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1、10申请公布号CN104130997A43申请公布日20141105CN104130997A21申请号201410388288422申请日20140808C12N9/78200601C12R1/6920060171申请人山东阳成生物科技有限公司地址274600山东省菏泽市鄄城县东环路1666号72发明人王东阳蔡传康徐强闫汝东张华74专利代理机构济南泉城专利商标事务所37218代理人张贵宾54发明名称一种氨基酰化酶的培养方法57摘要本发明涉及一种酶制剂技术领域，特别公开了一种氨基酰化酶的培养方法。该氨基酰化酶的培养方法，其特征在于以米曲霉诱变得到的菌株为菌种，将米曲霉诱变菌种经斜面培养基活化后接。
2、种至发酵培养基，培养54H，在5G麸曲培养物中加入PH70的001MOL磷酸缓冲液30ML，之后浸提2H，用超滤膜过滤后，得到上清液，即为氨基酰化酶粗酶液；将诱变株孢子悬液置于种子培养基中培养24H后，挑取生长较迅速的单菌落，培养后测定酶活力。本发明选育的是以氨基酰化酶表达优势的新菌种，目的基因ARGE的表达产物即为L氨基酰化酶，具有酶活性高，酶热稳定性高等优点，且该菌的发酵周期短。51INTCL权利要求书1页说明书2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书2页10申请公布号CN104130997ACN104130997A1/1页21一种氨基酰化酶的培养方法，其特。
3、征在于以米曲霉诱变得到的菌株为菌种，将米曲霉诱变菌种经斜面培养基活化后接种至发酵培养基，培养54H，在5G麸曲培养物中加入PH70的001MOL磷酸缓冲液30ML，之后322浸提2H，用超滤膜过滤后，得到上清液，即为氨基酰化酶粗酶液；将诱变株孢子悬液置于种子培养基中培养24H后，挑取生长较迅速的单菌落，培养后测定酶活力。2根据权利要求1所述的氨基酰化酶的培养方法，其特征在于所述斜面培养基的成分为NANO303G、KCL005G、K2HPO401G、MGSO47H2O005G、蔗糖3G、H2O100G。3根据权利要求1所述的氨基酰化酶的培养方法，其特征在于所述发酵培养基的成分为每升发酵液中含有2。
4、00G土豆浸出液、20G葡萄糖、2G蛋白胨。4根据权利要求1所述的氨基酰化酶的培养方法，其特征在于所述种子培养基的组成为豆饼粉55、麸皮45，其中料水比为100重量份85体积份。5根据权利要求1所述的氨基酰化酶的培养方法，其特征在于所述氨基酰化酶活力的定义为在PH70、37下，1H内由酶催化拆分产生1MOL/L的LMET的酶量为1个酶活力单位。权利要求书CN104130997A1/2页3一种氨基酰化酶的培养方法0001（一）技术领域本发明涉及一种酶制剂技术领域，特别涉及一种氨基酰化酶的培养方法。0002（二）背景技术L蛋氨酸是含硫必需氨基酸，与生物体内各种含硫化合物的代谢关系密切，具有保肝解毒。
5、的作用，蛋氨酸可作为药物治疗疾病，也可作为饲料添加剂广泛地使用。采用化学合成法所制得的氨基酸一般都是消旋的DL氨基酸，而在食品、医药及饲料等方面的应用皆要求为L氨基酸，所以，必须对化学合成的氨基酸进行拆分。0003氨基酰化酶的立体特异性为L型，可以将化学合成的N乙酰DL氨基酸拆分，从而获得L氨基酸。反应物中留下的D型底物可以用化学方法消旋转型继续拆分或去乙酰化获得D氨基酸。这一方法几乎适合于所以合成法获得的DL氨基酸的拆分。氨基酰化酶最初的来源为动物肾脏，现在较普遍的来源为米曲霉。目前的研究热点多集中在从米曲霉中提取氨基酰化酶及酶的固定化上，但其酶活力急待提高。0004（三）发明内容本发明为了。
6、弥补现有技术的不足，提供了一种产品纯度高、活性大的氨基酰化酶的培养方法。0005本发明是通过如下技术方案实现的一种氨基酰化酶的培养方法，其特征在于以米曲霉诱变得到的菌株为菌种，将米曲霉诱变菌种经斜面培养基活化后接种至发酵培养基，培养54H，在5G麸曲培养物中加入PH70的001MOL磷酸缓冲液30ML，之后浸提2H，用超滤膜过滤后，得到上清液，即为氨基酰化酶粗酶液；将诱变株孢子悬液置于种子培养基中培养24H后，挑取生长较迅速的单菌落，培养后测定酶活力。0006本发明的重点是寻找具有高活性酶的菌种、发酵条件的油化以及高活力酶的纯化，通过大量实验工作达到了很高的生产水平。0007本发明的更优方案为。
7、所述斜面培养基的成分为NANO303G、KCL005G、K2HPO401G、MGSO47H2O005G、蔗糖3G、H2O100G。0008所述发酵培养基的成分为每升发酵液中含有200G土豆浸出液、20G葡萄糖、2G蛋白胨。0009所述种子培养基的组成为豆饼粉55、麸皮45，其中料水比为100重量份85体积份。0010所述氨基酰化酶活力的定义为在PH70、37下，1H内由酶催化拆分产生1MOL/L的LMET的酶量为1个酶活力单位。0011本发明选育的是以氨基酰化酶表达优势的新菌种，目的基因ARGE的表达产物即为L氨基酰化酶，具有酶活性高，酶热稳定性高等优点，且该菌的发酵周期短。0012（四）具体。
8、实施方式实施例说明书CN104130997A2/2页41菌种米曲霉诱变得到的菌株。00132培养基斜面培养基（查氏培养基）NANO303G、KCL005G、K2HPO401G、MGSO47H2O005G、蔗糖3G、H2O100G；种子培养基豆饼粉55、麸皮45，料水10085W/V；发酵培养基G/L200G土豆浸出液、20G葡萄糖、2G蛋白胨。00143方法（1）氨基酰化酶的制备米曲霉经查氏斜面培养基活化后接种至发酵培养，培养54H，在5G麸曲培养物中加入PH70、01MOL磷酸缓冲液30ML，322浸提2H,用超滤膜过滤后，得到上清液，即为氨基酰化酶粗酶液。0015（2）高酶活力菌株的选育将诱变株孢子悬液于平板培养24H后，挑取生长较迅速的单菌落，培养后测定酶活力。0016（3）氨基酰化酶活力的测定参照CHIBATA等人的方法进行，酶活力单位定义为在PH70、37下，1H内由酶催化拆分产生1MOL/L的LMET的酶量为1个酶活力单位1U。0017（4）细胞的酶活力测定称取菌球05G加入01MOL/L、PH70的磷酸盐缓冲液25ML，37下保温5MIN后，加入005MOL/L的N乙酰DLMET内含5104MOL/L的CO25ML，150RPM、37保温30MIN，反应结束后取出1ML反应液，用茚三酮显色法测定所释放出来的LMET的量。说明书CN104130997A。