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1、(10)申请公布号 CN 103356994 A (43)申请公布日 2013.10.23 CN 103356994 A *CN103356994A* (21)申请号 201310301019.5 (22)申请日 2013.07.17 A61K 38/17(2006.01) A61P 5/16(2006.01) G01N 33/68(2006.01) (71)申请人 上海交通大学医学院附属瑞金医院 地址 200025 上海市卢湾区瑞金二路 197 号 (72)发明人 宁光 綦一澄 王曙 崔斌 (74)专利代理机构 上海伯瑞杰知识产权代理有 限公司 31227 代理人 吴瑾瑜 (54) 发明名称。
2、 CD40 配体的应用 (57) 摘要 本发明涉及生物技术和医药领域， 公开了 CD40 配体在制备治疗 GD 的药物、 制备或筛选 GD 初发的诊断试剂， 或者制备或筛选调控骨桥蛋白 的药物、 治疗毒性弥漫性甲状腺肿的药物或者调 控 B 淋巴细胞抗体的药物。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103356994 A CN 103356994 A *CN103356994A* 1/1 页 2 1.CD40 配体用于制备或筛选调控骨桥。
3、蛋白的药物。 2.CD40 配体用于制备或筛选治疗毒性弥漫性甲状腺肿的药物。 3.CD40 配体用于制备或筛选调控 B 淋巴细胞抗体的药物。 4.CD40 配体用于制备毒性弥漫性甲状腺肿初发的诊断试剂。 5. 权利要求 1-4 任一项所述的应用， 其特征在于， 所述的 CD40 配体为血浆 sCD40L 或 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L。 权 利 要 求 书 CN 103356994 A 2 1/7 页 3 CD40 配体的应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术和医药领域， 具体为 CD40 配体的应用。 背景技术 0002 甲 状 腺 功 能 亢 进 症 (hyperthyr。
4、oidism，简 称 甲 亢 )，也 称 甲 状 腺 毒 症 (thyrotoxicosis)， 是指由于甲状腺本身或甲状腺以外的多种原因引起的甲状腺激素合成 和分泌增加， 进入循环血中， 作用于全身的组织和器官， 造成机体的神经、 循环、 消化等各系 统的兴奋性增高和代谢亢进为主要表现的一组疾病的总称。 甲状腺合成和释放的最主要的 两种激素是甲状腺素 （thyroxine， T4） 和三碘甲状腺原氨酸 （triiodothyronine， T3） 。 T4是 一种激素原， 浓度比T3高， 但T3与各组织中特异性核受体相互作用的生物活性比T4高。 T3 可调节能量的产生和物质代谢速率， 且对心。
5、血管、 肝脏和神经肌肉功能均有较大的影响。 甲 亢是一种常见病， 研究显示女性发病率高于男性， 随着年龄增长发病率增加， 此外白种人发 病率较其他人种高。 在一项关于6000名年龄大于65岁的志愿者的筛查研究中发现， 甲亢的 发病率为 0.3%， 而亚临床甲亢发病率更是高达 2.1%。统计显示我国目前甲亢和亚临床甲亢 的总发病率高达 2-3。临床上， 甲亢的病因有很多， 以 Graves 病 （Graves Disease， GD） 甲亢及桥本甲状腺炎甲亢 （hashimoto thyroiditis,HT） 、 亚急性甲状腺炎甲亢 （Subacute thyroiditis， SAT） 为多。
6、见。毒性多结节甲状腺肿， 甲状腺自主高功能腺瘤等疾病， 也常出 现甲状腺功能亢进的症状。其中 Graves 病是导致甲亢的最常见原因， 约占全部甲亢的 80%-85%。 0003 Graves 病甲亢 (Graves disease， GD） 又称毒性弥漫性甲状腺肿， 也称 Basedow 病， Parry 病， 是一种常见的抗体介导的器官特异性自身免疫性内分泌疾病， 要是由于体内 存在促甲状腺激素受体 （thyrotropic-stimulating hormone receptor,TSHR） 的自身抗体 （thyrotrophin receptor antibody,TRAb） ， 与甲。
7、状腺细胞膜上的TSHR结合， 过度刺激TSHR 而引起甲状腺机能亢进及弥漫性甲状腺肿， 部分患者还伴有突眼及胫前黏液性水肿等甲状 腺外的表现， 典型临床表现包括甲状腺功能亢进， 弥漫性甲状腺肿和 GD 相关眼病等。GD 甲 状腺组织中存在大量包括单核细胞、 T 淋巴细胞、 B 淋巴细胞、 NK 细胞及树突状细胞在内的 多种免疫细胞浸润， 局部可产生大量的自身抗体， 主要包括促甲状腺激素受体 (TSHR） 的自 身抗体 （TRAb） 、 甲状腺过氧化物酶抗体 （TPOAb） 、 甲状腺球蛋白抗体 （TGAb） 。 研究证实TRAb 与 GD 发病最为相关， TRAb 可刺激甲状腺合成过量的甲状腺。
8、激素， 导致甲状腺功能亢进和甲 状腺体积增大， 但 GD 中 TRAb 升高的具体机制尚不明确。 0004 通常认为， 遗传因素、 环境因素及自身免疫系统紊乱是 Graves 病发病及疾病发展 过程中的重要因素， 然而 Graves 病的发病最直接、 最核心的问题仍然是免疫因素。 0005 GD 的治疗方法主要包括抗甲状腺药物 (antithyroid drug,ATD)、 手术、 放射性 I 治疗。ATD 药物安全性较高， 虽然可导致部分患者粒细胞减少和肝功能损害， 但停药后即可 恢复正常， 所以目前全世界对于 Graves 病甲亢的治疗仍以药物为主， 但是 ATD 的高复发率 以及疗程太长。
9、， 给患者带来了诸多不便。而手术及放射性 I 治疗都是通过破坏甲状腺组织 说 明 书 CN 103356994 A 3 2/7 页 4 及细胞， 以减少甲状腺激素的合成和分泌， 疗程短， 治疗率高， 复发率低， 但是甲状腺功能减 退症发生率显著增高。因此 Graves 病甲亢要改善治疗方法、 缩短疗程， 就必须深入研究 Graves 病甲亢引起 TRAb 产生的免疫机制， 这无疑将是 Graves 病甲亢研究的新方向。 0006 骨桥蛋白 （OPN） 是一种具有趋化、 促炎因子分泌和整合素性能的胞外基质蛋白， 与多种自身免疫性疾病发病相关。OPN 主要通过 2 种机制发挥细胞信号转导的作用 :。
10、 一是 以分子内 RGD 序列与整合素家族分子结合 RGD 途径 , 其整合素受体包括 v3、 v1、 41、 81、 91 等 ； 二是与细胞表面粘附性糖蛋白 CD44 以非 RGD 依赖方式结合， 其 粘附素受体为 CD44。在类风湿性关节炎 （RA） 中 , 关节滑液 CD4+T 淋巴细胞中 OPN 表达增 加， 从而放大并维持滑膜的炎症反应。在移植物抗宿主病 (GVHD) 中， 抑制 OPN 表达可减轻 CD8+T 淋巴细胞介导的移植物抗宿主反应。在自身免疫性阿弗他溃疡中 OPN 通过上调 T 淋 巴细胞表面受体 CD44 和 CEACAM1 蛋白促进活化的 T 淋巴细胞存活。我们之前。
11、研究显示 GD 患者血清 OPN 及外周血单个核细胞 （PBMCs） 中 OPN mRNA 表达均显著增高。作为一种多功 能性细胞因子， OPN 主要是通过 NF-B 和 MAPK 通路发挥免疫调节作用。Jingwu Zhang 等 发现在类风湿性关节炎中， OPN 通过激活 NF-B 和 MAPK 通路中的 IKK、 p38、 和 JNK 来调节 趋化因子 MCP-1 和 MIP-1 的表达。此外， 有研究证实 OPN 也可促进 B 淋巴细胞的增殖及其 抗体产生。我们之前研究也发现 OPN 水平与包括 TRAb、 TPOAb、 TGAb 在内的 GD 相关自身抗 体呈显著正相关。因此， 我们。
12、拟研究 OPN 在 GD 自身抗体产生过程中的作用。 0007 B 淋巴细胞产生自身抗体在 GD 发病中起着重要作用 , 据报道活化 CD4+T 淋巴细 胞表面 CD40L 与 B 淋巴细胞表面 CD40 的相互作用是 B 淋巴细胞抗体产生的一条重要信号 通路。其中 CD40 是一种 I 型跨膜蛋白， 主要表达于 B 淋巴细胞、 单核细胞、 巨噬细胞、 树突 状细胞及其他非造血来源细胞如血管内皮细胞、 成纤维细胞表面。CD40 在 B 淋巴细胞分 化、 发育的各个阶段发挥重要作用。CD40L（CD40 配体） 是一种型表面蛋白， 属于肿瘤坏 死因子基因超家族成员， 可表达于 CD4+T 淋巴细。
13、胞、 嗜酸性粒细胞、 嗜碱性粒细胞和肥大细 胞， 包括膜结合型 （mCD40L） 和可溶型 （sCD40L） 两种形式。在一些自身免疫性和炎症性疾病 中 ,sCD40L 的增加是由于细胞表面增加的 mCD40L 脱落所致。 0008 CD40L可增强包括系统性红斑狼疮(SLE)、 类风湿性关节炎、 多发性硬化(MS)和自 身免疫性糖尿病等在内的多种自身免疫性疾病的自身免疫炎症反应。研究发现， 在类风湿 性关节炎体外实验中， anti-CD40L 单克隆抗体可抑制 CD40/CD40L 依赖的 B 淋巴细胞抗体 产生。 发明内容 0009 本发明旨在提供 CD40 配体的应用。 0010 技术方。
14、案为， CD40 配体可用于制备毒性弥漫性甲状腺肿初发的诊断试剂， 或者用 于制备或筛选调控骨桥蛋白的药物、 治疗毒性弥漫性甲状腺肿的药物或者调控 B 淋巴细胞 抗体的药物。 0011 本发明采用 ELISA 及流式细胞术分析了 GD 初发患者、 GD 缓解患者及正常志愿者 CD40L 水平， 0012 本发明通过收集初发 GD 患者、 GD 缓解患者和正常志愿者 27 例的临床资料及外周 血标本， 采用酶联免疫吸附试验 （ELISA） 检测患者与志愿者血浆中 OPN 和 sCD40L 水平 , 运 说 明 书 CN 103356994 A 4 3/7 页 5 用流式细胞术测定 CD4+T 淋。
15、巴细胞表面 mCD40L 水平 ； 并分析其与 GD 相关临床指标包括游 离 T3(FT3)、 游离 T4(FT4)、 超敏促甲状腺激素 (sTSH)、 TRAb、 TPOAb、 TGAb 水平的相关性 ； 运 用 Pearsons test 分析 CD40L 与 OPN 的相关性后， 进行体外实验验证 OPN 通过 MAPK 通路 调节 CD40L 表达水平， 从而调节 B 淋巴细胞自身抗体的产生。 0013 体外培养 GD 患者和正常志愿者外周血单个核细胞 （PBMCs） ， 分成对照、 人重组 OPN、 病人血浆、 正常人血浆、 病人血浆加 OPN 抗体处理组， 12 小时后检测经磁珠分。
16、选纯化的 CD4+T 淋巴细胞中 CD40L mRNA 的表达， 培养 24 小时后检测 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 水 平 ； 运用 NF-B 及 MAPK 通路相关阻断剂， 检测 CD4+T 淋巴细胞中 CD40L 基因及 sCD40L 表 达情况。此外， GD 患者和正常志愿者外周血单个核细胞体外培养 10 天， 分成对照， OPN 处 理， OPN 加 CD40L 抗体处理组， ELISA 检测细胞培养上清中 IgG、 IgM 含量。 0014 结果显示， GD 初发患者 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 水平显著高于正常对照组 （2.731.59% 对 1.160.。
17、51%， P0.001） ， 而 GD 缓解患者 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 水 平与正常对照组相比无统计学差异 （1.160.38% 对 1.160.51%， P 0.05） ； 与正常对 照组比较， GD 初发患者血浆 sCD40L 水平显著升高 （1076314pg/ml 对 30051121pg/ml， P0.001） ， GD 缓解患者 sCD40L 水平与正常对照组比较， 差异无统计学意义 （903236pg/ ml 对 1076314pg/ml， P 0.05） ； GD 初发患者血浆 OPN 水平显著高于正常对照组 （14852ng/ml 对 5320ng/ml， 。
18、P0.001） ， 而 GD缓解患者血浆 OPN 水平与正常对照组相比 无统计学差异 （64.921ng/ml 对 5320ng/ml， P 0.05） ； 相关分析提示 OPN、 CD40L 均和 甲状腺功能 FT3、 FT4、 TRAb 水平呈显著正相关， 并发现 OPN 和 CD40L 之间存在很好的相关关 系。在治疗后缓解的 GD 患者中， OPN 和 CD40L 表达水平恢复正常。 0015 相关分析显示 mCD40L 和 sCD40L 均与 OPN 水平呈显著正相关 ； 人重组 OPN 及 GD 患 者血浆中升高的OPN可显著促进CD4+T淋巴细胞CD40L的表达， 而OPN单克隆。
19、抗体可显著抑 制GD患者血浆对CD40L表达的促进作用 ； 同时体外实验发现CD40水平的上调是由Graves 病患者血浆中升高的 OPN 通过调节 p38 和 JNK 所导致 ； 进一步研究证实阻断 CD40L 表达可 降低 OPN 促进的 B 细胞抗体产生。体外实验证实， GD 患者血浆中升高的 OPN 通过调节 p38 和 JNK 来促进 CD40L 的表达， 从而促进 B 淋巴细胞自身抗体的产生。因此， OPN 和 CD40L 可 能成为 Graves 病的新的生物标志物， 并为 Graves 病的治疗提供了新的可能的靶点。 0016 由此可见， 受血浆中升高的 OPN 调节， GD 。
20、初发患者血浆 sCD40L 和 CD4+T 淋巴细胞 表面 mCD40L 水平明显增加， 从而促进了抗体的产生， 参与 GD 发生、 发展的免疫调节过程。 0017 因此， CD40L 可作为分子标记物， 用于制备毒性弥漫性甲状腺肿初发的诊断试剂， 以诊断 GD 初发患者。 0018 或者， 由于 CD40L 受 OPN 的调控， CD40L 可作为靶点， 用于制备或筛选调控骨桥蛋 白的药物。阻断 CD40L 表达可降低 OPN 促进的 B 细胞抗体产生， 因此 CD40L 可作为标记物， 用于制备或筛选调控B淋巴细胞抗体的药物。 CD40L参与GD的发生、 发展的免疫调节过程， 可作为靶点制。
21、备或筛选治疗毒性弥漫性甲状腺肿的药物 0019 本发明研究CD40L与GD发生、 发展的关系， 同时验证OPN通过调节CD40L的表达来 影响 GD 自身抗体的产生， 揭示了 OPN 和 CD40L 在 Graves 病中的表达情况及 OPN 对 CD40L 的调控机制， 同时发现两者在自身抗体产生过程中的重要性为 Graves 病治疗提供了新的 靶点。 说 明 书 CN 103356994 A 5 4/7 页 6 附图说明 0020 图 1 为实施例 1 中， 正常对照组、 初发 GD 组和 GD 治疗缓解组的 mCD40L 和 sCD40L 表达水平。 0021 图 2 为实施例 1 中，。
22、 正常对照组、 初发 GD 组和 GD 治疗缓解组的 OPN 表达水平 0022 图 3 为实施例 1 中， 血浆 OPN 水平与 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 和血浆中 sCD40L 相关关系 0023 图 4 为实施例 2 中， 正常对照者和初发 GD 患者的外周血单个核细胞在空白对照 （Medium） 、 人重组 OPN 处理 （OPN） 、 正常血浆处理 （NP） ， GD 初发患者血浆处理 （PP+CTRl Ab） 和 GD 初发患者血浆加 OPN 单克隆抗体处理 （PP+OPN Ab） 后 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 水 平 （图 A） 和 CD40L 基因表。
23、达水平 （图 B） 。 0024 图 5 为实施例 3 中， 加入抑制剂阻断后， OPN 对 CD40L 的调控。 0025 图 6 为实施例 3 中， 加入 CD40L 单克隆抗体阻断 CD40L 的表达， 对 OPN 所促进抗体 产生的影响。 具体实施方式 0026 实施例 1 0027 I. 研究对象 ： 0028 （1） 初发 Graves 病 （GD） 患者 40 例， 其中 13 例男性， 27 例女性， 所有初发 GD 患 者均未经治疗， 且符合中国甲状腺疾病诊治指南 ： 有甲状腺功能亢进症的临床表现和体征， 甲状腺弥漫性肿大 ； 甲状腺功能检查 : 游离 T3(FT3)、 游离。
24、 T4(FT4) 升高、 超敏促甲状腺激 素 (sTSH) 水平降低， 促甲状腺激素受体抗体 TRAb 阳性， 和 / 或甲状腺同位素吸碘率升高。 0029 （2） GD 治疗缓解组患者 21 例， 其中 7 例男性， 14 例女性， 均为持续药物甲巯咪唑治 疗半年以上， 病情缓解， 临床症状基本消失， 甲状腺功能 FT3、 FT4、 sTSH 均正常， 抗体水平较 初发时显著下降者。 0030 （3） 27 名性别、 年龄相匹配的健康志愿者作为正常对照组， 其中 9 例男性， 18 例 女性。正常志愿者入组标准 ： 排除甲状腺疾病及其它自身免疫性疾病病史 ； 排除甲状腺疾 病家族史和其它自身。
25、免疫性疾病家族史 ； 血清 FT3、 FT4、 sTSH 均在正常范围 ； TRAb、 TPOAb、 TGAb 均为正常水平 ； 甲状腺 B 超无异常。 0031 所有研究对象均为居住于中国大陆的汉族人， 均为黄色人种。 3组研究对象的基线 资料如表 1 和表 2 所示。 0032 表 1 ： 3 组研究对象基线资料情况对比 说 明 书 CN 103356994 A 6 5/7 页 7 0033 0034 aP0.01,GD 初发组与正常对照组比较 0035 bP0.01,GD 治疗缓解组与 GD 初发组比较 0036 三组之间的性别和年龄无明显统计学差异 ； 初发 Graves 病患者组， 。
26、其临床甲状 腺功能指标 ： 血清 FT3、 FT4、 TPOAb、 TRAb 及 TGAb 水平均显著高于正常对照组 （P0.01） ， 血 清 sTSH 水平显著低于正常对照组 （P0.01） ； 治疗后缓解的 Graves 病组患者均经过至少六 个月的抗甲状腺药物治疗， 甲状腺功能维持正常， 与初发 Graves 病组相比， 其临床甲状腺 功能指标明显改善 ： 血清 FT3、 FT4、 TPOAb、 TRAb 及 TGAb 表达水平明显下调 （P0.01） ， 血清 sTSH（促甲状腺素） 表达水平显著高于初发 Graves 病组 （P0.01） 。 0037 II.CD40L、 OPN 。
27、表达水平与临床参数相关性 0038 采用酶联免疫吸附试验 （ELISA） 检测患者与志愿者血浆中 OPN 和 sCD40L 水平， 用 流式细胞术测定 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 水平。三组研究对象的 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 及血浆 sCD40L 的表达水平如图 1 所示， CD40L 表达水平与临床参数相关性如表 2 所 示 ； 血浆 OPN 表达水平及与临床参数的相关性如图 2 和表 3。 0039 表 2 CD40L 表达水平与临床参数的相关性 0040 0041 在一些自身免疫性和炎症性疾病中 ,sCD40L 的增加是由于细胞表面增加的 mCD40L 脱落所。
28、致。运用 Pearsons 相关分析发现， sCD40L 水平与 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 水平呈显著相关关系 （R=0.713， P0.0001） ， 结果验证了之前的文献报道。 0042 同时由表 2 发现， 血浆 sCD40L 与 FT3（游离三碘甲腺原氨酸） 、 FT4（游离甲状腺 素） 、 TRAb（促甲状腺素受体抗体） 、 TPOAb（甲状腺过氧化物酶抗体） 、 TGAb（抗甲状腺球蛋白 抗体） 水平均呈显著正相关关系， 与 sTSH 水平呈负相关。而 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 仅 与 FT3、 FT4、 TRAb 水平呈正相关， 与 sTSH 水平呈负。
29、相关， 却与 TPOAb、 TGAb 无显著相关性。 上述结果提示 CD40L 可能参与了 GD 的自身抗体产生过程， 且 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 水平与 GD 发病相关自身抗体 TRAb 存在更好的特异性。 说 明 书 CN 103356994 A 7 6/7 页 8 0043 用流式细胞术进行检测， 分析三组研究对象 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 水平。结 果显示 GD 初发患者 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 水平最高达 3.3%， 而正常志愿者为 1%， GD 治疗后缓解者为 0.8%。将所有进行流式检测者的流式结果进行分析显示， GD 初发患 者 C。
30、D4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 水平显著高于正常对照组 （2.731.59% 对 1.160.51%， P0.001） ， 而 GD 缓解患者 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 水平与正常对照组相比无统计学 差异 （1.160.38 对 1.160.51%， P 0.05） ； 同时， 与正常对照组比较， GD 初发患者血 浆 sCD40L 水平显著升高 （1076314pg/ml 对 30051121pg/ml， P0.001） ， 而 GD 缓解患者 sCD40L水平与正常对照组之间差异无统计学意义 （903236pg/ml对1076314pg/ml， P 0.05） 0044。
31、 表 3 OPN 表达水平与临床参数的相关性 0045 OPNFT4FT3sTSHTRAbTPOAbTGAb r0.6830.706-0.5840.4990.5660.334 p0.0010.0010.0010.0010.0010.035 0046 由表 3 和图 2 可见， GD 初发患者血浆 OPN 水平显著高于正常对照 （14852ng/ml 对 5320ng/ml， P0.001） ， 而 GD 缓解患者血浆 OPN 水平与正常对照组相比无统计学差异 （64.921ng/ml对5320ng/ml， P0.05， 图2） ， 且血浆OPN水平与FT3、 FT4、 TRAb、 TPOAb、。
32、 TGAb 水平呈正相关， 与 sTSH 水平呈负相关 ( 表 3)。结果提示 OPN 与 GD 自身抗体产生存在 相关性。 0047 III.OPN 与 CD40L 水平的相关分析 0048 相关分析发现血浆 OPN 水平与 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 和血浆中 sCD40L 均呈 显著相关关系， 如图 3 所示， R=0.565， P0.0001 ； R=0.8421， P0.0001） ， 证明 OPN 与 CD40L 之间确实存在联系。 0049 实施例 2 0050 运用体外细胞实验来验证 OPN 调控 CD40L 的表达。我们分别收集了 10 例正常对 照者 （Ctrl。
33、） 和 10 例初发 GD 患者的新鲜外周血标本， 并分离外周血单个核细胞 （PBMCs） 进 行体外细胞培养。分为空白对照 （Medium） 、 人重组 OPN 处理 （OPN） 、 正常血浆处理 （NP） ， GD 初发患者血浆处理 （PP+CTRl Ab） 和 GD 初发患者血浆加 OPN 单克隆抗体处理 （PP+OPN Ab） 5 组。其中 5 例正常对照者和 5 例初发 GD 患者的 PBMCs， 在培养 24 小时后收集细胞， 检测 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 水平， 经流式细胞分析发现， 经人重组 OPN 和 GD 初发患者血浆 处理后CD4+T淋巴细胞表面mCD40。
34、L水平较对照显著升高， 而OPN单克隆抗体可显著抑制GD 初发患者血浆对 CD4+T 淋巴细胞表面 mCD40L 表达的促进作用。同时， 另外 5 例正常对照者 和 5 例初发 GD 患者的 PBMCs， 在培养 12 小时后收集细胞， 检测经磁珠分选纯化的 CD4+T 淋 巴细胞中 CD40L mRNA 的表达， 经过 real-time PCR 检测同样发现人重组 OPN 和 GD 初发患 者血浆可促进 CD4+T 淋巴细胞 CD40L 基因表达， 而 OPN 单克隆抗体可抑制 GD 初发患者血浆 对 CD4+T 淋巴细胞 CD40L 基因表达的促进作用。如图 4 的 A 和 B 所示。 。
35、0051 因此可以判断， GD 病人中 CD4+T 淋巴细胞中 CD40L 水平的升高是由血浆中增加的 说 明 书 CN 103356994 A 8 7/7 页 9 OPN 水平所导致的， OPN 对 CD40L 的表达起调节作用。 0052 实施例 3 0053 进一步研究 OPN 对 CD40L 表达的调控机制， 我们用 IKK 抑制剂阻断 NF-B 通路， p38、 JNK、 MEK-1/2抑制剂阻断MAPK通路。 结果发现p38和JNK抑制剂可阻断OPN促进CD4+T 淋巴细胞中 CD40L 基因和细胞上清中 sCD40L 的表达， 结果如图 5。因此， 我们认为 OPN 是通 过 M。
36、APK 通路中的 p38 和 JNK 来调节 CD40L 的表达。 0054 收集 5 例正常对照者和 5 例初发 GD 患者的新鲜外周血标本， 并分离 PBMCs 进 行细胞培养。分为空白对照 （Medium） 、 OPN 处理 （OPN）和 OPN 加 CD40L 单克隆抗体 （OPN+antiCD40L） 处理 3 组。培养 10 天后， 收集细胞上清， 经 ELISA 检测发现， OPN 确实可 促进 IgG 和 IgM 表达， 而这种作用可被 CD40L 单克隆抗体阻断。以对照组为 100%， 各组结 果用百分比表示。PBMCs 来源于 GD 初发患者， 对照组 IgG 产量为 15。
37、60589ng/ml ； 对照组 IgM 产量为 615331ng/ml。PBMCs 来源于正常志愿者， 对照组 IgG 产量为 999474ng/ml ； 对照组 IgM 产量为 296205ng/ml。实验结果见图 6。 0055 结果证实， OPN 是通过促进 CD40L 的表达来促进 B 细胞抗体产生。 说 明 书 CN 103356994 A 9 1/3 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103356994 A 10 2/3 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103356994 A 11 3/3 页 12 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103356994 A 12 。