共价乳蛋白/异硫氰酸酯复合物.pdf

《共价乳蛋白/异硫氰酸酯复合物.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《共价乳蛋白/异硫氰酸酯复合物.pdf（17页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 102341008 A (43)申请公布日 2012.02.01 CN 102341008 A *CN102341008A* (21)申请号 201080010181.6 (22)申请日 2010.03.03 09154996.4 2009.03.12 EP A23L 1/30(2006.01) A23L 1/305(2006.01) A23J 1/20(2006.01) A23L 3/3535(2006.01) A61K 31/26(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 雀巢产品技术援助有限公。

2、司 地址 瑞士沃韦 (72)发明人 K拉德 - 库奇克 CJE施密特 (74)专利代理机构 北京市中咨律师事务所 11247 代理人 黄革生 林柏楠 (54) 发明名称 共价乳蛋白 / 异硫氰酸酯复合物 (57) 摘要 本发明涉及共价复合物领域。本发明的实 施方案涉及包含至少一种乳蛋白和至少一种 ITC- 化合物的食品级共价复合物并涉及这类 复合物的用途， 所述用途为例如降低所感知的 ITC- 化合物的辛辣味， 以产生抗菌作用和 / 或形 成和稳定乳剂和 / 或泡沫。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.09.02 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2010。

3、/052705 2010.03.03 (87)PCT申请的公布数据 WO2010/102937 EN 2010.09.16 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 5 页 CN 102341022 A1/1 页 2 1. 包含至少一种异硫氰酸酯化合物和至少一种乳蛋白的共价复合物的组合物， 其中所 述的组合物是乳剂或泡沫。 2. 根据权利要求 1 的组合物， 其中乳蛋白可选自牛乳的蛋白部分、 脱脂乳的蛋白部分、 乳蛋白浓缩物、 乳蛋白分离物、 胶束酪蛋白、 酪蛋白、 s1- 酪蛋白、 s2- 酪蛋白、 - 酪。

4、蛋 白、 - 酪蛋白， 酸或甜乳清的蛋白部分、 乳清蛋白浓缩物、 乳清蛋白分离物、 - 乳清蛋白、 - 乳球蛋白、 牛血清蛋白和 / 或乳铁蛋白。 3. 根据前述权利要求的一项的组合物， 其中乳蛋白是 - 乳球蛋白。 4. 根据前述权利要求的一项的组合物， 其中所述的异硫氰酸酯选自 R-N C S 形 式的有机异硫氰酸酯， 例如异硫氰酸甲酯、 异硫氰酸烯丙酯、 异硫氰酸苯乙酯、 1- 异硫氰 基 -4R- 甲基亚硫酰基 丁烷、 异硫氰酸苯乙酯、 异硫氰酸苄酯、 3- 甲基硫代丙基异硫氰酸 酯及其组合。 5. 根据前述权利要求的一项的组合物， 其中异硫氰酸酯与乳蛋白以约 100 1 至 1 10。

5、 范围的摩尔比， 优选以约 10 1 至 1 10 范围的摩尔比， 最优选以约 1 1 的范围 存在于复合物中。 6. 根据前述权利要求的一项的组合物， 其中组合物具有约 2 至 9 的 pH 范围， 优选约 3 至 7 的 pH 范围。 7. 根据前述权利要求的一项的组合物， 其中所述的组合物是水包油型乳剂。 8. 包含根据权利要求 1-7 的一项的组合物的特别是在贮存期间保存异硫氰酸酯的用 途。 9. 根据权利要求 1-7 的一项的组合物用于产生来自 ITC- 化合物的不太辛辣和 / 或较 轻刺激催泪味道的用途。 10.根据权利要求1-7的一项的组合物用于提供抗菌作用、 特别是抑制大肠埃希。

6、菌和/ 或金黄色葡萄球菌的用途。 11. 根据权利要求 1-7 的一项的组合物用于制备治疗或预防与微生物感染、 特别是大 肠埃希菌和 / 或金黄色葡萄球菌感染的障碍的产品的用途。 12. 根据权利要求 1-7 的一项的组合物用于制备抑制癌变和 / 或肿瘤生成、 特别是 (UV) 光诱导的皮肤癌变、 和 / 或治疗囊性纤维化的产品的用途。 13.根据权利要求1-7的一项的组合物用于制备治疗或预防炎性障碍、 特别是通过2期 酶诱导作用能够治疗的炎性障碍的产品的用途。 14. 包含根据权利要求 1-7 的一项的组合物的产品， 其中产品是食品、 保健品、 食品添 加剂、 药物、 局部用乳膏或饮料。 1。

7、5. 根据权利要求 14 的产品， 其中食品选自填充剂、 蘸料、 酱汁 ( 优选蛋黄酱 )、 糊、 浇 头、 基于乳的制品、 乳和 / 或基于奶油的泡沫和 / 或乳剂、 沙拉酱、 汤、 饮料或口服食品补充 剂。 权 利 要 求 书 CN 102341008 A CN 102341022 A1/10 页 3 共价乳蛋白 / 异硫氰酸酯复合物 0001 本发明涉及复合物领域。 本发明的实施方案涉及包含至少一种乳蛋白和至少一种 ITC 化合物的食品级共价复合物并涉及这类复合物的用途， 所述用途为例如降低所感知的 ITC- 化合物的辛辣味， 以产生抗菌作用和 / 或形成和稳定乳剂和 / 或泡沫。 00。

8、02 芥子油苷 (GLS) 是天然的含硫植物化学物质， 其是例如在十字花科的植物例如西 兰花、 羽衣甘蓝、 卷心菜、 菜花、 抱子甘蓝、 芜菁或芥菜中被合成的。这些植物的摄入一直伴 随例如癌症发生率的降低， 特别是肺癌、 胃癌、 结肠癌和直肠癌。它们的保护作用极大地归 因于具有以下共同结构的 GLS 的存在 ： -D- 硫代葡萄糖基团、 一个磺化部分和由甲硫氨 酸、 色氨酸、 苯丙氨酸或各种支链氨基酸衍生的可变侧链。 0003 GLS 化学上是稳定的， 并且被认为是生物学上无活性的， 但当与植物酶黑芥子硫苷 酸酶或人体结肠细菌接触时， 它们将分解释放出葡萄糖和不稳定的糖苷配基。后者经自发 重排。

9、成为不同的可能的产物， 包括腈类、 硫氰酸盐、 环硫腈类或异硫氰酸酯 (ITC)， 具体取决 于水解条件。 0004 ITC 被认为是干预癌症发展过程的最强效的天然存在的生物活性化合物。它们可 影响内源性抗氧化能力， 改善解毒机制并诱导未分化细胞的凋亡。 ITC还被描述为有效的抗 菌化合物。 0005 US20030235634A1 描述了一种从植物提取非极性异硫氰酸酯的方法和包含它们的 膳食补充剂。 0006 US200330064131 描述了从十字花科植物原料制备异硫氰酸酯产物并将异硫氰酸 酯产物进一步加工的方法， 所述的十字花科植物原料通过将植物原料保持在特定温度而制 备。 0007 。

10、GB2404659A 是芥菜籽分馏， 其涉及将破碎的芥菜籽贮备物与水结合产生活化的芥 末浆， 将芥子油苷黑芥子苷转化为烯丙基油组分， 并从剩余的芥末浆分离这一组分。 0008 WO0215722 描述了用于治疗幽门螺杆菌感染的方法， 方法包括施用包含芥子油苷 或异硫氰酸酯或衍生物的组合物。 0009 DE2045408 描述了硫氰酸盐或异硫氰酸酯加至未适当酸化的乳中用于制备酸奶或 其它类型的发酵乳制品的方法。 0010 WO2005032283A1 是关于保存固体食品的组合物的， 其包含湿度敏感的异硫氰酸酯 化合物和吸湿性载体， 其中所述组合物基本上无山梨酸、 苯甲酸及其盐。 0011 WO2。

11、006133789A1描述了包含天然防腐剂系统的消费类产品。 防腐剂系统具有比例 为 1 2 至 1 25 的脂族与芳族异硫氰酸酯的混合物， 并且适合用于各种消费类产品。 0012 在最近一篇综述中， Zhang(Cancer-preventive isothiocyanates ： measurements of human exposure and mechanism of action.2004.Mutation Res， 555， 173-190)报告了 流行病学研究结果， 显示在肺癌、 乳腺癌或结肠癌的发生风险与饮食摄入 ITC 之间的负相 关关系。 0013 US200602585。

12、99A1 描述了异硫氰酸酯用于治疗患有囊肿性纤维化的个体的用途。 0014 WO2006118941A1 报告了关于在涉及施用萝卜硫素或其类似物、 异硫氰酸酯或芥子 说 明 书 CN 102341008 A CN 102341022 A2/10 页 4 油苷的个体中， 对紫外光诱导皮肤癌的抑制作用。 0015 但是， 尽管 ITC 有高效的作为生物活性分子的潜力， 它们具有通常感觉不愉快的 味道。 例如， 它们影响芸苔属蔬菜的味道。 当然， 它们也负面影响它们所加入的食品的味道。 0016 Drewnowski 和 Gomez-Carneros(Bitter taste， phytonutri。

13、ents， and the consumer ： a review.2000.Am J Clin Nutr， 72， 1424-1435) 报告了出现在十字花科 ( 特别 是白菜、 芥末和辣根 ) 中的异硫氰酸烯丙酯在感官试验中是有辛辣味和刺激催泪感觉的化 合物。 0017 因此， 通常熟知的是 ITC- 化合物对健康具有非常有益的性质， 它们仍然摄入不 足， 因为它们的味道通常不受人喜欢。 0018 因此技术上需要获得让人乐于摄入的包含 ITC 化合物的组合物。 0019 因此本发明的目标是改善现有技术并提供味道能够接受的包含 ITC 化合物的组 合物。 0020 本发明人令人惊异地看到他们。

14、能够通过独立权利要求书的主题实现这一目标。 从 属权利要求进一步发展了本发明的想法。 0021 本发明的主题提供了包含ITC-化合物的组合物， 其无刺激流泪和/或催泪味道或 与现有技术的包含 ITC- 化合物的组合物相比感觉不太刺激和 / 或催泪感轻。 0022 本发明人提供了包含至少一种异硫氰酸酯化合物与至少一种乳蛋白的共价复合 物的组合物。 0023 本发明人还发现这些复合物呈现出优秀的乳化与发泡性质。 这进一步改善了复合 物在食品工业中的可应用性。 0024 - 乳球蛋白 (BLG)， 主要的牛乳清蛋白已知包含 1 个游离巯基和 16 个氨基基团。 因此能够与 ITC 形成共价复合物。 。

15、0025 在本发明中， 本发明人显示 BLG( 乳蛋白的一个实例 ) 和至少一种 ITC- 化合物之 间形成复合物， 能够减轻 ITC- 化合物不希望有的味道。这使其可将 ITC- 化合物加至许多 食品中， 这些食品至今由于味道的原因不能富含 ITC- 化合物。本发明现在允许通过各种食 品递送 ITC- 化合物。此外， 共价复合物的形成能够改善蛋白的功能性质， 使其作为食品成 分有更宽和 / 或改善的用途。 0026 因此， 本发明的一个实施方案是包含共价复合物的组合物。所述的共价复合物包 含至少一种 ITC- 化合物和至少一种乳蛋白。 0027 术语 “复合物” 是指在至少一种 ITC 化合。

16、物和至少一种乳蛋白之间的任何形式的 结合作用。 0028 本发明的复合物是共价结合的复合物。在 ITC- 化合物和乳蛋白之间存在共价相 互作用， 被视为在异硫氰酸酯的亲核试剂加入时发生， 例如， 在 pH 值升高时， 蛋白的游离巯 基或 - 或 - 氨基基团 (Rawel、 Kroll 和In vitro enzymatic digestion of benzyl-andphenylisothiocyanate-derivatized food proteins.1998.J Agric Food Chem， 46， 5103-5109)。 0029 术语 “乳蛋白” 包含乳、 及任何乳或乳衍。

17、生的蛋白部分中存在的任何蛋白。 0030 乳可以是例如牛乳、 绵羊乳、 山羊乳、 马乳、 骆驼乳或豆乳。牛乳是优选的。 0031 在本发明可替换的优选实施方案中， 乳蛋白是乳清蛋白， 例如甜乳清蛋白或酸乳 说 明 书 CN 102341008 A CN 102341022 A3/10 页 5 清蛋白， 优选牛来源的。 0032 因此， 乳蛋白可以是牛乳或由蛋白部分衍生的牛乳。例如乳蛋白可选自脱脂乳的 蛋白部分、 乳蛋白浓缩物、 乳蛋白分离物、 胶束酪蛋白、 酪蛋白、 s1- 酪蛋白、 s2- 酪蛋白、 - 酪蛋白、 - 酪蛋白、 酸或甜乳清的蛋白部分、 乳清蛋白浓缩物、 乳清蛋白分离物、 - 。

18、乳 清蛋白、 - 乳球蛋白、 牛血清蛋白、 乳铁蛋白或其组合。 0033 ITC-化合物是包括异硫氰酸酯基团的所有化合物。 异硫氰酸酯可通过异硫氰酸酯 基团中氧替换为硫形成。ITC- 化合物包括具有通式 R-N C S 的有机异硫氰酸酯， R 可 选自 C1-C6烷基、 C1-C6链烯基、 C1-C6炔基、 C5-C18芳基及其组合， 所有基团任选包含 1-6 个选 自 o、 N、 P、 S 的杂原子。 0034 一般的可用于本发明框架中的异硫氰酸酯包括有机异硫氰酸酯例如异硫氰酸甲 酯、 异硫氰酸烯丙酯、 异硫氰酸苯乙酯、 1-异硫氰基-4R-甲基亚硫酰基丁烷、 异硫氰酸苯 乙酯、 异硫氰酸苄。

19、酯、 3- 甲基硫代丙基异硫氰酸酯及其组合。 0035 当制备复合物时， 复合物的计量化学将取决于例如所使用蛋白的类型、 ITC 结合位 点的数量与立体化学的可利用度， 以及所用的ITC-化合物的种类与相对数量。 例如， -乳 球蛋白 (BLG)， 主要的牛乳清蛋白已知包含 1 个游离巯基和 15-16 个氨基基团， 其全部可与 ITC 官能团形成共价键。重要地并且优先地是， 例如， 通过以适当的相对量选择具体的乳蛋 白和具体的 ITC- 化合物， 可调整得到的复合物的属性， 并按照最终产品的需要进行微调。 0036 一般地， 异硫氰酸酯与乳蛋白在复合物中以约 100 1 至 1 10 的摩尔。

20、比存在， 优选约 10 1 至 1 10， 最优选约为 1 1。 0037 本发明的组合物可具有任意的 pH 值， 但具体地对食品而言， 其优选具有约 2 至 9 范围的 pH， 优选约 3 至 7。 0038 发现本发明的复合物可用于稳定乳剂。 0039 乳剂是两种不能混合的液体的混合物。一种液体 ( 分散相 ) 被分散在另一种 ( 连 续相 ) 液体中。例如， 乳剂可以是水包油或油包水乳剂。许多乳剂是油 / 水乳剂， 膳食脂肪 是一种日常生活中常见类型的油。乳剂的实例包括黄油、 人造奶油、 乳、 奶油、 蛋黄酱和 / 或 色拉调味汁。在乳和奶油中， 水围绕在脂肪液滴周围 ( 一种水包油乳剂。

21、 )。 0040 已显示本发明的复合物提供了非常好的乳化稳定性。因此， 复合物可用于长时间 稳定乳剂。另外， 本发明的复合物还可用于稳定加热条件下的乳剂。 0041 例如， 发明人能够显示本发明的复合物允许稳定在酸性 pH( 例如， pH4) 下及升温 下 ( 例如， 85 ) 的乳剂。 0042 乳剂保持稳定 33 天， 无任何乳化或脱脂的迹象。 0043 因此， 本发明的复合物可用作乳化剂和 / 或稳定剂， 例如在食品、 化妆品和 / 或药 物产品中的乳化剂和 / 或稳定剂。 0044 例如， 本发明的组合物可包含或由泡沫组成。泡沫是一种通过许多气泡分散在液 体或半固体或固体连续相中形成的。

22、物质。 0045 本发明的组合物可以是食品、 保健品、 食品添加剂、 药物、 局部用乳膏或饮料。 0046 本发明的组合物也可用于制备包含 ITC- 化合物 ( 例如包含 ITC- 化合物乳剂和 / 或泡沫 ) 的产品。该产品可以是食品、 保健品、 食品添加剂、 药物、 局部用乳膏或饮料。 0047 包含本发明复合物的组合物和 / 或产品优选选自 ： 甜点、 冰冻甜点、 乳制品、 宠物 说 明 书 CN 102341008 A CN 102341022 A4/10 页 6 食品、 烹饪产品、 临床营养产品等。 具体地， 它们可包括酱汁、 汤、 蛋黄酱、 沙拉酱、 奶油、 冰淇 淋、 巧克力、 。

23、摩丝和 / 或乳。 0048 一般的食品还可选自 ： 填充剂、 蘸料、 酱汁、 蛋黄酱、 糊、 浇头、 基于乳的制品、 乳和 / 或基于奶油的泡沫和 / 或乳剂、 沙拉酱、 汤、 饮料或口服食品补充剂。 0049 本发明的复合物或组合物也可用于化妆品， 例如乳膏、 泡沫、 摩丝、 凝胶、 香波、 乳 剂等。 0050 本发明的复合物可加入的药物产品包括片剂、 胶囊、 糖浆等。 0051 本发明还延伸至用于本文提到的障碍的治疗和/或预防的本发明的复合物和/或 组合物。 0052 当用作乳化剂和 / 或稳定剂时， 复合物优选存在于产品中的量为所述产品的 0.01至 10重量， 优选 0.1 -5重。

24、量、 最优选 0.1至 0.5重量。事实上已经发现乳 化性能和稳定性能在低浓度下最适合。 本发明的产品因此提供了它们的高度有效的乳化剂 和 / 或稳定剂的优点。 0053 本发明的复合物可简单地通过将适量的至少一种 ITC- 化合物与至少一种乳蛋白 混合在液体中、 优选基于水的介质中， 并通过使形成复合物进行制备。任选地， pH 可进行适 当调节， 并且混合物可以被加热， 例如加热至 85持续 15min 并 / 或搅拌。 0054 得到的复合物具有食品级的优点。如果是被批准为包含人或动物摄食的化合物， 那么材料是食品级的。 0055 复合物作为其加入的组合物中的乳化剂和 / 或稳定剂是高度有。

25、效的。此外， 复合 物仅包含天然成分， 因此比由化学修饰或合成的产品组成的传统乳化剂更吸引人。 同样， 本 发明的复合物在其可加入的产品方面是多方面的。例如， 通过切换选择的蛋白和 ITC- 化合 物， 它们在宽的 pH 范围内可作为乳化剂和 / 或稳定剂。例如， 它们可用于具有约 4.5 的 pH 的酸性成品例如蛋黄酱中， 以及具有 6.5 以上的 pH 的产品例如乳中。 0056 此外， 复合物形成后的溶液可经受超滤。这具有将本发明的复合物从游离 ITC 中 分离的优点。 0057 在优选的实施方案中， 所述溶液通过任何本领域已知的方法进行干燥， 例如喷雾 干燥、 冷冻干燥或真空干燥。 0。

26、058 本发明的复合物因此可以是溶液、 凝胶或干燥粉末的形式。 0059 在进一步的实施方案中， 蛋白 -ITC- 化合物的复合物可在另外成分的存在下进行 干燥。或者， 干燥的水解蛋白 -ITC 化合物复合物可与其他干燥的成分混合。 0060 得到的产品可以是包含本发明复合物的例如乳粉或脱水汤粉。 0061 异硫氰酸酯已知是不稳定的， 特别是热不稳定。 因此， 它们倾向于因食品加工与贮 存时间失去至少部分健康的益处。 但是， 即使在食品加工与长时间储存后， 增加十字花科植 物或植物产品， 及一般含异硫氰酸酯产物的健康益处是可取的。 0062 ITC也是挥发性的， 因此它们的量也将随时间降低。 。

27、本发明的复合物避免了这种损 失。 0063 本发明人已发现本发明框架中所述的复合物甚至在热暴露和 / 或长时间储存后 允许保持异硫氰酸酯及它们的对健康的益处。 0064 因此， 本发明的组合物可用于例如在长时间储存期间与或在特别是在涉及热处理 说 明 书 CN 102341008 A CN 102341022 A5/10 页 7 的食品加工期间保存异硫氰酸酯。 0065 本发明的组合物也可用于减少 ITC- 化合物的辛辣和 / 或刺激流泪味道。这对于 包含 ITC- 化合物的食物组合物或饮料特别有意义。因为本发明所述的复合物可用于提供 包含 ITC- 化合物的泡沫和 / 或乳剂， 其也可用于减。

28、轻包含 ITC- 化合物的泡沫和 / 或乳剂 的辛辣和 / 或刺激流泪味道。 0066 辛辣味也称作辣味。它是尖锐和刺人的感觉的表达。引起这种感觉的食品常称作 “辛辣” (spicy)。引起辛辣的 ITC- 化合物， 例如异硫氰酸烯丙酯， 或辣椒素， 常被视为由包 含 TRPV1 和 TRPA1 感受器的热敏 - 和化学敏感的 TRP 离子通道的激活引起的。 0067 刺激流泪味道是例如由 ITC- 化合物引起的感觉， 即刺激眼中的角膜神经引起流 泪、 疼痛并可能甚至暂时失明。 0068 此外， 本发明人能够显示出本发明的组合物可用于产生抗菌作用。 例如， 在与乳蛋 白-ITC-化合物共价复合。

29、物孵育后， 大肠埃希菌与金黄色葡萄球菌分散物的光密度(OD)降 低。 0069 因此， 本发明的组合物可用于在产品例如食品中产生抗菌作用。 具体地， 可抑制大 肠埃希菌和 / 或金黄色葡萄球菌的生长。 0070 或者， 本发明的组合物也可用于制备治疗或预防与细菌感染、 特别是大肠埃希菌 和 / 或金黄色葡萄球菌感染相关的障碍的产品。 0071 产品可以是例如食品、 保健品、 食品添加剂、 饮料、 局部用乳膏和 / 或药物组合物。 0072 在进一步的实施方案中， 本发明的组合物可用于制备抑制癌症和 / 或肿瘤发生， 特别是抑制(UV)光诱发的皮肤癌变的产品。 ITC-化合物当前被认为抑制癌变，。

30、 例如通过抑 制可产生引起突变与诱发癌发展的极性环氧 - 二醇类的细胞色素 P450 酶。 0073 在进一步的实施方案中， 本发明组合物可用于制备治疗囊性纤维化的产品。 US20060258599A1 描述了异硫氰酸酯用于治疗患有囊性纤维化的个体的用途。 0074 在另一项实施方案中， 本发明的组合物可用于制备治疗或预防炎性障碍的产品， 特别是可通过 2 期酶类诱导治疗或预防的炎性障碍。可通过 2 期酶类诱导治疗或预防的炎 性障碍是本领域技术人员已知的， 例如是 Juurlink 描述的。Therapeutic potential of dietary phase 2enzyme induc。

31、ers in ameliorating diseases that have an underlying inflammatory component， Can J.Physiol.， Volume 79， 2001， 第 266ff 页。 0075 可用 2 期酶类诱导治疗或预防的炎性障碍的两个典型实例是动脉粥样硬化和肠 炎。 0076 本领域技术人员应理解他们可自由组合本文描述的本发明的所有特点， 而不偏离 本发明公开的范围。 具体地， 对于本发明用途所描述的特征可用于本发明的组合物和产品， 反之亦然。 0077 本发明的另外的优点与特征从以下实施例与图可以显见。 0078 图 1 显示了。

32、在 25下 pH8.5 孵育后， 异硫氰酸烯丙酯 (AITC) 与 - 乳球蛋白 (BLG) 的结合曲线， 从蛋白的 -SH 或 -NH2 基团的消失计算得到。对结合常数 KD与结合位点 的最大数 nmax画实线进行结合曲线的拟合。竖直的棒表示标准偏差。 0079 图 2 显示 BLG-AITC 共价复合物在 pH 4.0 和 pH 7.0 下进行热处理 (85， 15min) 或不经热处理制备的泡沫的体积稳定性， AITC 与蛋白混合比表示在图上。 说 明 书 CN 102341008 A CN 102341022 A6/10 页 8 0080 图 3 显示在 pH 4.0 和 pH 7.0。

33、 下用 0.25mM AITC 或用 BLG-AITC 共价复合物 ( 摩 尔比 1 1) 制备的 10水包油乳剂， 进行热处理 (85， 15min) 或不进行热处理制备 4 天 和 26 天后的肉眼外观。乳剂在 +4下贮存。 0081 图 4 显示 0.5mM 或 1mM AITC 自身， 与 BLG 共价复合物 (AITC/BLG 摩尔比为 1 或 2) 热处理后 (85， 15min) 的辛辣味评价相关的感觉分数。 0082 图 5 显示在与 BLG-AITC 共价复合物 (AITC/BLG 摩尔比为 1 至 20) 孵育后， 在大肠 埃希菌与金黄色葡萄球菌分散物中的光密度 (OD) 。

34、的降低。竖直的棒表示标准偏差。 0083 实施例 ： 0084 实施例1 ： -乳球蛋白/烯丙基异硫氰酸烯丙酯共价复合物形成的测定将-乳 球蛋白(BLG)粉末在室温下搅拌1小时分散于密理博 水中。 BLG购买自Davisco(Biopure， 批号 JE 001-3-922)。蛋白含量为 93.5g/100g 粉末， 通过 Kjeldahl 分析测定 (N x 6.38)。 在主要的乳清蛋白部分中的组成是 ： 89.22 BLG、 6.91 - 乳清蛋白、 3.87牛血清白蛋 白， 通过反相 HPLC(RP-HPLC) 测定 ； 0.2脂肪、 1.5灰分和 4.9水分， 如供应商所述。矿 物质。

35、组成如下 ： 0.87 Na+、 0.004 K+、 0.04 Cl-、 0.019 Ca2+、 0.053 P、 0.002 Mg2+， 通过原子吸收光谱测定。蛋白质在 pH 4.6 的溶解度显示 96的蛋白是天然状态。 0085 蛋白质溶液中的BLG浓度为1mM(1.84w/w)。 4下贮存过夜使水合。 次日， 蛋白 质分散系使用 0.22m GP Express Plus 膜的 Stericup 过滤系统 ( 密理博) 进行滤过。 滤过后的溶液 (pH 7.2) 使用 1M NaOH 调至 pH 8.5。1M HCl 的加入量约为总体积的 0.3。 0086 异硫氰酸烯丙酯 (AITC)。

36、 溶液在试验前通过溶解 AITC(SIN) 在乙醇中得到 200mM 的浓度 (1.98 v/w) 新鲜制备。异硫氰酸烯丙酯 98， 购自 Sigma( 批号 455295)。 0087 50mL 体积的混合物通过将 1mM BLG(pH 8.5) 与 200mM AITC 混合至密理博 水中 制备， 以得到 AITC 与 BLG 0.1 至 40 的摩尔比。将乙醇在全部样品溶液中的最终浓度调至 5。样品在室温搅拌下 ( 使用滚筒混合器 SRT2， Milian， 瑞士 ) 避光孵育 24h。在孵育后， 游离巯基 (-SH) 和氨基 (-NH2) 基团分别使用 Ellman 试剂 5， 5 -。

37、 二硫代 - 双 (2- 硝基苯 甲酸) ； DTNB(Ellman G L. Tissue sulfhydryl groups.1959.Arch Biochem Biophys， 82， 70-77) 和邻苯二醛 (OPA) 法 (Hofmann K， Hamm R.Sulfhydryl and disulfide groups in meats.1978.Adv Food Res， 24， 1-111) 测定。 0088 为了测定总的-SH基团的量， 将样品混合物用200mM含1SDS和8mM尿素pH 8.0 的 Tris- 碱 ( 三 ( 羟基甲基 )- 氨基甲烷 ) 缓冲液稀释， 使。

38、 BLG 最终浓度为 50M。将在乙 醇中的 50L 10mM DTNB 加至 3mL 的这些样品中， 并将它们在室温柔和搅拌下放置 20min。 在 412nm 对相应的试剂空白 (1乙醇在 DTNB 缓冲液中 ) 使用810 分光光度计 (Kontron Instruments， 瑞士巴塞尔)测定吸收值。 无DTNB的样品在此波长下无吸收。 AITC 溶液浓度超过0.1mM， 以与样品相同的条件处理， 在DTNB存在下在指定波长下略有吸收。 因 此， 样品的吸收值对相应浓度的 AITC 吸收进行校正。样品溶液中的 SH 基团浓度根据前面 制备的标准校正曲线进行评价。为此目的， 使用浓度范围。

39、 0.005-0.1mM 溶解在相同缓冲液 的 L-Cys(Fluka， 瑞士 )。 0089 使 用 基 于 Goodno 等 人 的 方 法 (Goodno C.C.Swaisgood H.E.， Catignani G.L. ； (1981).A fluorimetric assay for available lysine in proteins.Anal. Biochem.115(1)， 203-211)和我们实验室的修正， 进行游离(-和-)氨基基团的定量测 说 明 书 CN 102341008 A CN 102341022 A7/10 页 9 定。简言之， 氨基基团的测定是通过将。

40、样品溶液 (0.1mL) 与 0.3 (w/v)N- 乙酰基 -L- 胱 氨酸 (Fluka， 瑞士 ) 在硼酸盐缓冲液 pH9.3(9.1mL) 和 20 SDS(w/w， 0.5mL) 混合进行的。 在 50孵育 10 分钟后， 加入 3.4 OPA 在甲醇中 (w/v) 至混合物 (0.3mL) 中， 在相同温度 下再孵育 30 分钟。在 10mL 样品混合物中 BLG 的最终浓度为 5M。孵育后， 使混合物冷却 至室温 30 分钟， 在 340nm 读取吸收值。使用前面描述的相同的分光光度计。AITC 溶液的浓 度超过0.2mM， 如样品相同的条件进行处理， 在OPA存在下在指定波长下。

41、略有吸收。 因此， 样 品的吸收值用相应的 AITC 浓度吸收值进行校正。样品溶液中的游离 (- 和 -) 氨基基 团浓度按照前面制作的标准校正曲线进行评价。为此目的， L-Leu(Fluka， 瑞士 ) 与相同溶 液进行混合， 并以与上文描述的相同方式孵育， 使用浓度范围 0.002-0.15mM。 0090 假定在此时一个AITC与每一个-SH基团或每一个-NH2基团结合， AITC与BLG的摩 尔结合比 (BAITC/BLG) 从游离 -SH 和 -NH2基团测定值进行估算。通过为每个反应性基团 BAITC/ BL对加入的 AITC 分别作图得到结合曲线 ( 图 1)。 0091 对结合。

42、参数 (KD和 nmax) 的最佳拟合值是通过使用非线性最小二乘回归， 使用 Microcal Origin 6.0 软件 (Microcal Software Inc.， Northampton， 美国 ) 实现的。对每 一结合点， 使用对于一个点结合的方程。 0092 从图 1 可得出结论， AITC 首先与 BLG 的单个游离巯基反应， 得到饱和位点的最大 数 0.840.06。这可以通过计算的非常低的结合常数 KD得到解释， 得到 ITC 对 SH 基团的 高亲和性。因此， ITC 与氨基反应， 氨基对 ITC 具有较低的亲和性 ( 高 KD)， 但具有较大量的 可能的结合位点， 可能。

43、的结合位点是由于在 BLG 上有 16 个游离 NH2。 0093 实施例 2 ： - 乳球蛋白 / 异硫氰酸烯丙酯共价复合物发泡性能的测定 0094 样品 ( 照实施例 1 中的描述制备 ) 的发泡性能使用 Guillerme C， LoiselW， Bertrand D， Popineau Y提出的标准化方法进行评价 ： Study of foam stability by video image analysis ： Relationship with the quantity of liquid in the foams.1993.J Text Stud， 24， 287-302。使用。

44、的仪器是来自 Teclis-ITConcept(Longessaigne， 法国 ) 的 标准版 FoamscanTM。方法的原理是通过特定孔隙率的玻璃料注入气体使一定量的蛋白分 散系发泡。气流与发泡持续时间是受控的。泡沫在液体表面产生， 并在玻璃管中上升， 通 过使用电荷偶联装置 (CCD) 照相机的图像分析实时跟踪其高度。通过测定作为时间函数 的电导率， 并参考在比色皿 ( 剩余的液相 ) 和置于管中不同高度的电极下发泡前溶液的 电导率， 对加入泡沫的液体量与引流速率进行跟踪 (Kato A， Takahashi A， Matsudomi N， Kobayashi K.Determinat。

45、ion of foaming properties of proteins by conductivity measurements.1983.JFood Sci， 48， 62-65)。 0095 如实施例 1 中的描述制备 BLG-AITC 结合物， 然后加入 1M HCl 酸化至 pH 7.0 或 4.0。HCl 加入的量为总体积的 0.02和 0.8， 分别用于中性和酸性 pH 的调节。在两 种 pH 下每个样品 12mL 置于 12mL 玻璃小瓶中， 并在 85加热 15min， 此外需要 5min 使小瓶 温度达到 85。不搅拌在温度控制的水浴中进行加热。接着， 使样品冷却至室温 。

46、40 分钟， 柔和搅拌， 然后置于冰上直至分析。 0096 样品溶液的 20mL 体积 ( 未加热的与加热的 BLG-AITC 共价复合物， AITC 与 BLG 的 摩尔比 0.5、 1 和 2， 在两种 pH 下 )， 稀释至 55M BLG(0.1 ) 置于杯中。氮气以 80mL/min 的流速通到孔隙率 4 的玻璃料中， 产生直径 10 至 16m 的空气泡。在发生强重力排出前该 说 明 书 CN 102341008 A CN 102341022 A8/10 页 10 流速能产生足够的气泡。当气泡体积达到 110cm3的体积时， 停止发泡。因此， 计算气泡容 量 (FC 气泡体积 / 。

47、注入的气泡体积 ) 和气泡膨胀 (FE 气泡体积 / 气泡中的液体体积 )。 在 241下跟踪气泡体积与液体稳定性 ( 气泡排出初始液体含量 50的时间 )30 分钟。 0097 图 2 显示在 pH 7.0 下使用在气泡形成前加热处理或不经加热处理的 BLG-AITC 共 价复合物， 能够得到体积稳定气泡。该结果是复合物空气 / 水表面活性的鲜明指征， 初始 AITC/BLG 摩尔比率轻微地影响气泡体积稳定性， 但比值 1 给出气泡的最佳稳定性。在酸性 条件下 (pH 4.0) 的气泡比 pH 7.0 下更体积稳定， 不论在气泡形成前加热或不加热。这显 示出共价复合物在酸性条件下比中性 pH。

48、 下更能包埋气体与液体。初始 AITC/BLG 摩尔比对 气泡稳定性无显著影响。 0098 表 1 显示了在 pH 4.0 和 7.0 下未加热与加热 (85， 15min) 的摩尔混合比 0.5、 1 和2的BLG-AITC共价复合物在25下泡沫膨胀、 泡沫容量和泡沫液体稳定性。 报告的数据 是均值与相应的标准偏差。 0099 说 明 书 CN 102341008 A CN 102341022 A9/10 页 11 0100 表 1 显示了在 pH 4.0 下未加热处理与加热处理 (85， 15min) 的气泡膨胀值更 低。这表明在 pH 7.0 下得到润湿性略强的气泡。气泡容量比 1 略高， 表明气泡的体积包含 显著量的液体 (1418 至 18 )， 连同注入的氮气。对于未加热的样品得到较高的气泡容量。 对于在酸性下产生的气泡， 气泡液体稳定性显著得到改善(超过30长的时间稳定性)。 像 对于气泡容量， 当共价复合物未进行后续的热处理时， 得到更高的数值。 0101 实施例 3 ： - 乳球蛋白 / 异硫氰酸烯丙酯共价复合物乳化性能的测定 0102 BLG-AITC 结合物 ( 按实施例 1 和 2 中描述制备 ) 在 pH7.0 和 4.0 下未加热和加 热处理的乳化性能， 通过。