％的克隆具有缺失。
图2A：pAC-FNA10的质粒图谱。质粒元件如下：pUB110＝来自质粒pUB110(McKenzie等，Plasmid15：93-103[1986])的DNA片段，pBR322＝来自质粒pBR322(Bolivar等，Gene2：95-113[1977])的DNA片段，pC194＝来自质粒pC194(Horinouchi和Weisblum，J.Bacteriol150：815-825[1982])的DNA片段
图2B提供了pHPLT-FNA的图谱。
图2C提供了pHPLT-BPN的图谱。载体pHPLT包含LAT启动子(PLAT)、编码LAT信号肽的序列(preLAT)。复制原点和neoR来自质粒pUB110。
具体实施方式
本发明提供枯草蛋白酶变体及包含至少一种此处所述枯草蛋白酶变体的组合物，还提供了应用这些变体和组合物的方法。用来产生这些变体枯草蛋白酶的本发明的蛋白酶前体修饰包括至少一个取代、至少一个缺失或至少一个插入。在一些实施方式中，所述修饰包括突变的组合。例如，在一些实施方式中，所述修饰包括至少一个取代和至少一个缺失的组合。在其它一些实施方式中，所述修饰包括至少一个取代和至少一个插入的组合。在另外一些实施方式中，所述修饰包括至少一个缺失和至少一个插入的组合。在又一些实施方式中，所述修饰包括至少一个取代、至少一个缺失和至少一个插入的组合。
产生本发明的修饰多核苷酸序列的一些适当方法是本领域已知的，包括但不限于：位点饱和诱变技术、扫描诱变技术、插入诱变技术、缺失诱变技术、随机诱变技术、定点诱变技术和定向进化技术，以及很多其它重组方法。常用的方法包括：DNA改组(参见Stemmer，Proc Natl Acad Sci U S A.25：10747-51[1994])、基于基因非同源重组的方法(例如ITCHY)(Ostermeier等，Bioorg Med Chem.7：2139-44[1999])、SCRACHY(Lutz等 Proc Natl Acad Sci USA.98：11248-53[2001])、SHIPREC(Sieber等，Nat Biotechnol.，19：456-60[2001])和NRR(Bittker等，Nat Biotechnol.，20：1024-9[2001]；Bittker等，Proc Natl Acad Sci.USA.101：7011-6[2004])以及依赖于用寡核苷酸随机插入和靶向突变、缺失和/或插入的方法(Ness等，Nat Biotechnol.20：1251-5[2002]；Coco等，Nat Biotechnol.，20：1246-50[2002]；Zha等，Chembiochem.3：34-9[2003]，Glaser等，J Immunol.，149：3903-13[1992]，Sondek和Shortle，Proc Natl Acad Sci USA 89：3581-5[1992]，等，Nucleic Acids Res.，32：e158[2004]，Osuna等，Nucleic Acids Res.，32：e136[2004]，Gaytán等，Nucleic Acids Res.，29：E9[2001]，和Gaytán等，Nucleic Acids Res.，30：e84[2002])。
在一些实施方式中，全长亲本多核苷酸被连接到适宜表达质粒上，接下来虽然也可使用其它方法，但是诱变方法的应用促进了本发明修饰蛋白酶的构建。本方法是基于Pisarchik等描述的方法(Pisarchik等，Prot.Eng.Des.Select.，20：257-265[2007])。在一些实施方式中，提供了另外的优点，其中此处使用的限制性内切酶在其识别序列的外侧切割，这使得几乎任何核苷酸序列都可以消化，并避免了限制性酶切位点疤痕的形成。首先，如此处所述，获得编码全长蛋白酶的天然发生的基因并测序，扫描寻找在一个或多个氨基酸处期望进行突变(缺失、插入、取代，或它们的组合)的一个或多个位点。为了改变基因序列使其与所需序列一致的基因突变根据公知方法通过引物延长来完成。目标突变位点左右的片段通过PCR扩增而且也包括Eam1 104I限制性酶切位点。左边和右边的片段用Eam1 104I消化，产生多个具有互补的三碱基突出端的片段，然后合并并连接这些片段产生包含一个或多个突变的经修饰序列的文库。这种方法避免了移码突变的发生。另外，由于所有的寡核苷酸能被合成以便有相同的限制位点，所以这种方法简化了诱变形成，而且不像一些其他方法那样必需合成连接物来形成限制性内切酶位点。
组合物
本发明提供蛋白酶变体及包含至少一种此处所述枯草蛋白酶变体的组合物。在一些实施方式中，本发明提供了生产有多种商业用途的蛋白酶的方法，这些商业用途需要多肽的分解或合成，包括：清洁组合物，以及饲料成分、纺织品加工、皮革整理、谷物加工、肉类加工、食物加工、蛋白质水解物制备、助消化剂、杀微生物组合物、抑菌组合物、抑真菌组合物，以及个人护理产品(如口腔护理，头发护理，和/或皮肤护理)。
本发明进一步提供了与现在所应用的枯草蛋白酶相比具有可比性或更好洗涤性能的酶组合物。
清洁组合物
本发明的清洁组合物可以有利地应用到例如洗衣用途。实际上，由于在较低温溶液中增强效果的独特优点，本发明的酶理想地适合于洗衣应用。此外，本发明的酶既可以用于粒状组合物，又可以用于液体组合物中。
本发明的蛋白酶变体也可以应用于衣物清洁添加剂产品中。在一些实施方式中，可用于低温溶液清洁用途。添加剂产品可以是其最简单形式：一种或多种蛋白酶。在一些实施方式中，添加剂包装为剂量形式，用于在清洁过程中添加。本发明还可以使用任何合适的单一剂型，包括但不限于丸剂、片剂、软胶囊或其他单一剂型单位如预先称重的粉末或液体。在一些实施方式中，包含填充剂或载体材料以增加这些组合物的体积。适当的填充剂或载体材料包括但不限于各种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐以及滑石粉、粘土之类。液体组合物的适当填充剂或载体材料包括但不限于水或低分子量一级和二级醇，包括多元醇和二醇。这些醇的例子包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施方式中，组合物包含约5％-约90％这样的材料。酸性填充剂用于降低pH。另外，清洁添加剂包括下面更全面描述的添加剂成分。
本发明的清洁组合物和清洁添加剂要求含有至少一种此处提供的有效剂量的蛋白酶变体，该蛋白酶变体单独或与其他蛋白酶和/或另外的酶组 合。通过添加本发明的一种或更多种的蛋白酶变体来达到所需的酶水平。通常本发明的清洁组合物包含至少约0.0001wt％，从约0.0001wt％到约1wt％，从约0.001wt％到约0.5wt％，或甚至含有从约0.01wt％到约0.1wt％的至少一种本发明的蛋白酶变体。
此处的清洁组合物通常是这样配制的：在含水清洁操作的应用中，洗涤水的pH值为约5.0至约11.5或甚至约7.5至约10.5。液体产品制品被通常配制成具有约为3.0至9.0或甚至约3至5的净pH值(neat pH)。粒状洗衣产品被通常配制成具有大约为9-11的pH值。控制pH在建议的使用水平的技术包括使用缓冲剂、碱、酸等，这些技术为本领域所公知。
适合的低pH清洁组合物通常具有大约为3-5的净pH，并且通常不含会在这样的pH环境中水解的表面活化剂。这些表面活化剂包括含有至少一个环氧乙烷部分或甚至大约1-16摩尔环氧乙烷的烷基硫酸钠表面活化剂。这些清洁组合物通常包含足量的pH调节剂，如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，来提供净pH大约为3-5的清洁组合物。这些组合物通常包含至少一种酸稳定的酶。在一些实施方式中，组合物是液态的，而在其它的实施方式中，它们是固态的。这种液体组合物的pH值通常测定为净pH值。这种固体组合物的pH值是通过测量所述组合物的10％固体溶液得到的pH值，所用溶剂是蒸馏水。在这些实施方式中，所有的pH测量都在20℃进行。
在一些实施方式中，当蛋白酶变体被应用于粒状组合物或液体中时，希望蛋白酶变体是包封化的颗粒形式，以在存储时保护蛋白酶变体不与该粒状组合物的其它成分混合。另外，包封化也是在清洁过程中控制蛋白酶变体有效性的一种方法。在一些实施方式中，包封化强化了蛋白酶变体和/或添加的酶的性能。在这方面，本发明的蛋白酶变体用本领域已知的任何适宜包封材料包封化。在一些实施方式中，包封材料通常至少包裹本发明蛋白酶变体的部分催化剂。通常，包封化材料是水溶性的和/或水分散性的。在一些实施方式中，包封化材料的玻璃化转变温度(Tg)为0℃或更高。在WO 97/11151中更详细地描述了玻璃化转变温度。包封化材料选 自下组中：碳水化合物、天然或合成树胶、几丁质、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡和它们的组合。当包封化材料是碳水化合物时，它通常选自单糖、寡糖、多糖及其组合。通常包封化材料是淀粉。适合的淀粉在EP 0 922 499；US 4,977,252；US 5,354,559和US 5,935,826中有描述。在一些实施方式中，包封化材料是一种塑料制成的微球，这些塑料如：热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及它们的混合物；可使用的可商购的微球包括以下所提供的：(Stockviksverken，瑞典)，和PM 6545、PM 6550、PM 7220、PM 7228、和(PQ Corp.，Valley Forge，PA)＞。
如此处所述，本发明的蛋白酶变体在衣物洗涤剂中有特殊用途。这些应用使酶承受了各种环境压力。本发明的蛋白酶变体由于它们在各种条件下的稳定性所以比很多现在应用的酶更有优势。
的确，存在涉及洗涤的蛋白酶暴露其中的多种洗涤条件，包括不同洗涤剂配方、洗涤水容量、洗涤水温度和洗涤时间长短。另外，在不同的地理区域应用的洗涤剂配方在洗涤水中的相关成分的浓度不同。例如，在洗涤水中，欧洲洗涤剂通常含有大约4500-5000ppm洗涤剂成分，而日本洗涤剂通常含有大约667ppm洗涤剂成分。在北美尤其在美国，在洗涤水中洗涤剂通常含有约975ppm的洗涤剂成分。
低洗涤剂浓度系统在洗涤水中包含的洗涤剂要少于约800ppm洗涤剂成分。通常日本洗涤剂被认为是低洗涤剂浓度系统，因为在洗涤水中它们含有大约667ppm洗涤剂成分。
中洗涤剂浓度包括在洗涤水中包含约800ppm至约2000ppm之间的洗涤剂成分的洗涤剂。通常北美洗涤剂被认为是中等洗涤剂浓度系统，因为在洗涤水中它们大约含有975ppm洗涤剂成分。巴西通常在洗涤水中含有大约1500ppm洗涤剂成分。
高洗涤剂浓度系统在洗涤水中包含的洗涤剂要大于约2000ppm洗涤剂成分。通常欧洲洗涤剂被认为是高洗涤剂浓度系统，因为在洗涤水中它 们含有大约4500-5000ppm洗涤剂成分。
拉丁美洲洗涤剂一般是高泡磷酸盐增效洗涤剂(high suds phosphate builder detergent)，而且由于在洗涤水中含有的洗涤剂成分浓度范围为1500ppm到6000ppm，所以在拉丁美洲用的洗涤剂的范围既落入中等洗涤剂浓度又落入高洗涤剂浓度范围内。如上所述，巴西通常在洗涤水中含有大约1500ppm洗涤剂成分。但是，其它高泡磷酸盐增效洗涤剂地理区域不局限于其它拉丁美洲国家，在洗涤水中可含有高至大约6000ppm洗涤剂成分的高洗涤剂浓度系统。
根据上文所述，很明显，世界范围内通常洗涤溶液中洗涤剂组合物浓度从低于约800ppm的洗涤剂组合物(低洗涤剂浓度地理区域，如在日本，约667ppm)到约800ppm和约2000ppm之间(中等洗涤剂浓度地理区域，如在美国大约975ppm，和在巴西约1500ppm)，到高于约2000ppm(高洗涤剂浓度地理区域，如在欧洲约4500ppm到约5000ppm和在高泡磷酸盐增效洗涤剂地理区域的大约6000ppm)。
通常的洗涤溶液浓度是由经验决定的。例如，在美国通常一个洗衣机容纳约64.4L洗涤溶液。相应地，为了在洗涤溶液中获得大约975ppm的洗涤剂浓度，必须添加大约62.97g洗涤剂组合物到64.4L的洗涤溶液中。这个量是消费者用与洗涤剂一起提供的量杯量取到洗涤水中的常用量。
作为另外的例子，不同的地理区域应用不同的洗涤温度。在日本的洗涤水温度通常低于在欧洲用的温度。例如，在北美和日本的洗涤水温度通常在10-30℃之间(例如大约20℃)，而在欧洲洗涤水温度通常在30-60℃(例如约40℃)。
作为另外的例子，不同的地理区域通常有不同的水硬度。水硬度通常按照每加仑混合Ca²⁺/Mg²⁺微粒数描述。硬度是水中含有的钙(Ca²⁺)和镁(Mg²⁺)量的一种量度。在美国大部分水是硬水，但是硬度不同。中等硬度水(60-120ppm)到硬水(121-181ppm)有60-181ppm的硬矿物质(百万分率ppm与每美国加仑微粒数的转换关系是：ppm值除以17.1等于每加仑微粒数的值)。

水每加仑微粒数百万分率ppm软低于1.0低于17轻度硬1.0-3.517-60中度硬3.5-7.060-120硬7.0-10.5120-180非常硬高于10.5高于180
欧洲水硬度通常高于每加仑10.5(例如10.5-20.0)个混合Ca²⁺/Mg²⁺微粒数(如大约每加仑15个混合Ca²⁺/Mg²⁺微粒数)。北美水硬度通常高于日本水硬度，但低于欧洲水硬度。例如，北美水硬度可以在3-10微粒之间、3-8微粒之间或大约6微粒。日本水硬度通常低于北美水硬度，通常低于每加仑4个混合Ca²⁺/Mg²⁺微粒数，例如3个混合Ca²⁺/Mg²⁺微粒数。
相应地，在一些实施方式中，本发明提供的蛋白酶变体至少在一套的洗涤条件(如水温度、水硬度和/或洗涤剂浓度)中表现出惊人的洗涤性能。在一些实施方式中，本发明的蛋白酶变体的洗涤性能比得上其他枯草蛋白酶。在一些实施方式中，本发明的蛋白酶变体与其他现在可商购的枯草蛋白酶相比表现出加强的洗涤性能。因此，在一些本发明优选的实施方式中，此处提供的蛋白酶变体表现出加强的氧化稳定性、加强的热稳定性和/或加强的螯合剂稳定性。另外，本发明的蛋白酶变体在不包括洗涤剂的清洁组合物中单独或与助洗剂和稳定剂组合而发挥作用。
在本发明的一些实施方式中，清洁组合物包含至少一种按组合物重量计占该组合物约0.00001wt％至约10wt％的本发明蛋白酶变体，和按组合物重量计包含清洁添加剂材料的余量(如占该组合物的约99.999wt％至90.0wt％)。在本发明的其他方面，本发明的清洁组合物包含至少一种占该组合物的约0.0001wt％至约10wt％、约0.001wt％至约5wt％、约 0.001wt％至约2wt％、约0.005wt％至约0.5wt％的蛋白酶变体，和清洁组合物的余量(如大约99.9999wt％至约90.0wt％、约99.999wt％至约98wt％、约99.995wt％至约99.5wt％)，该余量包含清洁添加剂材料。
在一些实施方式中，优选的清洁组合物除了包含一种或更多此处提供的蛋白酶变体外，还包含一种或多种提供清洁性能和/或织物护理益处的其它酶或酶衍生物。这些酶包括但不限于其他蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶(如漆酶)和/或甘露聚糖酶。
任何其他适当的蛋白酶都可用于本发明组合物中。适合蛋白酶包括那些来源于动物、植物或微生物的。在一些特别优选的实施方式中应用了微生物蛋白酶。在一些实施方式中，也包括化学或遗传修饰的突变体。在一些实施方式中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，优选的是一种碱性微生物蛋白酶或一种胰蛋白酶类蛋白酶。碱性蛋白酶的例子包括枯草蛋白酶特别是那些来源于杆菌(如枯草蛋白酶、迟缓杆菌蛋白酶(lentus)、amyloliquefaciens、Carlsberg枯草蛋白酶、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168)的。另外的例子包括那些美国专利号RE 34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628描述的蛋白酶突变体，所有这些均合并于此作为参考。另外的蛋白酶例子包括但不限于胰蛋白酶(如猪或牛来源的)和WO 89/06270描述的镰孢菌属蛋白酶。优选的可商购的蛋白酶类包括MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、和OXP(Genencor)；DURAZYM^TM、和(Novozymes)，和BLAP^TM(Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien，Duesseldorf，德国)。WO95/23221、WO 92/21760和U.S.Pat.Nos.5,801,039、5,340,735、5,500,364、5,855,625、US RE 34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628以及各种其他专利描述了各种蛋白酶类。
另外，任一适合的脂肪酶均可用在本发明中。适合的脂肪酶包括但不限于那些细菌或真菌来源的脂肪酶。本发明包含化学或遗传修饰的突变 体。适用的脂肪酶的例子包括绵毛状腐质菌(Humicola lanuginosa)脂肪酶(如：参见EP 258068和EP 305216)、米赫根毛菌(Rhizomucor miehei)脂肪酶(参见例如EP 238 023)、假丝酵母属脂肪酶例如南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如南极假丝酵母脂肪酶A或B，例如参见EP214761)、假单胞菌脂肪酶例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)和类产碱假单胞杆菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(例如参见EP218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(例如参见EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(例如参见GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌属脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)脂肪酶[Dartois等，Biochem.Biophys.Acta1131：253-260[1993])；嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)脂肪酶(参见例如JP 64/744992)；和短小芽孢杆菌(B.pumilus)脂肪酶(参见例如WO 91/16422])。
另外，在本发明的一些实施方式中，也可以使用许多克隆化的脂肪酶，其包括但不限于，卡门柏青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见Yamaguchi等，Gene103：61-67[1991])、白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见Schimada等，J.Biochem.，106：383-388[1989])和各种根霉属脂肪酶例如德氏根霉(R.delemar)脂肪酶(参见Hass等，Gene109：117-113[1991])、雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya等，Biosci.Biotech.Biochem.56：716-719[1992])和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。
在本发明的一些实施方式中可使用其他类型的脂解酶，例如角质酶，包括但不限于来自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶(参见WO 88/09367)和来自豌豆根腐镰孢菌(Fusarium solani pisi)的角质酶(参见WO 90/09446)。
另外的适宜脂肪酶包括可商购的脂肪酶，例如M1LIPASE^TM、LUMA FAST^TM和LIPOMAX^TM(Genencor)；和ULTRA(Novozymes)；和LIPASE P^TM″Amano″(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.，日本)。
在本发明的一些实施方式中，本发明的清洁组合物以添加的脂肪酶占 该组合物约0.00001wt％至约10wt％的水平进一步包含脂肪酶，和余量的按组合物重量计的添加剂材料。在本发明的其他方面中，本发明的清洁组合物还包括占该组合物约0.0001wt％至约10wt％、约0.001wt％至约5wt％、约0.001wt％至约2wt％、约0.005wt％至约0.5wt％的脂肪酶。
适用于碱性溶液中的任何淀粉酶(α和/或β)可用于本发明的一些实施方式中。适合的淀粉酶包括但不限于那些细菌或真菌来源的淀粉酶。在一些实施方式中，也包括化学或遗传修饰的突变体。用于本发明的淀粉酶包括但不限于来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α-淀粉酶(参见例如GB 1,296,839)。用于本发明的可商购淀粉酶包括但不限于和BAN^TM(Novozymes)和和P(Genencor)。
在本发明的一些实施方式中，本发明的清洁组合物以添加的淀粉酶占该组合物约0.00001wt％至约10wt％的水平进一步包括淀粉酶，和余量的按组合物重量计的清洁添加剂材料。在本发明的其他方面中，本发明的清洁组合物还包括按组合物的重量计占该组合物约0.0001wt％至约10wt％、约0.001wt％至约5wt％、约0.001wt％至约2wt％、约0.005wt％至约0.5wt％的淀粉酶。
在另外一些实施方式中，在本发明的清洁组合物中可使用任何适宜的纤维素酶。适合的纤维素酶包括但不限于那些细菌或真菌来源的纤维素酶。在一些实施方式中，也包括化学或遗传修饰的突变体。适宜的纤维素包括但不限于特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶(参见例如美国专利No.4,435,307)。特别适宜的纤维素酶是具有护色(color care)益处的纤维素酶(参见例如EP 0 495 257)。用于本发明的可商购纤维素酶包括但不限于(Novozymes)和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。在一些实施方式中，纤维素酶作为成熟野生型或变体纤维素酶的部分或片段加入到本发明的组合物中，其中该纤维素酶N末端部分缺失(参见例如美国专利No.5,874,276)。在一些实施方式中，本发明的清洁组合物以添加的纤维素酶占该组合物约0.00001wt％至约10wt％的 水平进一步包括纤维素酶，和余量的按组合物重量计的清洁添加剂材料。在本发明的其他方面中，本发明的清洁组合物还包括按组合物重量计占该组合物约0.0001wt％至约10wt％、约0.001wt％至约5wt％、约0.001wt％至约2wt％、约0.005wt％至约0.5wt％的纤维素酶。
适用于洗涤剂组合物的任何甘露聚糖酶也可用于本发明。适合的甘露聚糖酶包括但不限于那些细菌或真菌来源的甘露聚糖酶。在一些实施方式中，也包括化学或遗传修饰的突变体。用于本发明的各种甘露聚糖酶是已知的，参见例如美国专利No.6,566,114、No.6,602,842和No.6,440,991，这些专利都合并于本申请作为参考。在一些实施方式中，本发明的清洁组合物以添加的甘露聚糖酶占该组合物约0.00001wt％至约10wt％的水平进一步包括甘露聚糖酶和按组合物重量计余量的清洁添加剂材料。在本发明的其他方面中，本发明的清洁组合物还包括按组合物重量计占该组合物约0.0001wt％至约10wt％、约0.001wt％至约5wt％、约0.001wt％至约2wt％、约0.005wt％至约0.5wt％的甘露聚糖酶。
在一些实施方式中，在本发明的组合物中，过氧化物酶与过氧化氢或过氧化氢源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合使用。在一些备选的实施方式中，氧化酶与氧组合使用。这两种类型的酶用于“溶液漂白”(即，当在洗涤液体中一起洗涤织物时为了防止纺织品染料从一个染色的织物转移到另一个织物上)，优选与增强剂一起使用(参见例如WO 94/12621和WO 95/01426)。适合的过氧化物酶/氧化酶包括但不限于那些植物、细菌或真菌来源的酶。在一些实施方式中，也包括化学或遗传修饰的突变体。在一些实施方式中，本发明的清洁组合物以添加的过氧化物酶和/或氧化酶占该组合物约0.00001wt％至约10wt％的水平进一步包括过氧化物酶和/或氧化酶，和按组合物重量计余量的清洁添加剂材料。在本发明的其他方面中，本发明的清洁组合物还包含占该组合物约0.0001wt％至约10wt％、约0.001wt％至约5wt％、约0.001wt％至约2wt％、约0.005wt％至约0.5wt％的过氧化物酶和/或氧化酶。
在一些实施方式中，可使用的其它酶包括但不限于过氧水解酶 (perhydrolases)(参见例如WO 05/056782)。另外，在一些特别优选的实施方式中，包含了上述酶的混合物，特别是一种或多种其它的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或至少一种纤维素酶。实际上，可预期的是这些酶的各种混合物都可以用于本发明。本发明还包含变体蛋白酶和一种或多种其它酶的不同水平均可以独立地至约10％，清洁组合物的余量是清洁添加剂材料。清洁添加剂材料的具体选择易于通过考虑要清洁的表面、项目或织物，以及使用过程中的清洁条件所需的组合物形式来进行。
适宜清洁添加剂材料的实例包含但不限于，表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活性剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、去污聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶增溶剂、光漂剂、荧光剂、衣物柔顺剂、可水解的表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗缩剂、防皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、color speckles，银护理(silvercare)、防晦暗剂和/或防腐蚀剂、碱性源、加溶剂、载体、加工助剂、色素和pH控制剂(参见例如美国专利号Nos.6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，所有这些专利都合并于本申请作为参考)。下面详细举例说明具体清洁组合物材料的实施方式。在清洁添加剂材料与清洁组合物中本发明的变体蛋白酶不相容的实施方式中，使用了适当方法使清洁添加剂材料与蛋白酶保持分离(即，不互相接触)，直至这两种组分适宜组合时。这种分离方法包含本领域已知的任何适宜方法(例如胶丸、包封、片剂、物理分离等)。
例如，下面更加详细地说明了其中使用了本发明的变体蛋白酶的几种清洁组合物。在本发明的清洁组合物被配制成适用于洗衣机洗涤方法的组合物的实施方式中，本发明的组合物优选包含至少一种表面活性剂和至少一种助洗剂化合物，以及一种或多种清洁添加剂材料，该清洁添加剂材料优选选自有机聚合化合物、漂白剂、其它的酶、抑泡剂、分散剂、钙皂分散剂、悬污剂和抗再沉积剂和腐蚀抑制剂。在一些实施方式中，洗衣组合物还包含软化剂(即，作为附加的清洁添加剂材料)。本发明的组合物还 可使用固体或液体形式的洗涤剂添加剂产品。这样的添加剂产品是为了补充和/或增进常规洗涤剂组合物的性能，并能在清洁过程的任何阶段加入。在一些实施方式中，此处衣物洗涤剂组合物的密度在约400至约1200克/升的范围内，而在其他实施方式中，在20℃下，密度在每升组合物约500至约950克范围内。
在一些实施方式中，多种清洁组合物，例如美国专利No.6,605,458中提供的那些清洁组合物，可与本发明的变体蛋白酶一起使用。所以，在一些实施方式中，包含至少一种本发明的变体蛋白酶的组合物是致密的粒状织物清洁组合物，而在另外的实施方式中，该组合物是用于有色织物洗涤的粒状织物清洁组合物，在又一个实施方式中，该组合物是在洗涤能力之外还提供软化功能的粒状织物清洁组合物，在其它的实施方式中，该组合物是强效液体织物清洁组合物。在一些实施方式中，包含至少一种本发明的变体蛋白酶的组合物是织物清洁组合物，例如美国专利6,610,642和6,376,450中记载的那些。另外，本发明的变体蛋白酶可用于特别用于欧洲或日本洗涤条件下的粒状衣物洗涤剂组合物(参见例如美国专利6,610,642)。
本发明的清洁组合物被配制成任何适当形式，用配制者选择的任何方法制备，其非限制性实例记载于美国专利5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,565,422、5,516,448、5,489,392和5,486,303中，所有这些专利都合并于本申请作为参考。当需要低pH清洁组合物时，该组合物的pH通过加入例如单乙醇胺的物质或例如HCl的酸性物质来调节。
虽然对于本发明的目的不是必要的，下面描述的添加剂的非限制性列表适用于即溶(instant)清洁组合物。在一些实施方式中，例如，加入这些添加剂以协助或增强清洁性能以处理要清洁的基质，或者修饰清洁组合物的美感，如在这种情况下使用香料、着色剂、染料等。应理解这些添加剂是除本发明的变体蛋白酶之外而添加的。这些添加的成分的确切性质和加入的水平取决于组合物的物理形式和要使用该组合物的清洁操作的性 质。适宜的添加剂材料包括但不限于，表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、其它的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活性剂、漂白增强剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、结构弹性剂、衣物柔顺剂、载体、水溶增溶剂、加工助剂和/或色素。除了下文中的记载，其他此类添加剂的适当实例和使用水平可参见美国专利5,576,282、6,306,812和6,326,348，其通过合并于本申请作为参考。上述添加剂成分可构成本发明清洁组合物的余量。
在一些实施方式中，本发明的清洁组合物包含表面活性剂或表面活性剂系统，其中表面活性剂选自非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子型表面活性剂和它们的混合物。
在一些另外的实施方式中，本发明的清洁组合物包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂系统。助洗剂包括但不限于，多磷酸碱金属盐、多磷酸铵盐和多磷酸链烷醇铵盐、硅酸碱金属盐、碳酸碱土金属盐和碳酸碱金属盐、硅铝酸盐助洗剂聚羧酸盐化合物、醚羟基聚羧酸盐、马来酸酐与亚乙基或乙烯基甲基醚、1，3，5-三羟基苯-2，4，6-三磺酸和羧基甲氧基琥珀酸的共聚物、聚乙酸(例如乙二胺四乙酸和氨三乙酸)的各种碱金属盐、铵盐和取代的铵盐、以及聚羧酸酯，例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧二琥珀酸、聚马来酸、苯1，3，5-三羧酸、羧基甲氧基琥珀酸及其可溶性盐。
在一些其他的实施方式中，本发明的清洁组合物包含螯合剂。适当的螯合剂包含铜、铁和/或锰螯合剂及其混合物。
在又一些其他的实施方式中，本发明提供的清洁组合物包含沉积助剂。适宜的沉积助剂包含聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸盐、去污聚合物例如聚对苯二甲酸(polytelephthalic acid)、粘土例如高岭土、蒙脱石、凹凸棒土(atapulgite)、伊利石、膨润土、多水高岭石和它们的混合物。
在另外一些实施方式中，本发明的清洁组合物还包含一种或多种染料转移抑制剂。适宜的聚合染料转移抑制剂包括但不限于，聚乙烯吡咯烷酮 聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑，或它们的混合物。
在又一些另外的实施方式中，本发明的清洁组合物还含有分散剂。适当的水溶性有机材料包含均聚或共聚酸或它们的盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基集团，其通过不超过两个碳原子互相分离。
在一些特别优选的实施方式中，清洁组合物包括一种或多种提供清洁性能和/或织物护理效果的洗涤剂酶。适宜的酶的实例包括但不限于，半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶，或它们的混合物。一种典型组合是常规适用酶的混合物，包括联合至少一种淀粉酶的至少一种蛋白酶、至少一种脂肪酶、至少一种角质酶和/或至少一种纤维素酶。
在一些进一步的实施方式中，用于清洁组合物的酶用任何适用技术稳定。在一些实施方式中，通过在完成的组合物中存在水溶性钙离子和/或镁离子源，为酶提供这些离子来稳定化其中使用的酶。
在又一些另外的实施方式中，本发明的清洁组合物包括催化金属复合物。一种类型的含金属的漂白催化剂是包括具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子的催化系统，例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子，和具有很少或没有漂白催化活性的辅助金属阳离子，例如锌或铝阳离子，和对于催化和辅助金属阳离子具有限定的稳定常数的多价螯合物(sequestrate)，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐。这类催化剂公开于美国专利4,430,243中。
在一些实施方式中，此处的组合物利用锰化合物催化。这类化合物和使用水平为本领域所公知，而且包括例如美国专利5,576,282中公开的锰类催化剂。此外，用于此处的钴漂白催化剂是已知的，并记载于例如美国专利5,597,936和5,595,967中。这类钴催化剂易于通过已知方法制备，在 例如美国专利5,597,936和5,595,967中教导了这类方法。在一些实施方式中，此处提供的组合物还适于包括大多环刚性配基(macropolycyclic rigid ligand，即MRL)的过渡金属复合物。作为实用的内容，而不是为了限制，此处的组合物和清洁方法是可调节的，以在水性洗涤介质中提供至少每亿分之一级别的活性MRL物质，优选在该洗涤液中提供约0.005ppm至约25ppm，更优选约0.05ppm至约10ppm，最优选约0.1ppm至约5ppm的MRL。在本过渡金属漂白催化剂中的优选过渡金属包括锰、铁和铬。此处优选的MRL是特殊类型的超刚性配基，其被交叉桥接，例如5，12-二乙基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷。适当的过渡金属MRL易于通过已知方法制备，例如在WO 00/332601和美国专利6,225,464中所教导的方法。
如上所述，本发明的清洁组合物被配制成任何适当形式，用配制者选择的任何方法制备，其非限制性实例记载于美国专利5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,516,448、5,489,392和5,486,303中，所有这些专利都合并于本申请作为参考。
此处公开的清洁组合物可用于清洁例如表面、餐具或织物部位。通常这类部位的至少一部分接触本发明清洁组合物的一个实施方式，该组合物可以是纯组合物形式或在洗涤液中稀释，然后可选地洗涤和/或漂洗该部位。为了本发明的目的，“洗涤”包括但不限于擦洗和机械振摇。在一些实施方式中，在溶液中清洁组合物通常以约500ppm至约15000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温通常在约5℃至约90℃范围内，当上述部位包括织物时，水与织物的质量比通常在约1∶1至约30∶1的范围内。
定义
除非另外指明，本发明的实施包括属于本领域技术的普遍用于分子生物学、蛋白质工程、微生物学和重组DNA等的常规技术。这些技术为本领域技术人员所公知，并记载于许多教科书和参考著作中(参见，例如Sambrook等，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第二版(Cold  Spring Harbor)，[1989])；和Ausubel等，“Current Protocols in Molecular Biology”[1987])。此处提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，包括上文中和下文中的，都通过明确地引入本申请而作为参考。
除非另外定义，此处所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。有多种本领域技术人员可以获得并且知晓的提供这些术语定义的词典。虽然与此处描述的方法和材料相似或相同的任何方法和材料都可以用于本发明的实施，本文中还是描述了优选的方法和材料。因此，通过整体参考本说明书而更加完全地描述下面定义的术语。并且，此处使用的单数“一个”和“所述”包括其复数指代，除非另外清楚指明。数值范围包括限定范围的端点数值。除非另外说明，核酸以5′至3′的方向从左向右书写，氨基酸序列以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。应理解本发明不限于所描述的特定方法学、实验方案和试剂，因为本领域技术人员可以根据使用它们的背景而对其进行改变。
除非另外指明，本发明的实施利用了蛋白质纯化、分子生物学、微生物学、重组DNA技术和蛋白质测序的常规技术，所有这些技术都是本领域的技术。
此外，此处提供的标题不是本发明的各个实施方式或方面的限制，本发明的各个实施方式或方面可以通过整体参考说明书而获得。因此，通过参考整个说明书而更加完全地描述下面定义的术语。无论如何，为了便于理解本发明，下面定义一些术语。
此处使用的术语“蛋白酶”和“蛋白水解活性”是指呈现能够水解肽或具有肽键的底物的活性的蛋白质或肽。存在许多公知的方法来测定蛋白水解活性(Kalisz，“Microbial Proteinases”，出自Fiechter(编著)，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，[1988])。例如，蛋白水解活性可以通过比较实验来确定，该实验分析了各个蛋白酶水解商业底物的能力。用于这种蛋白酶或蛋白水解活性分析的示例性底物包括但不限于，二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)，牛胶原(Sigma C-9879)，牛弹性蛋白(Sigma  E-1625)和牛角蛋白(ICN Biomedical902111)。使用这些底物的比色测定为本领域所公知(参见，例如WO 99/34011和美国专利No.6,376,450)，其通过引入本申请作为参考。pNA方法(参见例如，Del Mar等，Anal.Biochem.，99：316-320[1979])也可用于测定在梯度洗脱过程中收集的级分的活性酶浓度。该实验测量当酶水解可溶性合成底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对-硝基苯胺(sAAPF-pNA)时的对硝基苯胺释放率。用分光光度计在410nm处测量从水解反应中产生的黄色的产生率，且其与酶活性浓度成比例。此外，可以使用280nm处的吸光度测量来测定总蛋白浓度。活性酶/总蛋白比例给出了酶的纯度。
此处使用的“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的芽孢杆菌属内的所有物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短小芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、B.halodurans、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。应承认，杆菌属还在持续进行分类学上的重新组织。所以，杆菌属包括那些已经重新分类的物种，包括但不限于例如嗜热脂肪芽孢杆菌(现在命名为Geobacillus stearothermophilus)等微生物。氧气存在下抵抗性的内生孢子被认为是芽孢杆菌属的定义性特征，虽然该特征也适用于最近命名的环脂芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、兼性芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、Filobacillus、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、解脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
术语“多核苷酸”和“核酸”，在此可以互换使用，是指任何长度核苷酸 的聚合物形式，不论是核糖核苷酸还是脱氧核糖核苷酸。这些术语包括但不限于，单链、双链或三链DNA，基因组DNA，cDNA，RNA、DNA-RNA杂合子、或包括嘌呤和嘧啶碱基的聚合物，或其他天然的、化学的、生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。下面是多核苷酸的非限制性实例：基因、基因片段、染色体片段、EST、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。在一些实施方式中，多核苷酸包括修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸，和核苷酸类似物，uracyl，其他糖和连接基团，例如氟代核糖和硫代酯(thioate)，和核苷酸分支。在备选实施方式中，核苷酸序列被非核苷酸成分所间断。
此处使用的术语“DNA构建体”和“转化DNA”可互换使用，是指用于将序列引入宿主细胞或有机体的DNA。DNA可以在体外通过PCR或任何其他本领域技术人员已知的适宜技术产生。在特别优选的实施方式中，DNA构建体包括目的序列(例如作为插入序列)。在一些实施方式中，该序列有效连接到附加的元件上，例如控制元件(如启动子等)。DNA构建体可进一步包括可选择标记物。它可进一步包括侧翼为同源盒的插入序列。在又一个实施方式中，转化DNA包括加入到末端的其他非同源性序列(例如填充序列或侧翼)。在一些实施方式中，插入序列的末端被闭合从而该转化DNA形成一个闭合的环。转化序列可以是野生型的、突变的或修饰的。在一些实施方式中，DNA构建体包括与宿主细胞染色体同源的序列。在其他实施方式中，DNA构建体包括非同源性序列。一旦DNA构建体在体外装配，其可以用于：1)将异源序列插入到宿主细胞的目的靶序列中，和/或2)诱变宿主细胞染色体的区域(即，用异源序列取代内源性序列)，3)缺失靶基因，和/或4)将复制质粒引入宿主中。
此处使用的术语“表达框”和“表达载体”是指重组产生或合成的核酸构建体，具有允许特殊核酸在靶细胞中转录的一系列特定的核酸元件。该重组表达框能够合并入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核 酸片段中。通常，表达载体的重组表达框部分除了其他序列之外还包括要转录的核酸序列和启动子。在优选的实施方式中，表达载体具有在宿主细胞中合并和表达异源DNA片段的能力。许多原核和真核表达载体可商购获得。适当表达载体的选择是本领域技术人员的常识。此处的术语“表达框”可与“DNA构建体”和它们的语法等同物互换使用。适当表达载体的选择为本领域技术人员已知。
此处使用的术语“载体”是指设计用来将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、表达框(cassettes)等。在一些实施方式中，多核苷酸构建体包括编码蛋白酶(例如前体或成熟蛋白酶)的DNA序列，其有效连接到能够影响该DNA在适宜宿主中的表达的适当前导序列(例如促进分泌的等)上。
此处使用的术语“质粒”是指用作克隆载体的环状双链(ds)DNA构建体，其在一些真核细胞或原核细胞中形成染色体外自主复制遗传元件，或整合到宿主染色体中。
在将核酸序列引入细胞的语境中，术语“引入”是指适宜于将核酸序列转移入该细胞的任何方法。这样的引入方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、结合反应(conjugation)和转导(参见，例如在Hardwood等，(编著)，Bacillus，Plenum Publishing Corp.，57-72页，[1989]中的Ferrari等的“Genetics”)。
此处使用的术语“转化的”和“稳定转化的”是指具有整合到其基因组中的，或作为保持至少两代的游离质粒的非天然(异源的)多核苷酸序列的细胞。
核酸当处于与其他核酸序列的功能关系中时，是“有效连接的”。例如，如果多肽作为参与多肽分泌的前蛋白表达，编码分泌前导序列(即信号肽)的DNA是有效连接到该多肽的DNA上的；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子是有效连接到编码序列上的；或者，如果其放置促进翻译则核糖体结合位点是有效连接到编码序列上的。一般而言，“有效连接”是指要连接的DNA序列是邻接的，在分泌前导序列的 情况下，其是邻接的而且在阅读框内。但是，增强子不一定是邻接的。通过在合宜的限制性酶切位点处连接达成连接。如果不存在这样的位点，则根据常规经验使用合成的寡核苷酸接头或连接物。
此处使用的术语“基因”是指多核苷酸(例如DNA片段)，该多核苷酸编码多肽，并包括编码区域之前和之后的区域以及在各个编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
此处使用的“同源基因”是指来自不同但是通常相关物种的成对基因、其互相对应、而且彼此相同或非常相似。该术语包含那些由物种形成(即，新物种的形成)而分离的基因(例如直向同源基因)，以及那些已经通过遗传复制而分离的基因(例如共生同源基因)。
此处使用的“直向同源物”和“直向同源基因”是指从共同的祖先基因(即同源基因)通过物种形成进化而来的在不同物种中的基因。通常，直向同源物在进化过程中保留了相同的功能。直向同源基因的鉴定用于在新测序的基因组中可靠地预测基因的功能。
此处使用的“共生同源物”和“共生同源基因”指那些通过在基因组中的复制而相关的基因。虽然直向同源基因在进化过程中保留了相同的功能，共生同源基因却进化出了新的功能，即使经常有些功能与原来的功能相关。共生同源基因的例子包括但不限于，编码胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血酶的基因，这些酶都是丝氨酸蛋白酶，而且在同样的物种中一起存在。
如果其在相同的排列中具有相同的主要二级结构，并具有相同的拓扑学连接，则此处使用的蛋白质定义为具有相同的“折叠”。具有相同折叠的不同蛋白质经常具有大小和构象不同的二级结构和转角区域的周边元件。在一些情况下，这些不同的周边区域可包括该结构的一半。一起放在同样的折叠分类中的蛋白质不一定具有共有的进化起源(例如源于有利于某些包装排列和链的拓扑学的蛋白质的物理和化学性质的结构相似性)。
此处使用的“同源”是指序列相似性或同一性，优选同一性。可以用本领域公知的标准技术测定同源性，(参见，例如Smith和Waterman，Adv. Appl.Math.，2：482[1981]；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443[1970]；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444[1988]；威斯康辛遗传软件包中的如GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA等程序(遗传计算机组，威斯康辛州麦迪逊)；和Devereux等人，Nucl.Acid Res.，12：387-395[1984])。
此处使用的“同功序列”是其中基因的功能与野生型枯草蛋白酶基因的功能基本相同的基因。并且，同功基因包括与野生型枯草蛋白酶的序列有至少约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或约100％序列同一性的序列。或者，同功序列与解淀粉芽孢杆菌中发现的基因中的枯草芽孢杆菌蛋白酶区域具有约70％至100％的对准性(alignment)。在另外的实施方式中，所述序列具有超过一个的上述性质。同功序列用已知的序列比对方法来测定。常用的比对方法是BLAST，但是如上文和下文中所述，还有其他也可以用于比对序列的方法。
使用的算法的一个例子是PILEUP。PILEUP使用累进的、配对的比对从一组相关的序列形成多个序列比对。也可以绘出表明用于形成比对的簇关系的树。PILEUP使用Feng和Doolittle(Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.，35：351-360[1987])的累进比对方法的简化方法。该方法与Higgins和Sharp(Higgins和Sharp，CABIOS5：151-153[1989])中所述的方法类似。可用的PILEUP参数包括3.00的缺省缺口权重(default gap weight)，0.10的缺省缺口长度权重和加权的末端缺口。
可用的算法的另一个例子是BLAST算法，由Altschul等所描述(Altschul等，J.Mol.Biol.，215：403-410，[1990]；和Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5787[1993])。具体可用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见Altschul等，Meth.Enzymol.，266：460-480[1996])。WU-BLAST-2使用几种研究参数，大部分设定为缺省值。可调的参数设定为下列数值：重叠跨距(overlap span)＝1，重叠分数(overlap fraction)＝0.125，字符阈值(word threshold)(T)＝11。HSP S和HSP  S2参数是动态的值，由程序本身根据具体序列的组成和目的序列所针对搜索的具体数据库的组成建立。然而，这些值可以调节以增加灵敏性。％氨基酸序列同一性值用匹配的相同残基数除以比对的区域中较长的序列的残基总数来测定。“较长”序列是在比对区域具有最多实际残基的序列(忽略为了最大化比对分值而由WU-Blast-2引入的缺口)。
因此，“核酸序列同一性百分数”定义为候选序列中与起始序列(即，目的序列)的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。优选的方法使用设定为缺省参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块，分别将重叠跨距和重叠分数设定为1和0.125。
此处使用的“重组”包括对已经通过引入异源核酸序列修饰的细胞或源自这样修饰的细胞的细胞或载体的指代。所以，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中找不到相同形式的基因，或表达那些由于有意的人为干预的结果的天然基因，否则其会异常表达、下调表达或完全不表达。“重组”(“Recombination，””recombining”)和产生“重组的”核酸一般是两个或多个核酸片段的排列，其中该排列产生了嵌合体基因。
在一些优选的实施方式中，突变的DNA序列由在至少一个密码子处的位点饱和诱变产生。在另一个优选的实施方式中，位点饱和诱变在两个或更多个密码子处进行。在一个实施方式中，突变的DNA序列与野生型序列具有超过约50％、超过约55％、超过约60％、超过约65％、超过约70％、超过约75％、超过约80％、超过约85％、超过约90％、超过约95％或超过约98％的同源性。在备选的实施方式中，突变的DNA用任何已知的诱变方法在体内产生，例如放射性照射、亚硝基胍等。然后分离需要的DNA序列，并将其用于此处提供的方法中。
此处使用的术语“扩增”和“基因扩增”是指使特定的DNA序列不成比例地复制的方法，从而该扩增的基因以比原来在基因组存在的数量更高的拷贝数存在。在一些实施方式中，在药物(例如可抑制酶的抑制剂)存在下通过生长对细胞的选择导致该药物存在时编码生长所需的基因产物的内源性基因的扩增，或者通过编码该基因产物的外源性(例如输入的)序列 的扩增来选择，或者两者兼备。
“扩增”是指涉及模板特异性的核酸复制的特定情况。它与非特异性模板复制(即模板依赖的但是不依赖于特殊模板的复制)相反。此处的模板特异性不同于复制(即合适的多核苷酸序列的合成)的保真度和核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)特异性。模板特异性经常以“靶”特异性来描述。靶序列是要与其他核酸区分意义上的“靶”。扩增技术已经首先设计用来这种区分。
此处使用的术语“引物”是指寡核苷酸，其或者是在纯化的限制性内切酶消化中天然产生的或者是合成制备的，其在诱导合成了与核酸链互补的引物延伸产物的情况下能够作为合成的起始点发挥作用(即核苷酸和诸如DNA聚合酶等诱导剂存在下，而且在适宜的温度和pH下)。为了最大扩增效率，该引物优选是单链的，但也可以是双链的。如果是双链的，在用于制备延伸产物之前先处理引物以分离其链。优选该引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长，以在诱导剂的存在下引导延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。
此处使用的术语“探针”是指寡核苷酸(即核苷酸的序列)，或者是作为纯化的限制性内切酶消化产物天然发生的，或者是合成、重组或PCR扩增制备的，其能够与另一个目的寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针用于特定基因序列的检测、鉴别和分离。设想用于本发明的任何探针都用任何“报告分子”标记，从而使其可在任何检测系统中检测到，这种标记包括但不限于酶(例如ELISA，以及基于酶的组化检测)、荧光、放射性和发光系统。这并不意味着本发明限于任何具体的检测系统或标记。
此处使用的术语“靶”当涉及聚合酶链式反应使用时，是指被用于聚合酶链式反应的引物所限定的核酸区域。所以，“靶”是要与其他核酸序列区分的。“片段”定义为在靶序列范围内的核酸的区域。
此处使用的术语“聚合酶链式反应(PCR)”是指美国专利4,683,195、4,683,202和4,965,188中的方法，其通过引入本申请作为参考，其中包括 不经克隆或纯化在基因组DNA的混合物中提高靶序列的片段浓度的方法。扩增靶序列的这种方法包括：将大大过量的两个寡核苷酸引物引入含有目的靶序列的DNA混合物中，然后在DNA聚合酶存在下进行精确顺序的热循环。这两个引物分别与双链靶序列中它们各自的链互补。为了完成扩增，将混合物变性，然后将引物退火至靶分子中它们的互补序列。退火之后，用聚合酶延伸该引物，以形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复许多次(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有许多个“循环”)，以得到高浓度的目的靶序列扩增片段。目的靶序列的扩增片段的长度决定于引物相互间的相对位置，因此，其长度是可控参数。由于该过程方面的重复，该方法被称作“聚合酶链式反应”(下面称为“PCR”)。因为靶序列的目的扩增片段成为混合物中的优势序列(指浓度方面)，因此被称为“PCR扩增的”。
此处使用的术语“扩增试剂”指除引物、核酸模版和扩增酶之外的那些扩增所需试剂(脱氧核糖核苷酸三磷酸盐、缓冲液等)。通常，扩增试剂与其他反应成分一起放入并包含于反应容器(试管、微孔等)中。
此处使用的术语“RT-PCR”是指RNA序列的复制和扩增。在该方法中，反转录与PCR联用，经常使用一种酶方法，其中使用了热稳定的聚合酶，如通过引入本申请作为参考的美国专利5,322,770中所述。在RT-PCR中，利用聚合酶的反转录活性，RNA模板转化为cDNA，然后用聚合酶的聚合活性扩增(即像在其他PCR方法中一样)。
此处使用的术语“限制性核酸内切酶”和“限制性酶”是指细菌的酶，其在特异性核苷酸序列处或附近切割双链DNA。
“限制性酶切位点”是指给定的限制性内切酶所识别和裂解的核苷酸序列，通常是DNA片段插入的位点。在本发明的某些实施方式中，限制性酶切位点被设计加入到选择性标记中，和DNA构建体的5′和3′末端中。
“同源重组”是指两个DNA分子或成对的染色体在相同或几乎相同的核苷酸序列的位点处交换DNA片段。在优选的实施方式中，染色体整合是同源重组。
此处使用的“氨基酸”涉及肽或蛋白质序列或其部分。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用。
此处使用的“目的蛋白质”和“目的多肽”是指所需的和/或要评估的蛋白质/多肽。在一些实施方式中，目的蛋白质在细胞内表达，而在其他实施方式中，目的蛋白质是分泌型多肽。在特别优选的实施方式中，这些酶包括本发明的丝氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，目的蛋白质是融合到信号肽(即在要分泌的蛋白质上的氨基末端延伸片段)上的分泌型多肽。几乎所有的分泌蛋白质使用氨基末端蛋白质延伸片段，该氨基末端蛋白质延伸片段在前体蛋白质跨膜的靶向和迁移中起决定性作用。这种延伸片段在膜转运期间或在膜转运之后立即被信号肽酶蛋白水解切除。
如果一个多核苷酸在其天然状态或用本领域技术人员已知的方法操作时能够转录和/或翻译以生产RNA、多肽或其片段，则该多核苷酸称作编码该RNA或多肽。这样的核酸的反义链也称为编码该序列。本领域已知，DNA可由RNA聚合酶转录产生RNA，但是RNA可以被逆转录酶逆转录产生DNA。因此，DNA可编码RNA，反之亦然。
“宿主株”或“宿主细胞”是指适用于包括本发明的DNA的表达载体的适宜宿主。
如果酶在细胞中以高于相应野生型细胞的表达水平表达，则该酶在宿主细胞中“过表达”。
此处术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。本公开中使用符合IUPAC-IUB生物化学命名委员会(JCBN)定义的氨基酸的三字母密码。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一个核苷酸序列编码。
“前导序列”是信号序列和成熟蛋白酶之间的氨基酸序列，前导序列对于蛋白酶的分泌是必需的。前导序列(prosequence)的裂解导致成熟的活性蛋白酶。
术语“信号序列”或“信号肽”是指核苷酸和/或氨基酸的任何序列，其可参与蛋白质的成熟形式或前体形式的分泌。信号序列的这个定义是功能性定义，意在包括由蛋白质N-末端部分基因编码的所有的氨基酸序列，其 参与蛋白质分泌的完成。它们经常但不总是结合到蛋白质的N末端部分，或前体蛋白质的N末端部分。信号序列可以是内源性的或外源性的。信号序列可以与蛋白质(例如蛋白酶)正常地相关联，或可以来自编码另一个分泌蛋白质的基因。一个示例性外源性信号序列包括枯草芽孢杆菌的枯草蛋白酶的信号序列的前七个氨基酸残基，其与来自迟缓芽孢杆菌(ATCC21536)的枯草蛋白酶的信号序列的剩余部分融合。
术语“杂合信号序列”是指其中部分序列得自表达宿主的信号序列，该信号序列与要表达的基因的信号序列融合。在一些实施方式中，使用了合成序列。
术语“成熟”形式的蛋白质或肽是指该蛋白质或肽的最终功能形式。例如，本发明的BPN’枯草蛋白酶的成熟形式至少包括与SEQ ID NO：2的1-275残基位点相同的氨基酸序列，如下所示：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQ ID NO：2)
术语“前体”形式的蛋白质或肽是指具有有效连接到蛋白质的羧基末端或氨基末端的前导序列的蛋白质的成熟形式。该前体也可具有有效连接到前导序列的氨基末端的“信号”序列。该前体还可具有附加的多核苷酸，该附加的多核苷酸在翻译后活性中涉及(例如从中裂解以留下成熟形式蛋白质或肽的多核苷酸)。
“天然发生的酶”涉及具有与自然中发现的序列相同的未修饰的氨基酸序列的酶。天然发生的酶包括天然酶、天然表达的酶或在特殊微生物中发现的酶。
术语“来源于”和“得自”不仅是指所描述的微生物菌株生产的或可生产的蛋白酶，还指从该菌株分离的DNA序列编码、并在含有该DNA序列的宿主微生物中生产的蛋白酶。另外，该术语是指合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码的蛋白酶，其具有所描述的蛋白酶的相同特征。
该定义范围内的“衍生物”一般保留野生型、天然或亲本形式中观察到的特征蛋白水解活性，其保留程度为该衍生物可用于与野生型、天然或亲本形式相似的目的。丝氨酸蛋白酶的功能性衍生物包括天然发生的、合成的或重组制备的肽或肽片段，其具有本发明的丝氨酸蛋白酶的一般特征。
术语“功能性衍生物”是指具有编码丝氨酸蛋白酶的核酸的功能性特征的核酸衍生物。编码本发明的丝氨酸蛋白酶的核酸的功能性衍生物包括天然发生的、合成的或重组制备的核酸或片段，并编码本发明表征的丝氨酸蛋白酶。编码本发明的丝氨酸蛋白酶的野生型核酸包括基于本领域已知的遗传密码简并性的天然发生的等位基因和同源基因。
在两个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同的”是指这两个序列中的残基当最大相关性比对时是相同的，如用下列序列比较或分析算法之一测量所得。
术语“最优比对”是指得到最高同一性百分比分数的比对。
“序列同一性百分比”、“氨基酸序列同一性百分比”、“基因序列同一性百分比”和/或“核酸/多核苷酸序列同一性百分比”对于两个氨基酸、多核苷酸和/或基因序列(如果适宜)而言，是指当这些序列最优比对时这两个序列中相同的残基的百分比。所以，80％氨基酸序列同一性是指两个最优比对的多肽序列中氨基酸的80％是相同的。
因此在两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本相同”是指用程序或算法(例如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)以标准参数与参考序列比较，包含至少约70％序列同一性、优选至少约75％、优选至少约80％、优选至少约85％、优选至少约90％、优选至少约95％、优选至少约97％、优选至少约98％和优选至少约99％序列同一性的多核苷酸或多肽。两个多肽基本相同的一个指征是第一多肽与第二多肽可免疫性交叉反应。通常，通过保守氨基酸置换而不同的多肽可免疫性交叉反应。因此，例如当两个肽仅仅由于保守置换而不同时，该多肽与第二多肽基本相同。两个核酸序列基本相同的另一个指征是这两个分子在严格条件下(例如在中等至高度严格条件范围内)可互相杂交。
在该上下文中短语“等同物”是指能够在中等至最大严格条件下与具有SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的丝氨酸蛋白酶。例如，等同物是指包括与SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的成熟枯草蛋白酶具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％和/或至少约99％序列同一性的等同成熟丝氨酸蛋白酶。
术语“分离的”或“纯化的”是指从其原始环境(例如如果是天然发生的则指天然环境)移出的材料。例如，当在特定的组合物中以比天然发生或野生型有机体中存在的浓度更高或更低的浓度存在时，或者与在天然发生或野生型有机体表达时不是正常存在的成分共存时，该物质称为“纯化的”。例如，存在于活的动物中的天然发生的多核苷酸或多肽不是分离的，但是从天然系统的一些或所有共存物质中分离出来的同样的多核苷酸或多肽，则是分离的。在一些实施方式中，这样的多核苷酸是载体的一部分，和/或这样的多核苷酸或多肽是组合物的一部分，而且如果这样的载体或组合物不是其天然环境的一部分，则这样的多核苷酸或多肽是分离的。在优选的实施方式中，核酸或蛋白质被称为纯化的，例如，如果其在电泳凝胶或印迹法中基本呈现一条带。
术语“分离的”当用于DNA序列时，是指已经从其天然遗传环境移出，因此不含其他外部的或不需要的编码序列的DNA序列，而且是处于适用于基因工程化蛋白质生产系统的形式。这种分离的分子是从其天然环境分离出来的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子不含它们通常相关的其他基因，但是可包括天然发生的5′和3′未翻译区域，例如启动子和终止子。相关区域的鉴定为本领域技术人员已知(参见例如Dynan和Tijan，Nature316：774-78[1985])。术语“分离的DNA序列”也可称为“克隆的DNA序列”。
术语“分离的”当指蛋白质时，是指在不是其天然环境的条件下发现的蛋白质。在优选的形式中，分离的蛋白质基本不含其他蛋白质，特别是其 他同源蛋白质。分离的蛋白质用SDS-PAGE测定为高于约10％纯，优选高于约20％纯，更优选高于约30％纯。本发明的进一步的方面包括高度纯化形式的蛋白质(即，高于约40％纯、高于约60％纯、高于约80％纯、高于约90％纯、高于约95％纯、高于约97％纯、和甚至高于约99％纯)，其纯度用SDS-PAGE测定。
此处使用的术语“组合诱变”是指其中产生起始序列变体文库的方法。在这些文库中，变体包括一个或几个选自预先定义突变组中的突变。此外，该方法提供了引入随机突变的手段，这些随机突变不是预先定义的突变组中的成员。在一些实施方式中，该方法包括2000年10月26日申请的序列号为09/699.250美国专利申请中提及的那些，该专利申请通过引入本申请作为参考。在备选的实施方式中，组合诱变方法包括可商购的试剂盒(例如Multisite，Stratagene，San Diego，CA)。
此处使用的术语“突变体文库”是指基因组中大部分都相同但是包括一个或多个基因的不同同源物的细胞群。例如可以使用这样的文库来鉴别具有改良特性的基因或操纵子。
此处使用的术语“起始基因”是指编码要用本发明改良和/或改变的目的蛋白质的目的基因。
此处使用的术语“多序列比对(MSA)”是指用算法(例如Clustal W)比对的起始基因的多个同源物的序列。
此处使用的术语“共有序列”和“规范序列”是指所有的特定蛋白质或目的序列的变体与之相比较的基础(archetypical)氨基酸序列。该术语还涉及列出了最经常存在于目的DNA序列中的核苷酸的序列。对于基因的每个位点，共有序列给出了在MSA的该位置中丰度最高的氨基酸。
此处使用的术语“共有突变”是指起始基因和共有序列的序列之间的区别。共有突变通过比较起始基因的序列和得自MSA的共有序列来鉴别。在一些实施方式中，共有突变被引入到起始基因中，以使其与共有序列更相似。共有突变还包括在与氨基酸在起始基因中的频率相比，在该位置将起始基因中的氨基酸改变为MSA中更频繁出现的氨基酸的氨基酸改变。 因此，术语共有突变包括用比MSA中的氨基酸丰度更高的氨基酸取代起始基因中的该氨基酸的所有的单个氨基酸改变。
此处使用的术语“增强的组合共有诱变文库”是指基于CCM诱变和筛选较早的轮中得到的筛选和/或测序结果来设计和构建的CCM文库。在一些实施方式中，增强的CCM文库基于CCM早期的轮中得到的初始结果的序列。在另外的实施方式中，设计增强的CCM以使其偏向于在早期诱变和筛选轮中得到的初始结果中频繁观察到的突变。在优选的实施方式中，这通过省略与较早期CCM文库中使用的其他引物相比编码降低了性能的突变的引物或提高与较早期CCM文库中使用的其他引物相比编码增强了性能的突变的引物来实现。
此处使用的术语“降低了性能的突变”是指组合共有诱变文库中这样的突变，其与未筛选的组合共有诱变文库相比，在筛选结果中以更小频率发现。在优选的实施方式中，筛选过程去除和/或降低了包含“降低性能的突变”的变体的丰度。
此处使用的术语“功能性检测”是指提供蛋白质活性指征的检测。在特别优选的实施方式中，该术语是指其中分析蛋白质以其通常容量行使其功能的能力的检测系统。例如，对于酶，功能性检测涉及测定酶在催化反应中的有效性。
此处使用的术语“靶性质”涉及要改变的起始基因的性质。不应理解为本发明限于任何具体的靶性质。但是，在一些优选的实施方式中，靶性质是基因产物的稳定性(例如耐变性、蛋白水解或其他降解因素)，而在其他实施方式中，改变了在生产宿主中的生产水平。实际上，可预期的是起始基因的任何性质都可以用于本发明。
此处使用的术语“性质”或其语法上等同物在核酸的上下文中是指能够选择或检测的核酸的任何特性或属性。这些性质包括但不限于：影响与多肽结合的性质、赋予在包含特殊核酸的细胞上的性质、影响基因转录的性质(例如启动子强度、启动子识别、启动子调节、增强子功能)、影响RNA加工的性质(例如RNA剪接、RNA稳定性、RNA构象和转录后修 饰)、影响翻译的性质(例如水平、调节、mRNA与核糖体蛋白质的结合、翻译后修饰)。例如，核酸的转录因子、聚合酶、调节因子等的结合位点可以改变，以产生所需的特性或鉴别不想要的特性。
此处使用的术语“性质”或其语法上等同物在多肽(包括蛋白质)的上下文中是指能够选择或检测的多肽的任何特性或属性。这些性质包括但不限于：氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、碱稳定性、pH活性谱、耐蛋白水解降解性、K_M、k_cat、k_cat/k_M比例、蛋白质折叠、诱导免疫应答、结合配体的能力、结合受体的能力、分泌的能力、呈现于细胞表面的能力、寡聚化的能力、信号能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞增殖的能力、诱导凋亡的能力、通过磷酸化或糖基化而得到修饰的能力和/或治疗疾病的能力等。
术语“修饰的序列”和“修饰的基因”在此处可互换使用，是指包括天然发生的核酸序列的缺失、插入或中断的序列。在一些优选的实施方式中，修饰序列的表达产物是截短的蛋白质(例如，如果该修饰是缺失或序列的中断的话)。在一些特别优选的实施方式中，截短的蛋白质保持了生物学活性。在备选的实施方式中，修饰序列的表达产物是延长的蛋白质(例如包含向核酸序列中的插入的修饰)。在一些实施方式中，插入导致截短的蛋白质(例如当插入导致终止密码子形成时)。所以，插入可导致或者截短的蛋白质或者延长的蛋白质作为表达产物。
此处使用的术语“突变序列”和“突变基因”可以互换使用，是指在宿主细胞的野生型序列中发生至少一个密码子的改变的序列。突变序列的表达产物是具有相对于野生型改变了氨基酸序列的蛋白质。表达产物可具有改变的功能性能力(例如增强的酶活性)。
术语“诱变引物”或“诱变寡核苷酸”(此处可互换使用)是指对应于模板序列的一部分的寡核苷酸组合物且其能够与模板序列杂交。对于诱变引物来说，引物不会精确地与模板核酸匹配，引物的错配用来引入所需的突变至核酸文库中。此处使用的“非诱变引物”或“非诱变寡核苷酸”是指与模板核酸精确匹配的寡核苷酸组合物。在本发明的一个实施方式中，仅仅使 用了诱变引物。在本发明的另一个优选的实施方式中，设计引物以使得至少一个区域包括诱变引物，在寡核苷酸混合物中还具有非诱变引物。通过加入诱变引物和对应于至少一个诱变引物的非诱变引物，有可能生产其中存在多种组合突变模式的核酸文库结果。例如，如果想要突变核酸文库中的一些成员在某些位置上保持它们的前体序列，而其他成员在这些位点上突变的话，对给定残基，非诱变引物提供了在核酸文库中得到特定水平的非突变成员的能力。本发明的方法使用突变和非突变寡核苷酸，其长度通常在10-50碱基，更优选约15-45个碱基。但是，使用或者短于10个碱基或长于50个碱基的引物得到想要的诱变结果可以是必须的。对于相应的诱变和非诱变引物，不一定加入相同长度的相应寡核苷酸，只要是在对应于待加入的突变的区域有重叠即可。可以根据本发明以预先定义的比例加入引物。例如，如果想要得到的文库在相同或不同位点具有显著水平的某些特定突变和较少量的不同突变，通过调节加入的引物的量，有可能产生所需的偏好文库。或者，通过加入更少或更多量的非诱变引物，有可能调节相应突变在突变核酸文库中产生的频率。
此处使用的短语“邻接突变”是指在相同的寡核苷酸引物中存在的突变。例如，邻接突变可互相毗邻或靠近，但是他们将通过相同的引物引入到得到的突变模板核酸中。
术语“野生型序列”和“野生型基因”在此处可以互换使用，是指在宿主细胞中天然的或天然产生的序列。在一些实施方式中，野生型序列是指蛋白质工程项目的起始点的目的序列(即亲本序列)。野生型序列可以编码同源的或异源的蛋白质。同源蛋白质是没有干预的情况下宿主细胞产生的蛋白质。异源蛋白质是宿主细胞不会产生除非有干预的情况才会产生的蛋白质。
此处使用的术语“蛋白酶变体”、“枯草蛋白酶变体”、“枯草蛋白酶的变体”是指与用作蛋白质工程的起始点的野生型枯草蛋白酶或亲本蛋白酶(例如枯草蛋白酶)相似的蛋白酶。这些变体与野生型或其他亲本在功能上相似，但是在其氨基酸序列上具有突变，这使其在序列上不同于野生型 或亲本蛋白酶(例如枯草蛋白酶)。
除非另外说明，氨基酸位置的数是指那些为SEQ ID NO：2的成熟解淀粉芽孢杆菌枯草蛋白酶序列指定的位置数。但是本发明不限于这种特殊枯草蛋白酶的突变，而扩展至包含在“等同”于解淀粉芽孢杆菌枯草蛋白酶中特别鉴定的残基的位点处的氨基酸残基的前体蛋白酶。
此处使用的术语“修饰”和“突变”是指氨基酸序列中的任何改变或变化。该术语是要包括在目的氨基酸序列(例如枯草蛋白酶序列)中氨基酸侧链的取代、缺失、插入和/或置换。该术语还包括目的氨基酸序列(例如枯草蛋白酶序列)的化学修饰。
术语“氧化稳定”是指本发明的蛋白酶在蛋白水解、水解、清洁或本发明的其他过程中(例如当暴露于或接触漂白剂或氧化剂过程中)的通行的(prevailing)条件下在给定的时间段后保持特定量的酶活性。在一些实施方式中，蛋白酶在接触漂白剂或氧化剂给定的时间段之后，例如至少约1分钟、约3分钟、约5分钟、约8分钟、约12分钟、约16分钟、约20分钟等之后，保持至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的蛋白水解活性。在一些实施方式中，该稳定性如实施例中所述测量。
术语“螯合剂稳定”是指本发明的蛋白酶在蛋白水解、水解、清洁或本发明的其他过程中(例如当暴露于螯合剂或与其接触的过程中)的通行条件下在给定的时间段后保持特定量的酶活性。在一些实施方式中，蛋白酶在接触螯合剂给定的时间段之后，例如至少约10分钟、约20分钟、约40分钟、约60分钟、约100分钟等之后，保持至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％蛋白水解活性。在一些实施方式中，如实施例中所述测定螯合剂稳定性。
术语“热稳定”(“thermally stable”和“thermostable”)是指本发明的蛋白酶在蛋白水解、水解、清洁或本发明的其他过程中(例如当暴露于改变的温度过程中)的通行条件下暴露于指定温度给定的时间段后保持特 定量的酶活性。改变的温度包括升高或降低的温度。在一些实施方式中，蛋白酶在暴露于改变的温度一给定的时间段之后，例如至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等之后，保持至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％蛋白水解活性。在一些实施方式中，如实施例中所述测定热稳定性。
术语“增强的稳定性”在涉及氧化、螯合剂、热和/或pH稳定的蛋白酶时，是指与其他丝氨酸蛋白酶(例如枯草蛋白酶)和/或野生型酶比较，随时间推移保持更高的蛋白水解活性。
术语“减小的稳定性”在涉及氧化、螯合剂、热和/或pH稳定的蛋白酶时，是指与其他丝氨酸蛋白酶(例如枯草蛋白酶)和/或野生型酶比较，随时间推移保持更低的蛋白水解活性。
术语“清洁活性”是指在蛋白水解、水解、清洁或本发明的其他过程中的通行条件下，用该蛋白酶达到的清洁性能。在一些实施方式中，清洁性能通过利用针对酶敏感的污渍(例如草、血液、奶或卵蛋白)的多种清洁检测来测定，如在将这些污渍进行标准洗涤之后用各种色谱、分光光度测量或其他定量方法测定这些污渍。示例性检测包括但不限于，WO 99/34011和美国专利6,605,458(其通过引入本申请作为参考)，以及实施例中包括的那些方法中记载的那些检测。
术语蛋白酶的“清洁有效量”是指在具体清洁组合物中达到所需酶活性水平的前述蛋白酶的量。这种有效量容易由本领域普通技术人员确定，并且基于许多因素，例如所使用的特殊蛋白酶、清洁用途、清洁组合物中的特定组合物、和需要液体还是干的(例如粒状、棒状)组合物等。
此处使用的术语“清洁添加剂材料”是指为具体类型的所需清洁组合物和产品形式(例如液体、粒状、粉末、棒状、糊状、喷雾、片剂、凝胶或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料也优选与组合物中使用的蛋白酶相容。在一些实施方式中，粒状组合物是“紧密的”形式，而在其他实施方式中，液体组合物是“浓缩”形式。
在清洁活性的上下文中术语“增强的性能”是指对于某些酶敏感的污渍更高或提高的清洁活性，污渍诸如蛋、奶、草或血液，清洁活性在标准洗涤循环和/或多个洗涤循环之后用通常的评价方法测定。
在清洁活性的上下文中术语“下降的性能”是指对于某些酶敏感的污渍下降或更低的清洁活性，污渍诸如蛋、奶、草或血液，清洁活性在标准洗涤循环之后用通常的评价方法测定。
在清洁活性的上下文中术语“相当的性能”是指相当的枯草蛋白酶(例如可商购的蛋白酶)的至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的清洁活性，相当的枯草蛋白酶包括但不限于OPTIMASE^TM蛋白酶(Genencor)、PURAFECT^TM蛋白酶产品(Genencor)、SAVINASE^TM蛋白酶(Novozymes)、BPN的变体(参见例如美国专利Re 34,606)，RELASE^TM、DURAZYME^TM、EVERLASE^TM、KANNASE^TM蛋白酶(Novozymes)、MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、PROPERASE^TM蛋白酶(Genencor；还参见美国专利Re 34,606和美国专利5,700,676；5,955,340；6,312,936；和6,482,628)，以及迟缓芽孢杆菌变体蛋白酶产品(例如记载于WO 92/21760、WO 95/23221和/或WO 97/07770中的蛋白酶)。
可以通过将本发明的蛋白酶与那些枯草蛋白酶在各种清洁检测中比较来测定清洁性能，这些清洁检测涉及酶敏感性污渍，例如草、血液或奶，在标准洗涤循环条件之后用通常的分光光度测量或分析方法进行测定。
此处使用的“清洁组合物”和“清洁配方”是指用于从待清洁的物品(例如织物、餐具、接触镜、其他固体物质、头发(洗发水)、皮肤(肥皂和乳膏)、牙齿(漱口药、牙膏)等)上去除不想要的化合物的组合物。该术语包括为所需的具体类型的清洁组合物和产品形式(例如液体、凝胶、粒状或喷雾组合物)选择的任何材料/化合物，只要该组合物与该组合物中使用的过氧化氢酶(perhydrolase)和其他酶相容。清洁组合物材料的具体选择易于通过考虑要清洁的表面、物品或织物，以及使用过程中的清洁条件所需的组合物形式来进行。
该术语还涉及适用于清洁、漂白、消毒和/或灭菌任何物体和/或表面 的任何组合物。该术语意在包括但不限于洗涤剂组合物(例如液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁配方，例如用于玻璃、木材、陶瓷和金属柜台顶部和窗口的清洁配方；地毯清洁剂；烘箱清洁剂；织物清新剂；织物柔顺剂；和纺织品和衣物预除污剂，以及餐具洗涤剂)。
实际上，除非另外指明，此处使用的术语“清洁组合物”包括：粒状或粉末形式的通用的或强效(heavy duty)洗涤剂，特别是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊形式的通用洗涤剂，特别是所谓的强效液体型(HDL)；液体精细织物洗涤剂；餐具手洗洗涤剂或轻效型餐具洗涤剂，特别是那些高泡沫型的；机器餐具洗涤剂，包括家用和公共机构用的各种片剂、粒状、液体和助漂洗型的；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗型、清洁棒、漱口水、假牙清洁剂、汽车或地毯香波、浴室清洁剂；洗发水和洗发剂；沐浴凝胶和泡沫浴和金属清洁剂；以及清洁助剂，例如漂白添加剂和“去污棒(stain-stick)”或预处理型添加剂。
此处使用的术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配方”指要在清洁弄脏的物品的洗涤介质中使用的混合物。在一些优选的实施方式中，该术语指用于洗涤织物和/或衣服(例如“衣物洗涤剂”)。在备选的实施方式中，该术语指其他洗涤剂，例如用于清洁盘碟、餐具等(例如“餐具洗涤剂”)。这并不意味着本发明限于任何具体的洗涤剂配方或组合物。实际上，除了过氧化氢酶，该术语涵盖了包含表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白活性剂、上蓝剂和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂和增溶剂。
此处使用的“织物清洁组合物”包括手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，包括洗衣添加剂组合物和适用于浸湿和/或预处理弄脏的织物(例如布、亚麻布和其他纺织材料)的组合物。
此处使用的“非织物清洁组合物”包括非纺织品(即织物)表面清洁组合物，包括但不限于餐具洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物和个人清洁组合物。
此处清洁组合物的“紧密”形式由密度来最好地反映，就组合物而言，用无机填料盐的量反映。无机填料盐是粉末形式洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐以通常占总组合物重量约17wt％至约35wt％的实际量存在。相反，在紧密的组合物中，填料盐在不超过约15％总组合物的量存在。在一些实施方式中，填料盐以不超过组合物重量的约10％或更优选约5％的量存在。在一些实施方式中，无机填料盐选自碱金属和碱土金属的硫酸盐和氯化物盐。优选的填料是硫酸钠。
此处使用的术语“表面活性剂”是指在本领域中通常鉴别为具有表面活化性质的任何化合物。表面活性剂通常包括此处进一步描述的阴离子、阳离子、非离子和两性离子化合物。
实验
在下列实施例中更加详细地描述本发明，这些描述并不以任何方式限制本发明要求保护的范围。附图应被看做申请文件和本发明说明书的整个的一部分。提供下列实施例仅仅为了解释本发明，而不是要限制要求保护的本发明。
在下面的实验公开中，使用了下列缩写：PI或Pi(性能指数)、ppm(百万分之一)；M(摩尔每升)；mM(毫摩尔每升)；μM(微摩尔每升)；nM(纳摩尔每升)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；pg(皮克)；L(升)；ml和mL(毫升)；μl和μL(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；h(s)和hr(s)(小时)；℃.(摄氏度)；QS(足量)；ND(未做)；NA(不适用)；rpm(每分钟转数)；H₂O(水)；dH₂O(去离子水)；HCl(盐酸)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；cDNA(复制或互补DNA)；DNA(脱氧核糖核酸)；ssDNA(单链DNA)；dsDNA(双链DNA)；dNTP(脱氧核糖核苷酸三磷酸)；RNA(核糖核酸)；MgCl₂(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；w/v(重量体积比)；v/v(体积体积比)；g(重力)；OD(光密度)；Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(DPBS)；SOC(2％细菌用胰蛋白胨、0.5％细菌用酵母提取物、 10mM NaCl、2.5mM KCl)；极品肉汤培养基(TB；12g/l细菌用胰蛋白胨、24g/l甘油、2.31g/l KH₂PO₄和12.54g/l K₂HPO₄)；OD₂₈₀(280nm处的光密度)；OD₆₀₀(600nm处的光密度)；A₄₀₅(405nm处的吸光度)；Vmax(酶催化反应的最大初始速度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；PBS(磷酸盐缓冲盐[150mM NaCl、10mM磷酸钠缓冲剂、pH7.2])；PBST(PBS+0.25％20)；PEG(聚乙二醇)；PCR(聚合酶链式反应)；RT-PCR(逆转录PCR)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N-[2-乙烷磺酸])；HBS(HEPES缓冲盐)；Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸)；Tricine(N-[三-(羟甲基)-甲基]-甘氨酸)；CHES(2-(N-环-己基氨基)乙烷-磺酸)；TAPS(3-{[三-(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙基磺酸)；CAPS(3-(环己基氨基)-丙烷-磺酸；DMSO(二甲基亚砜)；DTT(1，4-二硫代-DL-苏糖醇)；SA(介子酸(s，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)；TCA(三氯乙酸)；Glut和GSH(还原型谷胱甘肽)；GSSG(氧化型谷胱甘肽)；TCEP(三[2-羧乙基]膦)；Ci(居里)；mCi(毫居里)；μCi(微居里)；HPLC(高压液相层析)；RP-HPLC(反相高压液相层析)；TLC(薄层层析)；MALDI-TOF(基质辅助的激光解吸/电离飞行时间)；Ts(甲苯磺酰基)；Bn(苄基)；Ph(苯基)；Ms(甲磺酰)；Et(乙基)、Me(甲基)；Taq(Thermus aquaticus DNA聚合酶)；Klenow(DNA聚合酶I大(Klenow)片段)；EGTA(乙二醇-双(β-氨乙基醚)N、N、N′、N′-四乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)；bla(β-内酰胺酶或氨苄青霉素抗性基因)；HDL(高密度液体)；MJ研究所(MJ研究所，内华达州里诺)；Baseclear(Baseclear BV有限公司，荷兰莱顿)；PerSeptive(PerSeptive生物系统，马萨诸塞州弗雷明汉)；ThermoFinnigan(ThermoFinnigan，加利福尼亚州圣何塞)；Argo(Argo BioAnalytica，新泽西州Morris Plains)；Seitz EKS(SeitzSchenk Filtersystems公司，德国Bad Kreuznach)；Pall(Pall公司，纽约East Hills)；Spectrum(Spectrum实验室，加利福尼亚州Dominguez Rancho)；分子结构(分子结构公司，德克萨斯州Woodlands)；Accelrys(Accelrys有限公司，加利福尼亚州圣地亚哥)；Chemical Computing(Chemical  Computing公司，加拿大蒙特利尔)；New Brunswick(New Brunswick科学公司，新泽西Edison)；CFT(实验材料中心，荷兰Vlaardingen)；Test Fabrics(Test Fabrics公司，宾夕法尼亚州West Pittiston)、宝洁(宝洁公司，俄亥俄州辛辛那提)；Epicentre(Epicentre生物技术公司，威斯康辛州麦迪逊)；GE健康护理(GE健康护理，英国Chalfont St.Giles)；OXOID(Oxoid，Basingstoke，英国汉普郡)；Megazyme(Megazyme国际爱尔兰有限公司，Bray公司Bray商业区，爱尔兰Wicklow)；Finnzymes(Finnzymes Oy，芬兰Espoo)；Kelco(CP Kelco，德国威尔明顿)；Corning(Corning生命科学公司，Corning，纽约)；(NEN(NEN生命科学产品公司，马萨诸塞州波士顿)；Pharma AS(Pharma AS，挪威奥斯陆)；Dynal(Dynal，挪威奥斯陆)；Bio-Synthesis(Bio-Synthesis，德克萨斯州Lewisville)；ATCC(美国典型培养物中心，马里兰州罗克维尔)；Gibco/BRL(Gibco/BRL，纽约格兰德岛)；Sigma(Sigma化学公司，密苏里圣路易斯)；Pharmacia(Pharmacia生物技术公司，新泽西皮斯卡塔韦)；NCBI(国家生物技术信息中心)；Applied Biosystems(Applied Biosystems，加州福斯特城)；BD生物科学和/或Clontech(BD生物科学CLONTECH实验室，加州帕洛阿尔托)；Operon技术公司(Operon技术有限公司，加州阿拉米达)；MWG Biotech(MWG Biotech，北卡罗来纳州海波因特)；Oligos Etc(Oligos Etc.有限公司，俄勒冈州Wilsonville)；Bachem(Bachem生物科学有限公司，宾夕法尼亚州King of Prussia)；Difco(Difco实验室，密歇根州底特律)；Mediatech(Mediatech，弗吉尼亚州Herndon)；Santa Cruz(Santa Cruz生物技术有限公司，加州圣克鲁斯)；Oxoid(Oxoid公司，纽约Ogdensburg)；Worthington(Worthington生化公司，新泽西州Freehold)；GIBCO BRL或Gibco BRL(生命技术公司，马里兰州盖瑟斯堡)；Millipore(Millipore，马萨诸塞州Billerica)；Bio-Rad(Bio-Rad，加州Hercules)；Invitrogen(Invitrogen公司，加州圣地亚哥)；New England Biolabs和NEB(新英格兰生物实验室，马萨诸塞州Ipswich)；Sigma(Sigma化学公司，密苏里州圣路易斯)；Pierce(Pierce生物技术，伊利诺斯州罗克福德)； Takara(Takara生物技术公司，日本大津)；Roche(Hoffmann-La Roche，瑞士巴塞尔)；EM科学(EM科学，新泽西州Gibbstown)；Qiagen(Qiagen公司，加州巴伦西亚)；Biodesign(Biodesign公司，缅因州Saco)；Aptagen(Aptagen公司，弗吉尼亚州Herndon)；Sorvall(Sorvall brand，来自Kendro实验室产品，北卡罗来纳州阿什维尔)；United States Testing(United States Testing公司，新泽西州霍波肯)；Molecular Devices(Molecular Devices公司，加州桑尼维尔)；R&D系统(R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯)；Stratagene(Stratagene Cloning Systems，加州拉霍亚)；Marsh(Marsh Biosciences，纽约罗彻斯特)；Geneart(Geneart GmbH，德国Regensburg)；DNA2.0(DNA2.0，加州Menlo Park)；Gene Oracle(Gene Oracle，加州Mountain View)；Zymo Research(Zymo Research，加州Orange)；Bio-Tek(Bio-Tek设备公司，佛蒙特州Winooski)；Biacore(Biacore公司，新泽西州Piscataway)；PeproTech(PeproTech，新泽西州Rocky Hill)；SynPep(SynPep，加州都柏林)；New Objective(New Objective brand；科学仪器服务公司，新泽西州Ringoes)；Waters(Waters公司，马萨诸塞州Milford)；Matrix Science(Matrix Science，马萨诸塞州波士顿)；Dionex(Dionex公司，加州桑尼维尔)；Monsanto(Monsanto公司，密苏里州圣路易斯)；Wintershall(Wintershall AG，德国Kassel)；BASF(BASF公司，新泽西州Florham Park)；Huntsman(Huntsman Petrochemical公司、犹他州盐湖城)；Enichem(Enichem Iberica，西班牙Barcelona)；Fluka Chemie AG(Fluka Chemie AG，瑞士Buchs)；Gist-Brocades(Gist-Brocades公司，荷兰代尔夫特)；Dow Corning(Dow Corning公司，密歇根州米德兰)；和Microsoft(微软公司，华盛顿雷蒙德)。
实施例1
检测
在下面的实施例中，使用了如下所述的多种检测方法，以使其易于读数。在实施例中说明了对下面提供的实验方案的偏差。在本发明中，枯草 蛋白酶的编号方式对应于成熟BPN的序列的编号，如下所述：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQ ID NO：1)
A、用于在96孔微滴定板中蛋白质含量测定的TCA检测
对于BPN(例如参照蛋白酶)和BPN变体，用在33℃、230rpm振摇和湿润通风条件下在微滴定培养板上生长3-4天的过滤后的培养上清开始该检测。该检测使用新的96孔平底微滴定板(MTP)。首先，在每孔中放置100μL/孔的0.25N HCl。然后加入50μl过滤的肉汤培养基。然后测定405nm处的光散射/光吸收(使用平板读数器的5秒混合模式)，以提供“空白”读数。为了得到最好的结果，在孔板中放置100μL/孔的15％(w/v)三氯乙酸(TCA)，并在室温下孵育5到30分钟。然后测定405nm处的光散射/光吸收(使用平板读数器的5秒混合模式)。
使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)和SpectraMAX(340型；Molecular Devices)MTP读数器；MTP读数器购自Costar(9017型)。使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)和SpectraMAX340型(Molecular Devices)MTP读数器；MTP是9017型(Costar)。
通过从使用TCA的实验读数减去空白(没有TCA)进行计算，得到样品中蛋白含量的相对测量。如果需要的话，可用菌落的AAPF检测以已知的转换因子对TCA读数进行校准，来形成标准曲线。但是，TCA结果对于50至500蛋白每毫升(ppm)的蛋白浓度是线性的，因此可直接对酶性能作图，以选择性能良好的变体。样品中浊度/光散射的升高与培养基上清中可沉淀蛋白质的总量相关。
B.96孔微滴定板中的AAPF蛋白酶检测
为了测定本发明蛋白酶及其变体的蛋白酶活性，测量N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酰(phenyl)-对-硝基酰基苯胺(suc- AAPF-pNA)的水解。使用的试剂溶液是：100mM Tris/HCl，pH8.6，含0.005％(Tris稀释缓冲液)；100mM Tris缓冲液，pH8.6，含10mM CaCl₂和0.005％(Tris/Ca缓冲液)；和溶于DMSO的160mM suc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA储存液)(Sigma：S-7388)。将1mlsuc-AAPF-pNA储存液加入到100ml Tris/Ca缓冲液中混合至少10秒来制备suc-AAPF-pNA工作液。向各孔中加入10μl稀释的蛋白酶溶液，然后立即加入190μl的1mg/ml suc-AAPF-pNA工作液进行检测。这些溶液混合5秒，在MTP读数器中于25℃下、410nm、动力学模式下读取吸光度变化(5分钟内20个读数)。蛋白酶活性表示为AU(活性＝ΔOD·min^-1ml^-1)。
C表面活性剂和螯合剂稳定性检测
实验蛋白酶分别在LAS和LAS/EDTA存在下孵育之后测量LAS和LAS/EDTA稳定性，测定为用AAPF检测测定的残余活性的函数。
LAS稳定性方法
试剂：
十二烷基苯磺酸钠盐(＝LAS)：Sigma D-2525
Sigma P-8074
TRIS缓冲液(不含酸)：Sigma T-1378)；6.35g溶于约960ml水中；pH用4N HCl调节为8.2。TRIS的终浓度为52.5mM。
LAS储备液：在MQ水中制备10.5％LAS溶液(＝每100ml MQ含10.5g)
TRIS缓冲液-100mM/pH8.6(100mM Tris/0.005％
TRIS-Ca缓冲液，pH8.6(100mM Tris/10mM CaCl₂/0.005％
硬件：
平底MTP(Costar No.9017)
Biomek FX
ASYS多重微移液器
Spectramax MTP读数器
iEMS孵箱/摇床
Innova4330孵箱/摇床
Biohit多通道移液器
BMG Thermostar摇床
在52.5mM Tris缓冲液pH8.2中制备0.063％LAS溶液。向100ml(100mM)TRIS缓冲液，pH8.6中加入1ml的100mg/ml suc-AAPF-pNA储备液(在DMSO中)来制备suc-AAPF-pNA工作液。为了稀释上清，平底微滴定板中充满稀释缓冲液，加入上清的等份样品并混合好。稀释比例取决于生长板(AAPF活性)中蛋白酶对照的浓度。想要的蛋白浓度为80ppm。
10μl的稀释上清加入到每孔的190μl的0.063％LAS缓冲液中。用带子覆盖MTP，振摇几秒，放置到45C孵箱(Innova 4230)中200rpm振摇60分钟。初始活性(t＝10分钟)在孵育10分钟后通过转移每孔中10μl混合物至含190μlsuc-AAPF-pNA工作液的新MTP中而测定。将这些溶液混合均匀，用MTP读数器测量AAPF活性(25℃下5分钟内读数20次)。
终活性(t＝60分钟)通过将孵育60分钟之后的孵育板中移出另外10μl溶液来测定。然后如上所述测定AAPF活性。样品的稳定性通过如下计算剩余AAPF活性和初始AAPF活性的比例来测定：
剩余活性(％)＝[t-60值]*100/[t-10值]。
LAS/EDTA稳定性方法
在设定条件下孵育之后测定在代表性阴离子表面活性剂(LAS＝线性烷基苯磺酸盐，十二烷基苯磺酸钠-DOBS)和EDTA二钠存在下蛋白酶变 体的稳定性，剩余活性用AAPF检测测定。使用的试剂为：十二烷基苯磺酸钠盐(DOBS，Sigma No.D-2525)；(Sigma No.P-8074)；EDTA二钠(Siegfried Handel No.164599-02)；HEPES(Sigma No.H-7523)；非应力(unstress)缓冲剂：50mM HEPES(11.9g/l)+0.005％pH8.0；应力(stress)缓冲剂：50mM HEPES(11.9g/l)，0.1％(w/v)DOBS(1g/l)，10mM EDTA(3.36g/l)，pH8.0；参照蛋白酶和蛋白酶变体培养上清，含200-400μg/ml蛋白质。使用的仪器为：V-或U-底MTP作为稀释板(分别为Greiner651101和650161)，F-底MTP(Corning9017)用于非应力和LAS/EDTA缓冲剂以及suc-AAPF-pNA板，Biomek FX(Beckman Coulter)，Spectramax Plus384MTP读数器(Molecular Devices)，iEMS孵箱/摇床(1mm振幅)购自Thermo Electron公司，封口带：Nunc(236366)
该iEMS孵箱/摇床(Thermo/Labsystems)设定为29℃。培养上清稀释到含有非应力缓冲液的板中，至浓度约为25ppm(主稀释板)。从主稀释板取20μl样品加入到含180μl非应力缓冲液的板中，得到终孵育浓度2.5ppm。混合内容物，室温放置，在该板上进行AAPF检测。再从主稀释板中取20μl样品加入到含180μl应力缓冲液(50mM HEPES(11.9g/l)，0.1％(w/v)DOBS(1g/l)，10mM EDTA(3.36g/l)，pH8.0)的板中。混合该溶液，立即放入29℃的iEMS摇床中400rpm振摇30分钟。30分钟孵育之后，在该应力板上进行AAPF检测。样品的稳定性如下通过计算剩余AAPF活性和初始AAPF活性的比例来测定：剩余活性(％)＝[mOD.min^-1应力]*100/[mOD.min^-1非应力]。
D.清洁性能检测
在商购洗涤剂中测定蛋白酶变体的污渍去除性能。热灭活商品洗涤剂制剂用来破坏任何蛋白质成分的酶活性，而保留其非酶成分的性质。因此，该方法适用于制备用于检测本发明酶变体的商购洗涤剂。
小样片：
1/4″直径圆形的小样片得自CFT。单个小样片或两个小样片垂直放入96孔MTP的各个孔中，以暴露整个表面积(即不是平铺在孔的底面上)。
BMI小样片检测
含有血液、奶和墨水(BMI)的0.25英寸直径圆形的小样片从CFT得到。在切割样品之前，用水洗涤织物(EMPA116)。一个小样片垂直放入96孔微滴定板的各个孔中，以暴露整个表面积(即不是平铺在孔的底面上)。如此处所述制备所需的洗涤剂溶液。在25℃的Thermomixer中平衡之后，向包含小样片的MTP的各个孔中加入190μL洗涤剂溶液。向该混合物中加入10μl稀释的酶溶液，使酶的终浓度为1μg/ml(以BCA检测测得)。用封口带密封MTP，放到孵箱中30分钟，在1400rpm下振摇。孵育后，在适当条件下，每孔取100μL溶液，转移到新的MTP中。含100μl溶液/孔的新的MTP在405nm下用MTP SpectraMax读数器读数。还包括空白对照，以及含有两个微样片和洗涤剂但没有酶的对照。
“预洗”的样片
这一类小样片在环境温度下，去离子水中预洗20分钟。预洗步骤之后，将样片放到纸巾顶上干燥。然后将空气干燥的样片用1/4″圆形冲模在冲压下冲孔。最后，将两个小样片垂直放入96孔MTP的各个孔中，以暴露整个表面积(即不是平铺在孔的底面上)。
洗涤剂
对于北美(NA)和西欧(WE)的强效液体衣物(HDL)洗涤剂，通过将预称重的液体洗涤剂(玻璃瓶中)在95℃水浴中放置2小时来进行热灭活。洗涤剂购自当地超市。通过在5分钟的洗涤剂溶解中检测未热处理和热处理后的洗涤剂来精确测定灭活的百分比。用AAPF检测测定酶活性。
从热灭活的储存液制备洗涤剂工作液用于检测热灭活洗涤剂中的酶活性。向该洗涤剂溶液中加入适量水硬度(6gpg或12gpg)和缓冲剂，以满足 所需条件。涡旋或颠倒试剂瓶来混合该溶液。
酶和仪器
其参照丝氨酸蛋白酶变体的样品得自在MTP板中生长的培养物的过滤后的培养基肉汤。使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)、SpectraMAX MTP读数器(340型；Molecular Devices)、iEMS孵箱/摇床(Thermo/Labsystems)；平底MTP(Costar9017型，用于孵育之后反应板读数)；和V-底MTP(Greiner651101，用于上清的预稀释)。在该检测中，蛋白酶水解了底物，并从底物释放出色素和不可溶的颗粒。所以，浊度率是酶活性的一个量度。
参照丝氨酸蛋白酶及其变体在小样片上的污渍去除性能以MTP规模在商购的热灭活的洗涤剂中测定。使用的试剂为：5mM HEPES，pH8.0或5mM MOPS，pH7缓冲液，3∶1Ca∶Mg用于中等水硬度(CaCl₂∶MgCl₂·6H₂O)；每加仑15000颗粒(gpg)储存液稀释到6gpg，每板2个BMI(血液/奶/墨水)样片：CFT加工的EMPA-116BMI棉样片：每孔2个预漂洗和冲孔的样片，和热灭活的现货供应2X Cold洗涤剂，其中已确定缺乏蛋白酶活性。

孵箱设定在所需温度(16℃或32℃)。来自主稀释板含有约10ppm酶的10μl样品加入到具有190μl上表所述工作洗涤剂溶液的BMI2-样片板中。在检测板中，调节体积以得到0.5ppm变体的终浓度。立即将板转移到iEMS孵箱中，在给定温度下1400rpm振摇中孵育30分钟。孵育之后，100μl上清转移到新的96孔板中，在MTP读数器中测定405nm和/或600nm的吸光度。该实验中还包括含有1或2个小样片和未加入蛋白酶样品的洗涤剂的对照孔。在405nm处的测量提供了更高的值，追踪了色素的去除，而在600nm的测量追踪了浊度和清洁度。
所有小样片检测方法中污渍去除活性的计算：
得到的吸光度值对空白值(没有酶的底物)校正，得到水解活性的测定。对于每一个样品(变体)，计算性能指数。性能指数比较了同样的蛋白质浓度下变体性能(实际值)和标准酶性能(理论值)。此外，理论值可以用标准酶Langmuir公式的参数计算。
E.蛋白酶及其变体的相对比活性
为了区别蛋白酶变体，用suc-AAPF-pNA作为底物计算相对比活性，这种底物使得变体与野生型或标准蛋白酶比较并分等级成为可能。通过用蛋白水解活性除以各个样品用上述检测测得的TCA值，测定对suc-AAPF-pNA底物的比活性。使用这些值，计算相对比活性(变体比活性/参照蛋白酶的比活性)。
F.性能指数
性能指数比较了同样的蛋白质浓度下变体性能(实际值)和标准或参照蛋白酶性能(理论值)。此外，理论值可以用标准蛋白酶Langmuir公式的参数计算。性能指数(PI)大于1(PI＞1)鉴别出比标准蛋白酶(例如野生型)更好的变体，而当PI为1(PI＝1)则表示变体与标准蛋白酶的性能相同，PI小于1(PI＜1)则表示变体的性能比标准蛋白酶要差。所以，PI指示出了优胜者，以及在某些环境下使用时不那么理想的变体。
实施例2
靶ISD(插入取代缺失)文库的构建
使用以PCR为基础的方法来构建修饰的解淀粉芽孢杆菌枯草蛋白酶BPN’-Y217L(可以PRIME商购的枯草蛋白酶)多核苷酸的文库，如图1所示，在BPN’-Y217L两个区域中(成熟蛋白质位置63-77和92-132)包含表达框内插入、缺失和/或取代(参见Pisarchik等，Prot.Eng.Des.Select.，20：257-265[2007])。在正向和反向两个方向使用两套寡核苷酸，其在392个氨基酸的全长蛋白质的BPN’-Y217L基因中均匀覆盖目的区域，来扩增BPN’-Y217L基因部分的5’和3’片段。BPN’-Y217L成熟蛋白酶的编码区包括限制性内切酶酶切位点KpnI和XhoI用于克隆目的：
gaattcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctattataataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgagaagcaaaaaattgtgagaagcaaaaaattgtggatcagtttgctgtttgctttagcgttaatctttacgatggcgttcggcagcacatccagcgcgcaggctgcagggaaatcaaacggggaaaagaaatatattgtcgggtttaaacagacaatgagcacgatgagcgccgctaagaagaaagacgtcatttctgaaaaaggcgggaaagtgcaaaagcaattcaaatatgtagacgcagctagcgctacattaaacgaaaaagctgtaaaagaattgaaaaaagacccgagcgtcgcttacgttgaagaagatcacgtagcacacgcgtacgcgcagtccgtgccatatggcgtatcacaaattaaagcccctgctctgcactctcaaggctacaccggttcaaatgttaaagtagcggttatcgacagcggtatcgattcttctcatccagatcttaaagtagcaggcggagccagcatggttccttctgaaacaaatcctttccaagacaacaactctcacggaacacacgttgctggtaccgttgcggctcttaataactcaatcggtgtattaggcgttgcgccaagcgcatcactttacgctgtaaaagttctcggcgccgacggttccggccaatacagctggatcattaacggaatcgagtgggcgatcgcaaacaatatggacgttattaacatgagcctcggcggaccgtccggttctgctgctttaaaagcggcagttgataaagccgttgcatccggcgtcgtagtcgttgcggcagccggcaacgaaggcacttccggcagctcaagcacagtgggctaccctggtaaatacccttctgtcattgcagtaggcgctgtcgacagcagcaaccaaagagcatctttctcaagcgtaggacctgagctcgatgtcatggcacctggcgtatctatccaaagcacgcttcctggaaacaaatacggcgcgttgaacggtacatcaatggcatctccgcacgttgccggagccgcggctttgattctttctaagcacccgaactggacaaacactcaagtccgcagctctctagaaaacaccactacaaaacttggtgattctttctactatggaaaagggctgatcaatgtacaggcggcagctcagtaaaactcgagataaaaaaccggccttggccccgccggttttttat(SEQ ID NO：3).
BPN’-Y217L前体蛋白质的氨基酸序列如下所示。在此序列中，黑体表示成熟的BPN’-Y217L蛋白酶：
MRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPSVAYVEEDHVAHAYAQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQ ID NO：4).
成熟BPN’-Y217L蛋白酶的氨基酸序列用作制备变体文库的基础，如下所示：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQ ID NO：5).
每个寡核苷酸包含退火到模板必需的约20-24个核苷酸、靶密码子(有或没有简并性)和Eam1 104I识别序列。每个随后的引物向下游移动3bp，直至达到靶区域的端点。两个PCR反应(5’和3’片段)包含或者5’正向或者3’反向基因序列侧翼寡核苷酸，各自联合相应的相对引物寡核苷酸。5’片段使用单个正向引物(P3203，TGGATCAGTTTGCTGTTTGCT；SEQ ID NO：6)和反向引物P4385-P4441(参见表2-1)从pAC-FNA10质粒(参见图2A)扩增，各自含有Eam1 104I限制性内切酶酶切位点。3’片段使用单个反向引物(P3435，ATGTATCAAGATAAGAAAGAACAAG；SEQ ID NO：7)和正向引物P4328-P4384(参见表2-1)扩增，各自含有Eam1 104I限制性内切酶酶切位点。




每次扩增反应包含30pmol的各个寡核苷酸和100ng的pAC-FNA10模板DNA。用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)进行扩增。PCR混合物(20μl)在95℃初始加热2.5分钟，然后进行如下循环30次：94℃变性15秒、55℃退火15秒和72℃延伸40秒。扩增之后，凝胶纯化PCR反应产生的左侧和右侧片段，并混合(每个片段约200ng)。每次混合包括靶向三个相邻的密码子的三个左侧片段和靶向相同密码子的三个右侧片段。用Eam1 104I消化这些混合物，用T4DNA连接酶连接，用侧翼引物(P4299CGTTGAAGAAGATCACGTAGCA；SEQ ID NO：122，和P3246TTTATTTTATAAACTCATTCCCTGAT；SEQ ID NO：123)扩增。得到的片段用MluI和XhoI消化，并克隆到枯草杆菌表达质粒pHPLT-FNA的MluI/XhoI位点中(图2B)。使用的pHPLT载体的BPN’-Y217L表达框具有如下所示的多核苷酸序列。
pHPLT载体的表达框的多核苷酸序列(绘制了启动子-pre-pro-BPN’-Y217L-终止子)(SEQ ID NO.124)如下所示：
GCTTTTCTTTTGGAAGAAAATATAGGGAAAATGGTACTTGTTAAAAATTCGGAATATTTATACAATATCATATGTTTCACATTGAAAGGGGAGGAAAATCGTGAAACAACAAAAACGGCTTTAGTCTAGCAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGTTTGCTGTTTGCTTTAGCGTTAATCTTTACGATGGCGTTCGGCAGCACATCCTCTGCCCAGGCGGCAGGGAAATCAAACGGGGAAAAGAAATATATTGTCGGGTTTAAACAGACAATGAGCACGATGAGCGCCGCTAAGAAGAAAGATGTCATTTCTGAAAAAGGCGGGAAAGTGCAAAAGCAATTCAAATATGTAGACGCAGCTTCAGCTACATTAAACGAAAAAGCTGTAAAAGAATTGAAAAAAGACCCGAGCGTCGCTTACGTTGAAGAAGATCACGTAGCACACGCGTACGCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGATTCTTCTCATCCTGATTTAAAGGTAGCAGGCGGAGCCAGCATGGTTCCTTCTGAAACAAATCCTTTCCAAGACAACAACTCTCACGGAACTCACGTTGCCGGCACAGTTGCGGCTCTTAATAACTCAATCGGTGTATTAGGCGTTGCGCCAAGCGCATCACTTTACGCTGTAAAAGTTCTCGGTGCTGACGGTTCCGGCCAATACAGCTGGATCATTAACGGAATCGAGTGGGCGATCGCAAACAATATGGACGTTATTAACATGAGCCTCGGCGGACCTTCTGGTTCTGCTGCTTTAAAAGCGGCAGTTGATAAAGCCGTTGCATCCGGCGTCGTAGTCGTTGCGGCAGCCGGTAACGAAGGCACTTCCGGCAGCTCAAGCACAGTGGGCTACCCTGGTAAATACCCTTCTGTCATTGCAGTAGGCGCTGTTGACAGCAGCAACCAAAGAGCATCTTTCTCAAGCGTAGGACCTGAGCTTGATGTCATGGCACCTGGCGTATCTATCCAAAGCACGCTTCCTGGAAACAAATACGGCGCGTTGAACGGTACATCAATGGCATCTCCGCACGTTGCCGGAGCGGCTGCTTTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACTCAAGTCCGCAGCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAGTAAACTCGAGAGAGGACGGATTTCCTGAAGGAAATCCGTTTTTTTATTTTAAGCTTG(SEQ ID NO：124)
根据生产者的建议(Epicentre)用滚动环形扩增来扩增连接混合物。1μl的连接混合物与5μl的样品缓冲液混合，加热到95℃3分钟，并在冰上冷却。接下来，每管加入5μl的反应缓冲液和0.2μl的酶，在30℃孵育10小时。滚动环形扩增的产物稀释100倍，用于转化枯草芽孢杆菌。用45个含编码具有突变区域的BPN’-Y217L蛋白酶的DNA序列的文库转化枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE，ΔnprE，ΔspoIIE，amyE：：xylRPxylAcomK-phleo)，该细胞用木糖可诱导启动子控制下的comK基因的诱导制备感受态(参见例如Hahn等，Mol Microbiol，21：763-775[1996])。细胞在37℃生长于1ml的Luria Broth(LB)中1小时，然后铺板到含有1.6％脱脂乳和10mg/l新霉素的LB平板上，37℃孵育过夜。45个文库中的每个至少筛选出产生晕斑(halos)的2000个菌落。当铺到脱脂乳板上时，0.05％至20％的菌落产生晕斑。测序有限数量的产生晕斑的菌落。这些菌落中插入和缺失的比例不同，但是没有一个具有表达框移位突变。产生晕斑的菌落用实施例1所述的96孔板检测进一步筛选AAPF活性。如前所述，在96孔微滴定板中生长枯草芽孢杆菌转化体来 生产BPN’-Y217L变体蛋白质。培养上清中的蛋白质浓度用如实施例1所述TCA沉淀法测定。
实施例3
靶ISD产生的BPN’-Y217L变体的污渍去除性能
测定污渍去除活性的实验结果示于表3-1中，使用EMPA116样片(BMI污渍，CFT)的小样片检测来在pH8/16℃测定洗衣应用中的污渍去除性能，用如上所述产生的BPN’-Y217L变体的TCA沉淀(目的性质的检测)测定蛋白质。用实施例1中所述的方法和下述污渍去除性能检测实验的改变得到结果。使用的实验洗涤剂是热灭活的Tide2X洗涤剂(宝洁公司)。
热灭活商品洗涤剂制剂用来破坏任何蛋白质成分的内源性酶活性，而保留其非酶成分的性质。将预先称重量的液体洗涤剂(在玻璃瓶中)放到95℃的水浴中2小时来进行洗涤剂的热灭活。洗涤剂购自当地超市。通过在5分钟的洗涤剂溶解中检测未热处理和热处理后的洗涤剂来精确测定灭活的百分比。用AAPF检测测定酶活性。如上所述，BPN’-Y217L变体的功能性定量为性能指数(“Pi”或“PI”)，该指数为变体性能与亲本蛋白质BPN’-Y217L性能的比例。对于BMI污渍去除性能和/或TCA沉淀的PI值大于或等于0.5的BPN’-Y217L变体呈现出增加的清洁效果和/或表达。
突变用如下方法命名：亲本氨基酸的单字母密码，然后三个数字的位置数字，然后是变体氨基酸的单字母密码。例如突变87位的甘氨酸(G)为丝氨酸(S)表示为“G087S”。多重突变通过在突变之间插入“/”表示。在87位和90位的突变表示为“G087S/A090Y”。对于缺失使用单字母密码“Z”。对于对亲本序列的插入，单字母密码“Z”在位置数字的左侧。对于缺失，单字母密码“Z”在位置数字的右侧。对于插入，位置数字是插入氨基酸之前的位置数字，每个氨基酸加0.01。例如，在位置87和88之间插入三个氨基酸丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和酪氨酸(Y)表示为“Z087.01A/Z087.02S/Z087.03Y”。所以，组合上述所有突变加上100位的缺失表示为：“G087S/Z087.01A/Z087.02S/Z087.03Y/A090Y/A100Z”。























表3-2提供了构成该组合的插入的列表。

实施例4
BPN’3的组合变体的构建
使用BPN’G97A-G128A-Y217Q(“BPN’3”)作为亲本，用涉及使用该基因的四个片段的延长(融合)PCR的策略制备组合变体。片段1用引物P4974和P4977扩增(参见表4-1)。片段4用引物P4978和P4976扩增(表4-1)。片段1和4都不含有任何突变。片段2和3各自分别形成为一套包含所需突变的12和16个序列，或者用BPN’3作为模板，或者不用模板，使用部分交叠的正向和反向引物来制备。
片段2的这一套序列用下列引物扩增：
01：P4979和P4980(BPN’3作为模板)
02：P4981和P4982(没有模板)
03：P4983和P4984(没有模板)
04：P4985和P4986(没有模板)
05：P4987和P4988(没有模板)
06：P4989和P4990(没有模板)
07：P4991和P4992(没有模板)
08：P4993和P4994(没有模板)
09：P4995和P4996(没有模板)
10：P4997和P4998(没有模板)
11：P4999和P5000(没有模板)
12：P5001和P5002(没有模板)
片段3的这一套序列用下列引物扩增：
01：P5003和P5004(BPN’3作为模板)
02：P5005和P5006(没有模板)
03：P5007和P5008(没有模板)
04：P5009和P5010(没有模板)
05：P5011和P5012(没有模板)
06：P5013和P5014(没有模板)
07：P5015和P5016(没有模板)
08：P5017和P5018(没有模板)
09：P5019和P5020(没有模板)
10：P5021和P5022(没有模板)
11：P5023和P5024(没有模板)
12：P5025和P5026(没有模板)
13：P5027和P5028(没有模板)
14：P5029和P5030(没有模板)
15：P5031和P5032(没有模板)
16：P5033和P5034(没有模板)
组合变体构建中使用的引物序列在表4-1中列出。




每次扩增反应包含30pmol的各个寡核苷酸和100ng的模板DNA。用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)进行扩增。PCR混合物(20μl)在95℃初始加热2.5分钟，然后进行如下循环30次：94℃变性15秒、55℃退火15秒和72℃延伸40秒。扩增之后，将所有的片段用凝胶条带纯化试剂盒(Qiagen)纯化，并将其混合作为用引物P4975和P4948的融合PCR的模板。融合PCR反应的全长DNA片段用QIAGEN的凝胶条带纯化试剂盒凝胶纯化，用BamHI和HindIII限制性内切酶消化，连接到用相同的限制性内切酶切开的杆菌表达质粒pHPLT-BPN partial opt(图2C)中。
根据生产者的建议(Epicentre)用滚动环形扩增来扩增连接混合物。1μl的连接混合物与5μl的样品缓冲液混合，加热到95℃进行3分钟，并在冰上冷却。接下来，每管加入5μl的反应缓冲液和0.2μl的酶，在30℃孵育10小时。滚动环形扩增的产物稀释100倍，1μl稀释产物用于转化枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE，ΔnprE，ΔspoIIE，amyE：：xylRPxylAcomK-phleo)，如实施例2中所述。转化物铺板到含1.6％脱脂乳和10ppm新霉 素的LB平板上，在37℃孵育过夜。仅仅挑取有晕斑的菌落，使其在微滴定板中生长，用于进一步的分析，如实施例2所述。培养上清中的蛋白质浓度用如实施例1所述TCA沉淀法测定。





实施例5
BPN’3的组合变体的污渍去除性能
如实施例3所述，检测实施例4中产生的BPN’3组合变体的污渍去除活性。如上所述，BPN的变体的功能性定量为性能指数(“Pi”)，该指数为变体性能与亲本蛋白质BPN’3的性能的比例。显示出对于BMI污渍去除性能和/或TCA沉淀的Pi值大于或等于0.5的BPN’3变体呈现出增加的清洁效果和/或表达。小于或等于0.05的性能指数被固定到0.05并在表中用黑斜体表示。结果示于表5-1中。


实施例6
BPN’3在位置128、129和130的组合变体的构建
用位点特异性饱和诱变和/或位点特异性插入和/或缺失形成集中围绕BPN’G97A-G128A-Y217Q(BPN’3)的位置128/129/130的组合文库。产生的变体包含取代、插入和缺失突变。文库L1、L2和L3是基于野生型位置S130S，L4是基于S130A。集中围绕位置128/129和130的四个饱和文库如表6-1所示构建。

在构建文库之前，在BPN3’序列的128和129位引入两个终止密码子以灭活该蛋白酶。这么做是为了保证亲本质粒在文库中的低背景。根据NEB实验方案，亲本质粒(pHPLT-BPN’3)用2微克的质粒DNA和甲基 化酶(New England Biolabs)甲基化。然后用购自Zymo Research的DNA Clean and Concentrator试剂盒纯化甲基化的DNA。使用改良版本的Stratagene的QuikChange多位点定点诱变(QCMS)试剂盒用本领域已知的方法进行诱变(参见Amin等，Biotechniques35：1134-1140，[2003])。
诱变反应包含60ng的模板质粒、0.5μl正向引物128/129终止F(25uM)、0.5μl反向引物128/129终止R(25μM)、1μl的dNTP’s(QCMS试剂盒)、2.5ul10×QCMS反应缓冲液、18.5μl去离子水和1μl酶共混物(QCMS试剂盒)，总体积为25μl。对于诱变反应，使用的热循环器上的程序为：95℃持续1min的1个循环；然后进行25个如下循环：95℃持续1min、55℃持续1min、68℃持续11min(MJ Research热循环器)。模板DNA用DpnI(QCMS试剂盒，Qiagen)消化，使用生产者的实验方案，用Templiphi试剂盒(Amersham)通过滚动环形扩增(RCA)扩增1.5μl的反应物。

用1微升扩增的DNA转化100μl的感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE，ΔnprE，ΔspoIIE，amyE：：xylRPxylAcomK-phleo)。20μl或80μl转化混合物的等分试样铺板到含有10μg/ml新霉素+1.6％脱脂乳(Teknova)的Luria琼脂糖平板上。生长之后，挑取没有在脱脂乳平板上形成晕斑的4个菌落来鉴定具有正确序列的质粒。选择在128/129位置具有两个终止子的正确变体(称为“pHPLT-BPN’128/129终止”)作为亲本质粒来构建表6-1中描述的组合文库。
甲基化质粒pHPLT-BPN’128/129终止，并用作表6-3中所示的简并引 物对的模板。

为每个选择的文库设计中间具有NNS密码子，并具有17-20个侧翼碱基的交叠的正向和反向引物(PAGE纯化)，各个正向(F)和反向(R)引物的序列示于表6-3中。如上所述进行快速改变诱变和滚动环形扩增4个反应。转化物铺到含有10μg/ml新霉素+1.6％脱脂乳的Luria琼脂糖平板中。将所有的形成晕斑的菌落挑取到两个含125μl含10μg/ml新霉素的LB培养基的微滴定板中。用Quintara Biosciences对菌落测序。对于蛋白质表达，培养物在含有180μl强化的半合成培养基(基于MOP缓冲液，含有尿素作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源，1％的大豆胨用于旺盛的细胞生长，并补充有2.5μg/ml的新霉素)的微滴定板(22μm，Millipore)中生长过夜。培养物在37℃、250rpm和70％湿度条件下生长64小时。培养上清中的蛋白质浓度用如实施例1所述TCA沉淀法测定。
实施例7
BPN’3在位置128、129和130的组合变体的污渍去除性能
如实施例3所述，检测实施例6中产生的在位置128、129和130处的BPN’3组合变体的污渍去除活性。如上所述，BPN’变体的功能性定量为性能指数(“Pi”)，该指数为变体性能与亲本蛋白质BPN’3性能的比 例。对于BMI污渍去除性能和/或TCA沉淀显示出Pi值大于或等于0.5的BPN’3变体呈现出增加的清洁效果和/或表达。结果示于表7-1中。



实施例8
BPN’的组合变体的构建
用下列BPN’突变体作为亲本分子——BPN’G97A/G128A/Y217Q、BPN’M124V/L126A/Y217Q、BPN’G128A/Y217Q和BPN’N123G/Y217Q，通过延伸(融合)PCR，形成在位置96、98、129和/或222的插入或取代，制备BPN’组合变体。对于形成的各个组合变体，其亲本DNA分子、引入的突变和PCR引物列于表8-1中。为了形成各个突变，用PCR引物(表8-2)在基因的5′和3′区域用表8-1中列出的各个亲本分子，产生两个片段1和2。混合这些片段，用侧翼引物P4973和P4950(表8-2)扩增，以重建全长基因。
每次扩增反应包含30pmol的各个PCR引物和100ng的模板DNA。用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)进行扩增。PCR混合物(20μl)在95℃初始加热2.5分钟，然后进行如下循环30次：94℃变性15秒、55℃退火15秒和72℃延伸40秒。扩增之后，用QIAGEN的凝胶条带纯化试剂盒凝胶纯化5’和3’片段，并混合，用侧翼引物P4973和P4950扩增。产生的全长DNA片段用QIAGEN凝胶条带纯化试剂盒凝胶纯化，用BamHI和HindIII限制性内切酶消化，连接到用相同的限制性内切酶切开的含有各个亲本分子的pHPLT-BPN’载体中。根据生产者的建议(Epicentre)用滚动环形扩增来扩增连接混合物。1μl的连接混合物与5μl的样品缓冲液混合，加热到95℃持续3分钟，并在冰上冷却。接下来，每管加入5μl的反应缓冲液和0.2μl的酶，在30℃孵育10小时。滚动环形扩增的产物稀释100倍，用于转化枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE， ΔnprE，ΔspoIIE，amyE：：xylRPxylAcomK-phleo)，如实施例2所述。转化物铺板到含1.6％脱脂乳和10ppm新霉素的LB平板上，在37℃孵育过夜。仅仅挑取有晕斑的菌落，使其在微滴定板中生长，用于进一步的分析，如实施例2所述。培养上清中的蛋白质浓度用如实施例1所述TCA沉淀法测定



实施例9
BPN’的组合变体的污渍去除性能
如实施例3所述，检测实施例8中产生的BPN’的组合变体的污渍去除活性。如上所述，BPN’变体的功能性定量为性能指数(“Pi”)，该指数为变体性能与BPN’3(BPN’G97A-G128A-Y217Q)性能的比例。对于BMI污渍去除性能和/或TCA沉淀显示出的Pi值大于或等于0.5的变体呈现出增加的清洁效果和/或表达。小于或等于0.05的性能指数被固定到0.05并在表中用黑斜体表示。结果示于表9-1中


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