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1、(10)申请公布号 CN 102329008 A (43)申请公布日 2012.01.25 CN 102329008 A *CN102329008A* (21)申请号 201110247184.8 (22)申请日 2011.08.26 C02F 3/34(2006.01) C12N 11/14(2006.01) C02F 101/34(2006.01) (71)申请人 湖南大学 地址 410082 湖南省长沙市河西岳麓山湖南 大学环境科学与工程学院 (72)发明人 曾光明 刘媛媛 汤琳 庞娅 危臻 雷晓霞 李贞 伍梦诗 (74)专利代理机构 湖南兆弘专利事务所 43008 代理人 赵洪 杨斌 。
2、(54) 发明名称 利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体 中酚类污染物的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用基于磁性介孔碳的 固定化漆酶去除水体中酚类污染物的方法， 包括 以下步骤 ： 先调节待处理的含酚水体的 pH 值为 5.0 6.0， 并调节含酚水体中的酚类初始浓度为 1mM 4mM， 然后在所述含酚水体中加入基于磁性 介孔碳的固定化漆酶， 每毫升含酚水体中加入的 基于磁性介孔碳的固定化漆酶不少于 0.6mg， 接 着在 25 30的温度下对混合液进行振荡反 应 6h 12h， 再通过磁性分离将基于磁性介孔碳 的固定化漆酶与水体分离， 将分离后的水体调节 至中性后排放， 完成对水。
3、体中酚类污染物的去除 ； 本发明的方法操作简便、 成本低、 处理工艺简单、 去除效率高。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 3 页 CN 102329016 A1/1 页 2 1. 一种利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中酚类污染物的方法， 其特征在 于， 包括以下步骤 ： 先调节待处理的含酚水体的 pH 值为 5.0 6.0， 并调节含酚水体中的酚 类初始浓度为 1mM 4mM， 然后在所述含酚水体中加入基于磁性介孔碳的固定化漆酶， 每毫 升含酚水体中加入的基于磁性介孔碳的固定化漆酶不少于 0.6。
4、mg， 接着在 25 30的温 度下对混合液进行振荡反应 6h 12h， 再通过磁性分离将基于磁性介孔碳的固定化漆酶与 水体分离， 将分离后的水体调节至中性后排放， 完成对水体中酚类污染物的去除。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于 ： 所述含酚水体的pH值为6.0， 所述含酚水 体的酚类初始浓度为 2mM， 所述振荡反应的温度为 30， 所述振荡反应的时间为 12h。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述基于磁性介孔碳的固定化漆酶 以磁性介孔碳为载体， 漆酶通过物理吸附作用固定于所述磁性介孔碳上， 所述磁性介孔碳 的孔道内嵌入有磁性纳米颗粒， 所述磁性介。
5、孔碳上的漆酶吸附量在 140mg/g 以上， 所述固 定化漆酶的酶活性回收率为 60 95。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于 ： 所述的磁性介孔碳与漆酶的质量配比为 1 (1 2.5)。 5. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于 ： 所述磁性介孔碳含有有序双峰介孔结构， 所述有序双峰介孔结构是指孔径分布的两个峰值分别出现在 4nm 附近区域和 18nm 附近区 域。 6. 根据权利要求 4 或 5 所述的方法， 其特征在于， 所述基于磁性介孔碳的固定化漆 酶通过以下方法制得 ： 先准备磁性介孔碳和漆酶溶液， 所述漆酶溶液中漆酶的初始浓度为 0.3mg/ml 1.0mg。
6、/ml， 所述漆酶溶液的 pH 值为 3.0 6.0 ； 然后将磁性介孔碳加入至所述 漆酶溶液中， 在2530的温度下对该溶液振荡3h以上 ； 再经过洗涤、 磁性分离、 冷冻和 真空干燥后， 得到固定化漆酶。 7. 根据权利要求 6 所述的固定化漆酶的制备方法， 其特征在于 ： 所述漆酶溶液中漆 酶的初始浓度为 0.4mg/ml 或 1.0mg/ml， 所述漆酶溶液的 pH 值为 4.0， 所述振荡的转速为 100rpm， 所述振荡的时间为 3h。 8. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于， 所述磁性介孔碳通过下述方法得到 ： (1) 先将嵌段共聚物与正硅酸乙酯在 30 35的。
7、温度下混合搅拌 20h 24h， 再将 混合液转移至135140下水热反应22h24h， 得到白色沉淀， 将所述白色沉淀洗涤至 中性后过滤、 干燥， 得到白色粉末 ； (2) 将上述得到的白色粉末在 500 550的温度下煅烧 4h 5h 后得到介孔硅模 板 ； (3) 利用初湿浸渍法将由金属硝酸盐、 乙醇和糠醇组成的多元溶液渗透到所述介孔硅 模板中， 然后在7080的空气中对渗透有多元溶液的介孔硅模板固化10h12h， 干燥 后得到复合物 ； (4) 将上述得到的复合物在 N2中于 800 900的温度下热处理 1h 2h， 然后用加 热至 80 90的氢氧化钠溶液洗涤移除复合物中的硅模板，。
8、 再对移除硅模板后的复合 物过滤、 清洗和干燥， 得到磁性介孔碳。 9. 根据权利要求 8 所述的方法， 其特征在于 ： 所述金属硝酸盐是指摩尔比为 1 (1 1.1) 的 Fe(NO3)3与 Ni(NO3)2的混合物。 权 利 要 求 书 CN 102329008 A CN 102329016 A1/8 页 3 利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中酚类污染物 的方法 技术领域 0001 本发明涉及废水处理领域， 具体涉及利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体 中酚类污染物的方法。 背景技术 0002 酚类污染物作为一类持久性有机污染物， 具有较高的毒性和稳定性， 少量进入环 境即可造成较。
9、高的公共健康风险， 且难以通过自净作用在环境中去除， 对其降解转化方法 的研究近年来引起了广泛的关注。 生物降解技术， 尤其是生物催化技术， 作为一种新兴的处 理方法， 具有能耗低、 易操作、 降解效率高等优点， 是一项前景广阔的处理技术。 0003 漆酶 (laccase， E.C.1.10.3.2) 是一种含铜多酚氧化酶， 具有较广泛的底物专一 性和较强的稳定性， 能催化许多酚类和芳香胺类物质， 如苯酚、 对氯苯酚、 苯胺以及多酚和 多胺类物质， 因而广泛应用于生物转化及废水处理中。但由于在水中游离漆酶不可回收也 不能长期保存， 且在高温或其他极端环境下稳定性不易保持， 限制了其在实际中的。
10、应用。 固 定化技术是提高漆酶重复利用性和稳定性的有效手段， 常用的固定化载体包括活性炭、 壳 聚糖、 多孔硅胶、 微滤膜多种材料。 0004 因此， 利用固定化的漆酶去除水体中酚类污染物， 具有很多优势， 但现有的利用固 定化漆酶去除水体中酚类污染物的方法， 操作复杂， 去除效率低。 0005 新型介孔材料由于具有纳米规整有序孔道结构和巨大的比表面积及孔容等特 征， 在生物催化和分离尤其是作为酶固定化载体的研究和应用上显示了极大潜力。文献 (Andrea Salis et al， Journal of Molecular Catalysis B ： Enzymatic， 2009， 175-。
11、180) 用功能化介孔硅 SBA-15 固定来自 Pleurotus sajor-caju 的漆酶， 可用于处理含多种酚类 污染物的橄榄油作坊废水。但介孔材料具有制备过程繁琐、 难以分离的缺点。 发明内容 0006 本发明要解决的技术问题是 ： 针对现有技术的不足， 提供一种操作简便、 成本低、 处理工艺简单、 去除效率高的利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中酚类污染物的 方法。 0007 为解决上述问题， 本发明采用以下技术方案 ： 0008 一种利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中酚类污染物的方法， 包括以下 步骤 ： 先调节待处理的含酚水体的 pH 值为 5.0 6.0， 并调节。
12、含酚水体中的酚类初始浓度 为 1mM 4mM， 然后在所述含酚水体中加入基于磁性介孔碳的固定化漆酶， 每毫升含酚水体 中加入的基于磁性介孔碳的固定化漆酶不少于 0.6mg， 接着在 25 30的温度下对混合 液进行振荡反应6h12h(振荡反应采用摇床进行， 所述摇床的转速为100rpm150rpm)， 再通过磁性分离将基于磁性介孔碳的固定化漆酶与水体分离， 将分离后的水体调节至中性 后排放， 完成对水中酚类污染物的去除。 说 明 书 CN 102329008 A CN 102329016 A2/8 页 4 0009 上述的技术方案中， 优选地， 所述含酚水体的 pH 值为 6.0， 所述含酚水。
13、体的酚类初 始浓度为 2mM， 所述振荡反应的温度为 30， 所述振荡反应的时间为 12h。 0010 作为对上述技术方案的优化， 上述方法采用的基于磁性介孔碳的固定化漆酶以磁 性介孔碳为载体， 漆酶通过物理吸附作用固定于所述磁性介孔碳上， 所述磁性介孔碳的孔 道内嵌入有磁性纳米颗粒， 所述磁性介孔碳上的漆酶吸附量在 140mg/g 以上， 所述固定化 漆酶的酶活性回收率为 60 95 ( 优选的技术方案可达 75 95 )。 0011 作为对上述技术方案的优化， 所述的磁性介孔碳与漆酶的质量配比为 1 (1 2.5)。 0012 作为对上述技术方案的优化， 所述磁性介孔碳含有有序双峰介孔结构。
14、， 所述有序 双峰介孔结构是指孔径分布的两个峰值分别出现在4nm附近区域和18nm附近区域。 4nm附 近区域特别是指孔径主要集中分布在 4nm 5nm 的孔径范围内， 18nm 附近区域特别是指孔 径主要集中分布在 14nm 18nm 的孔径范围内。 0013 作为对上述技术方案的优化， 所述的基于磁性介孔碳的固定化漆酶， 通过以下方 法得到 ： 先准备磁性介孔碳和漆酶溶液， 所述漆酶溶液中漆酶的初始浓度为 0.3mg/ml 1.0mg/ml， 所述漆酶溶液的 pH 值为 3.0 6.0 ； 然后将磁性介孔碳加入至所述漆酶溶液中， 在2530的温度下对该溶液振荡3h以上 ； 再经过洗涤、 磁。
15、性分离、 冷冻和真空干燥后， 得到固定化漆酶。 0014 作为对上述技术方案的进一步优化， 所述漆酶溶液中漆酶的初始浓度为 0.4mg/ml 或 1.0mg/ml， 所述漆酶溶液的 pH 值为 4.0， 所述振荡的转速为 100rpm， 所述振荡的时间为 3h。 0015 本发明的固定化漆酶的上述应用中， 固定化漆酶的制备方法对固定化漆酶产品的 性能有着重要影响， 而固定化漆酶产品的性能又会进一步影响漆酶在废水中的应用处理效 果， 因此， 优化和确定漆酶的固定化时间， 漆酶溶液的 pH 值以及漆酶的初始浓度对本发明 有着重要意义。我们以不同固定化条件下的载体吸附酶量和固定化酶活性作为确定标准，。
16、 通过以下实验得到了本发明的固定化漆酶制备方法中的工艺参数。 0016 1. 固定化时间范围的确定 0017 取 40mg 磁性介孔碳作为载体， 加入 100mL 装有 40mg 漆酶的磷酸缓冲液中 ( 浓度 为50mM， pH值为4.0)， 于30下以100rpm的速度振荡15min420min， 磁性分离后用缓冲 液清洗数次 ； 用福林酚试剂法(lowry法)分别测定固定前缓冲溶液中漆酶量及固定后缓冲 液中剩余的漆酶量， 计算不同时间内单位载体吸附的漆酶量， 得到的结果如表 1 所示 ； 由表 1 可知， 单位载体吸附漆酶量随时间增长不断增高， 但在 3h 后吸附漆酶量达到平衡， 因此， 。
17、适宜的固定化时间范围为 3h 以上 ； 考虑到随着时间延长， 漆酶活损失增加， 因此， 上述技术 方案中确定的优选振荡固化时间为 3h 7h， 最佳的固定化时间为 3h。 0018 表 1 ： 不同振荡时间下载体吸附漆酶量 0019 时间 (min) 15 30 60 120 180 300 420 吸附漆酶量 (mg/g) 56.7 116.7 163.3 183.3 216.7 220 223.3 0020 2.pH 值范围的确定 说 明 书 CN 102329008 A CN 102329016 A3/8 页 5 0021 调节柠檬酸缓冲液 pH 值为 3.0 4.0， 磷酸缓冲液 pH。
18、 值为 5.0 8.0 ； 取 40mg 磁性介孔碳作为载体， 加入 100mL 装有 40mg 漆酶的不同 pH 值的缓冲液中 ( 浓度 50mM)， 于 30下以 100rpm 的速度振荡 3h， 磁性分离后用缓冲液清洗数次 ； 用紫外分光光度计测定固 定化漆酶氧化 2， 2- 连氮 - 二 (3- 乙基并噻 -6- 磺酸 )(ABTS) 吸光度在 420nm 处的变化， 得 到的固定化漆酶的相对活性情况如表 2 所示 ； 由表 2 可知， 固定化漆酶的相对活性在 pH 值 为 3.0 6.0 时较高。因此， 上述技术方案中优选的 pH 值范围为 4.0 6.0， 最佳 pH 值为 4.0。
19、， 此时相对活性最高。 0022 表 2 ： 不同 pH 值条件下制得的固定化漆酶的相对活性 0023 pH 值 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 相对活性 ( ) 58.9 100 69.8 62.5 39.2 32.9 0024 3. 初始漆酶浓度范围的确定 0025 取 40mg 磁性介孔碳作为载体， 加入 100mL 装有 10mg 400mg 漆酶的磷酸缓冲液 中 ( 浓度为 50mM， pH 值为 4.0)， 于 30下以 100rpm 的速度振荡 3h， 磁性分离后用缓冲液 清洗数次 ； 分别测定不同初始漆酶浓度的条件下， 载体吸附漆酶量、 固定化漆酶的相对活性 以。
20、及固定化漆酶的酶活性回收率 ( 即活性恢复 R， 活性恢复 R 按以下公式计算得来 ： R( ) (Ai/Af)100) ； 其中， Ai表示固定化漆酶的活性， Af表示同等质量的游离漆酶的活性 )， 测得的结果如表 3 所示， 由表 3 可知， 载体吸附漆酶量随着初始漆酶浓度增加而不断增长， 而在 0.4mg/ml 2.0mg/ml 初始漆酶浓度条件下制备的固定化漆酶的相对活性较高， 但在 0.1mg/ml 1.0mg/ml 初始漆酶浓度范围内， 固定化漆酶的活性恢复较高 ； 因此， 适宜的初 始酶浓度范围为 0.3mg/ml 1.0mg/ml， 最佳初始漆酶浓度为 0.4mg/ml 左右或。
21、 1.0mg/ml， 此时漆酶吸附量和酶活性回收率均相对较高， 且相对活性也维持在一个较高水平。 0026 表 3 ： 不同初始漆酶浓度下制得的固定化漆酶性质 0027 0028 作为对上述技术方案的优化， 所述磁性介孔碳通过下述方法得到 ： 0029 (1) 先将嵌段共聚物与正硅酸乙酯在 30 35的温度下混合搅拌 20h 24h， 再将混合液转移至135140下水热反应22h24h， 得到白色沉淀， 将所述白色沉淀洗 涤至中性后过滤、 干燥， 得到白色粉末 ； 0030 (2) 将上述得到的白色粉末在 500 550的温度下煅烧 4h 5h( 模板剂被脱 除 ) 后得到介孔硅模板 ； 00。
22、31 (3) 利用初湿浸渍法将由金属硝酸盐、 乙醇和糠醇组成的多元溶液渗透到所述介 孔硅模板中， 然后在7080的空气中对渗透有多元溶液的介孔硅模板固化10h12h， 说 明 书 CN 102329008 A CN 102329016 A4/8 页 6 干燥后得到复合物 ； 0032 (4) 将上述得到的复合物在 N2中于 800 900的温度下热处理 1h 2h， 然后 用加热至 80 90的氢氧化钠溶液洗涤移除复合物中的硅模板， 再对移除硅模板后的 复合物过滤、 清洗和干燥， 得到磁性介孔碳。 0033 上述的技术方案中， 所述金属硝酸盐优选是指摩尔比为 1 (1 11) 的 Fe(NO3。
23、)3 与 Ni(NO3)2的混合物。 0034 与现有技术相比， 本发明的优点是 ： 0035 1、 本发明的利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中酚类污染物的方法， 去 除效率高， 在最优 pH 值 6.0、 初始酚类浓度 2.0mM 的条件下， 6h 时可达到对苯酚和对氯苯酚 分别为约 58及约 62的去除率 ； 在最优条件下， 12h 时的苯酚去除率和对氯苯酚去除率 可分别达到 78和 85以上 ； 0036 2、 本发明利用磁性介孔碳固定的漆酶去除水体酚类污染物， 载体磁性介孔碳材料 的孔道结构有利于污染物的传质， 利用载体的传质和酶催化的协同作用可高效去除水体中 酚类污染物 ； 同。
24、时， 本发明提供的方法可利用磁性材料的易于分离等特点， 且操作简单， 投 资费用和运行费用较低。 附图说明 0037 图 1 为本发明实施例 1 制得的磁性介孔碳的透射电镜图 ； 0038 图 2 为本发明实施例 1 制得的磁性介孔碳的氮气吸附 - 解吸曲线图 ； 0039 图 3 为本发明实施例 1 制得的磁性介孔碳的孔径分布曲线图 ； 0040 图4为本发明实施例1中的固定化漆酶和对照样(游离漆酶)在60下不同时间 段的活性变化曲线图 ； 0041 图5为本发明实施例1中对制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶的进行操作稳定 性检测的结果图 ； 0042 图6为本发明实施例3中利用基于磁性介孔碳。
25、的固定化漆酶和失活的固定化漆酶 ( 对照样 ) 在不同振荡反应时间下去除含酚水体中酚类污染物的去除率曲线图。 具体实施方式 0043 下面结合附图和实施例， 对本发明作进一步地说明。 0044 实施例 1 0045 一种本发明的利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去水体中的酚类污染物的方法， 包括以下步骤 ： 0046 (1)制备磁性介孔碳 ： (a)先将4.0g嵌段共聚物Pluronic P123(Sigma公司生产， 分子量为 5800) 置于 160ml 浓度为 1.54M 的 HCl 中， 置于 35水浴中搅拌直至溶解， 然后 逐滴加入 8.5g 正硅酸乙酯 (TEOs)， 将得到的混合物在。
26、 35下搅拌 20h， 再将混合液转移至 反应釜中， 在 140下水热反应 24h， 得到白色沉淀， 将白色沉淀洗涤至中性后过滤、 室温下 风干， 干燥后得到白色粉末 ； (b) 为了去除多余的模板剂 ( 即嵌段共聚物 Pluronic P123)， 将上述得到的白色粉末放入箱式炉中， 控制升温速率为 1 /min， 在 550空气中煅烧 4h， 模板剂被脱除后， 经研磨即得介孔硅模板 (SBA-15 白色粉末 ) ； (c) 将 1.5mmol 金属硝酸盐 说 明 书 CN 102329008 A CN 102329016 A5/8 页 7 (0.75mmol Fe(NO3)39H2O 及 。
27、0.75mmol Ni(NO3)26H2O) 溶解于 0.5ml 乙醇中， 在搅拌下加 入1ml糠醇， 形成多元溶液， 抽取1.4ml多元溶液， 用初湿浸渍法逐滴渗透到1.2g的SBA-15 中， 通过搅拌使溶液与颗粒混合均匀， 然后在 80的空气中对渗透有多元溶液的介孔硅模 板固化 10h 以使糠醇转化为聚合糠醇， 常温下干燥后得到复合物 ； (d) 将步骤 (c) 得到的复 合物在 N2中于 900的温度下热处理 2h 以碳化糠醇， 控制升温速率为 2 /min， 同时将金 属氧化物还原成合金， 然后用加热至 80 90的浓度为 2M 的 NaOH 溶液洗涤两次， 移除 复合物中的硅模板，。
28、 再对移除硅模板后的复合物过滤、 清洗至中性， 在 70温度下干燥， 得 到磁性介孔碳。 0047 将制得的磁性介孔碳进行透射电镜成像， 得到如图1所示的透射电镜图， 由图1可 知， 图中有序条带清晰可见， 表明磁性介孔碳的有序介孔结构未经破坏， 同时， 大范围分散 在孔道内部、 表面的黑点则为磁性介孔碳的磁性纳米颗粒 ； 将制得的磁性介孔碳进行 N2吸 附 - 解析实验， 在 ASAP2020M+C 全自动比表面积分析仪上进行， 得到如图 2 所示的吸附 - 解 吸等温线， 图中的两个滞回环表明了磁性介孔碳中两种介孔结构的存在 ； 用 BET 方法计算 磁性介孔碳的比表面积， 得出磁性介孔碳。
29、的比表面积为 1058.7m2/g ； 用 BJH 模型估测磁性 介孔碳的总粒径分布， 得到如图 3 所示的粒径分布图， 由图 3 可知， 磁性介孔碳的孔径分布 峰值主要出现为 4nm 附近和 18nm 附近， 这表明本实施例的磁性介孔碳非常适宜于漆酶的 固定 ； 测得磁性介孔碳的饱和磁化值为 4.1emu/g， 表明磁性介孔碳的磁性可应用于磁性分 离。 0048 (2) 制备基于磁性介孔碳的固定化漆酶 ： 将 40mg 步骤 (1) 中得到的磁性介孔碳 分散在 100ml 含有 1mg/ml 漆酶的柠檬酸缓冲液 (pH 值为 4.0) 中， 将混合液置于摇床中于 30下以 100rpm 的速。
30、度振荡 3h 以达到吸附平衡 ； 再用 pH 值为 4.0 的柠檬酸缓冲液洗涤数 次， 利用磁性分离器磁性分离后， 经 -40冷冻真空干燥， 得到基于磁性介孔碳的固定化漆 酶 ( 制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶在 -4下保存 ) ； 0049 以游离漆酶作为对照样， 对上述制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶和游离漆酶 分别进行 pH 值的适应范围， 温度的适应范围和热稳定性进行对比实验。 0050 对比实验以对照样游离漆酶和基于磁性介孔碳的固定化漆酶的酶活力作为标 准， 其中， 游离漆酶活力的测定采取 ABTS 为底物， 取 2.9ml 以 0.1M 柠檬酸缓冲液为介质 的 ABTS(0.5m。
31、M)， 加入 0.1ml 稀释后的漆酶液启动反应， 用紫外分光光度计 (UV-2250， SHIMADZU Corporation， 日本 ) 测定反应体系 3min 内 420nm 处的吸光度变化， 每分钟转化 1mol的ABTS所需的酶量为一个酶活单位(U) ； 固定化漆酶活力的测定则是将1mg固定化 酶加入 4.8ml 柠檬酸缓冲液及 0.2ml 的 ABTS(12.5mM) 的混合溶液中启动反应， 30s 后加入 19的硫酸溶液终止反应， 磁性分离后测定上清液在 420nm 处的吸光度。 0051 1.pH 值的适应范围 0052 分别测定不同 pH 条件下游离漆酶和基于磁性介孔碳的固。
32、定化漆酶的活性， 得到 的相对活性变化情况如表 4 所示， 由表 4 可知， 基于磁性介孔碳的固定化漆酶的最适 pH 值 相对游离漆酶略有上升， 表明基于磁性介孔碳的固定化漆酶中的固定化载体改变了漆酶所 处的微环境 ； 游离漆酶在 pH 值为 2.2 4 时活性较高， 但 pH 值较高时， 尤其是 pH 值为 7 和 8 时， 游离漆酶几乎失去活性 ； 基于磁性介孔碳的固定化漆酶的适宜 pH 值较游离漆酶广泛， 在 pH 值为 2 6 间均能保持较高活性， 在较高 pH 值时仍保持一定活性 ； 因此， 与游离漆酶 说 明 书 CN 102329008 A CN 102329016 A6/8 页。
33、 8 相比， 本实施例制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶受溶液 pH 值的影响不显著， 具有较好 的 pH 值适应范围。 0053 表 4 ： 游离漆酶和基于磁性介孔碳的固定化漆酶在不同 pH 条件下的相对活性 0054 0055 2. 温度的适应范围 0056 分别测定不同温度条件下游离漆酶和基于磁性介孔碳的固定化漆酶的活性， 得到 的相对活性变化情况如表5所示， 由表5可知， 游离漆酶与基于磁性介孔碳的固定化漆酶具 有相同的最适温度， 但基于磁性介孔碳的固定化漆酶较游离酶固定化酶在较高温度下具有 更高活性， 表明基于磁性介孔碳的固定化漆酶具有更广泛的温度适应范围 ； 因此， 与游离漆 酶相比。
34、， 本实施例制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶更有利于适应于实际应用时温度变 化的复杂环境。 0057 表 5 ： 游离漆酶和基于磁性介孔碳的固定化漆酶不同温度条件下的相对活性 0058 0059 3. 热稳定性 0060 将游离漆酶和基于磁性介孔碳的固定化漆酶分别置于 pH 为 4.0 的柠檬酸缓冲溶 液中， 于 60下保温 ； 然后每隔 30min， 取出一定量的基于磁性介孔碳的固定化漆酶及游离 漆酶， 检测其氧化 ABTS 的活性， 得到的不同时间段基于磁性介孔碳的固定化漆酶及游离漆 酶的相对活性如图 4 所示， 由图 4 可知， 基于磁性介孔碳的固定化漆酶的失活速度明显远 低于游离漆酶的。
35、失活速度 ； 保温 2h 时， 基于磁性介孔碳的固定化漆酶的相对活性仍能维持 75左右， 而游离漆酶的相对活性不足 20； 保温 4h 后， 两者相对活性相差约 60； 由此可 见， 本实施例制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶热稳定性显著增长， 表明基于磁性介孔 碳的固定化漆酶中的载体磁性介孔碳能提供更适宜环境抵抗热变化， 因此， 基于磁性介孔 碳的固定化漆酶中的载体磁性介孔碳有利于增强热稳定性。 0061 最后， 对本实施例制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶进行重复利用性实验 ： 将 基于磁性介孔碳的固定化漆酶在 25下与 0.5mMABTS 反应， 再用柠檬酸缓冲溶液 (0.1M， pH4.0。
36、) 冲洗分离出的基于磁性介孔碳的固定化漆酶， 基于磁性介孔碳的固定化漆酶再次与 0.5mMABTS反应， 测试基于磁性介孔碳的固定化漆酶的重复使用性， 结果如图5所示， 由图5 可知， 较大的酶活损失发生在第3次循环和第6次循环， 可能是一些与载体结合较弱的漆酶 说 明 书 CN 102329008 A CN 102329016 A7/8 页 9 被洗脱 ； 反映循环进行到第 6 批次后， 基于磁性介孔碳的固定化酶相对活性差异较小， 且当 反应循环进行 10 批次后， 基于磁性介孔碳的固定化漆酶活仍能超过 50， 表明该固定化酶 具有一定的操作稳定性， 可以重复使用 ； 0062 由以上可见，。
37、 本实施例制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶具有较宽的 pH 值的 适应范围和温度的适应范围， 并具有良好的热稳定性， 同时也有一定的重复利用性。 0063 (3) 去除酚类污染物 ( 分别去除含苯酚水体和对氯苯酚水体 ) ： 0064 将浓度为 25mM 的苯酚溶液分成六组， 调节柠檬酸缓冲液 pH 值为 3.0 4.0， 磷酸 缓冲液pH值为5.08.0， 将每组苯酚溶液分别加入到缓冲液中， 使得每组苯酚的浓度均为 2mM， 体积为 10ml， 并使得每组混合液的 pH 值分别为 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0 和 8.0 ； 用多层 纱布将每组装有混合液的瓶口封好， 将每组。
38、混合液在往复振荡培养箱中充分振荡， 使溶液 中的溶解氧饱和 ； 然后往每组混合液中分别加入 6mg 上述制得的基于磁性介孔碳的固定化 漆酶， 将温度控制在 30， 以 100rpm 的速度进行振荡去除反应 6h， 充分反应后再通过磁性 分离器将基于磁性介孔碳的固定化漆酶与水体磁性分离， 将分离后的水体调节至中性后排 放， 完成对水中苯酚的去除 ； 0065 按照上述相同的步骤， 对含对氯苯酚水体 ( 浓度为 25mM 的对氯苯酚溶液 ) 中的对 氯苯酚进行去除 ； 0066 分别测定经上述工艺后含酚水中残留的苯酚和对氯苯酚污染物的浓度， 测量结果 如表 6 所示 ； 由表 6 可知， 在 pH。
39、 值为 6.0 时， 约 58.0和 63.4的苯酚和对氯苯酚被去除， 去除效果最佳， 因此最优的 pH 值为 6.0， 而适宜 pH 值范围为 5.0 6.0， 在适宜的 pH 值范 围内， 本实施例对含酚水体中的酚类污染物的去除取得了良好的效果。 0067 表 6 ： 基于磁性介孔碳的固定化漆酶在不同 pH 值条件下对酚类的去除 0068 0069 实施例 2 ： 0070 一种利用实施例 1 制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中的苯酚的方 法， 包括以下步骤 ： 分别配制 10ml 不同苯酚初始浓度 (0.25mM、 0.5mM、 1.0mM、 2.0mM、 4.0mM 和 6.0。
40、mM)， pH 值为 6.0 的含酚废水， 再用纱布包扎好后， 在往复振荡培养箱中充分振荡 ； 将 6mg 基于磁性介孔碳的固定化漆酶投加至每组混合液中， 在温度为 30、 转速为 100rpm 的 条件下进行振荡去除反应 6h， 充分反应后再通过磁性分离器将基于磁性介孔碳的固定化漆 酶与水体磁性分离， 将分离后的水体调节至中性后排放， 完成对水中苯酚的去除 ； 0071 再配制 10ml 不同对氯苯酚初始浓度 (0.25mM、 0.5mM、 1.0mM、 2.0mM、 4.0mM 和 6.0mM)， pH 值为 6.0 的含酚废水， 按照上述相同的步骤， 对含对氯苯酚水体中的对氯苯酚进 行去。
41、除 ； 0072 用紫外 - 分光光度计测量上述经去除后的含酚水体中残余的苯酚和对氯苯酚污 染物的浓度， 结果如表 7 所示 ； 由表 7 可知， 本发明的基于磁性介孔碳的固定化漆酶处理酚 说 明 书 CN 102329008 A CN 102329016 A8/8 页 10 类废水的适宜酚类初始浓度为 1.0mM 4.0mM， 最佳浓度为 2.0mM， 在适宜的酚类初始浓度 范围内， 本实施例对含酚水体中的酚类污染物的去除取得了良好的效果。 0073 表 7 ： 基于磁性介孔碳的固定化漆酶在不同酚类初始浓度下对酚类的去除 0074 0075 实施例 3 ： 0076 一种利用实施例 1 制得。
42、的基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中的苯酚的方 法， 包括以下步骤 ： 将含苯酚水体加入至磷酸缓冲液中， 配置得到 10ml 苯酚初始浓度为 2mM， pH 值为 6.0 的混合液， 将混合液用多层纱布密封后在摇床上振荡 15min 以使混合液中 的溶解氧饱和 ； 然后加入实施例 1 制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶， 于恒温摇床中在 30下以 100rpm 的速度振荡反应持续 12h， 每隔一段时间取出一定量的混合溶液， 磁性分 离后， 上清液用紫外分光光度计在270nm和279nm处分别测定剩余的苯酚的浓度 ； 将分离后 的水体调节至中性后排放， 完成对水中苯酚的去除 ； 0077 按照。
43、上述相同的步骤， 对含对氯苯酚水体中的对氯苯酚进行去除 ； 0078 上述的去除结果如图 6 所示， 由图 6 可知， 振荡反应 6h 以上， 苯酚去除率和对氯苯 酚去除率在 58和 62以上， 最佳振荡反应时间为 12h， 此时的苯酚去除率和对氯苯酚去 除率可分别达到 78和 85以上 ； 因此， 优选的振荡时间为 6h 以上， 在适宜的振荡反应时 间范围内， 本实施例对含酚水体中的酚类污染物的去除取得了良好的效果。 0079 将实施例 1 制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶置于 95水浴下一段时间， 直至 用 ABTS 测定出固定化酶活性为零 ； 将失活的固定化漆酶作为对照样， 与基于磁性介。
44、孔碳的 固定化漆酶进行对比， 将 6mg 失去活性的固定化漆酶加入 10ml 含有 2mM 苯酚或对氯苯酚 的磷酸缓冲液 (pH 值为 6.0) 中， 在与实施例 3 相同的条件下处理含酚水体 ； 反应持续 12h， 每隔一段时间取出一定量的混合溶液， 磁性分离后， 上清液用紫外分光光度计在 270nm 和 279nm 处分别测定剩余苯酚和对氯苯酚浓度。 0080 失活的固定化漆酶吸附水中酚类污染物的效果如图6所示， 由图6可知， 反应初始 时段， 固定化酶较高的污染物去除速度， 尤其是反应初始 1h 时的污染物高速去除可归因于 载体磁性介孔碳的吸附与固定化漆酶的催化去除的协同作用， 由于载体。
45、的吸附作用可在短 时间内达到平衡， 因此， 基于载体磁性介孔碳的固定化酶可在短时间内快速去除污染物， 同 时， 也说明了利用载体磁性介孔碳的固定化漆酶去除酚类污染物可利用载体的吸附性能和 漆酶的高效催化特性的协同效应达到高效去除酚类污染物的效果。 说 明 书 CN 102329008 A CN 102329016 A1/3 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102329008 A CN 102329016 A2/3 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102329008 A CN 102329016 A3/3 页 13 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102329008 A 。