聚乙二醇化的组织激肽释放酶及其制备方法和应用.pdf

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1、10申请公布号CN104073482A43申请公布日20141001CN104073482A21申请号201310745409122申请日20131230C12N9/96200601C12N9/64200601A61K38/48200601A61K47/48200601A61P3/10200601A61P13/12200601A61P9/1020060171申请人江苏众红生物工程创药研究院有限公司地址213022江苏省常州市新北区黄河中路132号申请人常州京森生物医药研究所有限公司72发明人马永王俊邱晶吴鼎龙徐春林陈晨王耀方74专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200代理人唐循文54。

2、发明名称聚乙二醇化的组织激肽释放酶及其制备方法和应用57摘要聚乙二醇化的组织激肽释放酶及其制备方法和应用，涉及聚乙二醇修饰的蛋白类药物，所述组织激肽释放酶具有SEQIDNO1或SEQIDNO2所示的序列，所述组织激肽释放酶可以是天然或重组的，其中聚乙二醇为分子量为2040KDA的聚乙二醇，其中所述聚乙二醇在组织激肽释放酶的N端伯氨基上偶联。本发明提供的聚乙二醇化的KLK1，在具有半衰期明显延长、免疫原性显著降低、结构稳定均一的等优点的基础上，更大程度的提高了其生物活性，尤其在治疗脑卒中及糖尿病肾病方面更加显著。51INTCL权利要求书1页说明书15页序列表7页附图7页19中华人民共和国国家知识。

3、产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书15页序列表7页附图7页10申请公布号CN104073482ACN104073482A1/1页21聚乙二醇化的组织激肽释放酶，其特征在于，其中聚乙二醇为分子量为2040KDA的聚乙二醇，其中所述聚乙二醇在组织激肽释放酶的N端伯氨基上偶联。2根据权利要求1所述的聚乙二醇化的组织激肽释放酶，其特征在于所述聚乙二醇通过丙醛基团与组织激肽释放酶的N端伯氨基偶联。3根据权利要求1所述的聚乙二醇化的组织激肽释放酶，其特征在于所述聚乙二醇分子为直链型或分支型。4根据权利要求3所述的聚乙二醇化的组织激肽释放酶，其特征在于所述聚乙二醇为分支型聚乙二醇衍生物，其中活化基团。

4、为丙醛、丁醛、乙醛或戊醛。5根据权利要求1所述的聚乙二醇化的组织激肽释放酶，其特征在于所述聚乙二醇化的组织激肽释放酶的结构通式如下所示其中R为H或C1C4的烷基；N为10到1150的整数值，P为13的整数；AA为N端的L氨基酸残基，M为05的整数。6根据权利要求5所述的聚乙二醇化的组织激肽释放酶，其特征在于所述烷基为甲基，N为57455之间的整数值，P为2，M为0，所述KLK1具有SEQIDNO1或SEQIDNO2所示的序列。7根据权利要求6所述的聚乙二醇化的组织激肽释放酶，其特征在于所述N为227455之间的整数。8聚乙二醇化的组织激肽释放酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤步骤1，用105。

5、0MMPH46的乙酸钠缓冲液配制0130MG/ML的组织激肽释放酶溶液；步骤2，按摩尔比组织激肽释放酶PEG还原剂1225201000在437的条件下反应0124H；步骤3，反应结束后以色谱法纯化处理，最终得到单修饰的聚乙二醇化的组织激肽释放酶；其中，所述还原剂优选为氰基硼氢化钠。9权利要求17任一所述聚乙二醇化的组织激肽释放酶在制备治疗脑卒中或糖尿病肾病药物中的应用。10一种治疗脑卒中或糖尿病肾病的药物，其特征在于有效成分为权利要求17任一项所述聚乙二醇化的组织激肽释放酶及其药学上可接受的盐及其复合物。权利要求书CN104073482A1/15页3聚乙二醇化的组织激肽释放酶及其制备方法和应用。

6、技术领域0001本发明涉及聚乙二醇修饰的蛋白类药物，特别是聚乙二醇修饰的组织激肽释放酶及其制备方法和其在药物制备中的应用。背景技术0002激肽释放酶，又称激肽原酶（KININOGENASE）或血管舒缓素（KALLIDINOGENASE），它是属于丝氨酸蛋白酶的一种，存在于各种组织和生物液体中，催化大分子前体物（激肽原，KININOGEN）释放生物活性肽（激肽，KININ）。激肽释放酶的生理效应包括使毛细血管和动脉血管舒张以及通透性增加，使冠状动脉、脑、视网膜处的血流供应增加，适用于高血压冠状血管以及动脉血管硬化等症，对心绞痛、血管痉挛、血栓性闭塞性脉管炎、冻疮以及创伤等症也有治疗作用。同时，激。

7、肽释放酶也可以作为活化因子，使纤溶酶原激活成纤溶酶，将不溶性的纤维蛋白水解成可溶性的小肽，从而对脑梗塞、动脉粥样硬化等起到治疗作用，并用于治疗血栓、预防血栓再形成（GMYOUSEF,EPDIAMANDISCLINBIOCHEM,200336443452）。体外研究显示，激肽释放酶对离体动脉具有舒张作用，并可抑制血小板聚集、增强血细胞变形能力和氧解离能力。动物试验显示，激肽释放酶静脉注射可增加麻醉犬椎间、颈总和股动脉血流量，增加麻醉犬后肢、家兔肌肉血流量。因此，激肽原酶在人类微循环障碍（如糖尿病肾病或糖尿病眼底病变等）及轻中度急性血栓性脑梗死等疾病的治疗中具有较高的应用价值。0003国内市场上现。

8、有的激肽释放酶药物分为两类一类是从猪胰脏中提取的组织激肽释放酶，它来源广泛，但是免疫原性较高，不适于静脉给药；另一类是从新鲜人尿中提取精制的人尿激肽原酶，虽然其不存在免疫原性问题，但是原料限制较大，产量较低。此外，二者均存在半衰期短，需反复重复给药的问题。为克服此类药用蛋白和多肽普遍存在的生物稳定性差、体内半衰期短和具免疫原性等缺点，通常采用基因工程改造和化学修饰等手段对其进行修饰改造，提高药用蛋白和多肽的体内生物稳定性，延长半衰期，降低或消除免疫原性。但针对每种蛋白的结构特殊性，对各类方法的适用及其产生的实际效果却有很大的差距。0004聚乙二醇POLYETHYLENEGLYCOL,PEG是一。

9、种常用的蛋白质修饰剂，可有效延长蛋白质类生物药物的半衰期并降低免疫原性。PEG修饰类型分为随机修饰和定点修饰。随机修饰是在蛋白质赖氨酸的氨基上进行的修饰反应，该类型PEG修饰剂反应迅速，修饰率高，但是修饰产物比较复杂，单修饰产物的位点不均一，修饰产物活性各不相同，难以保证批次间的稳定性。定点修饰主要包括N末端修饰和半胱氨酸残基修饰，两种修饰手段均可保证样品的一致性，但是对蛋白质的结构和性质要求较高。并且，在大多数情况下，与未修饰的原蛋白相比，聚乙二醇化的蛋白药物的活性会降低，一般修饰后的蛋白活性仅有原蛋白的3040,甚至更低。例如SCHERINGPLOUGH公司的PEGINTRON,是用分子量。

10、为5000的PEG修饰干扰素，修饰后其活性只有原蛋白的8。并且，随着PEG分子量的增大，修饰后的蛋白质活性降低更明显。例如用分子量为20KDA、30KDA、40KDA的PEG修饰促红细胞生成素说明书CN104073482A2/15页4（EPO）后，活性随着PEG分子量的增大而显著减小YINJUEWANG,JOURNALOFCONTROLLEDRELEASE,2010145306313。由此可见，蛋白的结构以及所用PEG的分子量以及修饰的位点等对聚乙二醇化的蛋白质的生物活性有很大的影响。对于特定药物的修饰，聚乙二醇修饰剂是影响修饰产物理化性质、体内外生物活性、药代动力学、药效学以及修饰产物临床表。

11、现最重要的因素。0005激肽原酶的PEG化修饰目前国外没有相关的报道研究，而国内只有中国药科大学的吴梧桐老师做过初步研究（聚乙二醇（PEG5000）对胰激肽释放酶化学修饰的初步研究，药物生物技术，2006（13）409412）。采用分子量为5000的以琥珀酰亚胺碳酸酯为活性基团的PEG对激肽原酶进行氨基随机修饰，所得产物均一性较差，并且稳定性不高，极易发生水解，半衰期及免疫原性均未得到明显改善。因此为了开发出长效的、低免疫原性的，并且具有较高生物活性的聚乙二醇化的激肽原酶需要选择更加合适的修饰方法和PEG原料。发明内容0006解决的技术问题本发明旨在提供一种具有高的生物活性、长半衰期、低免疫原。

12、性的聚乙二醇化的组织激肽释放酶KLK1，及其在制备治疗轻中度急性血栓性脑梗死疾病的药物中的应用。更进一步的说0007本发明的第一目的是提供一种聚乙二醇化的KLK1；0008本发明的第二目的是提供一种上述的聚乙二醇化的KLK1的制备方法；0009本发明的第三目的是提供一种上述所述的聚乙二醇化的KLK1在制备治疗轻、中度急性血栓性脑梗死疾病或糖尿病肾病的药物中的新用途。0010本发明的第四目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物含有上述所述的聚乙二醇化的KLK1和药学上可接受的辅料。0011本发明的第五目的是提供一种聚乙二醇化的KLK1或其药物组合物的配制为药学上可接受的盐及其复合物。0012技术。

13、方案聚乙二醇化的组织激肽释放酶，其中聚乙二醇为分子量为2040KDA的聚乙二醇，其中所述聚乙二醇在组织激肽释放酶的N端伯氨基上偶联。0013所述聚乙二醇通过丙醛基团与组织激肽释放酶的N端伯氨基偶联。0014所述聚乙二醇分子为直链型或分支型。0015所述聚乙二醇分子为分支型PEG衍生物，其中活化基团为丙醛、丁醛、乙醛或戊醛。0016所述聚乙二醇化的组织激肽释放酶的结构通式如下所示00170018其中R为H或C1C4的烷基；N为10到1150的整数值，P为13的整数；AA为N端的L氨基酸残基，M为05的整数。0019所述烷基为甲基，N为57455之间的整数值，P为2，M为0，所述KLK1具有SEQ。

14、ID说明书CN104073482A3/15页5NO1或SEQIDNO2所示的序列。0020所述N为227455之间的整数。0021聚乙二醇化的组织激肽释放酶的制备方法，包括如下步骤步骤1，用1050MMPH46的乙酸钠缓冲液配制0130MG/ML的组织激肽释放酶溶液；步骤2，按摩尔比组织激肽释放酶PEG还原剂1225201000在437的条件下反应0124H；步骤3，反应结束后以色谱法纯化处理，最终得到单修饰的聚乙二醇化的组织激肽释放酶。0022所述还原剂优选为氰基硼氢化钠。0023所述聚乙二醇化的组织激肽释放酶在制备治疗脑卒中药物中的应用。0024所述聚乙二醇化的组织激肽释放酶在制备治疗糖尿。

15、病引起的肾病中药物中的应用。0025一种治疗脑卒中或糖尿病引起的肾病药物，有效成分为上述聚乙二醇化的组织激肽释放酶及其药学上可接受的盐及其复合物。0026药学上可接受的盐在其被施用的量和浓度存在时是非毒性的。制备此类盐可通过改变化合物的物理特征而不妨碍其发挥生理学效果来促进药物应用。在物理特性方面有用的改变包括降低熔点以促进经粘膜施用，以及增加溶解性以促进施用更高浓度的药物。0027上述所述的药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如含有硫酸盐、盐酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐等。上述所述的药学上可接受的盐可来自酸，包括盐酸、马来酸、硫酸、磷。

16、酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸等。0028药学上可接受的载体和/或赋形剂也可被掺入根据本发明的药物组合物中促进特定激肽释放酶的施用。适于实施本发明的载体包括碳酸钙，磷酸钙，各种糖类（乳糖、葡萄糖、蔗糖），或各种淀粉，纤维素衍生物，明胶，植物油，聚乙二醇，以及生理学上相容的溶剂（包括用于注射的无菌水溶液，盐溶液和右旋糖）。0029有益效果本发明提供的聚乙二醇化的KLK1，在具有半衰期明显延长、免疫原性显著降低、结构稳定均一的等优点的基础上，更大程度的提高了其生物活性。附图说明0030图1为不同PEGKLK1偶联物的HPLCSEC纯度分析图。0031通过高效凝胶过滤分析结果可以看出制备的偶联物中没。

17、有明显杂质，纯度均大于98，符合中国药典标准。0032图2为不同PEGKLK1偶联物的体外生物活性图。0033通过体外活性检测结果可知，偶联物1到偶联物4分别保留了原蛋白活性的81、83、90、86，由此可见，各PEG修饰产物中偶联物3的生物活性最高，偶联物1的活性最低。0034图3为不同PEGKLK1偶联物的热稳定性图。0035由图可知，未修饰的激肽释放酶在65放置10MIN后活性基本丧失，而偶联物1和偶联物3在高温下的热稳定性均有提高，其中偶联物3在65放置20MIN后仍具有一定活力，说明激肽释放酶经PEG修饰后热稳定性提高，且偶联物3的热稳定性显著高于偶联物1。0036图4A为不同给药组。

18、的实验动物神经缺陷症状的评分状况图。根据实验结果可知，说明书CN104073482A4/15页6阳性对照1组（尤瑞克林）、偶联物2组、偶联物3组相对于模型组均具有显著性差异，且偶联物2组和偶联物3组的实验动物给药后神经缺陷症状评分明显高于阳性对照1组。0037图4B为不同给药组的实验动物脑梗死面积的结果图。根据实验结果可知，阳性对照1组（尤瑞克林）、偶联物2组、偶联物3组相对于模型组均具有显著性差异，且偶联物2组和偶联物3组的实验动物给药后脑梗死面积低于阳性对照1组。由此可见，偶联物4组、阳性对照2（TPA）及激肽释放酶均未有明显改善模型动物脑梗死状态；偶联物1可轻微改善实验动物脑梗死状态；偶。

19、联物2、偶联物3比阳性对照1（尤瑞克林）、阳性对照组2（TPA）及激肽释放酶具有更好的治疗急性血栓性脑梗死疾病的作用。0038图4A、图4B不同PEGKLK1偶联物治疗脑卒中的药效比较。0039图5A是给药前后实验动物尿量的变化图，根据结果可知，与模型组相比，原蛋白组及偶联物3组给药后24H尿量有显著降低；0040图5B是给药前后实验动物24H尿蛋白的变化图，根据结果可知，与模型组相比，原蛋白组及偶联物3组给药后24H尿蛋白有显著降低，且偶联物3组降低更为明显；0041图5C是给药前后实验动物24H尿肌酐的变化图，根据结果可知，与模型组相比，原蛋白组及偶联物3组给药后24H尿肌酐有显著降低，且。

20、偶联物3组降低更为明显；0042图5D是给药前后实验动物24H尿素氮的变化图，根据结果可知，与模型组相比，原蛋白组及偶联物3组给药后24H尿素氮有显著降低，且偶联物3组降低更为明显。由此可见，激肽释放酶原蛋白及PEG修饰后的激肽释放酶偶联物均可有效改善实验动物糖尿病肾病引起的肾脏损伤。并且，根据PEG修饰后的激肽释放酶偶联物给药间隔为激肽释放酶原蛋白一倍可知，经PEG修饰后，激肽释放酶的体内半衰期明显延长，且药效得到了显著的改善。0043图5A图5D展示了PEGKLK1偶联物对糖尿病肾病的治疗作用。0044图6为不同PEGKLK1偶联物的免疫原性图。0045实验结果显示，不同PEGKLK1偶联。

21、物在注射到小鼠体内后，偶联物2组、偶联物3组与相比，实验动物体内产生的抗体滴度远远低于阳性对照1组（尤瑞克林）、未经PEG修饰的激肽释放酶组实验动物的抗体滴度。说明经PEG修饰后的偶联物2和偶联物3的免疫原性远远低于阳性对照1（尤瑞克林）及未经PEG修饰的激肽释放酶，且偶联物3的对小鼠相对免疫原性略低于偶联物2。0046图7为不同PEGKLK1偶联物大鼠静脉给药后的血药浓度变化图。0047通过同位素标记示踪法对不同PEGKLK1偶联物的药代动力学进行检测。实验结果显示，与阳性对照1（尤瑞克林）及激肽释放酶相比，偶联物3的血药浓度降低较为缓慢，半衰期明显增长，且AUC显著提高，血浆清除速度明显下。

22、降。0048图8A为不同PEGKLK1偶联物和原蛋白的远紫外圆二色谱图比较图。0049图8B为不同PEGKLK1偶联物和原蛋白的近紫外圆二色谱图比较图。0050图8A、图8B不同PEGKLK1偶联物和原蛋白的圆二色谱图比较。通过圆二色谱图可以看出，KLK1用PEG修饰以后，其近紫外和远紫外的圆二色谱图基本没有改变，说明修饰后KLK1的二级结构和三级结构没有发生改变。0051图9为偶联物3和原蛋白的酶解肽图比较图。0052由偶联物3和原蛋白的酶解肽图可以看出，偶联物3的PEG是修饰在蛋白的N端说明书CN104073482A5/15页7的。0053图10为重组HK1蛋白在毕赤酵母X33工程菌中的表。

23、达鉴定图。0054其中，泳道1为相对分子质量较大的重组HK1蛋白，泳道2为相对分子质量较小的重组HK1蛋白；泳道3为10250KD范围的预染蛋白上样MARKER。两种分子量不同重组HK1蛋白除糖基化修饰不同外，其理化性质及生物学活性没有差异。0055图11为酵母表达的重组人激肽释放酶的PEG修饰产物的蛋白电泳分析图。0056其中，泳道1为10250KD范围的预染蛋白上样MARKER，泳道2为经YPALD30K修饰后的重组HK1蛋白。通过蛋白电泳结果可以看出制备的偶联物中没有明显杂质，分子量和原蛋白比有显著提高，纯度也较高。0057图12为CHOS细胞株稳定表达重组HK1蛋白的上清培养液免疫印迹。

24、图。0058其中，泳道1为10250KD范围的预染蛋白上样MARKER，泳道2为CHOS宿主细胞制备重组HK1蛋白第13天的上清培养液。0059图13为CHO细胞表达的重组人激肽释放酶的PEG修饰产物的HPLC分析图。0060用HPLC来对制备出的PEG修饰产物进行纯度分析。通过HPLC的结果可以看出制备的偶联物纯度较高，达到98以上。具体实施方式0061定义0062本发明使用以下缩写0063PEG（POLYETHYLENEGLYCOL）聚乙二醇；0064YPALD20K分子量为20KDA的包含两个直链甲氧基聚乙二醇的分支型PEG丙醛,结构呈Y型；0065YPALD30K分子量为30KDA的包。

25、含两个直链甲氧基聚乙二醇的分支型PEG丙醛,结构呈Y型；0066YPALD40K分子量为40KDA的包含两个直链甲氧基聚乙二醇的分支型PEG丙醛,结构呈Y型；0067KLK1猪胰脏中提取的组织激肽释放酶，人尿中提取的激肽释放酶。0068HK1重组人激肽释放酶。0069MPEGSC5000分子量为5000的直链单甲氧基PEG，活化基团为琥珀酰亚胺碳酸酯。0070本申请中所用术语“偶联物”，是指聚乙二醇修饰KLK1的单修饰产物；0071几种聚乙二醇修饰KLK1的单修饰产物可在本申请中称为“SCPEG5000KLK1，YPALD20KKLK1，YPALD30KKLK1，YPALD40KKLK1”统称。

26、为PEGKLK1或偶联物。0072“聚乙二醇”指环氧乙烷缩聚物和水的混合物，有分支型和直链型。“聚乙二醇”或“PEG”加上数字后缀表示其平均分子量。例如，PEG20000指分子量为20000左右的聚乙二醇；也可把“PEG”省略，如YPALD20K，表示分子量为20000左右的Y型PEG丙醛，结构式如下所示。0073说明书CN104073482A6/15页80074R为H或C1C4烷基，优选为甲基；N为10到1000整数值，本发明优选为57455之间的整数值，更优选为227455之间的整数，P为13的整数，本发明优选为2。聚乙二醇有利的具有下列范围内的分子量大约20000DA至大约40000DA。

27、。更具体地，聚乙二醇具有选自下列的分子量20000DA，30000DA，40000DA。在特定的实施方式中，聚乙二醇的分子量为30000DA。0075在本发明中，KLK1可从任何来源衍生、克隆或产生，包括来自动物或通过基因重组技术或它们的组合。例如，KLK1可从动物组织或尿液中提取，包括但不限于猪胰脏，人尿。在本发明的偶联物的特定实施方式中，KLK1与包含SEQIDNO1或SEQIDNO2的序列的蛋白具有至少约60的序列一致性。0076在特定的实施方式中，所述蛋白为来源于猪胰脏的组织型KLK1，其具有SEQIDNO1所示的序列。在另一个实施方式中，KLK1来自重组的人源KLK1，其具有SEQI。

28、DNO2所示的序列。0077SEQIDNO1或SEQIDNO2所示的蛋白的片段也被包含在本发明的偶联物中所使用的蛋白的定义中。所述的“SEQIDNO1或SEQIDNO2所示的蛋白的片段”是指多肽的序列可包括比SEQIDNO1或SEQIDNO2更少的氨基酸，但仍包括足够的氨基酸来赋予催化大分子前体物（激肽原）释放生物活性肽的活性。0078本领域熟知的是，可通过置换、插入、缺失和/或添加一个或多个氨基酸来修饰多肽但同时保留其酶活性。例如，在给定的位置通过化学上等同的氨基酸来置换一个氨基酸而不影响蛋白的功能特性是常见的。因此，可预期如下改变将产生功能上等同的产物产生以一个带负电的残基取代另一个的改变。

29、或产生一个带正电的残基取代另一个的改变。0079用来使PEG共价结合KLK1的连接基团可以是任何生物相容的连接基团。“生物相容”表示化合物或基团是非毒性且可在体外或体内使用而不引起损伤、呕吐、疾病或死亡。PEG可结合连接基团，例如通过酯键、硫醇键或酰胺键。0080本发明中，最优选的生物相容连接基团的共同特征是它们通过丙醛基团与KLK1的N末端氨基偶联。另外，KLK1可通过氨基、巯基、羟基或羧基直接与PEG偶联。在一个最优实施方案中，PEG通过酰胺键，偶联KLK1上N末端的氨基。0081本发明的制备聚乙二醇化的KLK1的方法，所述方法包括使用一定量的PEG与一定量的KLK1在缓溶液中反应足量时间。

30、至使PEG与KLK1共价结合。在特定的实施方式中，所述KLK1来自胰脏，更特别的来自猪胰脏，并且更特别的，所述KLK1包含SEQIDNO1的序列。在一个实施方式中，所述PEG为YPALD型。0082在一个特定的实施方式中，缓冲液的PH值在大约40至大约90的范围内。最优选的PH值范围是大约50至60，例如，PH值约为50，51，52，53，54，55，56，57，58，59或60。0083此外，激肽释放酶的聚乙二醇化在下列蛋白浓度下进行大约0530MG/ML，更特别优选的大约2MG/ML20MG/ML，最特别优选地大约3MG/ML15MG/ML。在特定的实施方式说明书CN104073482A7。

31、/15页9中，在这些蛋白浓度下聚乙二醇化的激肽释放酶来自猪的胰脏，并且更特别的，所述激肽释放酶包含SEQIDNO1或SEQIDNO2的序列。0084在升高的蛋白浓度下，聚乙二醇化反应快速进行，在少于3H之内。此外，所应用的PEG与激肽释放酶的摩尔过量至多为251。例如，摩尔过量为少于251，201，191，181，171，161，151，141，131，121，111，101，91，81，751，71，651，61，551。0085本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。0086实施例1KLK1的PEG偶联物的制备及分析0087制备例一，。

32、本发明聚乙二醇化KLK1通过如下方法制备、纯化、鉴定00881PEG偶联物样品制备0089用50MMPH50的乙酸乙酸钠缓冲液溶解将激肽释放酶（来源于常州千红生化制药股份有限公司）以配制成为8MG/ML的溶液，分别用YPALD20K,YPALD30K,YPALD40K购自北京键凯科技有限公司，按激肽释放酶PEG氰基硼氢化钠为110100的摩尔比进行反应，在4下反应12H后，加入1M甘氨酸终止反应。制备得到3种单修饰产物YPALD20KKLK1偶联物2，YPALD30KKLK1偶联物3，YPALD40KKLK1偶联物4。0090另外以50MMPH85的TRISHCL缓冲液溶解激肽释放酶，配制成为。

33、8MG/ML的激肽释放酶溶液，用MPEGSC5000购自北京键凯科技有限公司，按激肽释放酶PEG为18的摩尔比进行反应，在4下反应05H。制备得到单修饰产物SCPEG5000KLK1偶联物1，制备此修饰产物是为了与本发明的修饰产物进行比较。偶联物1、偶联物2、偶联物3和偶联物4的收率分别为40，55，58，61。00912PEG偶联物样品纯化009221色谱法去除未反应PEG0093色谱法条件Q离子交换柱（购自GE公司，HITRAPQHP5ML），A液20MM的TRISHCL（PH80），B液含1MNACL的20MM的TRISHCL（PH80），流速25ML/MIN，检测波长为280NM。00。

34、94上样上述修饰反应产物用05M的NAOH溶液调节至PH80，结合至Q离子交换柱。0095平衡A液冲洗5个柱体积。0096收集50V/V的B液洗脱，并收集洗脱峰样品。009722色谱法纯化单修饰PEG偶联物0098色谱法条件HILOAD16/60SUPERDEX200PG（购自GE公司）半制备型凝胶过滤柱，洗脱液为PBS，流速15ML/MIN，检测波长为280NM。00993PEG偶联物样品检测0100色谱法条件HPLC（WATERS，E2695HPLC），SUPERDEX20010/300GL（购自GE公司），流动相为含01MNA2SO4的PBS（PH74），流速为04ML/MIN，检测波长。

35、为280NM，进样量50L，检测时间为60MIN。0101分析结果见图1所示。如图可以看出，制备的4种单修饰产物SCPEG5000KLK1偶联物1，YPALD20KKLK1偶联物2，YPALD30KKLK1偶联物3，YPALD40KKLK1偶联物4的纯度均高于98，并且随着所使用的PEG的分子量的逐渐增加，偶联物1到偶联物4的分子量也逐渐增加。说明书CN104073482A8/15页100102制备例二至四除了PH值、反应温度、反应时间、蛋白浓度、摩尔比不同之外，其他方法与制备例一相同，具体参数与得率如下表所示0103制备例二制备例三制备例四PH值505560修饰剂YPALD30KYPALD3。

36、0KYPALD30K摩尔比（蛋白PEG还原剂）15100115150001252500反应温度42537反应时间（小时）241005蛋白浓度（MG/ML）151005收率6159630104制备例二、三、四所制备的单修饰产物的活性及纯度与制备例一中的所得的单修饰产物偶联物3的活性及纯度无显著差别。下述实施例中所用的PEGKLK1偶联物均采用制备例一中所得的偶联物。0105实施例2PEGKLK1偶联物的体外活性检测0106激肽释放酶可以降解N苯甲酰L精氨酸乙酯盐酸盐（BAEE购自SIGMA公司），根据酶促反应前后吸光度增量的变化可用于测定激肽原酶的活性，具体测定方法参照2010版中华人民共和国药。

37、典第二部850851页所述方法进行。检测的样品分别是制备例一的SCPEG5000KLK1偶联物1，YPALD20KKLK1偶联物2，YPALD30KKLK1偶联物3，YPALD40KKLK1偶联物4以及未修饰的原蛋白。它们的相对活性比较结果如图2所示。0107由图2的结果可以看出，原蛋白在用PEG修饰后活性均有一定的降低。与未修饰的原蛋白相比，偶联物1到偶联物4分别保留了原蛋白活性的81、83、90、86，各PEG修饰产物中偶联物3的生物活性最高，偶联物1的活性最低。由此可见，本发明的PEG修饰KLK1在更大程度上保留了原蛋白的体外生物活性。其中偶联物1和文献报道的活性一致。0108其次，根据。

38、PEG修饰的一般规律，所使用的PEG分子量越大，对活性的影响越大。然而，本发明中并未显示该规律，本发明所采用的PEG修饰剂分子量均远大于5000DA，但修饰后的激肽释放酶生物活性却仍然大于前者，并且当PEG分子量为30KDA的偶联物3的生物活性最高。0109实施例3PEGKLK1偶联物的热稳定性0110为了验证PEG修饰后可提高激肽释放酶的稳定性，本实施例分别检测了偶联物1、偶联物3及原蛋白在65水浴放置一段时间后的活性。具体方法如下把PBS缓冲液溶解的蛋白浓度为1MG/ML的偶联物1，偶联物3和未修饰的激肽释放酶置于65水浴中，分别于0MIN、25MIN、5MIN、75MIN、10MIN、2。

39、0MIN、25MIN、30MIN取样并放入4冰箱备用。取样说明书CN104073482A109/15页11结束后采用实施例2中的方法（即2005版中华人民共和国药典第三部的附录F所述方法）检测其生物活性。检测结果如下图3所示。0111由图可以看出，与原蛋白相比，经PEG修饰后的激肽释放酶热稳定性均有提高，但是偶联物1的热稳定性提高不明显，而偶联物3的热稳定性比原蛋白有了显著的提高。0112实施例4不同PEGKLK1偶联物治疗脑卒中的药效比较0113采用SD大鼠（购自上海西普尔必凯实验动物有限公司）颈内动脉线栓法制备大脑中动脉阻塞（MIDDLECEREBRALARTERY,MCAO）脑缺血再灌注。

40、模型，分别设置阳性药对照组1（尤瑞克林，广东天普生化医药股份有限公司），阳性药对照组2（TPA，上海勃林格殷格翰药业有限公司）、模型对照组（PBS）、假手术组、激肽释放酶组（来源于常州千红生化制药股份有限公司）、偶联物1组、偶联物2组、偶联物3组、偶联物4组。于脑缺血再灌注后按照3G/KG（按蛋白质量进行计算）立即尾静脉注射给药1次，再灌注后24H观察神经缺陷症状，测定脑梗死面积。0114其中模型组给大鼠尾静脉注射等体积的PBS。假手术组仅分离血管，不插入栓塞线，给大鼠尾静脉注射等体积的PBS。0115采用改良BEDERSON5分制法进行神经缺陷症状评价。单盲法评价脑外伤后大鼠的神经缺陷症状，。

41、即由试验设计者将动物按组标记，由不明分组情况的实验者对神经缺陷症状进行评分。0116脑梗死面积的计算采用如下的方法进行。SD大鼠大脑用TTC（2,3,5氯化三苯基四氮唑，SIGMA）染色后用图像分析软件对照片进行统计，按如下公式计算脑梗死面积的百分比。01170118实验结果如图4及表1、表2所示。0119表1PEGKLK1偶联物和激肽释放酶以及阳性对照药药效研究神经缺陷症状比较01200121表2PEGKLK1偶联物和激肽释放酶以及阳性对照药药效研究脑梗死面积比较说明书CN104073482A1110/15页1201220123试验结果表明，在神经缺陷症状评分及脑梗死面积计算实验中，偶联物4。

42、组、阳性对照2（TPA）及激肽释放酶均未有明显改善模型动物脑梗死状态，而阳性对照1组（尤瑞克林）、偶联物1组、偶联物2组、偶联物3组相对于模型组均具有显著性差异，且偶联物2组和偶联物3组对急性血栓性脑梗死的治疗作用高于阳性对照1组。综上所述，与未经PEG修饰的原蛋白及两种阳性药物相比，偶联物2及偶联物3对采用MACO法制备的脑缺血再灌注模型SD大鼠的脑缺血损伤有明显的保护作用，且药效优于市售产品。偶联物1仅有部分改善模型动物的脑梗状态，而偶联物4基本没有缩小实验动物的脑梗死面积，并且神经缺陷症状没有改善，说明二者并未达到治疗脑梗疾病的作用，无法改善脑梗病人的最终生理状态，由此可见采用PEG修饰。

43、改善蛋白多肽类的药理药效或药代性质具有较高的个体差异性。0124实施例5PEGKLK1偶联物和原蛋白治疗糖尿病引起的肾病的药效比较0125糖尿病肾病动物模型采用DB/DB小鼠（购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，SPF级，8周龄，雄性，合格证编号为2007000552656），分别设置模型组，激肽释放酶（购于常州千红生化制药股份有限公司）原蛋白组和偶联物3组。给药剂量为2UG/KG（按蛋白质量计算），尾静脉给药，其中模型组和原蛋白组每周给药一次，偶联物3组每2周给药一次，连续给药2个月后检测尿量、尿蛋白、尿素氮和尿肌酐。（尿蛋白检测试剂盒、尿肌酐检测试剂盒、尿素氮检测试剂盒均购自南京建成生物工。

44、程有限公司）0126检测结果见图5，由实验结果可以看出，与模型组相比，原蛋白组和偶联物3组的实验动物在尿量、尿蛋白、尿肌酐和尿素氮的数值都有显著下降，说明激肽释放酶对于治疗由糖尿病引起的肾病具有明显的治疗效果。另外偶联物3组和原蛋白组比较，尿蛋白、尿肌酐尿素氮均有更明显的减少。根据实验设置可知，偶联物3组是每两周给药一次，原蛋白组是一周给药一次，综合分析，偶联物3组的药效明显优于原蛋白组，说明激肽释放酶经PEG修饰后体内半衰期明显延长，使得药效也有了较为显著的改善。0127实施例6PEGKLK1偶联物的免疫原性0128本实施例测定了不同PEGKLK1偶联物的对小鼠的相对免疫原性，并和原蛋白进行。

45、了比较。试验分偶联物2组、偶联物3组、尤瑞克林组及原蛋白组，以每周两次的频率，连续4W的方法给小鼠尾静脉注射1MG/KG（按蛋白质量计算）的上述蛋白。在给药结束1周后说明书CN104073482A1211/15页13从眼眶取血。通过间接ELISA测定血清中抗激肽释放酶抗体的水平。结果如图6中所示。0129从结果可以得出，偶联物2和偶联物3对小鼠的抗体滴度均远远低于猪胰脏激肽释放酶和人尿来源的尤瑞克林，说明PEG修饰后能够明显降低蛋白的免疫原性，且偶联物3的对小鼠相对免疫原性略低于偶联物2。0130实施例7PEGKLK1偶联物的药代动力学研究0131本实施例采用125I同位素标记示踪法对PEG修。

46、饰前后的激肽释放酶的体内血药浓度进行了研究。其中，为了减少大鼠甲状腺对标记药物的吸收，实验前约8H腹腔注射1KI（国药集团）溶液1ML饱和大鼠的甲状腺。将大鼠随机分为偶联物3组、激肽释放酶组、尤瑞克林组三组，每组8只，雌雄各半（购自浙江省实验动物中心）。0132具体操作方法如下01331放射性碘取代蛋白质分子中氨基酸残基苯环上的羟基，得到具有放射性示踪作用的125I上述蛋白。01342用苦味酸在其身上按照编号规则进行编号，称重。用大鼠固定器固定后，由尾静脉注射给药（15U/KG）。给药后立即放开大鼠，自由活动，自由饮水和喂食。01353分别于给药后1MIN，3MIN、10MIN、20MIN、4。

47、0MIN、60MIN、2H、4H、8H、12H、24H、48H、72H、96H、120H从眼眶取血约02ML，并加入EDTA抗凝。013645000RPM/3MIN离心分离大鼠血浆，用伽马计数器（安可中佳，GC911）测定血浆放射性活度，测量时间为1MIN。01375放射性活度测量完毕后回收血浆，HPLC（岛津LC20AT）分离未降解的蛋白原性药物。药时曲线如图6所示，各参数的计算见表3所示。0138表3PEGKLK1偶联物3和激肽释放酶、尤瑞克林药药代动力学参数比较0139SAMPLET1/2HAUCG/LHCLL/H/KGVL/KG激肽释放酶18811859013353阳性对照1（尤瑞克林。

48、）17491168021516偶联物32003113620020640140实验结果表明，上述药物的药动学模型属于二房室模型。偶联物3的药代参数与原蛋白、尤瑞克林的参数相比，半衰期明显延长，并且药时曲线下面积（AUC）有了显著提高。其次，偶联物3的在血液中的清除速率也显著低于原蛋白和阳性对照，且三组中偶联物3的表观分布容积最小，说明偶联物3比其他两种未修饰蛋白更加集中在血浆中。由此可见，未修饰的激肽释放酶以及人尿来源的尤瑞克林相比，激肽释放酶经PEG修饰所得的偶联物3的半衰期显著提高，血液中代谢速度明显降低，有效的延长了激肽释放酶的药效时间。0141实施例8PEGKLK1偶联物和原蛋白的圆二色。

49、谱图分析0142用圆二色光谱仪可以表征修饰蛋白以及未修饰蛋白的二级结构及三级结构。蛋白浓度范围是0102MG/ML。样品加入1MM光径的圆二色比色杯，检测其远紫外区（190NM250NM）和近紫外区（253NM480NM）的圆二色光谱，扫描带宽为1NM，扫描速度为说明书CN104073482A1312/15页14500NM/MIN。每次检测以相应缓冲液为背景，测三次取平均值。由图8A可以看出，偶联物2和偶联物3的远紫外区圆二色谱图和原蛋白相比，偶联物的光谱几乎没有发生峰的位移，这说明PEG修饰没有影响KLK1的二级结构。由图8B可以看出，偶联物2和偶联物3的近紫外区圆二色谱图和原蛋白相比，偶联物的光谱几乎没有发生峰的位移，这说明PEG修饰没有影响KLK1的三级结构。总体看来，通过不同修饰剂制备的偶联物，KLK1的高级结构基本没有发生改变。由于偶联物经过PEG修饰后，其结构未变化，因此其活性和原蛋白比较，损失较少。实施例2的数据也验证了这一点。并且这个结果也符合PEG修饰的一般规律，大多数蛋白药物在被PEG修饰后，其高级结构都没有发生改变。0143实施例9偶联物3的PEG修饰位点的鉴定0144为了确定偶联物3的PEG修饰位点，我们对偶联物三进行了胰蛋白酶的酶解实验，并和原蛋白的酶解图谱做比较。通过比较原蛋白和修饰产物肽段的差异，可以确定。