二氢杨梅素新制备方法、药物制剂及用途.pdf

本发明公开了从蛇葡萄属Ampelopsis Michx植物蛇葡萄(Ampelopsissinica(Miq.)W.T.Wang)茎叶和显齿蛇葡萄(Ampelopsis grossedetata(Hand-Mazz)W.T.wang)茎叶中提取二氢杨梅素的方法、药物制剂及医药新用途。应用于预防和治疗老年痴呆症。制备的药物可以只含二氢杨梅素，也可以是含二氢杨梅素的组合物；可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂或注射剂等药物制剂。

1、  葡萄科蛇葡萄属Ampelopsis Michx植物蛇葡萄(Ampelopsissinica(Miq.)W.T.Wang)茎叶和显齿蛇葡萄(Ampelopsis grossedetata(Hand-Mazz)W.T.wang)茎叶中提取二氢杨梅素的新方法特征在于：药材用含水的乙醇、甲醇溶液提取一次或多次，趁热过滤，合并提取液，加入活性炭，过滤，滤液过大孔树脂柱，流出液浓缩，析晶，得粗提物；粗提物用乙醇—冷水、甲醇—冷水或丙酮—冷水重结晶2-3次，得二氢杨梅素晶体。将二氢杨梅素晶体在C-18反相柱(常压)上分离纯化，用氯仿-甲醇为洗脱剂，收集二氢杨梅素流分，薄层鉴定后合并，挥去部分溶剂，得纯度可达95％以上的单一成分二氢杨梅素。

2、  根据权利1所述的方法，其特征在于50—80％乙醇水溶液或甲醇水溶液提取时用量为药材重的5—50倍；提取时间为1h—3h；

3、  根据权利1所述的方法，其特征在于活性炭加入量为0.01—3％(W/V)。

4、  根据权利1所述的方法，其特征在于大孔树脂主要为AB-8、D101、D201、LX-38、D3500、D4020、D941、HP-20、LX-28型。我们优选AB-8、D101树脂。

5、  根据权利1所述的方法，其特征在于析晶温度为4—10℃，重结晶溶剂为10—90％的乙醇、甲醇、丙酮溶液。

6、  根据权利1所述的方法，其特征在于二氢杨梅素晶体纯度达95％以上。

7、  一种药物制剂，其特征在于含有有效治疗剂量的二氢杨梅素和一种或多种药学上可接受的药用赋形剂，或可与二氢杨梅素组方的其它药物。

8、  根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于含有1％—99％的二氢杨梅素和99％—1％的药用赋形剂或其它可组方的药物。

9、  根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于所说的药物是口服制剂或非肠道给药的剂型。

10、  权利要求6所述的制剂用于预防和治疗老年痴呆症。

二氢杨梅素新制备方法、药物制剂及用途
技术领域
本发明是关于一种从葡萄科蛇葡萄属植物蛇葡萄和显齿蛇葡萄中提取制备药物原料二氢杨梅素的新方法、药物制剂及其医药新用途，属于医药技术领域。
背景技术
蛇葡萄属植物蛇葡萄和显齿蛇葡萄中主要含有二氢杨梅素和杨梅素，文献报道二氢杨梅素提取主要包括通过各种溶剂(水或有机溶剂)煎煮或超声提取葡萄科植物，浓缩，再用热水溶解，趁热过滤，滤液直接用色谱分离；将药材在溶剂中浸泡，过滤，进行微波辐射处理，合并滤液，水浴加热提取，趁热过滤，滤液用热水溶解、冷水重结晶的方法进行分离和提纯；微波提取方法与动态循环阶段连续逆流提取方法结合。上述提取方法主要为操作复杂、设备要求较高，不利于工业化生产。
本发明的特点在于乙醇提取后不浓缩直接上大孔树脂柱，操作简单，并且解决了浓缩后溶液浑浊不利于上柱的问题。整个生产工艺简单、生产周期短，安全、不污染环境，成本低，收率高，二氢杨梅素纯度高达95％以上，特别适合产业化大量生产。
文献报道二氢杨梅素具有降血脂、降血糖、保护肾脏及肝脏损伤、抗氧化、消炎、止咳、抗高血压、抑菌等功效。没有报道具有预防和治疗老年痴呆的作用。老年痴呆症将是我国对人们健康危害最大的精神疾病之一。老年痴呆症主要可分为脑血管性老年痴呆、阿尔茨海默型痴呆、混合型和其它型等。老年人因脑血管障碍而致的脑细胞老化，使思考、运动等传递受阻引起的痴呆称为脑血管性老年痴呆。脑动脉硬化、脑血栓、脑溢血以及高血压等容易引起本病，约40％的科学家认为，老年痴呆症主要发病原因之一是脑血管病与某些脑神经中枢及功能上的联系发生了损害。老年痴呆已成为威胁人类晚年生活质量的主要疾病之一，患病率呈逐年上升趋势。由于缺乏有效治疗方法，老年痴呆已成为继心脏病、癌症和中风之后人类的第4位死因。因此，寻找治疗老年性痴呆症的有效药物，研究老年痴呆的病因及治疗具有十分重要的意义。已成为医药领域的研究热点之一。并且具有良好的社会效益。

二氢杨梅素结构式
发明内容
本发明的目的之一提供了单一成分二氢杨梅素在治疗老年痴呆症中的应用。具体的说二氢杨梅素用于制备防治老年痴呆症的新用途。经动物实验，能够显著改善痴呆小鼠的学习记忆功能，并能明显提高SOD的活性，降低MDA的含量，提高脑系数，最终提供安全有效可用于预防和治疗老年痴呆的药物制剂。在本发明申请前未见有应用二氢杨梅素单体成分预防和治疗老年痴呆症的报道。
本发明目的之二是提供了二氢杨梅素的提取分离方法，以往公开的提取分离二氢杨梅素的方法多是以通过各种溶剂(水或有机溶剂)煎煮或超声提取葡萄科植物，浓缩，再用热水溶解，趁热过滤，滤液直接用色谱分离；或将药材在溶剂中浸泡，过滤，进行微波辐射处理，合并滤液，水浴加热提取，趁热过滤，滤液用热水溶解、冷水重结晶的方法进行分离和提纯；或微波提取方法与动态循环阶段连续逆流提取方法结合。不适合产业化生产。本发明采用了安全有效的活性炭在乙醇提取液中脱脂除叶绿素等杂质的方法。并且乙醇提取液直接通过大孔树脂柱，除去水不溶性杂质，有效成分由乙醇提取液直接洗脱下来，解决了水不溶性样品不容易上大孔树脂柱的难题，节约了乙醇，降低了成本，有利于结晶的析出，可操作性强，适合工业生产，也是本发明主要创新之一。本发明分离二氢杨梅素的方法，成本低，易操作，获得的样品纯度高，二氢杨梅素的含量高达95％以上。
本发明的目的之三利用C-18反相常压柱分离纯化二氢杨梅素成分也是一项新的技术。该方法分离的二氢杨梅素纯度高(含量98％)由于采用常压分离柱，可跟据需要设计柱的规格，可大量制备高纯度二氢杨梅素，分离柱可反复使用，易操作。
本发明的目的之四是提供了单一成分二氢杨梅素的药物制剂，主要为口服制剂。所说的口服制剂选自于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂中的任何一种。
本发明的目的之五是药物优选含有1％—99％的二氢杨梅素和99％—1％的药用赋形剂或其它可组方的药物。药物中的辅料是指常规的赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂等。本发明药物中的其它配伍用的药物，指的是以有效剂量的二氢杨梅素为一定的药物原料，再配伍其它已允许合用的中药或化学药品。
本发明是通过以下方法实施的：葡萄科蛇葡萄属植物蛇葡萄茎叶和显齿蛇葡萄茎叶用50—80％乙醇或甲醇溶液提取一次或多次，趁热过滤，合并提取液，加入0.01—3％活性炭，过滤，滤液过大孔树脂柱，流出液浓缩，析晶(4—10℃)，得粗提物；粗提物用乙醇—冷水、甲醇—冷水或丙酮—冷水纯结晶2-3次，得二氢杨梅素晶体。将二氢杨梅素晶体在C-18反相柱(常压)上分离纯化，用氯仿-甲醇为洗脱剂，收集二氢杨梅素流分，薄层鉴定后合并，挥去部分溶剂，得纯度可达98％以上的单一成分二氢杨梅素。
二氢杨梅素及其药物制剂具有预防和治疗老年痴呆症的作用，这些药理作用，通过以下药效学试验得到证实。
1、二氢杨梅素对亚硝酸钠致小鼠记忆障碍的影响
取小鼠60只，随机按表1分组。各组灌胃给药7天后，除正常组外，其余各组于训练后立即皮下注射亚硝酸钠120mg/kg，各组于训练后24小时末次给药，并与给药后1小时进行跳台实验，记录动物犯错误的潜伏期和错误次数，结果见表1。
表1、二氢杨梅素对亚硝酸钠致小鼠记忆障碍的影响(n＝10，X±S)

_△与模型组比较，_△P<0.05，_△△P<0.01
结果表明，二氢杨梅素大、中、小剂量组对亚硝酸钠致小鼠记忆障碍均有明显的改善作用，能明显减少小鼠犯错误的次数，延长小鼠犯错误的潜伏期。
2、二氢杨梅素对AlCl₃致小鼠记忆障碍的影响
取小鼠60只，随机按表2分组。第1天至第7天，对照组每天皮下注射生理盐水，其余各组小鼠皮下注射AlCl₃ 50mg/kg。用药组分别灌胃连续给药2周。进行避暗试验，记录3min内小鼠进入暗室的错误次数，24h后以错误次数及错误百分率测验记忆成绩。
表2、二氢杨梅素对AlCl₃致小鼠记忆障碍的影响(n＝10，X±S)

*与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；_△与模型组比较，_△P<0.05，_△△P<0.01
说明二氢杨梅素不同剂量对AlCl₃致记忆障碍均有不同程度的对抗效果，各治疗组与模型组比较错误次数具有显著性差异(P<0.01)，错误发生率也具有显著性差异(P<0.05)。
3、二氢杨梅素对东莨菪碱致小鼠记忆障碍的影响
取小鼠60只，随机按表3分组。第1天至第7天，对照组及模型组给蒸馏水，其余各组按表3给药。每天一次，连续7天，末次给药1h后，正常组给生理盐水0.1ml/10g，其余各组给氢溴酸东莨菪碱3mg/kg，10min后进行跳台实验，24h后进行测试。结果见表3。
表3 二氢杨梅素对东莨菪碱致小鼠记忆障碍的影响(n＝10，X±S)

_△与模型组比较，_△P<0.05，_△△P<0.01
氢溴酸东莨菪碱组小鼠错误次数较正常组显著增加，用药组明显减少了小鼠的错误次数，说明二氢杨梅素对氢溴酸东莨菪碱组所致的小鼠记忆障碍有明显的对抗作用(P<0.01)。
4、二氢杨梅素对老年痴呆模型小鼠脑线粒体超氧化物歧化酶SOD活性、丙二醛(MDA)含量及脑系数的影响。
取小鼠60只，随机分为正常对照组和模型组。模型组给AlCl₃溶液，开始70天按400mg/kg/d灌胃，以后一直用2000mg/LAlCl₃溶液饮用；正常对照组灌胃等量的蒸馏水。将模型组随机分为5组，按表1所示，灌胃给药60天，正常对照组痴呆模型组灌以量的蒸馏水。整个实验过程避免与铝制品接触。处死小鼠，于冰浴中迅速取出脑组织，并精确称取，分别测定SOD、MDA和计算脑系数。实验结果见表4。
表4、二氢杨梅素对老年痴呆模型小鼠脑SOD活性、MDA含量
及脑系数的影响(n＝10，X±S)


*与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；_△与模型组比较，_△P<0.05，_△△P<0.01
模型对照组与正常对照组比较，脑SOD活性降低，MDA含量增加，脑系数减少(P<0.05)。与模型组比较，二氢杨梅素高、中、低剂量组SOD活性升高，MDA含量降低，说明二氢杨梅素具有明显的抗氧化作用，改善自由基在体内的过量代谢。二氢杨梅素中、低剂量组组脑系数显著增加(P<0.05)，高剂量组差异更显著(P<0.01)。从而说明有抗脑萎缩的作用。
5、二氢杨梅素对老年痴呆模型乙酰胆碱含量的影响。
取小鼠60只，随机分为正常对照组和模型组。模型组给AlCl₃溶液，开始70天按400mg/kg/d灌胃，以后一直用2000mg/LAlCl₃溶液饮用；正常对照组灌胃等容的蒸馏水。将模型组随机分为5组，按表5所示，灌胃给药60天，正常对照组痴呆模型组灌以等体积的蒸馏水。整个实验过程避免与铝制品接触。大鼠断头处死，迅速开颅剥离脑组织(去除小脑组织)，取部分脑组织生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，加入冷生理盐水放入匀浆管在冰浴中充分研碎，制成10％的脑匀浆，离心，取上清用比色法测定脑组织乙酰胆碱酶含量。实验结果见表5。
表5、二氢杨梅素对老年痴呆模型乙酰胆碱含量的影响(n＝10，X±S)

*与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；_△与模型组比较，_△P<0.05，_△△P<0.01
各治疗组和模型组比较，乙酰胆碱含量降低，并有显著性差异(P<0.01)。并且二氢杨梅素各剂量组与脑复康没有显著差异。6、小鼠的急性毒性实验
以动物能耐受的最大给药浓度(0.5g/ml)、小鼠最大给药容积(0.4ml/10g体重)一日内灌胃给药1次，连续观察7天内有无毒性反应及动物死亡。测得结果是：小鼠7天内动物均无一死亡，在此剂量下未观察到明显急性毒性反应。其小鼠最大给药量为20g/kg体重/d。
本发明是通过如下的实验施例得以实现(证实)
实施例1、二氢杨梅素的制备：
药材1kg，用50-80％乙醇(优选70％乙醇)8倍量回流提取2-3次，每次提取1～3小时，用提取液0.5％(w/v)的活性炭脱色，过滤，滤液通过预先处理好的D101或AB—8大孔树脂中，流出液浓缩回收乙醇至500ml，放置析晶(4—10℃)，离心，沉淀用乙醇—水纯结晶2-3次，得二氢杨梅素晶体(含量96.7％)。将二氢杨梅素晶体在C-18反相柱(常压)上分离纯化，用氯仿-甲醇为洗脱剂，收集二氢杨梅素流分，薄层鉴定后合并，挥去部分溶剂，得纯度可达98％以上的单一成分二氢杨梅素(含量98.9％)。
实施例1(胶囊剂)
二氢杨梅素100g，药用淀粉适量，混合均匀，制粒，干燥，整粒，装入1号胶囊，制成1000粒，即得。每次1粒，每日3次。
实施例2(片剂)
二氢杨梅素原料100g，药用淀粉适量，糊精适量，混合均匀，制粒，干燥，整粒，干燥，加入润滑剂适量，压片，制成1000片，即得。每次1片，每日3次。
实施例3(滴丸剂)
称取30g聚乙二醇4000，在水浴上熔化，加二氢杨梅素原料10g，搅拌均匀，倾入保温管中，调节恒温装置，使药液在80—90℃下滴入冷却过的液体石蜡中，滴完后，将药丸倾入滤纸上吸干石蜡油，制成1000粒，即得。每次10粒，每日3次。
实施例4(颗粒剂)
二氢杨梅素原料100g，糖粉400g，混合均匀，用适量乙醇制粒，干燥、整粒、分装，制成500袋，即得。每次0.5袋，每日3次。