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1、10申请公布号CN104055797A43申请公布日20140924CN104055797A21申请号201410269270222申请日20140617A61K35/56200601A61K38/00200601G01N30/88200601A61P35/00200601A61P31/2020060171申请人安徽华润金蟾药业股份有限公司地址235000安徽省淮北市龙发路39号72发明人边宝林高波司南王宏洁罗川54发明名称蟾皮提取物中两类组合物成分的检测及鉴定57摘要本发明提供了一种蟾皮中两类组合物成分的检测及鉴定方法。本发明是以干蟾皮为原料经过水提醇沉的方法制成中间提取物后，进行凝胶色谱分。
2、离、ODS纯化得到的，一种或N种多肽组成的组合物。运用HPLC凝胶层析色谱法，结合已知标准品制备校正曲线，得到该组合物成分分子量分布范围是100010000DA。本发明还涉及一种蟾皮中的脂溶性组合物，是以干蟾皮为原料经过水提醇沉的方法制成中间提取物后以溶剂或者层析色谱的方法得到的一种或N种脂溶性成分组合而成的组合物。照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈水为流动相进行梯度洗脱，联用质谱（HPLCMS），通过推导质谱的碎片信息并与已知标准品对比，指认出蟾皮脂溶性组合物中33个色谱峰代表的化合物。51INTCL权利要求书1页说明书11页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12。
3、发明专利申请权利要求书1页说明书11页附图4页10申请公布号CN104055797ACN104055797A1/1页21一种蟾皮提取物，其特征在于该蟾皮提取物由以下步骤制备得到取干蟾皮，洗净，加515倍蒸馏水提取，第一次3060分钟，第二次3060分钟，合并水提液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1014（80）后，离心得到；或者取干蟾皮，洗净，加515倍蒸馏水提取，第一次3060分钟，第二次3060分钟，合并水提液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1014（80）后，分别用4070、7590的乙醇沉淀，滤过，将滤液回收乙醇得到。2一种蟾皮组合物，其特征在于由权利要求1中所述蟾皮提取物进一步分离纯化得到，。
4、其主要包括蟾皮中多肽组合物和脂溶性组合物。3如权利要求2所述的组合物，其特征在于所述分离纯化方法是通过凝胶色谱分离、烷基键合硅胶纯化或溶剂分配结合层析色谱的方法得到的。4如权利要求2或3任一项所述的组合物，制备材料涉及凝胶包括葡聚糖凝胶和聚甲基丙烯酸基质凝胶；烷基键合硅胶包括C4、C8、C18键合硅胶的亲水及一般型；溶剂分配所用有机系溶剂涉及二氯甲烷、三氯甲烷，分配方法涉及溶剂萃取、超临界萃取。5权利要求14任一项提取物或组合物、含有所述组合物或提取物的制剂的检测方法，其特征在于采用高效液相凝胶色谱检测系统、紫外分光光度检测系统（UV）建立的多肽组合物的定性、定量方法。6权利要求23所述的组合。
5、物、含有所述组合物的制剂的检测方法，其特征在于采用高效液相质谱联用检测系统（HPLCMS）对脂溶性组合物成分进行定性检测及成分指认。7根据权利要求2所述的多肽组合物主要是指蟾皮及其相关制剂中，分子量在100010000DA的小分子肽类。8根据权利要求5或6所述的检测方法，适合于混合多肽的快速定性、定量检测，特别是针对蟾皮及其制剂，包括注射剂、片剂、口服液、胶囊等中药产品。9根据权利要求2所述的脂溶性组合物主要是指蟾皮及其相关制剂中的毒配基类成分的混合物。10根据权利要求5所述发明方法，适合于混合毒配基类成分的同时、快速定性、定量检测，特别是针对蟾皮及其制剂，包括注射剂、片剂、口服液、胶囊等中药。
6、产品。11权利要求1所述蟾皮提取物中脂溶性成分的检测方法，其特征在于采用高效液相色谱串联高分辨傅里叶变换离子回旋共振质谱测定，色谱柱为反相色谱柱，采用流动相为甲醇和水的梯度洗脱，紫外与质谱检测进行的。12如权利要求11所述的检测方法，其特征在于所述色谱柱为十八烷基键和硅胶色谱柱。13权利要求14任一项提取物或组合物、含有所述组合物或提取物的制剂的检测方法，其特征在于对其中所含的多肽类成分进行检测，采用高效液相凝胶色谱法，采用流动相为乙腈和水，紫外检测。14蟾皮提取物、及含有该组合物成分的制剂中多肽类组合物成分的含量测定方法，其特征在于经过权利要求24所述方法的预处理，可采用多肽特征显色结合紫外。
7、比色的方法进行，该方法简单易行、干扰少、结果准确。权利要求书CN104055797A1/11页3蟾皮提取物中两类组合物成分的检测及鉴定技术领域0001本发明属中药技术领域，具体涉及蟾皮提取物中两类组合物成分、及含有该一种或两种组合物制剂的检测及鉴定。背景技术0002蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍等的干燥皮,具有清热解毒、利水消胀之功效,临床用于治疗痈疽、肿毒、肿瘤、疳积腹胀、慢性气管炎等病症。蟾皮水溶性部位开发的药品已有多个上市,尤其华蟾素注射液，是从中华大蟾蜍皮经加工制成的水溶性制剂，治疗原发性肝癌和中晚期肺癌分别获得44和56的综合有效率，瘤体缩小率分别为10和16,且对化疗和放疗具。
8、有协同作用。临床应用表明华蟾素注射液具有解毒、消肿、止痛之功效，用于治疗中、晚期肿瘤、慢性乙型肝炎等症，其生理活性物质主要是蟾蜍毒素类BUFOTOXINS及其水解产物蟾毒配基类BUFAGEINS、蟾蜍色胺类BUFOTEININES等。0003从蟾蜍（主要是蟾皮）中已经确定的化合物来看，其成分主要可以分为蟾毒配基类、蟾蜍毒素类、蟾毒色胺类三大类以及核苷酸、多肽、氨基酸等其他化合物。但蟾皮的药用价值还没有得到充分的开发利用。目前为止，国内外关于蟾蜍以及华蟾素的研究焦点主要集中在其脂溶性蟾毒配基类等成分。该类成分中，其主要蟾毒配基类成分的化学模式与蟾酥及其制剂存在较大差异。大量研究结果表明，蟾皮提取。
9、物中的蟾毒配基类成分具有明显的细胞毒性抗肿瘤活性。同时，发明人发现大量的多肽类成分存在于蟾皮的提取物中，经过试验证实，该类成分具有一定的抗肿瘤、增强免疫、以及很广泛的镇痛作用。可见，华蟾素系列制剂在肿瘤治疗方面的良好表现，不仅来源于蟾毒内酯类成分。0004众所周知，从动物类中药原料中获得有价值的化合物极为困难，成本很高，一般不使用蟾皮中的纯化合物，而使用提取物直接用作药用原料。但蟾皮提取物的一个缺点是，成分复杂、有效成分及其含量不清楚，因此给药品的质量控制造成很大困难。为了保持蟾皮提取物及含有该提取物的药物、制剂的质量稳定，清楚知道其药效成分及其含量是十分重要的。目前，对于蟾皮提取物制剂多集中。
10、于其中总配基的含量检测，或者对其中常见毒配基类（如蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基等）单体成分进行测定。基于缺乏蟾皮提取物中蟾毒配基类成分的化学模式全面而深入的研究，导致其临床发挥抗肿瘤作用的效应物质基础长期未予明确。另一方面，对于其中多种多肽成分的组合物的解析就更加复杂和困难。0005本发明对蟾皮进行提取后得到蟾皮提取物，该提取物经过分离纯化制备得到多肽及脂溶性两类组合物。经过对该两类组合物的多种方法的检测，为阐明该组合物的组成，对其中化学成分进行分析和鉴定，为进一步深入研究其抗肿瘤效应机制、解析临床起效部位奠定了物质基础。发明内容0006本发明的目的是对蟾皮提取物进行分离解析，提出对其进行质。
11、量控制的新方法。本发明涉及的蟾皮提取物、蟾皮组合物、蟾皮制剂，具有解毒、消肿、止痛之功效，用于中、晚说明书CN104055797A2/11页4期肿瘤、慢性乙型肝炎等症的治疗。0007本发明提供了一种或几种来源于蟾皮的组合物。包括多肽类组合物和脂溶性组合物。0008本发明提供了一种或几种对于多肽类组合物的检测方法，指认了该种组合物分子量组成及区域，同时对于蟾皮组合物中多肽类组合物进行定量检测。测定方法排除了诸多干扰因素，方法简单易行，结果准确性强0009本发明提供了一种或几种对于蟾皮中脂溶性组合物的检测方法，能够同时对组合物中多种成分进行指认和鉴别。测定方法干扰小，说服力强。0010以下通过具体。
12、实施方式对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领域技术人员可以根据发明做出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。0011本发明的目的是通过如下技术方案实现0012本发明蟾皮组合物的检测方法包括如下检测方法中的一种或几种0013A一种蟾皮提取物0014一种蟾皮提取物，其特征在于它是以干蟾皮为原料经过水提或水提醇沉的方法制成的。0015B一种蟾皮中多肽组合物0016一种蟾皮中的多肽类组合物，是以干蟾皮为原料经过水提或水提醇沉的方法制成蟾皮提取物后，进行凝胶色谱分离、烷基键合硅胶纯化得到的，一种或N种多肽组成的组合物。运用HPLC凝胶层析色谱法，结合已知。
13、标准品制备校正曲线，得到该组合物成分主要分子量分布范围是100010000DA。经过上述处理后，能够对蟾皮提取物及提取物制剂中的多肽组合物成分，使用常规多肽显色方法进行含量测定，方法简便，准确性高。0017C一种蟾皮中脂溶性组合物0018一种蟾皮中的脂溶性组合物，是以干蟾皮为原料经过水提或水提醇沉的方法制成蟾皮提取物后，以溶剂或者层析色谱的方法得到的一种或N种脂溶性成分组合而成的组合物。照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇水为流动相进行梯度洗脱，联用质谱（HPLCMS），通过推导质谱的碎片信息并与已知标准品比对，指认出蟾皮脂溶性组合物中33个色谱峰代表的化合物。酯蟾毒配基、。
14、华蟾酥毒基、日蟾毒他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒他灵、华蟾毒他灵和蟾毒灵等。0019附图说明0020图1是“校准曲线及函数公式”0021“校正曲线是Y05072X69794R209934”0022图2是“多肽样品谱图”0023图3是“多肽样品放大的谱图”0024图4是“洗脱曲线”0025图5是“多肽标准品标准曲线”0026图6是“HPLC（296NM）色谱图”0027图7是“LCMS离子流图”0028说明书CN104055797A3/11页50029具体实施方式0030下面实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。0031实验例1本发明蟾皮提取物的制备0032干蟾皮洗净，用515倍的水提取。
15、2次，浓缩至小体积后分别用5070、7590的乙醇沉淀，滤过，回收乙醇得到蟾皮提取物；或者，干蟾皮洗净，用515倍的水提取2次，浓缩至相对密度为101135（80）后，分别用4070、7590的乙醇沉淀，滤过，将滤液回收乙醇得到蟾皮提取物。0033具体操作方法为取干蟾皮进行修治后，加入8倍水（V/M），煎煮2次，每次30MIN，滤过，合并滤液，浓缩。浓缩至小体积（相对密度在101135，80），冷却至40，加入95乙醇调节醇浓度为4060进行一次醇沉，后倾出上清液；将上清液回收乙醇至无醇味，加入95乙醇调节醇浓度为7590进行二次醇沉，静置后常压滤过，滤液浓缩至稠膏，冷藏24H，离心，即得蟾皮。
16、提取物。0034实验例2本发明蟾皮提取物中多肽组合物的制备0035使用葡聚糖凝胶SEPHADEXG10、G15、G25、G50、G75或LH20对实施例1中所述蟾皮提取物进行分离纯化，装柱径高比115，上样体积比140，恒流速3ML/MIN去离子水洗脱，按照柱体积1/10进行收集，采用双缩脲反应进行跟踪，收集反应阳性馏分合并后冷冻干燥，得到多肽类组合物；0036或者，使用聚甲基丙烯酸酯凝胶HW40、HW50或HW65对中间体进行分离纯化，装柱径高比11520，上样体积比11040，恒流速310ML/MIN去离子水洗脱，按照柱体积1/10每份进行收集，采用双缩脲反应进行跟踪，收集反应阳性馏分合并。
17、后冷冻干燥，得到多肽类组合物。0037实验例3多肽组合物分子量值的估算003831标准品分析条件及结果0039311标准品及其配制0040标准品生长抑制素MW16380041胸腺肽ALPHA1MW31080042胰岛素MW58080043核糖核酸酶MW137000044以上标准品加水溶解，配制成浓度为1MG/ML的溶液，待测。0045312分析条件色谱柱G2000SWXL（78MM30CM）0046柱号S00420047流动相ACNH2O28加005TFA0048流速07ML/MIN0049检测器UV214NM0050313分析结果（见表1，图1）0051表1标准品保留时间，保留体积以及分子量。
18、对数表005232多肽样品测定条件及结果0053321供试样品的制备0054多肽样品为本发明实施例2中所述蟾皮提取物中的多肽组合物。说明书CN104055797A4/11页60055取实施例2中多肽组合物，加水溶解，配制成样品浓度为01MG/ML的溶液，即为多肽供试品。0056322分析条件色谱柱TSKGELG2000SWXL78MM30CM0057柱号T017620058保护柱无0059洗脱液ACNH2O28加01TFA0060流速10ML/MIN0061检测条件UV214NM0062323分析结果（见表2、图2、图3）00630064表2谱图积分结果006533实验结论根据以上实验结果可见。
19、，来源于蟾皮的多肽组合物是由N种多肽组合而成的混合物，分子量范围集中在100010000DA。实验例4华蟾素注射液多肽含量测定41方案采用葡聚糖凝胶G10对华蟾素注射液中的多肽进行分离、富集，浓缩至适当体积，再以标准肽做标曲，双缩脲法进行测定。42材料仪器紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）试剂CUSO45H2O，NAOH，氯化钠，去离子水，酒石酸钾钠多肽标准品CL705，序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRNH2分子量329769纯度95。（CHINAPEPTIDES,CO,LTD）华蟾素注射液由安徽金蟾生化有限公司提供。43实验步骤及结果431试剂配制双缩。
20、脲试剂称以150G硫酸铜（CUSO45H2O）和60G酒石酸钾钠（KNAC4H4O64H2O），用500ML水溶解，在搅拌下加入300ML10NAOH溶液（G/ML），用水稀释到1L。生理盐水取360G氯化钠，800ML水溶解，稀释至1L。432供试品制备多肽分离、富集采用葡聚糖凝胶G10进行供试品制备。考察了不同的柱型号（1020CM/30ML，1545CM/45ML）、上样量。并对收集方法进行了确定上样后，生理盐水洗脱，每份1ML收集，220NM及275NM处测定吸收值，做洗脱曲线；根据峰合并（结合双缩脲反应检识）。图4为弃去前10ML后的洗脱曲线。多次结果表明，上样后洗脱，弃去前14ML。
21、，收集7ML，再浓缩后即得。由以上结果得到供试品制备方法精密取25ML注射液进行减压浓缩至干，12ML生理盐水复溶，上样至G10柱（柱型号1545CM；柱床体积45ML），生理盐水洗脱，弃去前14ML，收集7ML洗脱液，再50减压浓缩至干，即得待测样品。433标准溶液配制精密称取60MG多肽标品，生理盐水溶解，定容至5ML。标品浓度为12MG/ML，作为储备说明书CN104055797A5/11页7液。储存于4。434标准曲线制备分别取多肽标准液0,0133,0337,0500,0666,0867,1000ML，用生理盐水补足至10ML，分别加入双缩脲试剂2ML，摇匀，以第一管作为空白，30M。
22、IN后，在540NM处测定吸光度值。以浓度为X轴，吸光度值为Y轴，做标准曲线。标准曲线方程为Y004475X001107；R09985。线性范围为212MG/ML。表3标准肽标准曲线测定结果编号0123456标准肽含量MG/ML020040060080010001200吸光度值/WL540NM0009801950292037904610532435精密度精密移取华蟾素注射液（批号100615）25ML，按供试品制备项下操作得到待测样品，再按标准曲线制备项下操作，连续6次测定其吸光度值。结果表明，RSD为0，精密度很好。表4精密度实验结果436重复性取同一华蟾素注射液（批号100615），平行6。
23、份，按供试品制备项下操作，按标准曲线制备项下测定吸光度值。表5重复性实验结果437显色稳定性取华蟾素注射液（批号100613）25ML，按供试品制备项下操作，再按标准曲线制备项下于0,2,4,6,8,10MIN后分别测定吸光度值。表610MIN内稳定性结果取华蟾素注射液（批号100613）25ML，按供试品制备项下操作，再按标准曲线制备项下于10,20,30,40,50,60MIN后分别测定吸光度值。表760MIN内稳定性结果说明书CN104055797A6/11页8438加样回收率取同一华蟾素注射液样品（批号100615）15ML,平行6份，每份加入标准品4MG，按供试品制备项下操作，再按标。
24、准曲线项下测定吸光度值。根据结果，计算回收率。表8加样回收率结果（N6）439样品测定各取9批次华蟾素注射液样品25ML，按供试品制备项下操作，再按标准曲线制备项下分别测定吸光度值。结果见表9。表9样品测定结果实验例5脂溶性组合物的定性鉴别51仪器与分析条件分析仪器SOLARIXFTICRMS94T（德国BRUKER公司）；AGILENT1260高效液相色谱仪；色谱条件DIAMONSILC18色谱柱（46MM250MM，5M）；流动相甲醇（A）水（B），梯度洗脱程序05MIN，520A；545MIN，2042A；4570MIN，42100A；流速10ML/MIN；柱温30；进样量10L；检测波。
25、长296NM。说明书CN104055797A7/11页9质谱条件电喷雾离子源喷雾电压4000V，干燥气温度180，干燥气流速40L/MIN，喷雾气压力05BAR；正离子扫描模式采集，质谱扫描范围M/Z701500。52对照品制备分别精确称量酯蟾毒配基，华蟾酥毒基、日蟾毒他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒他灵、华蟾毒他灵、蟾毒灵对照品，加甲醇溶解，配置成以上给对照品02MG/ML的混合标准溶液，022M滤膜过滤，即得对照品溶液。53供试品的制备取本发明实施例1制备得到的蟾皮提取物，按照11的比例与硅胶拌匀，分散，加热混合物至完全干燥。用二氯甲烷进行索氏回流提取，滤过得到提取液，减压干燥，得到脂溶性。
26、组合物部分。取该组合物8MG加2ML甲醇溶解，022M微孔滤膜滤过，即得供试品。54结果与讨论通过推导质谱的碎片信息并与已知标准品对比，从组合物供试品色谱峰中推断出33个化合物。分别为日蟾毒他灵，沙蟾毒精，远华蟾毒精，蟾毒他灵，华蟾毒他灵，蟾毒灵、酯蟾毒配基、华蟾酥毒基等。结果见表10、图6。表10HPLCMS解析数据说明书CN104055797A8/11页10说明书CN104055797A109/11页11说明书CN104055797A1110/11页12说明书CN104055797A1211/11页13说明书CN104055797A131/4页14图1图2说明书附图CN104055797A142/4页15图3图4说明书附图CN104055797A153/4页16图5图6说明书附图CN104055797A164/4页17图7说明书附图CN104055797A17。