一种定量检测低丰度蛋白及其后修饰蛋白的方法技术领域
本发明属于生化分析领域，涉及一种定量检测低丰度蛋白及其后修饰蛋白的方
法。具体涉及利用酶联免疫吸附反应结合邻位连接技术对蛋白质及其后修饰实现快速灵敏
特异定量的方法；该方法具备酶联免疫吸附反应的快速，准确，便于操作等优点和邻位连接
技术的高特异性，高灵敏度的特点。该方法能实现对低丰度后修饰蛋白快速灵敏准确定量。
背景技术
夹心酶联免疫吸附反应(ELISA)是蛋白快速准确定量的金标准之一。捕获抗体对
目标蛋白的富集和洗涤步骤使夹心酶联免疫吸附反应能够快速准确低背景的定量目标蛋
白。该方法的主要缺点就是它的检测限在纳克每毫升水平，不能检测低浓度的蛋白。
邻位连接技术(PLA)是对传统免疫方法的重要补充，自从在2002年被首次提出就
由于高灵敏高特异性而得到了广泛的关注。该方法很众多领域都得到了应用，例如肿瘤标
志物的帅选和组蛋白修饰的发掘。邻位连接技术的主要原理就是待检测物同时被多个标记
有核酸序列的抗体识别，当这些抗体与目标待检测物结合后，修饰的核酸序列就被固定在
临位，这些核酸序列在核酸连接酶的作用下连接，连接后的核酸序列作为模板进行后续的
核酸扩增。简而言之，邻位连接技术通过多种抗体的识别获得高特异性，通过核酸扩增获得
高灵敏性。
目前，邻位连接技术分为三类：均相邻位连接技术，原位固相邻位连接技术，离体
固相邻位连接技术。虽然均相邻位连接技术步骤简单，但是由于所有实验步骤都在一个溶
液中缺乏洗涤步骤，导致均相邻位连接技术背景相对较高；原位固相邻位连接技术不能直
接用于检测如血清样的液体样品；离体固相邻位连接技术主要是基于微球和试管，该方法
应用于分析各类液体样品取得很好的效果，主要是由于富集步骤和洗涤步骤减低了背景干
扰。但是，目前实践中存在微球价格比较昂贵并且干扰荧光信号，修饰过的试管跟常规实时
聚合酶链反应仪器不兼容等缺陷。以上这些缺点阻碍了邻位连接技术的应用。
因此，本领域亟需发展一种便捷，快速，灵敏，特异的定量方法来检测低丰度蛋白
及其后修饰蛋白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种便捷，快速，灵敏，特异的定量方法来检测低丰度蛋白
及其后修饰蛋白。具体涉及利用酶联免疫吸附反应结合邻位连接技术对蛋白质及其后修饰
实现快速灵敏特异定量的方法；该方法具备酶联免疫吸附反应的快速，准确，便于操作等优
点和邻位连接技术的高特异性，高灵敏度的特点。该方法能实现对低丰度后修饰蛋白快速
灵敏准确定量。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1.将抗体蛋白夹心复合物固定在96孔板；
2.结合邻位连接技术探针进行核酸序列配对；
3.连接配对核酸序列；
4.进行基于滚环扩增的信号放大；
5.信号检测。
具体的，本发明的一种定量检测低丰度蛋白及其后修饰蛋白的方法，其包括步骤：
1. 50ng捕获抗体在50μl的PH 9.6的碳酸盐包被液37摄氏度2小时后，加入1％质
量分数的牛血清白蛋白37摄氏度1小时；
2.添加待检测溶液50μl，37摄氏度孵育1小时后，使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH
7.4)洗涤三次，每次五分钟；
3. 50ng检测抗体在50μl的1％质量分数的牛血清白蛋白中4摄氏度12小时后，使
用20mM磷酸缓冲溶液中(PH 7.4)洗涤三次，每次五分钟；
4.两种邻位连接探针(兔二抗结合非引物核酸序列，鼠二抗结合引物核酸序列)
1ng/μl溶于1％牛血清白蛋白溶液37摄氏度孵育1小时后，使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH
7.4)洗涤三次，每次五分钟；
5.延伸序列和连接核酸序列溶于T4DNA核酸连接酶缓冲液中，终浓度为100nM。在
96孔板每孔加入50μl该溶液37摄氏度孵育40分钟后，每孔加入0.3ul T4DNA核酸连接酶后
37摄氏度孵育1小时，使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH 7.4)洗涤一次五分钟；
6.每孔加入50μl滚环扩增溶液(50mM三异丙基乙磺酰-盐酸,10mM氯化镁,10mM硫
酸铵,0.16mM脱氧核糖核苷三磷酸,0.25mg/ml牛血清白蛋白,0.05％吐温20,0.3ul
ph29DNA核酸聚合酶，pH 7.5)37摄氏度孵育1.5小时使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH 7.4)洗
涤一次五分钟；
7.每孔加入50μl的100nM辣根过氧化酶标记核酸检测探针溶液37摄氏度孵育30分
钟后，使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH 7.4)洗涤三次，每次五分钟，使用酶标仪检测光密度信
号。
本发明中，使用商业化的96孔板，能对捕获抗体进行简便快速包被，捕获抗体可以
目标蛋白进行富集捕获，在复杂体系中可以降低背景干扰；
本发明中，使用邻位连接探针对双抗夹心中的两种一抗同时进行识别，可以提高
该方法的特异性；
本发明中，以邻位连接技术探针中的核酸序列作为模板进行滚环扩增，可以提高
该方法的灵敏度。
表1为本技术所用的核酸序列
表1
本方法用于检测绿色荧光蛋白，结果显示，其比常规的酶联免疫吸附反应的灵敏
度提高了两个数量级；其中分别使用位点特异性磷酸化抗体和泛磷酸化抗体，成功的定量
细胞外调节蛋白激酶的磷酸化水平变化；
结果还显示，本方法还可用于定量O连接N-乙酰氨基葡萄糖化(O-GlcNAc)的目标
蛋白，结果显示，相对于常规的O-GlcNAc修饰蛋白定量技术(蛋白免疫沉淀结合蛋白质印迹
法)，本方法更为快速灵敏。
本发明可以实现对低丰度蛋白及其后修饰实现快速灵敏特异性检测。
附图说明
图1为本方法的示意图。
图2为邻位连接探针合成示意图。
图3鼠邻位连接探针合成后鼠二抗的活性(a),兔邻位连接探针合成后兔二抗的活
性(b)。
图4二抗与巯基修饰的核酸序列连接效果。
图5对比ELISA和ELISA-PLA检测绿色荧光蛋白(GFP)在不同样品掺杂中的效果:绿
色荧光蛋白在血清中的掺杂(a),绿色荧光蛋白在细胞提取物中的掺杂(b),绿色荧光蛋白
在组织提取物中的掺杂(c)，其中黑色正方形表示ELISA结果，灰色正方形表示ELISA-PLA结
果。
图6 ELISA-PLA检测磷酸化蛋白(a),蛋白质印迹检测磷酸化蛋白(b)。
图7 ELISA和ELISA-PLA检测O-GlcNAc修饰蛋白(a),免疫蛋白沉淀结合蛋白质印
迹检测O-GlcNAc修饰蛋白(b)。
具体实施方式
下面的实例是对本发明提出的利用酶联免疫吸附反应结合邻位连接技术对蛋白
质及其后修饰实现快速灵敏特异定量的新方法的进一步说明。
实施例1合成邻位连接探针的活性的考察
邻位连接探针合成如图2所示：各取溶于10μl磷酸盐缓冲液(PH7.4)20ug兔二抗和
20ug鼠二抗，分别加入0.5μl 8mM sulfo-SMCC,室温反应2小时；使用截留为3K道尔顿的超
滤管超滤四次，除去过量的sulfo-SMCC；在超滤的鼠二抗中加入4μl的100uM巯基修饰引物
核酸序列，在超滤的兔二抗中加入4μl的100μM巯基修饰非引物核酸序列，室温反应2小时
后，置于-20摄氏度保存。
1)考察鼠邻位连接探针合成后鼠二抗的活性
取浓度为1ng/μl的鼠一抗50μl包被在96孔板中，封闭后分别按照鼠邻位连接探针
比辣根过氧化酶标记鼠二抗比例为1,10,50的比例加入96孔板室温结合1小时，洗涤三次后
进行显色，结果如图3(a)所示,鼠二抗与核酸反应后依然保持活性；
2)考察兔邻位连接探针合成后鼠二抗的活性
将兔一抗包被后，重复上述实验，结果如图3(b)所示,鼠二抗与核酸反应后依然保
持活性；
3)考察鼠二抗与巯基修饰的核酸序列连接效果
将鼠邻位连接探针取0.5μl吸附到PVDF膜，封闭后，延伸序列和连接核酸序列溶于
T4DNA核酸连接酶缓冲液中，终浓度为100nM。在膜上加入200μl该溶液37摄氏度孵育40分钟
后，每孔加入0.9μl T4DNA核酸连接酶后37摄氏度孵育1小时，使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH
7.4)洗涤一次五分钟。在膜上加入200μl滚环扩增溶液(50mM三异丙基乙磺酰-盐酸,10mM氯
化镁,10mM硫酸铵,0.16mM脱氧核糖核苷三磷酸,0.25mg/ml牛血清白蛋白,0.05％吐温20,
0.3μl ph29DNA核酸聚合酶，pH 7.5)37摄氏度孵育1.5小时使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH
7.4)洗涤一次五分钟。每孔加入50μl的100nM辣根过氧化酶标记核酸检测探针溶液37摄氏
度孵育30分钟后，使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH7.4)洗涤三次，显色，结果如图4所示，鼠二
抗与巯基修饰的核酸序列连接成功；
4)考察兔二抗与巯基修饰的核酸序列连接效果
鼠邻位连接探针取0.5μl吸附到PVDF膜后，重复上述实验，结果如图4所示，兔二抗
与巯基修饰的核酸序列连接成功。
实施例2
对比ELISA和ELISA-PLA检测绿色荧光蛋白(GFP)在不同样品掺杂中的效果
1)绿色荧光蛋白在血清中的掺杂
ELISA实验步骤：50ng鼠抗GFP抗体在50μl的PH 9.6的碳酸盐包被液37摄氏度2小
时后，加入1％质量分数的牛血清白蛋白37摄氏度1小时。添加待检测溶液50μl，37摄氏度孵
育1小时后，使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH 7.4)洗涤三次，每次五分钟。50ng兔抗GFP抗体在
50μl的1％质量分数的牛血清白蛋白中4摄氏度12小时后，使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH
7.4)洗涤三次，每次五分钟。加入50μl的1:5000稀释的辣根过氧化酶标记的兔二抗37摄氏
度1小时，洗涤三次后显色，结果如图5(a)所示；
ELISA-PLA实验步骤：50ng鼠抗GFP捕获抗体在50ul的PH 9.6的碳酸盐包被液37摄
氏度2小时后，加入1％质量分数的牛血清白蛋白37摄氏度1小时。添加待检测溶液50μl，37
摄氏度孵育1小时后，使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH 7.4)洗涤三次，每次五分钟。50ng兔抗
GFP检测抗体在50μl的1％质量分数的牛血清白蛋白中4摄氏度12小时后，使用20mM磷酸缓
冲溶液中(PH 7.4)洗涤三次，每次五分钟。两种邻位连接探针(兔二抗结合非引物核酸序
列，鼠二抗结合引物核酸序列)1ng/μl溶于1％牛血清白蛋白溶液37摄氏度孵育1小时后，使
用20mM磷酸缓冲溶液中(PH 7.4)洗涤三次，每次五分钟。延伸序列和连接核酸序列溶于
T4DNA核酸连接酶缓冲液中，终浓度为100nM。在96孔板每孔加入50μl该溶液37摄氏度孵育
40分钟后，每孔加入0.3μl T4DNA核酸连接酶后37摄氏度孵育1小时，使用20mM磷酸缓冲溶
液中(PH 7.4)洗涤一次五分钟。每孔加入50μl滚环扩增溶液(50mM三异丙基乙磺酰-盐酸,
10mM氯化镁,10mM硫酸铵,0.16mM脱氧核糖核苷三磷酸,0.25mg/ml牛血清白蛋白,0.05％吐
温20,0.3μl ph29DNA核酸聚合酶，pH 7.5)37摄氏度孵育1.5小时使用20mM磷酸缓冲溶液中
(PH 7.4)洗涤一次五分钟。每孔加入50μl的100nM辣根过氧化酶标记核酸检测探针溶液37
摄氏度孵育30分钟后，使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH 7.4)洗涤三次，每次五分钟。使用酶标
仪检测光密度信号。如图5(a)所示，ELISA-PLA比ELISA的检测限低两个数量级；
2)绿色荧光蛋白在细胞提取物中的掺杂
重复上述实验，结果图5(b)所示；
3)绿色荧光蛋白在组织提取物中的掺杂
重复上述实验，结果图5(c)所示。
实施例3使用ELISA-PLA来检测磷酸化蛋白
1)位点特异性磷酸化抗体实验组
ELISA-PLA实验步骤：1：1000稀释的鼠抗ERK1/2捕获抗体在50μl的PH 9.6的碳酸
盐包被液37摄氏度2小时后，加入1％质量分数的牛血清白蛋白37摄氏度1小时。1μl大鼠脑
组织提取液稀释至50μl，37摄氏度孵育1小时后，使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH 7.4)洗涤三
次，每次五分钟。取50μl的1：1000稀释的兔抗磷酸化ERK1/2抗体加入96孔板后，4摄氏度12
小时后，使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH 7.4)洗涤三次，每次五分钟。其他实验步骤同上
ELISA-PLA，结果如图6(a)所示，慢性痛大鼠的ERK1/2的磷酸化水平要高于正常大鼠；
2)泛磷酸化抗体实验组
ELISA-PLA实验步骤：1：1000稀释的鼠抗ERK1/2捕获抗体在50ul的PH 9.6的碳酸
盐包被液37摄氏度2小时后，加入1％质量分数的牛血清白蛋白37摄氏度1小时。1μl大鼠脑
组织提取液稀释至50μl，37摄氏度孵育1小时后，使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH 7.4)洗涤三
次，每次五分钟。取50μl的1：1000稀释的兔抗磷酸化酪氨酸抗体加入96孔板后，4摄氏度12
小时后，使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH 7.4)洗涤三次，每次五分钟；其他实验步骤同上
ELISA-PLA，结果如图6(a)所示，慢性痛大鼠的ERK1/2的磷酸化水平要高于正常大鼠。使用
泛磷酸化抗体可以取得与使用位点特异性磷酸化抗体相同的效果；
3)蛋白质印迹验证ELISA-PLA结果，结果如图6(b)所示，慢性痛大鼠的ERK1/2的磷
酸化水平要高于正常大鼠，此结果验证了ELISA-PLA技术的可靠性。
实施例4使用ELISA-PLA来检O连接的N乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)化蛋白
1)使用ELISA-PLA检测O-GlcNAc化的AKT蛋白
ELISA-PLA实验步骤：1：1000稀释的兔抗AKT捕获抗体在50μl的PH 9.6的碳酸盐包
被液37摄氏度2小时后，加入1％质量分数的牛血清白蛋白37摄氏度1小时。5μl大鼠脑组织
提取液稀释至50μl，37摄氏度孵育1小时后，使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH 7.4)洗涤三次，
每次五分钟。取50μl的1：1000稀释的鼠抗O-GlcNAc化抗体CTD110.6加入96孔板后，4摄氏度
12小时后，使用20mM磷酸缓冲溶液中(PH 7.4)洗涤三次，每次五分钟。其他实验步骤同上
ELISA-PLA，结果如图7(a)所示，ELISA-PLA结果表明脑缺血小鼠的AKT的O-GlcNAc修饰水平
要高于正常大鼠，而常规ELISA方法的灵敏度不足以区分该差异；
2)使用蛋白免疫沉淀结合蛋白质印迹验证ELISA-PLA结果
蛋白免疫沉淀结合蛋白质印迹实验步骤：取200μl脑组织裂解液加入2ul的AKT抗
体4摄氏度缓慢摇晃孵育过夜。取50μl的protein G-beads加入到细胞裂解液4摄氏度缓慢
摇晃孵育过夜。免疫沉淀反应后，在4℃以3,000g速度离心5min,将protein G-beads离心至
管底；将上清小心吸去，protein G-beads用1ml裂解缓冲液洗3次。最后加入15ul的2×SDS
加样缓冲液，沸水煮10分钟。使用蛋白质免疫印迹检测上述蛋白免疫沉淀获得的AKT蛋白的
O-GlcNAc化水平，结果如图7(b)所示，常规方法蛋白免疫沉淀结合蛋白印迹表明脑缺血小
鼠的AKT的O-GlcNAc修饰水平要高于正常大鼠，验证了ELISA-PLA的可靠性，但是由于常规
的蛋白免疫沉淀结合蛋白印迹技术灵敏度较低，需要使用更多的样品，整个试验流程耗时
更长。