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1、(10)申请公布号 CN 103999771 A (43)申请公布日 2014.08.27 CN 103999771 A (21)申请号 201410215448.5 (22)申请日 2014.05.21 A01H 4/00(2006.01) A01G 1/00(2006.01) (71)申请人 太原大学外语师范学院 地址 030012 山西省太原市南内环街南二巷 68 号 (72)发明人 方岩 王培军 夏罗宏 薛斌 (74)专利代理机构 太原晋科知识产权代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 14110 代理人 郑晋周 (54) 发明名称 古巴兰花的快速繁殖方法 (57) 摘要 本发明公开了一种。
2、古巴兰花快速繁殖的方 法， 其步骤分为 ： 制备无性繁殖叶片、 诱导培养获 得愈伤组织、 增殖培养获得大量的愈伤组织、 分化 培养、 生根培养、 炼苗和试管苗移栽。本发明以试 管苗的叶片作为外植体， 通过叶片诱导快速繁殖 形成愈伤组织， 通过愈伤组织的增殖培养、 分化培 养和生根培养， 最终获得古巴兰花小苗。 该方法愈 伤组织诱导率在 80% 以上， 芽苗分化率在 60% 以 上， 生根率在 85% 以上， 解决了古巴兰花无性繁殖 现有技术愈伤组织诱导率极低， 芽苗分化率低和 生根率低的现实问题， 对古巴兰花的规模化育苗 有现实的意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 。
3、页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 103999771 A CN 103999771 A 1/1 页 2 1. 一种古巴兰花的快速繁殖方法， 其步骤为 ： 制备无性繁殖叶片 选取古巴兰花植株的球茎上的芽作为外植体， 用洗洁精刷洗干净 并用自来水冲洗 30min 后， 在无菌条件下用 0.1%HgCl2表面消毒 3min， 然后用 75% 酒精表面 消毒 30s， 最后用无菌水冲洗后， 放在 MS+5.0mg/L 的 6- 苄氨基腺嘌呤 +1.5mg/L 的 a- 萘乙 酸+30g/L的蔗糖+7g/L的琼脂、 PH。
4、为5.8的培养基中培养诱导成苗， 培养条件为 ： 17-23、 光照强度 10001500Lux、 光周期为 15h/d， 待小苗长到 2-3 片叶、 叶长 5-8cm 时， 用剪刀将 叶片剪为 0.8-1.2cm 长的叶片， 备用 ： 诱导培养获得愈伤组织 以 MS 培养基为基本培养基， 再添加 0.5-1.0mg/L 的 6- 苄 氨 基 腺 嘌 呤 （6-benzylaminopurine， 简 称 6-BA） 、 0.3-0.5mg/L 的 2,4- 二 氯 苯 氧 乙 酸 （2,4-dichlorophenoxy， 简称2,4-D） 、 30g/L蔗糖、 7g/L琼脂， 制成PH为5。
5、.8的诱导培养基， 将 （1） 准备的 0.8-1.2cm 长的叶片消毒后置于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养， 培养 条件为 17-23， 暗光培养 60-65 天， 直至获得愈伤组织 ； 增殖培养获得大量的愈伤组织 以MS培养基为基本培养基， 添加0.5-1.0mg/L的6-苄 氨基腺嘌呤 （6-BA） 、 0.2-0.4mg/L 的 2,4- 二氯苯氧乙酸 （2,4-D） 、 30g/L 蔗糖和 7g/L 琼脂， 制成 PH 为 5.8 的增殖培养基， 将 （2） 培养的愈伤组织置于增殖培养基中增殖培养， 培养条 件同 （2） ， 直至获得大量愈伤组织 ； 分化培养 以 MS 培养基为基。
6、本培养基， 添加 8.0-10.0mg/L 的 6- 苄氨基腺嘌呤、 和 0.1-0.3mg/L 的 a- 萘乙酸 （a-naphthlcetic acid ， 简称 NAA） 、 30g/L 蔗糖和 7g/L 琼脂， 制 成 PH 为 5.8 的分化培养基， 将 （3） 培养的愈伤组织置于分化培养基中培养， 培养条件是 ： 17-23、 光照强度为 10001500Lux、 光周期为 15h/d， 直至愈伤组织分化成叶长为 3-4cm 的芽苗 ； 生根培养 以 1/2MS 培养基为基本培养基， 添加 0.8-1.0mg/L 的 a- 萘乙酸、 30g/L 蔗糖 和 7g/L 琼脂， 制备成 。
7、PH 为 5.8 的生根培养基， 将 （4） 培养的芽苗取单苗置于生根培养基中 生根培养， 培养条件同 （5） ， 直至芽苗生根获得古巴兰花生根苗 ； 炼苗 待 （5） 培养的小苗根长到 1-3cm 时， 将培养瓶的封口膜打开， 炼苗 6-8 天 ； 试管苗移栽 试管苗移栽基质为泥炭或蛭石， 基质移栽前用 50% 多菌灵可湿性粉剂的 700-900 液进行消毒， 取出 （6） 培养的小苗用自来水洗净根部的培养基， 稍晾干表面的水分 即可移栽入消毒后的基质中， 然后搭建拱棚， 将拱棚湿度保持在 85%-95%、 温度 20-25， 移 栽 10 天后逐渐降低温度至 17-20， 40 天后进入常。
8、规管理。 权 利 要 求 书 CN 103999771 A 2 1/3 页 3 古巴兰花的快速繁殖方法 技术领域 0001 本发明涉及古巴兰花的组培快繁方法， 特别涉及一种通过叶片诱导快速繁殖古巴 兰花的方法。 背景技术 0002 兰花， 以其形态优美别致、 花朵硕大、 花色艳丽、 色泽丰富、 花期长， 被称为花中之 王。古巴兰花更是兰花之精品。古巴兰花为单轴茎附生花卉， 植株极少萌发侧芽枝， 常规 的繁殖方法难以满足市场需求， 而组织培养是快速繁殖古巴兰花的最有效途径。1960 年， Morel 提出了离体无性繁殖兰花的方法。随着兰花的推广， 对兰花快繁体系的研究也逐渐 深入。各种无性繁殖技。
9、术成为研究的热点。但是， 由于生物的种间差异， 广义上可适用于兰 花无性繁殖的技术， 具体到古巴兰花上并不一定可行。古巴兰花无性繁殖的方法是用根诱 导形成愈伤组织， 再经过分化和生根培养， 这种方法的困难是用根诱导形成愈伤组织的难 度大、 成功率低。而通过叶片诱导快速繁殖古巴兰花的方法尚未见报道。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种通过叶片诱导快速繁殖古巴兰花的方法， 实现在短期 内获得大量优质的试管苗， 解决古巴兰花的规模化生产问题。 0004 本发明是通过下述方式实现的。 0005 一种古巴兰花的快速繁殖方法， 其步骤为 ： （1） 制备无性繁殖叶片 选取古巴兰花植株的球茎上的芽。
10、作为外植体， 用洗洁精刷洗干 净并用自来水冲洗 30min 后， 在无菌条件下用 0.1%HgCl2表面消毒 3min， 然后用 75% 酒精表 面消毒30s， 最后用无菌水冲洗后， 放在MS+5.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+1.5mg/L的a-萘乙 酸+30g/L的蔗糖+7g/L的琼脂、 PH为5.8的培养基中培养诱导成苗， 培养条件为 ： 17-23、 光照强度 10001500Lux、 光周期为 15h/d， 待小苗长到 2-3 片叶、 叶长 5-8cm 时， 用剪刀将 叶片剪为 0.8-1.2cm 长的叶片， 备用 ： （2）诱导培养获得愈伤组织 以 MS 培养基为基本培养基， 再添。
11、加 0.5-1.0mg/L 的 6- 苄氨基腺嘌呤 （6-benzylaminopurine， 简称 6-BA） 、 0.3-0.5mg/L 的 2,4- 二氯苯氧乙酸 （2,4-dichlorophenoxy， 简称2,4-D） 、 30g/L蔗糖、 7g/L琼脂， 制成PH为5.8的诱导培养基， 将 （1） 准备的 0.8-1.2cm 长的叶片消毒后置于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养， 培养 条件为 17-23， 暗光培养 60-65 天， 直至获得愈伤组织 ； （3） 增殖培养获得大量的愈伤组织 以 MS 培养基为基本培养基， 添加 0.5-1.0mg/L 的 6- 苄氨基腺嘌呤 （6。
12、-BA） 、 0.2-0.4mg/L 的 2,4- 二氯苯氧乙酸 （2,4-D） 、 30g/L 蔗糖和 7g/L 琼脂， 制成 PH 为 5.8 的增殖培养基， 将 （2） 培养的愈伤组织置于增殖培养基中增殖培养， 培 养条件同 （2） ， 直至获得大量愈伤组织 ； （4） 分化培养 以 MS 培养基为基本培养基， 添加 8.0-10.0mg/L 的 6- 苄氨基腺嘌呤、 和 0.1-0.3mg/L 的 a- 萘乙酸 （a-naphthlcetic acid ， 简称 NAA） 、 30g/L 蔗糖和 7g/L 琼脂， 制 说 明 书 CN 103999771 A 3 2/3 页 4 成 P。
13、H 为 5.8 的分化培养基， 将 （3） 培养的愈伤组织置于分化培养基中培养， 培养条件是 ： 17-23、 光照强度为 10001500Lux、 光周期为 15h/d， 直至愈伤组织分化成叶长为 3-4cm 的芽苗 ； （5） 生根培养 以 1/2MS 培养基为基本培养基， 添加 0.8-1.0mg/L 的 a- 萘乙酸、 30g/L 蔗糖和 7g/L 琼脂， 制备成 PH 为 5.8 的生根培养基， 将 （4） 培养的芽苗取单苗置于生根培养 基中生根培养， 培养条件同 （5） ， 直至芽苗生根获得古巴兰花生根苗 ； （6） 炼苗 待 （5） 培养的小苗根长到 1-3cm 时， 将培养瓶的。
14、封口膜打开， 炼苗 6-8 天 ； （7） 试管苗移栽 试管苗移栽基质为泥炭或蛭石， 基质移栽前用 50% 多菌灵可湿性粉剂 的 700-900 液进行消毒， 取出 （6） 培养的小苗用自来水洗净根部的培养基， 稍晾干表面的水 分即可移栽入消毒后的基质中， 然后搭建拱棚， 将拱棚湿度保持在 85%-95%、 温度 20-25， 移栽 10 天后逐渐降低温度至 17-20， 40 天后进入常规管理。 0006 本发明的有益效果是 ： 以试管苗的叶片作为外植体， 通过叶片诱导快速繁殖形成 愈伤组织， 通过愈伤组织的增殖培养、 分化培养和生根培养， 最终获得古巴兰花小苗。该方 法愈伤组织诱导率在 8。
15、0% 以上， 芽苗分化率在 60% 以上， 生根率在 85% 以上， 解决了古巴兰 花无性繁殖现有技术愈伤组织诱导率极低， 芽苗分化率低和生根率低的现实问题， 对古巴 兰花的规模化育苗有现实的意义。 0007 实施例 1 选取生长发育健康的古巴兰花植株的球茎上的芽作为外植体， 用洗洁精刷洗干净并 用自来水冲洗 30min 后， 在无菌条件下用 0.1%HgCl2表面消毒 3min， 然后用 75% 酒精表 面消毒 30s， 最后用无菌水冲洗后， 置于在 MS+5.0mg/L 的 6-BA +1.5mg/L 的 NAA +30g/L 的蔗糖和 7g/L 的琼脂、 PH 为 5.8 的培养基中培养。
16、成苗， 培养条件为 ： 17-20、 光照强度 1300-1500Lux、 光周期为 15h/d， 待小苗长到 2-3 片叶， 叶长 7-8cm 时， 用剪刀将叶片剪为 0.8-1.0cm 长的叶片。然后将该叶片消毒后转入 MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 0.5mg/L+7g/L 琼 脂 +30g/L 蔗糖， PH 为 5.8 的诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养， 培养温度 17-19， 暗 培养， 培养 65 天时间愈伤组织诱导率为 80.7%。将诱导出的愈伤组织放在 MS+6-BA 0.5mg/ L+2,4-D 0.2mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 7g/L、 PH 为 。
17、5.8 的增殖培养基中增殖培养， 培养条件 20-23， 暗培养 50 天时愈伤组织的增殖倍数为 2.86。将增殖后的愈伤组织放在 MS+6-BA 10.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L、 PH5.8的分化培养基中分化培养， 培养温度 为 20-23， 光照强度为 13001500Lux， 光周期为 15h/d， 芽苗分化率为 60.9%。待苗长涨 至 3-4cm 长时， 切取单苗放入 1/2MS+NAA 1.0mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 7g/L、 PH 为 5.8 的生 根培养基中培养至 35 天时生根率为 85.3%， 平均根长 1.5cm 和平。
18、均根数为 2.1 条。待根长 长到1-3cm时， 将封口膜打开， 炼苗6天， 然后取出苗用自来水洗净根部的培养基， 稍晾干表 面的水分即可进行试管苗移栽， 试管苗移栽基质为泥炭， 基质移栽前用 50% 多菌灵可湿性 粉剂的 700-900 液进行消毒。然后搭建拱棚， 将拱棚湿度保持在 85%-95%、 温度 20-25， 移 栽 10 天后逐渐降低温度至 17-20， 40 天后进入常规管理。 0008 实施例 2 取古巴兰花植株的球茎上的芽作为外植体， 用洗洁精刷洗干净并用自来水冲洗 30min， 在无菌条件下用 0.1%HgCl2表面消毒 3min， 然后用 75% 酒精表面消毒 30s，。
19、 最后用无菌水冲 洗后， 置于在 MS+5.0mg/L 的 6-BA +1.5mg/L 的 NAA +30g/L 的蔗糖和 7g/L 的琼脂、 PH 为 5.8 说 明 书 CN 103999771 A 4 3/3 页 5 的培养基中培养成苗， 培养条件为 ： 20-23、 光照强度 10001250Lux、 光周期为 15h/d， 待 小苗长到 2-3 片叶， 叶长 7-8cm 时， 用剪刀将叶片剪为 1.1-1.2cm 长的叶片。然后将该叶片 消毒后转入MS+6-BA 0.5mg/L+2,4-D 0.3mg/L+7g/L琼脂+30g/L蔗糖， PH为5.8的诱导培养 基中进行愈伤组织诱导培。
20、养， 培养温度 20-23， 暗培养， 培养 60 天时间愈伤组织诱导率为 80.7%。将诱导出的愈伤组织放在 MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 0.4mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 7g/ L、 PH 为 5.8 的增殖培养基中增殖培养， 培养条件 17-219， 暗培养 55 天时愈伤组织的增殖 倍数为 2.91。将增殖后的愈伤组织放在 MS+6-BA 8.0mg/L+NAA 0.3mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 7g/L、 PH5.8 的分化培养基中分化培养， 培养温度为 17-19， 光照强度为 10001280Lux， 光周期为 15h/d， 芽苗分化率为 64。
21、.2%。待苗长涨至 3-4cm 长时， 切取单苗放入 1/2MS+NAA 0.8mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L、 PH为5.8的生根培养基中培养至33天时生根率为87.1%， 平均根长 1.6cm 和平均根数为 2.3 条。待根长长到 1-3cm 时， 将封口膜打开， 炼苗 8 天， 然 后取出苗用自来水洗净根部的培养基， 稍晾干表面的水分即可进行试管苗移栽， 试管苗移 栽基质为蛭石， 基质移栽前用 50% 多菌灵可湿性粉剂的 700-900 液进行消毒。然后搭建拱 棚， 将拱棚湿度保持在 85%-95%、 温度 20-25， 移栽 10 天后逐渐降低温度至 17-20， 40 天 后进入常规管理。 说 明 书 CN 103999771 A 5 。