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1、10申请公布号CN104119860A43申请公布日20141029CN104119860A21申请号201310373662922申请日20130822201310150585020130426CNC09K11/06200601G01N21/6420060171申请人中国科学院大连化学物理研究所地址116023辽宁省大连市中山路457号72发明人韩克利楼张蓉于法标李鹏74专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司21002代理人马驰54发明名称用于实时可逆检测过氧化亚硝酰的荧光探针及其应用57摘要用于实时可逆检测过氧化亚硝酰的荧光探针及其应用涉及一种在ONOO存在下荧光发生增强，在还原性物质存。
2、在下荧光又恢复原来状态的荧光探针。本发明提供了一种可用于选择性地实时检测溶液体系、细胞、动物组织或动物个体内ONOO变化的可逆荧光探针。本发明采用花菁染料作为荧光母体，在花菁母体上引入有机碲结构作为与ONOO反应的活性中心，以实现选择性地检测ONOO；利用有机碲醚被氧化后形成的有机碲氧化物容易被生物体系中的还原性小分子如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等还原为有机碲醚的性质，实现探针分子对ONOO的可逆性检测。66本国优先权数据51INTCL权利要求书2页说明书6页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页附图5页10申请公布号CN104119860A。
3、CN104119860A1/2页21一种荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针的通式为通式R1TER2YF，通式中，R1为120个碳原子的烷基，烯丙基，含取代基或不含取代基苯环、萘环或蒽环；苯环、萘环或蒽环上的取代基为硝基、氨基、磺酸基、羟基、胺基、烷氧基、氰基、氟、氯、溴、碘中的一种或二种以上，取代基的个数为15个；R2为120个碳原子的烷基，烯丙基，含取代基或不含取代基的苯环、萘环或蒽环；苯环、萘环或蒽环上的取代基为硝基、氨基、磺酸基、羟基、胺基、烷氧基、氰基、氟、氯、溴、碘中的一种或二种以上，取代基的个数为15个；Y为O、S、SE、NRR“、NRCO、NRCS、NRNRCO或NRNRCS其。
4、中R和R“分别为H或C1C10的烷基,R和R“相同或不同；F为一甲川花菁母体、三甲川花菁母体、五甲川花菁母体或七甲川花菁母体。2根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于F为七甲川花菁母体，所述荧光探针的通式为R3为C1C20的烷基，最佳为C1C10的烷基；R4为C1C20的烷基，最佳为C1C10的烷基；Y为O、S、SE、NRR“、NRCO、NRCS、NRNRCO或NRNRCS其中R和R“分别为H或C1C10的烷基,R和R“相同或不同；R5、R6分别为H、C1C20的烷基、磺酸基、羧基、环烷基、羟基、卤素、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基；R5、R6相同或不同。3根据权利要求2所述的荧光探针，其特。
5、征在于R5或R6为环烷基，与各自相连的苯环以单键的方式连接或以并环的方式连接。4一种权利要求1、2或3所述的荧光探针在可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于将通式应用于检测ONOO时，其是与ONOO作用，生成具有通式结构的化合物，从而导致荧光的改变；具有通式结构的化合物，在还原性物质半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白的存在下，重新变为具有通式I结构的化合物，从而导致荧光的恢复，此过程可定性检测ONOO。5根据权利要求4所述的荧光探针在实时可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在权利要求书CN104119860A2/2页3于将通式应用于检测ONOO时，其是与ONOO作用，生成具有通式结构的化合。
6、物，从而导致荧光的改变；具有通式结构的化合物，在还原性物质半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白的存在下存在下，重新变为具有通式结构的化合物，从而导致荧光的恢复。6根据权利要求4所述的荧光探针在实时可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于通式可对ONOO进行定量检测。7根据权利要求4所述的荧光探针在实时可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于用通式测定溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的ONOO，其荧光强度随溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的氧化还原电位而改变，能够对溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的ONOO的进行实时可逆检测。权利要求书CN104119860A1/6页4用于实时可逆检。
7、测过氧化亚硝酰的荧光探针及其应用技术领域0001本发明涉及一种用于可逆检测过氧化亚硝酰（ONOO）的荧光探针，具体的说，是一种在ONOO存在下荧光发生增强，在还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等存在下荧光又恢复原来状态的荧光探针。背景技术0002过氧化亚硝酰（ONOO）是一种具有强氧化性的短寿命活性物种，在人体内由一氧化氮和超氧负离子反应产生。ONOO能作用于被免疫系统识别的病菌等有害物质而使之失活，从而保护机体免受有害物质侵害，维持细胞和组织的正常功能。但是，在细菌感染等病理条件下，大量ONOO的产生会导致缺血再灌注损伤、风湿性关节炎、败血症、中风、多发性硬化、动脉硬化、肠炎、。
8、癌症及多种神经退行性疾病。然而，长久以来，检测手段的缺乏阻碍了人们对ONOO在生命体系中作用行为的研究。0003荧光探针是有效检测生命体内ONOO的手段之一。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、可用于实时可逆检测等优点。TETSUONAGANO等公开了一类用以检测高反应性活性氧的荧光探针HPF及APF（结构见图1，TNAGANOETAL,JBIOCHEM,2003,278,3170），与ONOO作用后荧光增强从而检测ONOO的存在。但是这类荧光探针同时对羟自由基、次氯酸根等活性物种响应灵敏，不能用于专一性地检测ONOO，也不具有可逆性，不能用于ON。
9、OO的实时检测。DANYANG等公开了一种检测ONOO的荧光探针HKGREEN1（结构见图1，DANYANGETAL,JAMCHEMSOC,2006,128,6004）,次氯酸根不干扰ONOO的检测，但羟自由基对ONOO检测的干扰很大，并且这种探针不具有可逆性，不能用于ONOO的实时检测。最近，DANYANG等公开了一种检测ONOO的荧光探针HKGREEN2（结构见图1，DANYANGETAL,ORGLETT,2009,11,1887），该探针仍然对羟自由基有较强响应，并且不具有可逆性，不能用于ONOO的实时检测。由于不具有可逆性，上述探针无法准确提供生物体系中由ONOO引起的氧化应激随时间变。
10、化的情况，不具有应用前景。开发具有选择性，可用于溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中ONOO实时可逆检测的荧光探针具有重要意义。发明内容0004本发明就是针对上述问题，提供了一种可用于选择性检测细胞内ONOO的可逆荧光探针，此探针可以选择性地与ONOO作用，作用后荧光强度发生改变，在还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等存在下荧光又可以恢复到原先状态。0005为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案本发明采用花菁染料作为荧光母体，在花菁母体上引入有机碲结构作为与ONOO反应的活性中心，以实现选择性地检测ONOO；利用有机碲被氧化后形成的有机碲氧化物容易被生物体系中的还原性小。
11、分子如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等还原为有机碲醚的性质，实现探针对过氧化亚硝酰的可逆性检测。说明书CN104119860A2/6页50006所述的荧光探针的通式为0007通式R1TER2YF，0008通式中，R1为120个碳原子的烷基，烯丙基，含取代基或不含取代基苯环、萘环或蒽环；苯环、萘环或蒽环上的取代基为硝基、氨基、磺酸基、羟基、胺基、烷氧基、氰基、氟、氯、溴、碘中的一种或二种以上，取代基的个数为15个；0009R2为120个碳原子的烷基，烯丙基，含取代基或不含取代基的苯环、萘环或蒽环；苯环、萘环或蒽环上的取代基为硝基、氨基、磺酸基、羟基、胺基、烷氧基、氰基、氟、氯、溴、碘中的一。
12、种或二种以上，取代基的个数为15个；0010Y为O、S、SE、NRR“、NRCO、NRCS、NRNRCO或NRNRCS其中R和R“分别为H或C1C10的烷基,R和R“相同或不同；0011F为染料母体，染料母体为一甲川花菁、三甲川花菁、五甲川花菁或七甲川花菁。0012F为七甲川花菁时，所述荧光探针的通式为00130014R3为C1C20的烷基，最佳为C1C10的烷基；0015R4为C1C20的烷基，最佳为C1C10的烷基；0016Y为O、S、SE、NRR“、NRCO、NRCS、NRNRCO或NRNRCS其中R和R“分别为H或C1C10的烷基,R和R“相同或不同；0017R5、R6分别为H、C1C。
13、20的烷基、磺酸基、羧基、环烷基、羟基、卤素、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基；R5、R6相同或不同。0018R5或R6为环烷基时，与各自相连的苯环以单键的方式连接或以并环的方式连接。0019将通式应用于检测ONOO时，其是与ONOO作用，生成具有通式结构的化合物，从而导致荧光的改变；00200021具有通式结构的化合物，在还原性物质半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白的存在下，重新变为具有通式I结构的化合物，从而导致荧光的恢复，此过程可定性检测ONOO。0022将通式应用于检测ONOO时，其是与ONOO作用，生成具有通式结构的化合物，从而导致荧光的改变；说明书CN104119860A3/6页6。
14、00230024具有通式结构的化合物，在还原性物质半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白的存在下，重新变为具有通式结构的化合物，从而导致荧光的恢复。0025通式可对ONOO进行定量检测。0026用通式测定溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的ONOO，其荧光强度随溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的氧化还原电位而改变，能够对溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的ONOO进行实时可逆检测。0027将浓度呈梯度变化的过氧化亚硝酰水溶液分别加入通式的水溶液中，分别测定加入后各体系的荧光强度，然后以过氧化亚硝酰溶液的浓度和加入后体系的荧光强度为横坐标、纵坐标作图，根据荧光强度，即可从图中读出溶液中过氧。
15、化亚硝酰的含量。0028通式所代表的化合物，本身荧光很弱，可以特异性地与ONOO迅速作用，生成通式所代表的的碲氧化物，同时荧光增强；0029通式所代表的具有较强荧光的碲氧化物与还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等作用会重新回到具有通式所代表的结构的化合物，相应的荧光也变回初始的较弱的状态。0030具有通式结构的化合物用作ONOO荧光探针测定溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的ONOO，其荧光强度随溶液体系、细胞、动物组织或动物个体的氧化还原电位而改变，能够对溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的ONOO的进行实时可逆检测；具体的说就是，当溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中ON。
16、OO的浓度增加时，其与探针作用而生成的具有通式结构的化合物的浓度增加，从而导致荧光增强；在此基础上，当溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中还原性物质半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白增加时，ONOO的浓度降低，先前被ONOO氧化而生成的具有通式结构的化合物也会被还原到具有通式结构的化合物，从而导致荧光减弱。0031具有通式结构的化合物用作ONOO荧光探针测定溶液体系、细胞、动物组织或动物个体中的ONOO，其浓度为1M1MM。0032所述荧光探针与ONOO作用后荧光增强是由于生成了具有通式结构的化合物。也就是说，荧光探针与被检测物种作用后荧光发生增强并不是荧光探针本身的荧光发生了增强，而是其氧。
17、化产物使检测体系的荧光增强了。0033碲原子是本发明所述荧光探针的反应中心。即碲原子提供具有通式结构的化合物与ONOO选择性作用的活性中心，也提供具有通式结构的化合物与还原性物质如半胱氨酸作用的活性中心。同时，本发明所述荧光探针的荧光变化也是由有机碲片段的氧化说明书CN104119860A4/6页7还原状态调节。具有通式结构的化合物，其碲原子具有很强的给电子能力，容易通过光诱导电子转移过程猝灭花菁母体的荧光，使具有通式结构的化合物的荧光减弱；具有通式结构的化合物与ONOO作用后变为具有通式结构的化合物，具有通式结构的化合物其碲原子由于被氧化而不再具有强的给电子能力，不能有效猝灭花菁母体的荧光，。
18、从而出现体系荧光增强的现象。0034本发明的有益效果0035这类化合物用作过氧化亚硝酰荧光探针，在过氧化亚硝酰存在下荧光发生增强，再在还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽或金属硫蛋白等存在下荧光恢复原来状态，可用于过氧化亚硝酰的实时可逆检测。尤其是，这类化合物用作荧光探针，可用于细胞内过氧化亚硝酰的实时可逆检测，这对深入研究过氧化亚硝酰在生物体内的产生、输送及累积等过程的动力学机理，进一步了解过氧化亚硝酰的生理和毒理作用具有重要意义。附图说明0036图1背景技术中所举的已公开的过氧化亚硝酰荧光探针结构示意图；0037图2本发明提供的探针检测原理示意图；0038图3实施例1中合成CYTE的反应方。
19、程式；0039图4实施例2所采用的荧光探针对ONOO的选择性示意图，图4中，分别用待测物平衡0,5,10,15,20,25和30MIN后测的荧光强度1、过氧化亚硝酰，2、一氧化氮，3、双氧水，4、过氧化叔丁醇，5、枯烯氢过氧化物，6、脂质过氧化物，7、羟基自由基，8、超氧阴离子，9、次氯酸根；0040图5（A）表示实施例3所采用的荧光探针CYTE的荧光强度随ONOO浓度变化的示意图；图5（B）表示实施例所采用的荧光探针CYTE荧光强度随ONOO浓度变化的线性拟合曲线；0041图6表示实施例4所采用的荧光探针CYTE的可逆性示意图，图6中，分别用还原剂平衡0,3,5,20和30MIN；1半胱氨酸。
20、；2还原型谷胱甘肽；3硫氧还蛋白；4金属硫蛋白；5VC；6VE；7尿酸；8组氨；0042图7A、B、C、D、E表示实施例5所采用的荧光探针CYTE用于检测细胞内ONOO的共聚焦显微镜照片。图7F分别表示图7A、B、C、D、E所代表的荧光强度的平均值。具体实施方式0043实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。0044实施例1（探针的合成）0045如图3所示，实施例所采用的探针化合物的结构用代号CYTE表示，合成探针化合物所用的花菁母体用代号CY7CL1表示。0046CYTE的合成030GCY7CL1（可购买获得）和032G化合物1在氩气下溶于10ML无水乙腈中，加热至40反应12小时。
21、。真空下蒸去溶剂，所得固体经柱层析纯化得目标化合物CYTE。00471HNMR400MHZ,CD3ODD4PPM8921H,M,8091H,M,7881H,M,75470512H,M,6696493H,M,6001H,S,5181H,S,4443996H,M,2871H,说明书CN104119860A5/6页8S,2594H,T,17813020H,M13CNMRCD3ODD4,100MHZPPM17803,17596,16918,16768,15333,13690,13669,13511,13183,13081,12886,12863,12807,12792,12629,12604,1255。
22、4,12301,12230,12223,11841,11405,11027,9752,5012,4846,4648,4542,4310,2969,2811,2705,2600,2350,2029125TENMR157MHZ,DMSOD6PPM969710048LCMSAPIESM/ZC47H51N4OTECALCD8173120,FOUNDM8173022,M2H81513870049实施例2（CYTE对ONOO的选择性）0050为尽可能模拟生理条件，以下各项实验均在PH74条件下进行（PBS缓冲溶液，浓度为10MM），探针浓度仍采用100M。0051于10ML比色管中加入100M探针，再加入。
23、10MMPBSPH74到10ML，摇匀，然后加入各种待测物。摇匀溶液，分别平衡0,5,10,15,20,25和30MIN，将工作液倒进荧光皿测定荧光光谱。CYTE对ONOO的选择性如图4所示。图4表明CYTE对ONOO具有很好的选择性，体系荧光增强。测定条件下双氧水也能使探针荧光增强，但增加程度仅为ONOO的10左右。超氧负离子、单线态氧、过氧化脂肪酸、过氧叔丁醇等不能使探针荧光增强。0052实施例3（CYTE对ONOO的定量检测）0053于10ML比色管中加入100MCYTE，再加入10MMPBSPH74至10ML，摇匀，然后加入不同浓度过氧化亚硝酰。摇匀溶液，平衡10MIN，将工作液倒进荧。
24、光皿测定荧光光谱，取各荧光光谱最大值，输入软件ORIGINPRO85,得到线性工作曲线。0054定容后过氧化亚硝酰浓度0,20,40,60,80,100M0055图5（A）表示随ONOO浓度的变化体系荧光强度的变化，表明随ONOO浓度的增加，体系荧光在明显增强；图5（B）表示荧光强度随ONOO浓度变化的线性拟合曲线，线性拟合曲线的线性回归常数为0963，表明探针能定量的测定ONOO的浓度。0056实施例4（CYTE的可逆性）0057于10ML比色管中加入100M探针，再加入10MMPBSPH74到10ML，摇匀，然后加入过氧化亚硝酰100M。摇匀溶液，平衡10MIN，将工作液倒进荧光皿测定荧光。
25、光谱。将荧光皿中的工作液倒回比色管中，加入200M还原性物质（还原性物质包括半胱氨酸；还原型谷胱甘肽；硫氧还蛋白；金属硫蛋白；VC；VE；尿酸；组氨；摇匀，分别平衡0,3,5,20和30MIN，将工作液倒入荧光皿测定光谱强度。图6表示在CYTE与ONOO作用后的残液中加入还原性化合物后体系荧光的变化。图6表明还原性巯基化合物如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等能有效的还原CYTE的氧化产物，即具有通式结构的化合物，重新生成荧光较弱的CYTE。其中，半胱氨酸和还原型谷胱甘肽使体系荧光强度降低95以上，金属硫蛋白使体系荧光降低50左右。图6表明CYTE作为ONOO荧光探针具有可逆性，能实时检测。
26、ONOO的浓度变化。0058实施例5（CYTE用于细胞内ONOO的可逆检测）0059CYTERAW2647细胞按照AMERICANTYPETISSUECULTURECOLLECTION规定进行培养。10UM孵育RAW2647细胞5分钟，用培养基洗涤3次，置于共聚焦荧光显微镜下拍照，结果如图7A所示；RAW2647细胞用10M探针哺育，再用脂多糖1G/ML和干扰素50NG/ML哺育4小时，然后用伏波醇12肉豆蔻酸酯13乙酸盐10NM刺说明书CN104119860A6/6页9激05H，用培养基洗涤3次，共聚焦显微镜拍照，结果如图7B所示，荧光强度明显增强；图7B的细胞用氨基胍1MM和谷胱甘肽转移酶。
27、250UNITS/ML孵育细胞10分钟后，用培养基洗涤3次，共聚焦显微镜拍照，结果如图7C所示，荧光强度又减弱；探针哺育的细胞用100M5氨基34吗啉基1,2,3恶二唑鎓（ONOO源）哺育20分钟，用培养基洗涤3次，共聚焦显微镜拍照，结果如图7D所示，荧光增强；图7D的细胞用半胱氨酸1MM和谷胱甘肽转移酶250UNITS/ML哺育15分钟后，用培养基洗涤3次，共聚焦显微镜拍照，结果如图7E所示。0060实施例6将实施例5中在不同操作下所得的共聚焦显微镜照片（图7A、B、C、D、E）分别进行定量统计，所得的荧光强度的平均值见图7F。说明书CN104119860A1/5页10图1说明书附图CN104119860A102/5页11图2图3说明书附图CN104119860A113/5页12图4说明书附图CN104119860A124/5页13图5图6说明书附图CN104119860A135/5页14图7说明书附图CN104119860A14。