一种硫代异鼠李糖基二酰甘油酯的用途.pdf

本发明公开了一种具有如式Ⅰ所示结构的硫代异鼠李糖基二酰甘油酯用于制备止血药物的应用。I式I中的R1或R2代表酰基片段，所述酰基片段为含1‑30个碳原子的直链或支链脂肪酸；且酰基片段中含0‑15个顺式或反式双键。本发明的止血药物可作用于凝血共同途径从而发挥止血作用。本发明止血药物具有良好的体外、体内止血效果。止血作用机制明确，毒副作用小。本发明所用原料来源广泛，提取工艺简单，价格便宜。

1.一种具有如式所示结构的硫代异鼠李糖基二酰甘油酯化合物用于制备止血药物的应用：I式I中的R或R代表酰基片段，所述酰基片段为含1-30个碳原子的直链或支链脂肪酸；且酰基片段中含0-15个顺式或反式双键。 2.一种药物组合物，其特征在于含有如式所示结构的化合物作为止血药物，以及药学上可接受的载体。 3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物中含有1-99.9wt%的如式I所示的化合物。 4.一种如权利要求1所述硫代异鼠李糖基二酰甘油酯化合物的提取制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）以海藻为原料，加入5-15倍体积醇的水溶液，回流提取2-5次，合并提取液；（2）将所得提取液经过滤、浓缩后，用有机溶剂萃取1-3次，合并有机层，减压浓缩，干燥后得所述硫代异鼠李糖基二酰甘油酯提取物。 5.根据权利要求4所述的提取制备方法，其特征在于它还包括如下步骤：将所得提取物通过硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱层析纯化，得硫代异鼠李糖基二酰甘油酯。 6.根据权利要求4所述的提取制备方法，其特征在于所述醇的水溶液为75%的乙醇水溶液。 7.根据权利要求4所述的提取制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为正丁醇。 8.根据权利要求4所述的提取制备方法，其特征在于所述提取物中硫代异鼠李糖基二酰甘油酯含量为50-99%。 9.根据权利要求4或5所述的提取制备方法制备的提取物用于制备止血药物的应用。

技术领域

本发明涉及一种甘油酯类化合物的医药用途，特别涉及一种硫代异鼠李糖基二酰甘油酯在止血药物中的应用。

背景技术

临床上常见的止血方法有手术、压迫止血、药物止血等，其中以药物止血方法最为常见。止血药或凝血药可通过加速血液凝固过程或者阻止纤维蛋白溶解作用而起到止血效果（参见魏伟等，“药理实验方法学”，人民卫生出版社，第四版，第1075-1076页），常用的局部止血药物包括凝血酶、血凝酶、纤维素、明胶、甲壳素等。除此之外止血中药、复方制剂，如云南白药、妇人胶囊、槐花口服液等，也常用于咯血、妇科出血以及痔疮出血等病症（参见何希瑞等，“常用止血中药及其止血机制研究进展”，中国实验方剂学杂志，2010年，第15期，第217-221页）。然而复方药物成分复杂，作用机制不明确，毒副作用大。

硫代异鼠李糖基二酰甘油酯（Sulfoquinovosyldiacylglycerols，SQDGs），即1,2-二酰基-3-O-(6′-硫代-α-D-脱氧吡喃葡萄糖基)甘油，是光合膜上唯一在生理状况下带负电荷的糖脂，存在于所有的光合植物、海藻、蓝细菌、紫色硫细菌以及非硫细菌的类囊体膜中。生物活性研究显示，硫代异鼠李糖基二酰甘油酯具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗白血病等多种生物活性（参见Maciel E等，“Bioprospecting of Marine Macrophytes Using MS-Based Lipidomics as a New Approach”, Marine drugs. 2016, 14(3): 49；蒋志国等，“甘油糖脂生物活性最新研究进展”，中国粮油学报，2009年，第9期，第163-168页；Jain C K等，“Sulfonoquinovosyl diacylglyceride selectively targets acute lymphoblastic leukemia cells and exerts potent anti- leukemic effects in vivo”, Scientific reports, 2015, 5.）。目前，未见有对硫代异鼠李糖基二酰甘油酯在制备止血药物的应用研究报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种具有如式所示结构的硫代异鼠李糖基二酰甘油酯化合物用于制备止血药物的应用。

I

式I中的R1或R2代表酰基片段，所述酰基片段为含1-30个碳原子的直链或支链脂肪酸；且酰基片段中含0-15个顺式或反式双键。

优选地，式I中的R1或R2代表酰基片段，所述酰基片段为含12-24个碳原子的直链脂肪酸；且酰基片段中含0-5个顺式双键。

特别的，如式所示结构的化合物用于制备治疗出血相关疾病，如创伤及外科手术出血；咯血、妇科出血、痔疮出血以及治疗单纯血管因素所致表面局部出血、鼻出血、牙龈出血；衄血的药物中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种药物组合物，其含有如式所示结构的硫代异鼠李糖基二酰甘油酯化合物作为止血药物，以及药学上可接受的载体。

在本发明中，所述药物组合物可以按照本领域熟知的方法配制，可以将活性成分与常规的赋型剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、粘合剂、溶剂、增稠剂或增溶剂等药物辅料混合，制成任何一种适合于临床使用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、口服液体制剂、巴布剂、无菌粉剂、贴剂等。

优选地，所述的药物组合物含有1-99.9 wt%的如式I所示的化合物。

本发明的第三个目的是提供一种硫代异鼠李糖基二酰甘油酯提取物的制备方法，包括如下步骤：

（1）以海藻为原料，加入5-15倍体积醇的水溶液，回流提取2-5次，合并提取液；（2）将所得提取液经过滤、浓缩后，用有机溶剂萃取1-3次，合并有机层，减压浓缩，干燥后得提取物。

优选地，以海藻为原料，加10-12倍体积含水的醇溶液，回流提取3次，合并提取液；所得液体经过滤、浓缩后，用有机试剂萃取3次，合并有机层，减压浓缩，干燥后得的萃取物；将萃取物通过硅胶柱层析梯度洗脱，再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱得硫代异鼠李糖基二酰甘油酯。

更选地，所述醇的水溶液为75%的乙醇水溶液；所述的有机溶剂为正丁醇。

上述所制得的提取物中硫代异鼠李糖基二酰甘油酯含量为50%-99%，该提取物具有良好的止血活性，可用于制备止血药物的应用。

本发明的优点：本发明的化合物止血效果好，作用机制明确，毒副作用小。原料来源广泛，凡光合作用植物都含有本发明所述的硫代异鼠李糖基二酰甘油酯类成分。特别是海藻类原料，因能完成地球90%以上的光合作用，故SQDG含量极为丰富，且来源广泛、价格便宜，如海带、马尾藻、羊栖菜、裙带菜、鼠尾藻、石莼、浒苔、麒麟菜、螺旋藻等，没有毒副作用，且提取工艺简单。

附图说明

图1 为硫代异鼠李糖基二酰甘油酯1H-NMR谱。

图2 为硫代异鼠李糖基二酰甘油酯13C-NMR谱。

具体实施方式下面结合附图并通过具体实施例详细说明本发明，其目的在于帮助更好地理解本发明内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1：硫代异鼠李糖基二酰甘油酯的提取及分离

取褐藻门马尾藻科植物羊栖菜500 g，置于反应容器中，加入5000 mL的75%乙醇，回流提取2 h，重复3次。合并提取液，过滤、浓缩至无醇味。所得液体过滤浓缩后，经正丁醇萃取3次，合并正丁醇层，浓缩蒸干，得正丁醇层萃取物。

正丁醇层萃取物用二氯甲烷/甲醇溶解后，用200-300目硅胶H（青岛海洋化工集团公司产品）拌样，减压除去溶剂；用硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，二氯甲烷-甲醇（v/v 90:10）的洗脱物，再经Sephadex LH-20凝胶柱层析（二氯甲烷-甲醇 1:1洗脱），洗脱得硫代异鼠李糖基二酰甘油酯。

硫代异鼠李糖基二酰甘油酯为淡黄色固体。1H-NMR (500 Hz, CD3OD，如图1)峰形显示出甘油糖脂类化合物的典型特征：δH 4.52 (1H, dd, J = 12.0; 2.5, H-1)，δH 4.22 (1H, dd, J = 12.0; 6.9, H-2)，δH 5.35 (4H, m, H-3a)，δH 4.11 (2H, m, overlapped,H-3b) 为甘油骨架信号；δH4.79 (1H, d, J = 3.7, H-1′)，δH3.43 (1H, dd, J = 9.7, 3.7, H-2′)，δH3.66 (1H, t, J = 9.3, H-3′)，δH3.12(1H, t, J = 9.4, H-4′)，δH4.11(2H, m, overlapped, H-5′)，δH3.38(1H, dd, J = 14.3, 1.8, H-6′ a)，δH2.96 (1H, dd, J = 14.3, 9.0, H-6′ b)为硫代异鼠李糖基信号；δH0.92的三重峰为脂肪酰基部分中的末端甲基信号中的末端甲基信号，δH1.32宽单峰是脂肪酰基部分中众多的亚甲基信号。13C-NMR (150 MHz, CD3OD，如图2)给出了两个羰基碳信号δC 174.9 (-CO-)和δC 175.1 (-CO-)，提示为二酰基取代甘油。与文献比较糖基上的碳信号δC 100.0 (C-1′)，δC 73.4 (C-2′)，δC 74.8 (C-3′)，δC 74.9 (C-4′)，δC 69.8 (C-5′)，δC 54.2 (C-6′)，确定含硫代异鼠李糖。

经与文献比对，确定为硫代异鼠李糖基二酰甘油酯。

采用GC-MS法分析该样品的脂肪酰基组成情况，每种脂肪酸的相对含量以该脂肪酸色谱峰面积占总脂肪酸色谱峰面积的百分比表示，实验结果如下。

表1 硫代异鼠李糖基二酰甘油酯混合物的脂肪酰基组成情况

脂肪酸种类 相对含量/% C14:0 2.06 C15:0 0.20 C16:0 67.23 C18:0 0.39 C16:1n-7 2.02 C18:1n-9 9.27 C20:1n-9 4.39 C22:1n-9 7.60 C18:2n-6 1.15 C18:3n-3 4.41 C20:4n-6 0.43 C20:5n-3 0.85 总计 100.00

实施例2：体外凝血酶时间（TT）的测试

精密称取2.5 mg实施例1中所制得的硫代异鼠李糖基二酰甘油酯，加入1 mL生理盐水，配成浓度为2.5 mg/mL的样品溶液。取绵羊血浆（郑州九龙生物制品有限公司），加入样品溶液，混匀即成待测血样。使用TT试剂盒（南京建成生物工程研究所），按照SL-318型血凝仪（济南森蓝科贸有限公司）操作流程测定待测血样凝固时间。实验前将TT试剂预先水浴加热至37℃。取标准配制待测血样50 μL于血凝槽中，在37℃下孵育3 min。计时枪加入100 μL TT试剂，混匀，开始计时，记录血浆凝固时间，本实验以生理盐水为空白对照，每组测定平行3次。结果表明，空白对照组TT时间为12.52 ± 0.26 s，在100 μg/mL浓度下硫代异鼠李糖基二酰甘油酯组的TT时间为7.46 ± 0.56 s。与空白对照组相比，100 μg/mL的硫代异鼠李糖基二酰甘油酯可明显缩短TT时间（p < 0.001），缩短率为40.42%。以上实验证实，所制取的硫代异鼠李糖基二酰甘油酯是通过作用于凝血共同途径过程从而发挥止血作用。

实施例3：凝血时间的测定

通过玻片法评价实施例1中所制得的硫代异鼠李糖基二酰甘油酯对小鼠凝血时间的影响。取昆明种雄性小鼠，随机分组，每组8只，腹腔注射给药30min后用毛细管左眼眶内眦取血，迅速滴血于玻片上，立即开始计时。此后每隔30s用干燥针头挑动血液一次，直至挑起细纤维血丝止，即为凝血时间。本实验以生理盐水为空白对照组，实验数据采用t-检验分析。实验结果（表2）表明，50 mg·kg-1浓度硫代异鼠李糖基二酰甘油酯，能明显缩短小鼠凝血时间；与空白对照组相比缩短百分率为52.92%，且存在显著性差异（p<0.05）。

表2 玻片法测定对小鼠凝血时间的影响

组别 剂量 (mg·kg-1) 凝血时间 (min) 缩短百分率 (%) 空白对照组 - 2.57±0.95 - 硫代异鼠李糖基二酰甘油酯组 50 1.21±0.29* 52.92%

注：与生理盐水组比较，* P < 0.05。

实施例4：出血时间的测定

通过小鼠断尾法实验评价实施例1中所制得的硫代异鼠李糖基二酰甘油酯对小鼠出血时间的影响。取昆明种雄性小鼠，随机分组，每组8只，腹腔注射给药，固定，以毫米尺测鼠尾长度并标记之，给药30 min后以利剪将小鼠尾尖3 mm处横断，待血液自行溢出开始计时，每隔30 s用滤纸吸去血滴1次，直到血液自然停止为止，即为出血时间。本实验以生理盐水为空白对照组，实验数据采用t-检验分析。实验结果（表3）表明，与空白对照组相比，硫代异鼠李糖基二酰甘油酯在50 mg·kg-1浓度下能显著缩短小鼠出血时间（p < 0.05），缩短百分率为28.96%。

表3 小鼠断尾法测定对出血时间的影响

组别 剂量 (mg·kg-1) 出血时间 (min) 缩短百分率 (%) 空白对照组 - 19.44±4.61 - 硫代异鼠李糖基二酰甘油酯组 50 13.81±1.33* 28.96%

注：与生理盐水组比较，* P < 0.05。

实施例5：外用止血作用

取雄性昆明种小鼠，随机分组，每组8只。在距小鼠尾尖1.0 cm处剪短。待血液自行溢出时，将实施例1中所制硫代异鼠李糖基二酰甘油酯外敷于创面，空白对照组在创面外敷等量的普通淀粉。开始计时，直到血液自然停止为止，即为出血时间。实验结果表明，硫代异鼠李糖基二酰甘油酯组可显著减少小鼠的出血时间（p < 0.01），缩短百分率为19.3%，即硫代异鼠李糖基二酰甘油酯具有较好的外用止血作用。

实施例6：提取物的止血活性

称取褐藻门马尾藻科植物铜藻200 g，置于反应容器中，加入2400 mL的80%乙醇，回流提取2 h，重复3次。合并提取液，过滤、浓缩至无醇味。所得液体过滤浓缩后，经乙酸乙酯萃取3次后，取水层提取物。再用正丁醇萃取3次，合并正丁醇层，浓缩蒸干，得提取物。

精密称取2.5 mg上述提取物，加入1 mL生理盐水，配成浓度为2.5 mg/mL的样品溶液。取绵羊血浆（郑州九龙生物制品有限公司），加入样品溶液，混匀即成待测血样。使用TT试剂盒（南京建成生物工程研究所），按照SL-318型血凝仪（济南森蓝科贸有限公司）操作流程测定待测血样凝固时间。实验前将TT试剂预先水浴加热至37℃。取标准配制待测血样50 μL于血凝槽中，在37℃下孵育3 min。计时枪加入100 μL TT试剂，混匀，开始计时，记录血浆凝固时间，以生理盐水作为空白对照组，每组测定平行3次。结果表明，空白对照组TT时间为12.54 ± 0.29 s，在100 μg/mL浓度下提取物组的TT时间为12.02 ± 0.10 s。与空白对照组相比，100 μg/mL的提取物可明显缩短TT时间（p < 0.05）。以上实验证实，经上述实验方法所制取的提取物具有止血作用。

实施例7：无菌粉剂的制备

将实施例1中所制得的硫代异鼠李糖基二酰甘油酯进行研磨粉碎，过300目筛，获得粒度均匀的粉散剂，辐照灭菌，即得硫代异鼠李糖基二酰甘油酯无菌粉，密闭保存。

需要说明的是，以上所述的仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也不应排除在本发明的保护范围之外。