河豚毒素的提取、及河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂.pdf

本发明涉及河豚毒素的提取，另外还涉及河豚毒素的制剂。河豚毒素的提取，第一步原液提取：取菊黄东方豚卵巢，HAC溶液浸泡取得原液；第二步树脂交换：树脂为D152阳性大孔丙烯酸弱酸性树脂，经常法处理转NH4型，双柱两次交换，A柱为玻璃柱内下层装树脂，上层装硅藻土；B柱为玻璃柱内下层装中性氧化铝，上层装树脂；双柱交换后再进行第三步洗脱：双柱洗脱后合并交换和洗脱收集的强毒馏分，结晶得河豚毒素粗品结晶。本发明河豚毒素提取方法提高了产品的收率和纯度。制剂贮藏期限更长，用于脱瘾治疗，具有起效快，控制症状彻底，过度平稳，易接收等特点。

1、  河豚毒素的提取，包括原液提取、树脂交换和洗脱步骤，
第一步原液提取：取菊黄东方豚卵巢，切成1—2cm片状小块，用0.1％—0.5％HAC溶液浸泡、搅拌，48小时后用甩干机甩干得原液，加热至沸腾，立即停止加热，除去凝固蛋白，原液冷却后用50—80目筛初滤，再经白陶土——纸浆过滤，得浅黄色透明原液，卵渣继续分次浸泡24小时，重复上述步骤收集滤液，共取得原液20L，用氨水调制PH5—7，加1—5％正丁醇或1—2％甲醛防腐，常温放置备用；
第二步树脂交换：树脂为D152阳性大孔丙烯酸弱酸性树脂，经常法处理转NH4型，双柱两次交换，A柱为玻璃柱内下层装树脂，上层装硅藻土；B柱为玻璃柱内下层装中性氧化铝，上层装树脂；
A柱：原液上树脂柱进行交换，流速100—120ml/min，树脂交换后期用小鼠毒性跟踪，当小鼠显中毒反应时，表明树脂交换已达饱和程度，停止原液上柱，用去离子水冲洗至流出液无色，茚三酮试验阴性止，收集有毒馏分流出液；
B柱：将A柱所收集的有毒馏分，用氨水调PH值为7，开始上柱，流速30—50ml/min，当流出液PH7时，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，停止上柱，用去离子水(200L)冲洗柱，收集强毒馏分；
第三步洗脱：
A柱：用12％的HAC液洗脱，流速30—40ml/min，当流出液PH7，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，分步收集有毒馏分，毒素高峰在PH6.5—4.5之间；
B柱：将A柱树脂洗脱所得的有毒馏分，用氨水调PH6—7，上柱，用10％HAC洗脱，流速50ml/min，流出液PH7，小鼠跟踪显毒性反应时，分步收集强毒馏分，弱毒部分做下次浸泡用，共收集强毒馏分置于0—5℃冷藏存放备用。

2、  根据权利要求1所述的河豚毒素的提取，其特征是：还包括结晶步骤，在洗脱后进行第四步结晶：将B柱树脂交换和洗脱的强毒馏分，分次真空减压浓缩，-10℃放置24小时后，取出融化解冻并加8％氨水调PH8—9，震动搅拌，析出白色沉淀物，滤取沉淀物，沉淀物用蒸馏水反复洗涤3-5次，用2％—5％HAC液溶解，滤除不溶物杂质，溶液中加8％NH₄水调PH8—9，0—5度冷藏放置24小时，取出再进行上述重结晶2-3次，得河豚毒素粗品结晶。

3、  根据权利要求2所述的河豚毒素的提取，其特征是：第四步结晶：粗品结晶经高效液相色谱分离纯化得纯品河豚毒素结晶，经高效相色谱分析，纯度为99％。

4、  根据权利要求1-3任一所述的河豚毒素的提取，其特征是：第二步树脂交换：B柱中性氧化铝经180度活化处理2小时，冷却后湿法上柱，氧化铝先上柱，然后树脂上柱，使氧化铝在柱的下层，树脂在柱的上层。

5、  根据权利要求1-3任一所述河豚毒素的提取制得的河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，其特征是：1ml制剂中含有河豚毒素0.01-0.49μg/ml，含有河豚毒素20-40倍重量份的稳定剂硫酸软骨素。

6、  根据权利要求5所述的河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，其特征是：1ml制剂由下述原料配制而成：
河豚毒素            0.48μg

0.  5％枸橼酸         0.002ml
硫酸软骨素          9.6μg
注射用水            余量。

7、  根据权利要求5所述河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，其特征是：用于杜冷丁类药物依赖的制剂的制备方法：取河豚毒素溶于0.5％枸橼酸溶液中，硫酸软骨素溶于注射用水，两溶液混合后加入注射用水，调PH值4—6，充分搅拌均匀，经除菌过滤、超滤，在无菌条件下计量灌装入安瓶中，半开塞送冷冻干燥机-40度预冷，打开冷井制冷，温度降至-55度时启动真空泵，真空泵在真空度5帕以下，维持24小时，然后升温在30度维持14小时压塞、扎盖。

河豚毒素的提取、及河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂
一、技术领域：
本发明涉及河豚毒素的制法，另外还涉及河豚毒素用于杜冷丁等麻醉药物的原料药制剂。
二、背景技术：
河豚毒素(Tetrodotoxin简称TTX)是从河豚鱼卵巢或肝脏中提取分离的一种非蛋白小分子化合物，其分子式：C₁₁H₁₇N₃O₈，分子量为319.27。河豚毒素是专一性很强的细胞膜钠离子通道阻滞剂，可阻断神经传导，从而起到镇痛、戒毒的作用。临床用于内科、外科、皮肤科等领域。
河豚毒素的提取分离，最早为日本田原氏于1909年从河豚鱼卵巢中提取得到河豚毒素粗品结晶，并确立了其化学结构。1972年日本学者岸义人小组化学合成了河豚毒素。我国1982年北京防化院和河北水产研究所，1984年大连海洋渔业公司、青岛、天津等地相继在河豚毒素提取分离方面获得成功，目前各种提取方法大都采用平田后腾法，即原液提取—树脂交换—活性炭吸附—粗品结晶—苦味酸盐精制。活性炭吸附流程所用活性炭为动物性活性炭，分散性吸附法。河豚毒素损耗量很大，而且用化学法，苦味酸盐精制，每100kg河豚卵巢河豚毒素收率最多1.0—1.2g。
河豚毒素的临床应用，早在30年代日本人能三共株式会社已经将河豚毒素纯度为0.2—1.0(g/ml)的粗制品(推算当时商品每支含量为35.7mg/ml)用于镇痛。镇痉、镇静的治疗。日本学者项乃羲将河豚毒素注射液(粗品)用于鸦片类吸毒者的脱瘾治疗。阿片类药依赖是人类在吸食注射毒品后，会产生一种欣欲、亢奋的感觉。当染上μ毒瘾后会不惜一切手段寻找毒品，以满足这种精神和生理上的需要。戒毒是一个非常痛苦的过程，许多吸毒者之所以最后放弃戒毒，是因为无法忍受停止毒品后出现的戒断反应。
目前市场上用于戒毒药品的主要有美沙酮、LAAM、石丙甲羟二羟、吗啡酮和钠洛酮，而目前临床使用的戒毒药美沙酮自身具有成瘾性，使戒毒者在戒除毒瘾后，又不觉的染上了另一种药瘾，河豚毒素注射液作为新研究的戒毒药，却不具有成瘾性，而且脱瘾时间快速，只需要4—7天实为可推广的脱瘾药物。
如国际专利WO95/29903提供“氨基氢化喹唑啉化合物及其衍生物戒除药物依赖的新用途”，将河豚毒素溶于pH4—5醋酸液，制成河豚毒素含量为5—300μg/ml的注射液。
中国专利CN96119454.5提供一种用于戒毒镇痛药剂及其制法，河豚毒素溶于PH4—5醋酸溶液中，制成含量为0.5—10.0μg/ml加入0.0125普鲁卡因复方注射针剂。
中国专利98102072.0将河豚毒素溶于1％醋酸液中制成河豚毒素含量为0.001—0.45μg/ml注射液针剂。
中国专利CN1459286A提供一种“用于戒毒、镇痛的河豚毒素呼吸道给药制剂”，将原料药制成气雾剂、喷雾剂。
中国专利CN1353990A提供“用于镇痛、麻醉或治疗药物依赖性的制剂”河豚毒素含量为5—100μg/ml的注射液针剂。
中国专利200410102449.2提供“河豚毒素衍生物的制备和戒毒、镇痛用途”将河豚毒素溶于酒石酸中，制成含量为1—10μg/ml的注射液。
上述发明对河豚毒素临床应用研究起到积极作用。70年代末期以来，吸扎毒的现行在我国又死灰复燃，阿片类物质依赖已成为严重社会问题，我们北方地区主要以杜冷丁依赖比较多，杜冷丁属于中枢性镇痛麻醉药物，较强的成瘾性，一旦成瘾有较强的心里渴求，获得欢快振奋感，称之心里依赖，逐渐发展躯体依赖。对于杜冷丁依赖患者的治疗往往以其他成瘾性小的A片类物质进行递减替代疗法。这种疗法以小毒替代大毒的现象。有很大的弊端，如美沙酮。他是中枢吗啡多体激动剂，也易产生依赖性，而且疗程时间较长。因而寻找一种起效快、控制症状彻底过度平稳，无毒副作用的药物势在必行。而河豚毒素注射液，有较强的镇痛作用，抑制或减轻戒断症状的出现。目前文献中报导河豚毒素注射液(水针剂)和河豚毒素注射(冻干剂)一般都是由原药和稳定剂组成，稳定剂有枸橼酸盐或右旋糖酐双糖类。但上述配方的制剂稳定性很差，较长时间存放后，易产生差向异构化，使河豚毒素随时间的增长而逐步降低其含量，影响药效的发挥，治疗效果差。
三、发明内容：
本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种河豚毒素的提取，提取方法简单易操作，收率大大提高。另外提供一种河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，稳定性最佳，储存期限长，疗效好。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：河豚毒素的提取，包括原液提取、树脂交换和洗脱步骤，
第一步原液提取：取菊黄东方豚卵巢，切成1—2cm片状小块，用0.1％—0.5％HAC溶液浸泡、搅拌，48小时后用甩干机甩干得原液，加热至沸腾，立即停止加热，除去凝固蛋白，原液冷却后用50—80目筛初滤，再经白陶土——纸浆过滤，得浅黄色透明原液，卵渣继续分次浸泡24小时，重复上述步骤收集滤液，共取得原液20L，用氨水调制PH5—7，加1—5％正丁醇或1—2％甲醛防腐，常温放置备用；
第二步树脂交换：树脂为D152阳性大孔丙烯酸弱酸性树脂，经常法处理转NH4型，双柱两次交换，A柱为玻璃柱内下层装树脂，上层装硅藻土；B柱为玻璃柱内下层装中性氧化铝，上层装树脂；
A柱：原液上树脂柱进行交换，流速100—120ml/min，树脂交换后期用小鼠毒性跟踪，当小鼠显中毒反应时，表明树脂交换已达饱和程度，停止原液上柱，用去离子水冲洗至流出液无色，茚三酮试验阴性止，收集有毒馏分流出液；
B柱：将A柱所收集的有毒馏分，用氨水调PH值为7，开始上柱，流速30—50ml/min，当流出液PH7时，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，停止上柱，用去离子水(200L)冲洗柱，收集强毒馏分；
第三步洗脱：
A柱：交换后的A柱用12％的HAC液洗脱，流速30—40ml/min，当流出液PH7，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，分步收集有毒馏分，毒素高峰在PH6.5—4.5之间；
B柱：将A柱树脂洗脱所得的有毒馏分，用氨水调PH6—7，上柱，用10％HAC洗脱，流速50ml/min，流出液PH7，小鼠跟踪显毒性反应时，分步收集强毒馏分，弱毒部分做下次浸泡用，合并交换和洗脱收集的强毒馏分，置于0—5℃冷藏存放备用。
所述河豚毒素的提取还包括结晶步骤，在洗脱后进行第四步结晶：将B柱树脂交换和洗脱的强毒馏分，分次真空减压浓缩，-10℃放置24小时后，取出融化解冻并加8％氨水调PH8—9，震动搅拌，析出白色沉淀物，滤取沉淀物，沉淀物用蒸馏水反复洗涤3-5次，用2％—5％HAC液溶解，滤除不溶物杂质，溶液中加8％NH₄水调PH8—9，0—5度冷藏放置24小时，取出再进行上述重结晶2-3次，得河豚毒素粗品结晶。
所述第四步结晶：粗品结晶经高效液相色谱分离纯化得纯品河豚毒素结晶，经高效相色谱分析，纯度为99％。
所述第二步树脂交换：B柱中性氧化铝经180度活化处理2小时，冷却后湿法上柱，氧化铝先上柱，然后树脂上柱，使氧化铝在柱的下层。
本发明制得的河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，1ml制剂中含有河豚毒素0.01-0.49μg/ml，含有河豚毒素20-40倍重量份的稳定剂硫酸软骨素。
所述1ml制剂由下述原料配制而成：
河豚毒素           0.48μg
0.5％枸橼酸        0.002ml
硫酸软骨素         9.6μg
注射用水           余量。
所述用于杜冷丁类药物依赖的制剂的制备方法：取河豚毒素溶于0.5％枸橼酸溶液中，硫酸软骨素溶于注射用水，两溶液混合后加入注射用水，调PH值4—6，充分搅拌均匀，经除菌过滤、超滤，在无菌条件下计量灌装入安瓶中，半开塞送冷冻干燥机-40度预冷，打开冷井制冷，温度降至-55度时启动真空泵，真空泵在5帕以下，维持24小时，然后升温在30度维持14小时压塞、扎盖。
本发明河豚毒素提取方法经过反复研究，克服了活性炭仍有部分不可逆的吸附作用的不足问题，不采用活性炭吸附的流程，直接用两次树脂交换，两次树脂交换的A柱内径大于B柱，高度小于B柱，A柱内装树脂，在树脂上层加硅藻土，在原液树脂交换中往往会在柱的上部有菌团的形成，使原液通过树脂柱流速减慢，甚至树脂柱有阻塞现象的发生，本发明A柱树脂上层加硅藻土后，可随时分步清除菌团，提高了流速。B柱内上层装树脂，树脂下层装中性氧化铝，中性氧化铝对生物碱的分离，具有较好的分离作用，提高了河豚毒素的分离效果，从而提高了产品的收率和纯度，减除了活性炭吸附工艺流程，提高了收率5—10％。
本发明河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，有效剂量选用合理，配料稳定剂硫酸软骨素，起到稳定作用更显著，与同类产品相比贮藏期限更长，保证产品疗效。本发明制剂用于脱瘾治疗，具有起效快，控制症状彻底，过度平稳，易接收等特点，是一种杜冷丁类药物依赖脱瘾治疗较理想的药物。
四、具体实施方式：
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明不限于具体实施例。
实施例1
河豚毒素的提取，包括原液提取、树脂交换和洗脱步骤，
第一步原液提取：取菊黄东方豚卵巢100kg，切成1—2cm片状小块，用0.1％—0.5％HAC溶液100L浸泡、搅拌，48小时后用甩干机甩干得原液，直火加热至沸腾，立即停止加热，除去凝固蛋白，原液冷却后用50—80目尼龙网初滤，再经白陶土——纸浆过滤，得浅黄色透明原液，卵渣继续分次浸泡24小时，重复上述步骤收集滤液，共取得原液20L，用氨水调制PH5—7，加1—5％正丁醇或1—2％甲醛防腐，常温放置备用；
第二步树脂交换：树脂为D152阳性大孔丙烯酸弱酸性树脂，经常法处理转NH4型，双柱两次交换，树脂交换柱分为A、B两柱，A柱为玻璃制内径9cm、高100cm，柱内下层装入树脂5kg，，将0.3—0.5kg硅藻土装入树脂上层。B柱为玻璃制内径7cm、高120cm，柱内装树脂3.5kg，中性氧化铝750g，中性氧化铝经180度活化2小时湿法上柱，首先将750g中性氧化铝上柱，然后装入树脂3.5kg使氧化铝在B柱的下层，树脂在B柱的上层；
A柱：原液上树脂柱进行交换，流速100ml/min，树脂交换后期用小鼠毒性跟踪，当小鼠显中毒反应时，表明树脂交换已达饱和程度，停止原液上柱，用去离子水冲洗至流出液无色，茚三酮试验阴性止，收集有毒馏分流出液；
B柱：将A柱所收集的有毒馏分7.5L，用氨水调PH值为7，开始上柱，流速50ml/min，当流出液PH7时，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，停止上柱，用去离子水(200L)冲洗柱，收集强毒馏分；
第三步洗脱：
A柱：用12％的HAC液洗脱，流速40ml/min，当流出液PH7，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，分步收集有毒馏分100ml/份，毒素高峰在PH6.5—4.5之间，其收集有毒馏分7.5L；
B柱：将A柱树脂洗脱所得的有毒馏分，用氨水调PH6—7，上柱，用10％HAC洗脱，流速50ml/min，流出液PH7，小鼠跟踪显毒性反应时，分步收集强毒馏分100ml/份，弱毒部分做下次浸泡用，共收集强毒馏分3.2L，置于冰箱0—5℃冷藏存放备用；
第四步结晶：将B柱树脂交换和洗脱的强毒馏分，分次真空减压浓缩至200ml，-10℃放置24小时后，取出融化解冻并加8％NH4水调PH8—9，震动搅拌，析出白色沉淀物，滤取沉淀物，沉淀物用蒸馏水反复洗涤5次，用2％—5％HAC液溶解，滤除不溶物杂质，溶液中加8％NH₄水调PH8—9，0—5度冷藏放置24小时，取出后再进行上述重结晶3次，得河豚毒素粗品结晶3.82g，粗品结晶经高效液相色谱(HPLC)分离纯化得纯品河豚毒素结晶2.38g，经高效相色谱(HPLC)分析，纯度为99％。
实施例2
采用实施例1制得的河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，由下述原料按重量份比配制而成1000支注射制剂，每支1ml：
河豚毒素         480μg
0.5％枸橼酸      2ml
硫酸软骨素       960μg
注射用水         余量。
具体制备方法为：取河豚毒素溶于0.5％枸橼酸溶液中，硫酸软骨素溶于注射用水，两溶液混合后加入注射用水，调PH值4—6，充分搅拌均匀，经除菌过滤、超滤，在无菌条件下计量灌装入安瓶中，半开塞送冷冻干燥机-40度预冷，打开冷井制冷，温度将至-55度时启动真空泵，真空泵在真空度5帕以下，维持24小时，然后升温在30度维持14小时压塞、扎盖。
表1：不同河豚毒素注射液和河豚毒素冻干剂在常温下稳定性试验