水稻抗稻瘟病蛋白及其编码基因与应用.pdf

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1、10申请公布号CN104072596A43申请公布日20141001CN104072596A21申请号201410314670022申请日20140703C07K14/415200601C12N15/29200601C12N15/82200601A01H5/0020060171申请人中国科学院遗传与发育生物学研究所地址100101北京市朝阳区北辰西路1号院2号72发明人朱立煌吕启明徐筱江光怀李晓兵李仕贵徐吉臣74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅54发明名称水稻抗稻瘟病蛋白及其编码基因与应用57摘要本发明公开了一种水稻抗稻瘟病蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白。

2、质是如下A或BA由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；B将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗稻瘟病相关的由A衍生的蛋白质。本发明所提供的PID3KN蛋白及其编码基因可用于培育抗稻瘟病植物新品种，特别是对由下述稻瘟病菌MAGNAPORTHEORYZAE小种中的至少一种引起的稻瘟病表现出抗性0310661、073112、0310763、04821、102511、103221、1012821、106231、0311371、075511、10120212、99202、CH43、99262、ZHONG10814、CHUANGZB15、97272、Y34。

3、、B04、B16和B23。这将有利于对水稻品种的改良，对扩大作物种植范围，提高农作物产量具有重要意义。51INTCL权利要求书1页说明书12页序列表8页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书12页序列表8页附图3页10申请公布号CN104072596ACN104072596A1/1页21蛋白质，是如下A或BA由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；B将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗稻瘟病相关的由A衍生的蛋白质。2编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。3根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子为。

4、编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为如下14中任一所述的DNA分子1编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；2序列表中序列1所示的DNA分子；3在严格条件下与1或2所限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；4与1或2所限定的DNA分子至少具有90以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。4含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。6根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为35S启动子。7权利要求1所述的。

5、蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4或5或6所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在如下A1或A2中的应用A1调控植物对稻瘟病的抗性；A2选育抗稻瘟病植物品种。8一种培育抗稻瘟病转基因植物的方法，包括如下步骤将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入目的植物，获得抗稻瘟病的转基因植物。9根据权利要求7所述的应用，或权利要求8所述的方法，其特征在于所述稻瘟病由下述稻瘟病菌MAGNAPORTHEORYZAE小种中的至少一种引起0310661、073112、0310763、04821、102511、103221、1012821、106231、0311371、075511、10120212、99。

6、202、CH43、99262、ZHONG10814、CHUANGZB15、97272、Y34、B04、B16和B23。10根据权利要求79中任一所述的应用或方法，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物。权利要求书CN104072596A1/12页3水稻抗稻瘟病蛋白及其编码基因与应用技术领域0001本发明属于植物基因工程领域，涉及一种水稻抗稻瘟病蛋白及其编码基因与应用。背景技术0002植物在生长发育过程中会受到各种病原微生物的侵袭，虽然植物不具备主动“趋利避害”的能力，但在长期与各种病原微生物共进化过程中，植物形成了对病原微生物精确的信号感知与防御系统。植物先天免疫主要包括三方面内容基础抗性。

7、、抗病基因介导的抗性以及系统获得性抗性。其中，抗病基因介导的抗性由于反应时间快，抗病反应强烈，常常伴随着病原菌侵染点的超敏反应以及细胞程序化死亡，使其成为植物抗病的一个重要组成部分。FLOR在研究亚麻锈病抗性基因遗传时提出了“基因对基因”学说，其具体表述为病原菌不同的小种带有不同的无毒基因，当植物中的抗病基因能够特异识别病原菌当中的无毒基因时，就能通过信号传导启动抗病反应。因此，对植物抗病基因产物的结构分析与研究，是了解植物抗病机制的基础。0003水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米为主要食物。稻瘟病是水稻最主要的病害之一，全球每年因稻瘟病造成的水稻减产达1130，严重。

8、时减产达4050，甚至颗粒无收。实践证明，利用含有抗稻瘟病基因的水稻品种是应对稻瘟病危害的有效办法之一。到目前为止，在水稻中已至少报道了68个抗稻瘟病位点共83个主效基因，这些基因成簇地分布于除第3染色体外的所有水稻染色体上，已经克隆的有25个，它们分别是PB1、PIA、PIB、PID2、PID3、PIK、PIKH/PI54、PIKM、PIKP、PISH、PIT、PITA、PIZT、PI1、PI2、PI5、PI9、PI21、PI25、PI36、PI37、PI56T、RBR2、PI50、PI54RH，其中除了基因PID2编码一个丝苏氨酸受体类似激酶以及隐性抗稻瘟病基因PI21编码一个富脯氨酸蛋白。

9、外，其他24个抗稻瘟病基因全都属于NUCLEOTIDEBINDINGSITELEUCINERICHREPEATNBSLRR基因家族。NBSLRR基因由N端保守的核苷酸结合位点NBS和C端富亮氨酸重复LRR区域构成，在LRR区域，由数十个一般1540个不完全的LRR结构构成。尽管目前已经克隆了25个抗稻瘟病基因，但因为稻瘟病菌小种众多且变异速度快，所以，克隆更多的抗稻瘟病基因以应对稻瘟病的危害就显得尤为重要。0004对目前已经克隆的25个抗稻瘟病基因统计分析发现，从1999年第一个抗稻瘟病基因PIB被克隆开始，到2006年七年间只克隆了一个抗稻瘟病基因PITA，从2006年开始，抗稻瘟病基因的克。

10、隆出现大规模增长趋势，然而从已经克隆的这些抗稻瘟病基因位点可以发现，从2009年开始，尽管抗稻瘟病基因的数目在增加，但真正的抗稻瘟病基因位点数却增加得很少，后来克隆的抗稻瘟病基因大多数都是已经克隆的等位或是直系同源基因。虽然它们的序列差异很小，但对病原菌的抗性不尽相同。如PI9、PI2、PIZT基因均位于水稻第6号染色体同一位点的基因簇上，序列相似性高达9884，但稻瘟病菌株接种实验证明，三个等位基因的抗谱分别为937、922和545。另外，PIK基因簇上也鉴定了PIK，PIKM，PIKH，PIKP，PIKS，PI1共6个等位基因，对其中3个已经克隆的等位基因接说明书CN104072596A2。

11、/12页4种试验表明，抗谱由宽到窄依次为PIKM、PIK、PIKP。因此利用已经克隆的抗稻瘟病基因序列信息来发掘其他抗稻瘟病材料中的抗性等位应该是更方便更快捷的途径。0005目前，对抗稻瘟病基因的克隆还是主要依靠图位克隆，虽然籼稻9311和粳稻日本晴都有了全基因组序列，为水稻基因的图位克隆带来了巨大方便，但对于抗稻瘟病基因的克隆来说，依然还存在很多困难。比如对精细定位群体内各单株的稻瘟病抗性鉴定，不仅工作量巨大，而且田间稻瘟病发病情况还很容易受环境影响，造成性状统计错误，而不能准确定位；另外，从已经测序的9311和日本晴基因组序列来看，NBSLRR基因大多都是成簇存在，即使能够将目标基因定位到。

12、某一区段，也很难判断成簇基因中的哪一个才是真正的抗病基因。因此，可以直接利用已经克隆的NBSLRR型基因序列信息，克隆其在野生稻或者其他对稻瘟病具有高抗效应的水稻品种中的同源基因，直接转化易感稻瘟病的水稻品种，从而筛选出具有更优良抗性的基因。发明内容0006本发明的目的是提供一种水稻抗稻瘟病蛋白及其编码基因与应用。0007本发明所提供的蛋白质，名称为PID3KN，来源于栽培稻品种KASALATH，是如下A或B0008A由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；0009B将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗稻瘟病相关的由A衍生的蛋白质。0010其中。

13、，序列表中的序列2由924个氨基酸残基组成。0011为了便于PID3KN蛋白的纯化，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。0012表标签的序列0013标签残基序列POLYARG56通常为5个RRRRRPOLYHIS210通常为6个HHHHHHFLAG8DYKDDDDKSTREPTAGII8WSHPQFEKCMYC10EQKLISEEDL00140015上述B中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述B中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱。

14、基对的错义突变。0016编码所述PID3KN蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。说明书CN104072596A3/12页50017所述核酸分子可以是DNA，如CDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如MRNA、HNRNA或TRNA等。0018在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述PID3KN蛋白的基因名称为PID3KN，所述PID3KN基因为如下14中任一所述的DNA分子00191编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；00202序列表中序列1所示的DNA分子；00213在严格条件下与1或2所限定的DNA分子杂交且编码所述PID3KN蛋白的DNA分子；0。

15、0224与1或2所限定的DNA分子至少具有90以上同源性且编码所述PID3KN蛋白的DNA分子。0023上述严格条件可为用6SSC，05SDS的溶液，在65下杂交，然后用2SSC，01SDS和1SSC，01SDS各洗膜一次。0024其中，序列1由2775个核苷酸组成，整个序列1即为所述PID3KN基因的编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质所述PID3KN蛋白。0025含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。0026所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。0027所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和。

16、可用于植物微弹轰击的载体等，如PGREEN0029、PCAMBIA3301、PCAMBIA1300、PBI121、PBIN19、PCAMBIA2301、PCAMBIA1301UBIN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与MRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到MRNA前体的3端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒CAMV35S启动子、泛素基因UBIQUITIN启动子PUBI、胁迫诱导型启动子RD29A等，。

17、它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植。

18、株。0028在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述PID3KN基因转录的启动子具体为35S启动子。0029更为具体的，所述重组表达载体为在PZH01载体的多克隆位点处插入所述PID3KN基因得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为XBA和SAL。0030所述PZH01载体在XIAO,H,WANG,Y,LIU,D,WANG,W,LI,X,ZHAO,X,XU,J,ZHAI,WANDZHU,L2003FUNCTIONALANALYSISOFTHERICEAP3HOMOLOGUEOSMADS16BY说明书CN104072596A4/12页6RNAINTERFERENCEPLANTMOLBIOL。

19、52,957966中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。0031所述表达盒由能够启动所述PID3KN基因表达的启动子，所述PID3KN基因，以及转录终止序列组成。0032所述PID3KN蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下A1或A2中的应用也属于本发明的保护范围0033A1调控植物对稻瘟病的抗性；0034A2选育抗稻瘟病植物品种。0035在本发明的一个实施例中，所述调控植物对稻瘟病的抗性具体为提高植物对稻瘟病的抗性。0036所述选育抗稻瘟病植物品种的方法，具体可包括如下步骤将所述PID3KN蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交，从杂交后代中获得抗稻瘟。

20、病植物品种。0037本发明的另一个目的是提供一种培育抗稻瘟病转基因植物的方法。0038该方法包括如下步骤将编码所述PID3KN蛋白的基因导入目的植物中，获得抗稻瘟病的转基因植物，所述转基因植物表达所述基因；所述基因即PID3KN基因是如下1至4中任一所述的DNA分子00391编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；00402序列表中序列1所示的DNA分子；00413在严格条件下与1或2所限定的DNA分子杂交且编码所述PID3KN蛋白的DNA分子；00424与1或2所限定的DNA分子至少具有90以上同源性且编码所述PID3KN蛋白的DNA分子。0043上述严格条件可为用6SSC，05SDS的溶。

21、液，在65下杂交，然后用2SSC，01SDS和1SSC，01SDS各洗膜一次。0044所述PID3KN基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用TI质粒、RI质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。0045在本发明中，所述稻瘟病由下述稻瘟病菌MAGNAPORTHEORYZAE小种中的至少一种引起0310661、073112、0310763、04821、102511、103221、1012821、106231、0311371、0755。

22、11、10120212、99202、CH43、99262、ZHONG10814、CHUANGZB15、97272、Y34、B04、B16和B23。0046所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物如水稻。在本发明的一个实施例中，具体为水稻品种TP309。0047扩增所述PID3KN基因的全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。0048实验证明，本发明所提供的PID3KN蛋白及其编码基因可用于培育抗稻瘟病植物新品种，特别是对由下述稻瘟病菌MAGNAPORTHEORYZAE小种中的至少一种引起的稻瘟病表现出抗性0310661、073112、0310763、04821、102511、10。

23、3221、1012821、106231、0311371、075511、10120212、99202、CH43、99262、说明书CN104072596A5/12页7ZHONG10814、CHUANGZB15、97272、Y34、B04、B16和B23。这将有利于对水稻品种的改良，对扩大作物种植范围，提高农作物产量具有重要意义。附图说明0049图1为抗稻瘟病基因PID3KN的PCR扩增产物电泳结果。其中，泳道1为PID3KN基因的PCR产物；泳道M为DNA分子量标准。0050图2为重组表达载体PZH01PID3KN的质粒图谱。0051图3为T0代转PID3KN基因株系分子鉴定结果。其中，HPT为。

24、针对潮霉素抗性基因的PCR检测结果；CAPS为针对PID3KN基因的PCR扩增BAMH酶切检测结果。0052图4为T0代转PID3KN基因株系中PID3KN基因过表达分析及其对稻瘟病菌ZHONG10814的抗性表型。0053图5为转PID3KN基因株系中PID3KN基因的表达和对稻瘟病抗性之间相关性的分析。其中，HPT为针对潮霉素抗性基因的PCR检测结果；CAPS为针对PID3KN基因的PCR扩增BAMH酶切检测结果。0054图6为转PID3KN基因株系中PID3KN基因表达的特性分析结果。其中，A为接菌组；B为接水组。具体实施方式0055下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

25、。0056下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。0057实施例1、抗稻瘟病基因PID3KN的获得0058本实施例利用从水稻地方栽培种地谷中克隆的抗稻瘟病基因PID3序列信息分离克隆栽培稻KASALATH中的抗稻瘟病同源基因。00591、水稻抗稻瘟病基因PID3序列信息的获得0060抗稻瘟病基因PDI3是从水稻地方栽培种地谷中克隆得到的，它对粳稻区稻瘟病菌小种具有较好的抗性，其中用来定位克隆的鉴别小种为粳稻区稻瘟病菌小种ZHONG10814。从NCBIHTTP/WWWNCBINLMNIHGOV上获得地谷中抗稻瘟病基因PID3全基因序列GENBANKFJ7453641的。

26、第30105784位，PID3基因全长2775BP，不含有内含子，编码一个N端NONTIR、NONCC的含一段保守MOTIFRSLALSIEDVVD7889AA的NBSLRR蛋白。NBS结构域由第158位到466位氨基酸编码，在565位到924位氨基酸间有13个不完整的LRR。00612、利用地谷PID3基因序列设计引物扩增栽培稻KASALATH中PID3的同源基因PID3KN00621引物设计0063根据地谷中PID3基因序列GENBANKFJ7453641的第30105784位，设计引物扩增栽培稻KASALATH中的PID3同源基因。所设计的引物如下0064D3F5ATGGCGGAGGGT。

27、GTTGTGGGCTC3序列表中序列1的第123位0065D3R5TTATTGAATCCTTTCTGCAGCC3序列表中序列1的第27542775位的反向互补序列说明书CN104072596A6/12页80066为了便于后续将所扩增的PID3同源基因连入表达载体的试验，在此上下游引物中分别加入含有保护碱基的XBA和SAL酶切位点序列，得到引物如下0067PID3F5TTTCTAGAATGGCGGAGGGTGTTGTGGGCTC3下划线处为XBA的识别序列0068PID3R5CTGTCGACTTATTGAATCCTTTCTGCAGCC3下划线处为SAL的识别序列00692抗稻瘟病基因PID3KN。

28、的获得0070以栽培稻KASALATH的叶片基因组DNA为模板，用引物PID3F和PID3R进行PCR扩增。0071反应体系25L10PCR缓冲液25L；DNTPMIXTURE25MM25L；KOD酶5U/L02L；引物PID3F和PID3R均10MM各025L；模板DNA1L；MGSO425MM16L；DMSO16L；DDH2O补充至25L。0072反应条件先94预变性4MIN；然后94变性30S，58退火30S，68延伸3MIN，共30个循环；最后68延伸5MIN。0073对PCR产物进行1琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明PCR扩增得到大小约为3000BP的目的条带图1。切下该目的条带，纯化回。

29、收后将PCR产物连接到PEASYBLUNT载体北京全式金生物技术有限公司上，转化大肠杆菌DH5A，得到转化子，将转化子摇菌并提取质粒，送样测序。测序表明该PCR产物含有序列表中序列1所示的核苷酸序列，其序列具体为“TTTCTAGA序列1GTCGACAG下划线部分分别为XBA和SAL酶切位点的识别序列”。其中，序列1由2775个核苷酸组成，整个序列1为一个完整的开放阅读框，编码序列表中序列2所示的蛋白质。序列表中序列2由924个氨基酸残基组成。将序列1所示基因命名为PID3KN，将该基因编码的蛋白质命名为PID3KN。00743、对获得的同源基因PID3KN序列进行分析0075利用DNAMAN软。

30、件对地谷中PID3基因GENBANKFJ7453641的第30105784位和栽培稻KASALATH中PID3KN基因序列1序列相似性进行分析发现，地谷中PID3基因和栽培稻KASALATH中的PID3KN基因相似度很高，达到了996，一共只有11个碱基差异。利用在线基因预测软件HTTP/LINUX1SOFTBERRYCOM对序列1进行基因预测，发现序列1只含有一个ORF，没有内含子存在，这与地谷中PID3基因结构特征一致。将栽培稻KASALATH中PID3KN基因编码的氨基酸序列序列2利用在线软件HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/STRUCTURE/CDD/WRPSBCGI分析发现。

31、，它也编码一个NBSLRR蛋白，并且保守区域NBS的位置和地谷中PID3的位置一样，都由第158466位的氨基酸编码，并且二者间只存在6个氨基酸的差异，其中4个位于LRR区域，一个位于NBS区域，一个在N末端CC区。0076实施例2、转PID3KN基因水稻的获得及其功能研究0077一、转PID3KN基因水稻的获得00781、重组表达载体PZH01PID3KN的构建0079将实施例1得到的PCR产物TTTCTAGA序列1GTCGACAG经过XBA和SAL酶切，得到的片段与经过同样酶切植物双元表达载体PZH01参考文献XIAO,H,WANG,Y,LIU,D,WANG,W,LI,X,ZHAO,X,X。

32、U,J,ZHAI,WANDZHU,L2003FUNCTIONALANALYSIS说明书CN104072596A7/12页9OFTHERICEAP3HOMOLOGUEOSMADS16BYRNAINTERFERENCEPLANTMOLBIOL52,957966公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得的载体片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5A，得到转化子，将转化子摇菌并提取质粒，送样测序。将经测序表明在PZH01载体的XBA和SAL酶切位点之间插入序列表中序列1所示的PID3KN基因的重组质粒命名为PZH01PID3KN，该质粒即为重组表达载体，其质粒图谱如图2所示。在重组表达载体PZH01P。

33、ID3KN中，启动所述PID3KN基因转录的启动子为35S启动子。00802、转PID3KN基因水稻的获得0081将步骤1构建的重组表达载体PZH01PID3KN通过电击转化方法参考文献HIEI,Y,SOHTA,TKOMARIANDTKUMASHIRO,1994EFFICIENTTRANSFORMATIONOFRICEORYZASATIVALMEDIATEDBYAGROBACTERIUMANDSEQUENCEANALYSISOFTHEBOUNDARIESOFTHETDNAPLANTJ6271282转入农杆菌LBA4404参考文献CHEN,X,ETAL,2006ABLECTINRECEPTORK。

34、INASEGENECONFERRINGRICEBLASTRESISTANCEPLANTJ46794804公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得中得到转化子。同时设置转入PZH01空载体的对照。将转入重组表达载体PZH01PID3KN的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/PZH01PID3KN；将转入PZH01空载体的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/PZH01。0082通过农杆菌介导转化水稻成熟种子愈伤组织的方法参考文献HIEI,Y,SOHTA,TKOMARIANDTKUMASHIRO,1994EFCIENTTRANSFORMATIONOFRICEORYZASATIVALM。

35、EDIATEDBYAGROBACTERIUMANDSEQUENCEANALYSISOFTHEBOUNDARIESOFTHETDNAPLANTJ6271282将上述制备的重组农杆菌LBA4404/PZH01PID3KN或LBA4404/PZH01导入到水稻品种TP309参考文献JUNJUNSHANG,ETALIDENTICATIONOFANEWRICEBLASTRESISTANCEGENE,PID3,BYGENOMEWIDECOMPARISONOFPAIREDNUCLEOTIDEBINDINGSITELEUCINERICHREPEATGENESANDTHEIRPSEUDOGENEALLELESB。

36、ETWEENTHETWOSEQUENCEDRICEGENOMESGENETICS，2009年，18213031311，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得中，获得了8个T0代转入重组表达载体PZH01PID3KN的转PID3KN基因株系和6株转入PZH01空载体的对照株。00833、分子检测00841对PID3KN基因的PCR检测0085利用CAPS标记对上述步骤2获得的转PID3KN基因株系和转入PZH01空载体的对照株进行DNA水平上的分子检测，具体如下0086分别以上述步骤2获得的T0代转PID3KN基因株系和转入PZH01空载体的对照株的基因组DNA为模板，以PID3JF和PI。

37、D3JR为引物进行PCR扩增。同时设置未转基因的TP309水稻作为对照。0087PID3JF5TACTACTCATGGAAGCTAGTTCTC3序列1的第20572080位0088PID3JR5ACGTCACAAATCATTCGCTC3序列1的第26952714位的反向互补序列0089上述引物不仅可以扩增外源PID3KN基因的一段658BP的片段序列1的第20572714位，还可以扩增TP309水稻内源PID3TP309基因PID3的同源基因的一段658BP的片段GENBANKFJ7453661的第20712728位，但由于来自PID3KN基因的片说明书CN104072596A8/12页10段。

38、含有一个BAMH酶切位点序列1的第2204位，而PID3TP309基因由于此处一个碱基的差异没有这个酶切位点，所以可以通过用限制性内切酶BAMH对PCR产物进行酶切，从而检测TP309中是否成功转入了PID3KN基因。没有转入PID3KN基因的TP309经PCR扩增BAMH酶切后得到的一个目的条带，大小为658BP；而成功转入了PID3KN基因的TP309经PCR扩增BAMH酶切后得到两个目的条带，大小分别为510BP和148BP。0090对上述步骤2获得的8个T0代转PID3KN基因株系LINE1、LINE2、LINE3、LINE4、LINE5、LINE6、LINE7和LINE8和未转基因的。

39、TP309水稻进行上述PCR扩增，然后用BAMH酶切，结果如图3所示。从图中可以看出，8个T0代转PID3KN基因株系LINE1、LINE2、LINE3、LINE4、LINE5、LINE6、LINE7和LINE8经PCR扩增BAMH酶切后得到两个目的条带，而未转基因的TP309水稻经PCR扩增BAMH酶切后得到的一个目的条带，且条带大小与预期结果相符。这一结果表明8个T0代转PID3KN基因株系均为PID3KN基因阳性植株。另外，对转入PZH01空载体的对照株的鉴定结果与未转基因的TP309水稻相一致。00912对潮霉素抗性基因的PCR检测0092分别以上述步骤2获得的8个T0代转PID3KN。

40、基因株系和转入PZH01空载体的对照株的基因组DNA为模板，以HYGF和HYGR为引物进行PCR扩增。同时设置未转基因的TP309水稻作为对照。没有转入潮霉素抗性基因的TP309经PCR扩增后无目的条带；而成功转入了潮霉素抗性基因的TP309经PCR扩增后得到大小约为500BP的目的条带。0093HYGF5GACGGTGTCGTCCATCACAGTTT30094HYGR5ACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAA30095对上述步骤2获得的8个T0代转PID3KN基因株系LINE1、LINE2、LINE3、LINE4、LINE5、LINE6、LINE7和LINE8和未转基因的TP309水。

41、稻进行上述PCR扩增，结果如图3所示。从图中可以看出，8个T0代转PID3KN基因株系LINE1、LINE2、LINE3、LINE4、LINE5、LINE6、LINE7和LINE8经PCR扩增后得到大小约为500BP的目的条带；而未转基因的TP309水稻经PCR扩增后无目的条带。这一结果表明8个T0代转PID3KN基因株系均为潮霉素抗性基因阳性植株。另外，转入PZH01空载体的对照株的鉴定结果也为阳性。00964、PID3KN基因过表达分析0097为进一步验证转基因情况，本发明又对上述步骤2获得的8个T0代转PID3KN基因株系LINE1、LINE2、LINE3、LINE4、LINE5、LIN。

42、E6、LINE7和LINE8和转入PZH01空载体的对照株进行了PID3KN的过表达分析，具体如下0098以上述步骤2获得的8个T0代转PID3KN基因株系和转入PZH01空载体的对照株为实验材料，提取其叶片总RNA，并利用DNASE处理除去残留DNA，利用OLIGDT将其反转录为CDNA。以此CDNA为模板，用引物PID3JF和PID3JR扩增大小均为658BP的转入的PID3KN基因以及TP309水稻内源的PID3TP309基因PID3的同源基因。同时以ACTIN为检测内参，所用引物为ACTINF和ACTINR。同时设置未转基因的TP309水稻作为对照。在以ACTIN为内参，进行半定量检测。

43、的情况下，如果待检测株系扩增得到的大小为658BP的目的条带的亮度明显强于作为对照的未转基因的TP309水稻，则判定该待检测株系为表达PID3KN基因的转基因株系。0099ACTINF5AGCAACTGGGATGATATGGA30100ACTINR5CAGGGCGATGTAGGAAAGC3说明书CN104072596A109/12页110101结果如图4所示，在其中的6个转基因株系LINE1，LINE2，LINE3、LINE4、LINE5和LINE6中检测到了PID3KN基因的表达目的条带亮度强于作为对照的未转基因的TP309水稻，而另外2个转基因株系LINE7和LINE8与转入PZH01空载。

44、体的对照株检测结果一致，均没有能够检测到PID3KN基因的表达目的条带亮度与作为对照的未转基因的TP309水稻一致。分析其原因，这可能是由于PID3KN基因在转基因株系LINE7和LINE8中的插入位置造成转入的PID3KN基因不能表达。0102二、转PID3KN基因水稻对稻瘟病的抗性检测01031、对稻瘟病抗性的初步检测0104对上述步骤一2中获得的6个T0代转PID3KN基因株系和转入PZH01空载体的对照株进行抗稻瘟病菌鉴定，所用稻瘟病菌MAGNAPORTHEORYZAE小种为ZHONG10814参考文献SHANG,JJ,ETAL,2009IDENTICATIONOFANEWRICEBL。

45、ASTRESISTANCEGENE,PID3,BYGENOMEWIDECOMPARISONOFPAIREDNUCLEOTIDEBINDINGSITELEUCINERICHREPEATGENESANDTHEIRPSEUDOGENEALLELESBETWEENTHETWOSEQUENCEDRICEGENOMESGENETICS18213031311，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。具体如下0105在大田中，将上述步骤一2中获得的8个T0代转PID3KN基因株系LINE1、LINE2、LINE3、LINE4、LINE5、LINE6、LINE7和LINE8和转入PZH01空载体的对照株植。

46、株进行移栽，均在移栽后一个月左右未孕穗前利用注射器分别进行注射接菌，具体为用无菌水将稻瘟病菌MAGNAPORTHEORYZAE小种ZHONG10814配置成5104孢子/毫升的孢子悬浮液，用普通医用注射器从水稻茎杆基部将1ML孢子悬浮液注入直至悬浮液从水稻茎杆顶部溢出。一周后调查发病情况评判标准见表1。同时设置未经转基因的TP309水稻作为对照。实验重复三次。0106表1水稻植株发病情况评判标准0107抗性级别发病情况抗R0无任何病斑抗R1直径小于05MM的褐点病斑中抗MR2直径约为051MM的褐点病斑中感MS3直径13MM的椭圆形病斑，边缘褐色，中央灰白色感S4典型的纺锤形病斑，直径3MM或。

47、更长，病斑稍有融合或无融合感S5典型的纺锤形病斑，由于病斑融合，叶片上半部枯死0108结果发现，8个转基因株系中只有检测到了PID3KN表达的6个株系LINE1，LINE2，LINE3、LINE4、LINE5和LINE6表现为对稻瘟病菌ZHONG10814的抗性图4，而其他两个未能检测到PID3KN表达的株系LINE7和LINE8与未经转基因的TP309水稻和转入PZH01空载体的对照株相同，均表现为感病。说明书CN104072596A1110/12页120109为了进一步确认转入的PID3KN基因和抗病的相关性，对T0代中有抗病表现的1个株系LINE1的T1代分离植株15株进行分子检测和抗稻。

48、瘟病稻瘟病菌ZHONG10814性状分析，其中，抗稻瘟病性状分析步骤同上所述，分子检测步骤见步骤一3中的1和2。同时设置未转基因的TP309水稻作为抗稻瘟病阴性对照，设置栽培稻KASALATH作为抗稻瘟病阳性对照。实验重复三次。0110结果如图5所示，转PID3KN基因株系LINE1的T1代分离植株中各植株的抗稻瘟病性状与PID3KN基因的表达与否是一一对应的。这一结果说明本实例从栽培稻KASALATH中分离的PID3KN基因是一个有功能的抗稻瘟病基因。01112、PID3KN基因表达特性分析0112利用RTPCR对PID3KN基因的表达模式进行分析，具体如下0113在大田中，用注射器将抗稻瘟。

49、病菌ZHONG10814的栽培稻KASALATH进行注射接菌，具体为用无菌水将稻瘟病菌MAGNAPORTHEORYZAE小种ZHONG10814配置成5104孢子/毫升的孢子悬浮液，用普通医用注射器从水稻茎杆基部将1ML孢子悬浮液注入直至悬浮液从水稻茎杆顶部溢出。同时设置接水对照。在接菌或接水后不同的时间点0H、3H、6H、12H、24H、48H和72H采集叶鞘和叶片并提取其总RNA，利用DNASE处理除去残留DNA，利用OLIGDT将其反转录为CDNA。以此CDNA为模板，用引物PID3JF和PID3JR进行PCR扩增，并以ACTIN为检测内参，所用引物为ACTINF和ACTINR。0114结果如图6所示，接菌组和接水对照组中，PID3KN基因在各个时间点上的表达量基本一致。这一结果表明PID3KN基因在栽培稻KASALATH中表现为组成型表达，并且不受稻瘟病菌小种ZHONG10814所诱导。01153、PID3KN基因对稻瘟病菌抗谱的测定0116尽管PID3KN基因与PID3基因在序列上差异很小，但一般认为NBSLRR类基因的LRR结构域决定了此类基因对稻瘟病菌小种的特异识别，而PID3KN。