二氧化硅颗粒及其制备方法和使用方法 技术领域 本发明涉及二氧化硅颗粒， 包含二氧化硅颗粒的组合物， 二氧化硅颗粒的制备方 法， 以及二氧化硅颗粒的使用方法。
背景技术 在高效液相色谱 (HPLC) 柱中， 对填充介质施加相对高的填充压力以形成致密的 分离介质。例如， 达到或大于 1500psi 的填充压力是标准的填充压力。暴露在这样高填充 压力的期间， 一部分的填充介质， 例如二氧化硅颗粒， 可能会破碎形成微粒材料的细屑。在 填充过程中产生的细屑量的增加会导致一系列的操作问题包括但不限于， 流体流过柱子时 的额外阻力、 不均匀流体流过柱子和降低的柱效。
在本领域中， 一直努力开发具有最佳杨氏模量的颗粒， 例如二氧化硅颗粒， 以使得 颗粒在柱填充过程中仅适度地弹性屈服。如果颗粒的模量太低， 颗粒过度的弹性颗粒变形 会导致如上所述的操作问题 ( 例如， 流体流动时的高阻力 )。 然而， 如果颗粒的模量太高， 颗
粒柱可能缺乏足够的稳定性。在使用中及系统受到机械冲击时， 非常高模量的颗粒可能会 移动位置， 导致流体流动均一性降低和柱效降低。
本领域中需要具有最佳弹性模量的二氧化硅颗粒， 所述颗粒当用于填充柱时， 在 柱子内部产生一种 “内在弹簧效应” ， 即， 当受到填充压力时， 二氧化硅颗粒有一定程度的压 缩但不破碎。
发明简述
本发明通过发现新型二氧化硅颗粒解决了上述的一些困难和问题。 在用具有最佳 杨氏模量的二氧化硅颗粒填充的柱子内， 所述颗粒提供 “内在弹簧效应” 。认为二氧化硅颗 粒具有高度抗塑性变形的内部， 以及低抗弹性变形的表面 ( 即， 低弹性模量 )。新型二氧化 硅颗粒特别适用于作为高效液相色谱 (HPLC) 柱的色谱介质。新型二氧化硅颗粒通常是高 度球形多孔、 基本上无大孔隙、 无定形的二氧化硅颗粒， 并且未经表面修饰 ( 即， 未键合或 正相 ) 或经表面修饰 ( 即， 键合或反相， HIC 等 ) 的二氧化硅颗粒均可作为色谱介质。
在一个示例性实施方式中， 本发明的二氧化硅颗粒包含多孔二氧化硅颗粒， 其包 含 (i) 具有第一弹性模量的内部以及 (ii) 具有第二弹性模量的颗粒外表面部分， 其中第一 弹性模量大于第二弹性模量。 指定二氧化硅颗粒内弹性模量的差别可能会导致二氧化硅颗 粒区域间不同的孔密度。例如， 二氧化硅颗粒内部区域的孔密度要低于同一颗粒外表面区 域的孔密度。
在另一个示例性实施方式中， 本发明的二氧化硅颗粒包含多孔二氧化硅颗粒， 其 中所述颗粒具有至少约 100MPa 的塑性变形和小于约 4GPa 的弹性变形。当作为色谱介质使 用时， 高塑性变形和低弹性变形使得上述二氧化硅颗粒能被有效的填充到色谱柱中， 且不 会破坏颗粒。
本发明也涉及到制备二氧化硅颗粒的方法。在一个示例性方法中， 制备二氧化硅 颗粒的方法包含 ： 部分水解有机硅酸盐以形成部分水解物质 ； 蒸馏部分水解物质以除去任何乙醇并形成经蒸馏的部分水解物质 ； 在极性连续相中乳化经蒸馏的部分水解物质， 以在 极性连续相中形成部分水解硅酸盐的微滴 ； 通过使用氢氧化铵的缩合反应使得微滴凝胶化 以形成球形多孔颗粒 ； 洗涤球形多孔颗粒 ； 湿热老化球形多孔颗粒 ； 并干燥球形多孔颗粒 以形成干燥多孔颗粒。
本发明还涉及到使用二氧化硅颗粒的方法。在使用二氧化硅颗粒的示例性方法 中， 包含制备色谱柱的方法， 其包括将至少一种多孔二氧化硅颗粒掺入到色谱柱中， 所述多 孔二氧化硅颗粒包含 (i) 具有第一弹性模量的内部以及 (ii) 具有第二弹性模量的颗粒外 表面部分， 其中第一弹性模量大于第二弹性模量。更多使用二氧化硅颗粒的示例性方法可 能包括使用上述色谱柱将流过色谱柱的一种或多种物质彼此分离。
本发明还涉及色谱柱、 制备色谱柱的方法以及使用色谱柱的方法， 其中色谱柱包 含至少一种多孔二氧化硅颗粒， 所述至少一种二氧化硅颗粒包含 (i) 具有第一弹性模量的 内部以及 (ii) 具有第二弹性模量的颗粒外表面部分， 其中第一弹性模量大于第二弹性模 量。
通过研究本申请已公开的实施例和提交的权利要求的详细描述， 本发明的上述特 征和优点以及其它特征和优点显而易见。 附图说明 图 1 描述了本发明的示例性二氧化硅颗粒的放大视图 ；
图 2A 描述了具有阶梯状性质梯度 (property gradient) 的本发明的示例性二氧 化硅颗粒的横断面视图 ；
图 2B 描述了具有基本连续性质梯度的本发明的示例性二氧化硅颗粒的横断面视 图；
图 3 描述了本发明的示例性二氧化硅颗粒填充于 HPLC 柱之前和之后的粒度分 析；
图 4 描述了本发明的示例性二氧化硅颗粒填充于 HPLC 柱之后的扫描电镜 (SEM) 图像 ；
图 5 描述了与常规二氧化硅颗粒相比的本发明的示例性二氧化硅颗粒的柱填充 效率 ；
图 6 描述了以下色谱图， 其显示与常规二氧化硅颗粒相比的本发明的示例性二氧 化硅颗粒的肽选择性 ；
图 7 描述了以下色谱图， 其显示与常规二氧化硅颗粒相比的本发明的示例性二氧 化硅颗粒的纯合成肽选择性 ；
图 8 描述了以下色谱图， 其显示与常规二氧化硅颗粒相比的本发明的示例性二氧 化硅颗粒的粗合成肽选择性 ；
图 9 描述了粗 20-AA 合成肽的色谱图， 其使用本发明的示例性二氧化硅颗粒和常 规二氧化硅颗粒 ；
图 10 描述了以下色谱图， 其显示与常规二氧化硅颗粒相比的本发明的示例性二 氧化硅颗粒血管活性肠肽 (VIP) 选择性 ； 和
图 11 描述了与常规二氧化硅颗粒相比的本发明的示例性二氧化硅颗粒的胰岛素
负载容量。
发明详述
为了加强对本发明原理的理解， 下文是对本发明的特定实施方式的描述， 并且使 用特定语言来描述所述特定实施方案。 然而， 应当理解的是， 特定语言的使用并无意于限制 本发明的范围。认为对本发明内容的变更、 进一步修改以及对所讨论的本发明原理的进一 步应用对于本领域的普通技术人员是正常的。
本发明涉及到多孔二氧化硅颗粒。本发明还涉及到制备多孔二氧化硅颗粒的方 法， 以及使用多孔二氧化硅颗粒的方法。 下文提供了对示例性多孔二氧化硅颗粒、 制备多孔 二氧化硅颗粒的方法、 以及使用多孔二氧化硅颗粒的方法的描述。
I. 二氧化硅颗粒
本发明的二氧化硅颗粒具有使该二氧化硅颗粒与已知二氧化硅颗粒相比能够提 供一种或多种优点的物理结构和性质。
A. 二氧化硅颗粒的物理结构
本发明的二氧化硅颗粒呈球形， 具有平均最大颗粒尺寸 ( 即， 最大直径尺寸 )。 通常， 本发明的二氧化硅颗粒具有小于约 700μm 的平均最大颗粒尺寸， 更通常地， 小于约 100μm。在本发明的一个理想实施方案中， 二氧化硅颗粒具有约 1.0- 约 100μm 的平均最 大颗粒尺寸， 更理想地， 为约 3.0μm- 约 20μm。 例如应用透射电子显微技术 (TEM) 进行测量， 本发明的多孔二氧化硅颗粒通常的 长径比小于约 1.4。在此使用的术语 “长径比” 用于描述 (i) 二氧化硅颗粒平均最大颗粒尺 寸和 (ii) 二氧化硅颗粒平均最大横断面颗粒尺寸之间的比率， 其中横断面颗粒尺寸与二 氧化硅颗粒最大颗粒尺寸基本垂直。在本发明的一些实施方式中， 二氧化硅颗粒的长径比 小于约 1.3( 或小于约 1.2， 或小于约 1.1， 或小于约 1.05)。 通常， 二氧化硅颗粒的长径比在 约 1.0- 约 1.2 之间。
本发明的多孔二氧化硅颗粒也具有能使该二氧化硅颗粒成为理想色谱介质的孔 隙容积。通常， 经氮气孔隙率仪测量， 二氧化硅颗粒的孔隙容积为至少约 0.40cc/g。在 本发明的一个示例性实施例中， 经氮气孔隙率仪测量， 多孔二氧化硅颗粒的孔隙容积为约 0.40cc/g- 约 1.4cc/g。在本发明的另一个示例性实施例中， 经氮气孔隙率仪测量， 多孔二 氧化硅颗粒的孔隙容积为约 0.75cc/g- 约 1.1cc/g。
本发明的二氧化硅颗粒的平均孔径为至少约 40 埃 - 约 700 - 约 150。 在本发明的一个示例性实施方案中， 二氧化硅颗粒的平均孔径为约 40 案中， 二氧化硅颗粒的平均孔径为约 90
。在本发明的另一示例性实施方经 BET 氮气吸附法 ( 即， 布鲁诺埃梅特特勒方法 ) 测量， 本发明的多孔二氧化硅颗 2 粒还具有至少约 150m /g 的表面积。在本发明的一个示例性实施方案中， 二氧化硅颗粒具 2 2 有约 200m /g- 约 450m /g 的 BET 表面积。在本发明的另一示例性实施方案中， 二氧化硅颗 2 2 粒具有约 260m /g- 约 370m /g 的 BET 表面积。
本发明的示例性二氧化硅颗粒的放大视图见图 1， 由放大率 1000 的扫描电子显微 镜 (SEM) 提供。 如图 1 所示， 示例性二氧化硅颗粒 10 呈球形并且具有相对较窄的粒度分布。 此外， 如图 2A 和 2B 所示， 认为示例性二氧化硅颗粒 10 沿颗粒横断面具有颗粒性质梯度。
如图 2A 所示， 在本发明的一个实施方案中， 认为示例性二氧化硅颗粒 10 在示例性二氧化硅颗粒 10 的内部 12 和外表面 11 之间具有阶梯状性质梯度。例如， 示例性二氧化硅 颗粒 10 可能在内部区域 13 具有较高的杨氏模量， 而在表面区域 14 具有较低的杨氏模量。 例如， 示例性二氧化硅颗粒 10 可能在内部区域 13 具有较高的杨氏模量 ( 或者较低的孔密 度 )， 而在表面区域 14 内具有较低的杨氏模量 ( 或者较高的孔密度 )。应注意的是， 在这个 实施方案中， 在示例性二氧化硅颗粒 10 的内部 12 和外表面 11 之间可能会有两个以上的具 有不同的颗粒性质的区域。
如图 2B 所示， 在本发明的另一实施方案中， 认为示例性二氧化硅颗粒 10 具有基本 连续的性质梯度， 从内部 12 的内部值变化到沿外表面 11 的表面值。例如， 示例性二氧化硅 颗粒 10 在内部 12 处具有最大杨氏模量 ( 或者最小孔密度， Pmin)， 并且沿外表面 11 具有最 小杨氏模量 ( 或者最大孔密度， Pmax)。应注意的是， 在这个实施方案中， 最大或者最小性质 值 ( 例如， 最小孔密度， Pmin) 可能会位于示例性二氧化硅颗粒 10 的内部 12 和外表面 11 之 间的某个点， 而不是在如图 2B 所示的内部 12 上。
B. 二氧化硅颗粒的性质
作为上述本发明二氧化硅颗粒物理性质的结果， 所述二氧化硅颗粒很适合作为 HPLC 应用中色谱介质。基本为球形的形状允许均匀填充， 因此使得液体可以更均匀地流过 HPLC 柱， 导致更好的柱效。此外， 由于二氧化硅颗粒的塑性变形性质， 当暴露于填充压力下 时， 本发明的二氧化硅颗粒抵抗破碎， 因而防止产生对流体流动的过大的阻力并且保持流 体流过 HPLC 柱时的均一性。 如上所述， 本发明的二氧化硅颗粒显示出具有最佳杨氏模量， 该量使得所述颗粒 在柱填充期间能适度的弹性屈服， 但又不至于使颗粒破碎。当用于 HPLC 柱中时， 本发明的 二氧化硅颗粒提供 “内在弹簧效应” ， 其以与通过动态轴向压缩所达到的方式的类似方式稳 定柱子。
此外， 如上所述， 据认为本发明的二氧化硅颗粒具有弹性模量的放射状延伸的性 质梯度。 更准确的说， 据认为本发明的二氧化硅颗粒具有表面区域， 所述区域的模量适当地 低于该二氧化硅颗粒内部区域。 上述颗粒结构可解释为什么本发明的二氧化硅颗粒能形成 稳定的填充柱 ( 即， 柱中的粒子运动和孔隙结构小 )。 认为本发明的二氧化硅颗粒在该颗粒 表面具有更大的弹性变形， 但是较高的模量指向颗粒内部， 使得内部模量能够防止颗粒产 生导致颗粒破碎和流体流动的高阻力的整体变形 ( 即， 塑性 )。
另外， 由于本发明二氧化硅颗粒的经认定的多孔性梯度， 当应用于填充柱时， 二氧 化硅颗粒提供了良好的质量传递性质。 因为， 在色谱分离过程中， 大部分的分子并不扩散到 颗粒的最中心， 前面所述的放射状延伸的多孔性梯度允许颗粒内外的质量传递增加， 使得 能够获得改善的柱效。
在一个实施方案中， 经原子力显微镜 (AFM) 测量， 本发明颗粒具有至少约 100MPa 的硬度或塑性变形， 通常为至少约 200MPa， 更通常为至少约 300MPa， 甚至更通常为至少约 400MPa。用购自 Veeco
Instruments 的、 具有嵌金刚石探针的 Nanoman II SPM 系统在 30μN 压力下实施 AFM。 硬度由公式 “硬度＝压力 / 面积” 测定， 其中面积是指由探针造成的压痕面积。 AFM 是如 “应用原子力显微镜测量纳米尺度的理论模型和仪器的弹性模量 (Theoretical Modelling And ImplementationOf Elastic Modulus Measurement At The Nanoscale Using Atomic
ForceMicroscope)” Journal ofPhysics ： Conference Series 61， 第 1303-07 页， 2007 中所 述方法进行实施的。
在另一个实施方案中， 经 AFM 测量， 本发明颗粒具有小于约 4GPa 的杨氏模量或 弹性变形， 通常小于约 3GPa， 更通常小于约 2GPa， 甚至更通常小于约 1GPa。用购自 Veeco Instruments 的、 具有嵌金刚石探针的 Nanoman II SPM 系统在 3.297μN 压力下实施 AFM。 杨氏模量由 Oliver 与 Pharr 分析测定， 如 “应用负载和移位传感压痕仪器测定硬度和弹 性模量的改良技术 (An Improved Technique for DeterminingHardness and Elastic Modulus Using Load and Displacement SensingIndentation Experiments)” J.Mater. Res.， Vol.7， 第 1564-83 页， 1992 中所述。
在另一个示例性实施方案中， 本发明的二氧化硅颗粒包含多孔二氧化硅颗粒， 其 中所述颗粒具有至少约 100MPa 的塑性变形和小于约 4GPa 的弹性变形， 优选至少约 100MPa 的塑性变形和小于约 3GPa 的弹性变形， 更优选至少约 100MPa 的塑性变形和小于约 2GPa 的弹性变形。此外， 本发明二氧化硅颗粒可能具有本文所列举的塑性变形和弹性变形性质 的任何组合， 例如至少约 100MPa( 或 200MPa、 300MPa 或 400MPa 等 ) 的塑性变形和小于约 4GPa( 或 3GPa、 2GPa 或 1GPa 等 ) 的弹性变形。当用作色谱介质时， 高塑性变形和低弹性变 形使得颗粒能在不被破坏的情况下有效的填充到色谱柱中。 通过参考图 3-5， 进一步详述所公开的二氧化硅颗粒的上述性质。图 3 描述了在 填充于 HPLC 柱之前和之后对本发明示例性二氧化硅颗粒的粒度分析。如图 3 所示， 由以下 (1) 和 (2) 可知本发明二氧化硅颗粒在动态轴向压缩填充期间显示出更少的颗粒破碎 ： (1) 与市售二氧化硅颗粒 ( 购自 Eka Nobel AB 的 Kromasil 10 微米 C18)“前” 和 “后” 的数 字 (％ ) 曲线相比， 本发明二氧化硅颗粒 “前” 和 “后” 的数字 (％ ) 曲线相似 ； (2) 与市售二 氧化硅颗粒细屑量的增加相比， 本发明二氧化硅颗粒产生最小量的细屑。在将本发明颗粒 填充到柱中后， 粒度分布基本不改变， 然而市售介质的粒度分布则明显不同。例如， 本发明 颗粒产生最小量的细屑 ( 例如， 基于小于 5μm 的细屑的总数量， 数量小于约 50％ )， 而市售 颗粒产生更多的细屑 ( 例如， 基于小于 5μm 的细屑的总数量， 数量大于约 50％ )。优选在 本发明颗粒填充期间产生数量小于约 40％的细屑、 更优选小于约 30％、 最优选小于约 20％ ( 即， 小于 15％、 10％、 5％、 4％、 3％、 2％等 )。
图 4 描述了本发明示例性二氧化硅颗粒在经动态轴向压缩填充到 HPLC 柱后的扫 描电镜影像 ( 右图 )( 放大倍数＝ 500) 与上述市售二氧化硅颗粒在经动态轴向压缩填充到 HPLC 柱后的扫描电镜影像 ( 左图 ) 的对比。 左图显示将上述市售二氧化硅颗粒在经动态轴 向压缩填充期间产生的细屑， 而右图基本没有将本发明二氧化硅颗粒在经动态轴向压缩填 充期间产生的细屑。
图 5 描述了本发明的示例性二氧化硅颗粒与常规二氧化硅颗粒相比的柱填充效 率。如图 5 所示， 与市售二氧化硅颗粒 ( 购自 EkaNobel， AB 的 Kromasil 10 微米 C18 和购 自 Daiso Co.Ltd 的 Daiso 10 微米 C18) 相比， 本发明的二氧化硅颗粒显示出最高的理论塔 板数 / 米。
II. 制备二氧化硅颗粒的方法
本发明也涉及制备二氧化硅颗粒的方法。 以下讨论制备本发明二氧化硅颗粒的原 料以及制备方法步骤。
A. 原料
制备本发明二氧化硅颗粒的方法可由许多含硅原料形成。合适的含硅原料包括 但不限于， 可通过包括 Sigma-Aldrich Co.(St.Louis， MO) 的多种渠道购买的原硅酸四乙 酯 (TEOS) ； 部分低聚化硅酸盐， 诸如购自 Silbond 公司 (Weston， MI) 的 SilbondTM 40 或 SilbondTM 50 ； 部分低聚化硅酸盐， 诸如购自 Dynasil 公司 (West Berlin， NJ) 的 DynasilTM 40 ； 和部分低聚化硅酸盐， 诸如购自 Wacker Chemie AG(Munich， Germany) 的 TES 40WN。 TM
在本发明的一个理想的实施方案中， SILBOND 40 被用于制备 “小分子” 产品。在 此使用的术语 “小分子” 产品是用于描述特别用于小分子色谱应用中的本发明二氧化硅颗 粒。本发明的 “小分子” 二氧化硅颗粒通常具有约 0.75cc/g- 约 1.1cc/g 的 N2 孔隙容积 ； 约 260m2/g- 约 370m2/g 的 N2 表面积范围 ； 和约 90 埃
- 约 150 埃的平均孔径范围。B. 工艺步骤
本发明二氧化硅颗粒通常通过多步骤工艺制备出来， 其中将诸如上文所述的那些 的有机硅酸盐部分水解、 蒸馏， 然后分散到更极性的连续相中， 由于部分水解硅酸盐在极性 连续相中的不相溶性， 结果形成微滴。 然后， 通过氢氧化铵催化的缩合反应使得这些微滴凝 胶化。然后将所得球形多孔颗粒洗涤、 湿热老化并干燥。据发现湿热老化和干燥步骤期间 的工艺条件对控制所得颗粒上的孔隙结构特别重要。然后通过常规的方法 ( 例如， 淘析或 空气分级 ) 可将所得多孔二氧化硅颗粒分布于适当窄的粒度分布。对不同工艺步骤进一步 的描述见下文。 1. 部分水解步骤
水解度是获得具有理想物理性质 ( 例如， 最佳杨氏模量、 粒度等 ) 的二氧化硅颗粒 的重要工艺参数。 例如， 过度水解可能会导致在颗粒形成步骤的连续相中完全混溶的溶液， 然而水解不足可能会导致原料在随后的缩合步骤 ( 即， 凝胶化 ) 中过于惰性。
部分水解通常使用 0.1M HCl( 水溶液 )， 虽然也可以应用其它酸。在混合物 ( 搅 拌中 ) 中加入乙醇 (EtOH) 以克服有机硅酸盐和水相的不相溶性。反应在室温下自发进行。 一份标准的反应物组成包含 100.0gSILBONDTM 40、 21.5g 乙醇和 4.6g 0.1M HCl( 水溶液 )。
2. 蒸馏步骤
可进行蒸馏部分水解物质以除去乙醇 ( 即， 加入的和作为副产物在水解步骤形成 的乙醇 )。蒸馏步骤最小化和 / 或消除无大孔隙的颗粒的形成。在此使用的术语 “无大孔 隙的颗粒” 指的是具有基本连续的微多孔颗粒结构的二氧化硅颗粒。蒸馏通常在真空 ( 即， 小于 100 托 )、 约 90℃条件下进行除去乙醇所必需的一段时间 ( 通常， 小于约 1 小时 )。
3. 颗粒形成 ( 乳化 ) 步骤
颗粒的形成伴随着 PHS 在氨水相中的乳化。由于涉及 PHS 的氨催化的缩合反应， 微滴快速胶凝化 ( 即， 固化 )。
已将两种方法应用于生产粒度范围在 1-100μm 的二氧化硅颗粒。第一种方法是 一种应用 Cowles 搅拌机的两步批量技术。第一步中， 即微滴形成步骤， 将经蒸馏的 PHS 在 异丙醇 (IPA)/ 水溶液 ( 例如， 30wt％ IPA 水溶液 ) 中乳化。然后， 第二步中， 在持续搅拌下 加入 NH4OH 以促进缩合反应， 从而固化多孔、 球形颗粒。由搅拌叶桨尖速度 ( 例如， 较高的 速度产生小颗粒 ) 和连续相组成 ( 例如， 较多的醇产生小颗粒 ) 控制平均粒度。
第二种生产二氧化硅颗粒的方法应用管路静态混合器来使 PHS 乳化到 30wt ％
IPA/1wt％ NH4OH 水溶液中。在此情况下， 以较高速度通过管路混合器会导致较小的粒度。
4. 过滤 / 倾析步骤
在颗粒形成步骤之后， 通常采用过滤和倾析从二氧化硅产品中除去过量的醇和任 何的氨。在标准过滤 / 倾析步骤中， 得自上述颗粒形成步骤中的滤饼被再悬浮于去离子水 中 ( 例如， 12 升去离子水 )， 然后留置沉降过夜 ( 例如， 12 小时 )。在沉降期后， 倾析含颗粒 溶液以除去大部分的液体。
5. 湿热老化步骤
湿热老化步骤可用于降低多孔二氧化硅颗粒的内表面积。 以类似于生产硅胶的方 法， 越严重的老化 ( 即， 更久、 更热和 / 或更碱性 ) 会导致在干燥期间更大的表面积降低以 及更大的颗粒孔隙保留 ( 孔隙容积 )。 在老化步骤结束时， 加入足量的去离子水以冷却从而 猝灭老化工艺。
在一个示例性实施方式中， 湿热老化步骤包括将上述倾析 / 过滤步骤中制得的沉 降二氧化硅饼再悬浮于足量的去离子水中以制成可搅拌的浆料 ( 例如， 约 1kg 的二氧化硅 饼干料加入约 1 升水 )。将可搅拌的浆料在约 75℃下加热约 90 分钟。加入约 12 升室温的 去离子水 ( 每升热水 ) 以停止老化过程。然后， 或将悬浮液过滤， 或将其留置沉降并倾析。 6. 干燥步骤
干燥率同样对二氧化硅终产品的表面积和孔隙容积有影响。 在一个示例性实施方 案中， 干燥步骤包括将经倾析的体积的二氧化硅产品或二氧化硅产品的滤饼摊开到一个托 盘中， 以形成厚约 1.25cm 的二氧化硅饼 ； 将容纳二氧化硅饼的托盘置于炉温为约 140℃的 重力对流加热炉中约 20 小时 ； 从炉中移出托盘和二氧化硅 ； 收集二氧化硅。 然后， 干燥的二 氧化硅物质可进行接下来的任选筛分和键合步骤。
III. 使用二氧化硅颗粒的方法
本发明还涉及到使用二氧化硅颗粒的方法。如上所述， 二氧化硅颗粒可用作色谱 介质。在图 6-11 中描述多种使用二氧化硅颗粒作为色谱介质的方法。
图 6 描述了以下色谱图， 其显示与常规二氧化硅颗粒 ( 购自 Phenomenex Inc 的 Luna 5 微米 C18) 相比的本发明的示例性二氧化硅颗粒 ；
图 7 描述了以下色谱图， 其显示与常规二氧化硅颗粒 ( 购自 AkzoNobel AB 的 Kromasil 5 微米 C18) 相比的本发明的示例性二氧化硅颗粒的纯合成肽选择性 ；
图 8 描述了以下色谱图， 其显示与常规二氧化硅颗粒相比 ( 购自 Akzo Nobel AB 的 Kromasil 5 微米 C18) 的本发明的示例性二氧化硅颗粒的粗合成肽选择性 ；
图 9 描述了粗 20-AA 合成肽的色谱图， 其使用本发明的示例性二氧化硅颗粒和常 规二氧化硅颗粒 ( 购自 Phenomenex Inc 的 Jupiter Proteo 5 微米 C18) ；
图 10 描述了以下色谱图， 其显示与常规二氧化硅颗粒相比的本发明的示例性二 氧化硅颗粒的血管活性肠肽 (VIP) 选择性 ；
图 11 描述了与常规二氧化硅颗粒 ( 购自 Akzo Nobel AB 的 Kromasil 5 微米 C8 和购自 YMC Co.， Ltd 的 Hydrosphere 5 微米 C8) 相比的本发明的示例性二氧化硅颗粒的胰 岛素负载容量。
实施例 下面通过实施例更详细的描述本发明， 不应该以任何方式将下述实施例解释为对 本发明范围的限制。 相反， 应该清楚地理解可通过手段获得各种其他实施方案、 修饰和它的 等同物， 这些可由本领域技术人员在阅读过本文的描述后联想到， 而不脱离本发明精神和 / 或提交的权利要求的范围。
实施例 1
制备部分水解物质 (PHS)
在搅拌下， 将 230g 0.1M HCl( 水溶液 ) 溶液加入到 5000gSILBONDTM 40 中。然后， 在搅拌下向该混合物中加入 1075g 乙醇， 以克服 SILBONDTM 40 和水相之间的不相溶性。反 应在室温条件下自发进行。
对所得部分水解物质 (PHS) 进行蒸馏， 以除去加入到混合物中或者是作为副产物 在水解步骤中形成的任何乙醇。蒸馏在真空 ( 即， ＜ 100 托 )、 约 90℃的条件下进行。
实施例 2
应用批量混合方法制备 “小分子” 二氧化硅颗粒
将 3800g 实施例 1 中形成的经蒸馏的 PHS 倒入 14900g 30wt％ IPA/ 水 ( 预先制备 好并且静置至少 16 小时以进行脱气 ) 中。使用 Cowles 搅拌机， 并设定为 1160 转 / 分， 搅 拌 5 分钟以完成乳化。然后， 在继续搅拌的同时一次性加入 378g 30wt％ NH4OH。将所得溶
液于 1160 转 / 分额外混合 20 分钟， 在此过程中颗粒完全凝胶化。将二氧化硅悬浮液留置 沉降过夜。
第二天， 过滤二氧化硅悬浮液并将所得二氧化硅滤饼再悬浮于 12 升去离子水中， 以除去任何过量的醇和 / 或氨。将二氧化硅溶液留置沉降过夜并在后一天倾析。重复该操 作一次。
将从沉降溶液中获得的二氧化硅饼再悬浮于约 1 升去离子水中， 以制得可搅拌的 浆料。然后， 将经搅拌的浆料在约 75℃下加热 90 分钟。加入 12 升室温去离子水以停止老 化过程。然后， 过滤悬浮液以除去过量的液体。
将二氧化硅饼状产品摊开到托盘中， 抹平至厚度约 1.25cm。将容纳二氧化硅饼的 托盘置于炉温约 140℃的重力对流加热炉中 20 小时。然后从炉中移出托盘和二氧化硅， 并 将二氧化硅装瓶。
实施例 3
应用管路静态混合器制备 “小分子” 二氧化硅颗粒
将实施例 1 中形成的经蒸馏的 PHS(950ml/min) 和 30 ％ IPA/1 ％ NH4OH 水溶液 (4090ml/min) 通过直径 15.2cm(6 英寸 ) 的静态混合器混合。 然后， 将所得二氧化硅颗粒浆 料流入摇动的容器中。将二氧化硅悬浮液留置沉降过夜。
第二天， 过滤二氧化硅悬浮液并将所得二氧化硅滤饼再悬浮于 12 升去离子水中， 以除去任何过量的醇和 / 或氨。将二氧化硅溶液留置沉降过夜并在后一天倾析。重复该操 作一次。
将从沉降溶液中获得的二氧化硅饼再悬浮于约 1 升去离子水中， 以制得可搅拌的 浆料。然后， 将经搅拌的浆料在约 75℃下加热 90 分钟。加入 12 升室温去离子水以停止老 化过程。然后， 过滤悬浮液以除去过量的液体。将二氧化硅饼状产品摊开到托盘中， 抹平至厚度约 1.25cm。将容纳二氧化硅饼的 托盘置于炉温约 140℃的重力对流加热炉中 20 小时。然后从炉中移出托盘和二氧化硅， 并 将二氧化硅装瓶。
实施例 4
用 AFM 法测量二氧化硅颗粒
在该实施例中， 用 AFM 测量包含 10μm 球形多孔颗粒的本发明二氧化硅颗粒以测 定弹性和塑性变形性质。所述二氧化硅包括使得 C18 甲硅烷层共价结合至二氧化硅表面的 表面处理， 其为颗粒提供了疏水性。在弹性和塑性变形性质方面与例如 Daiso SP-120-ODS 的市售二氧化硅颗粒比较， Daiso SP-120-ODS 为具有含有共价结合至二氧化硅表面的 C18 甲硅烷层的 10μm 球形多孔二氧化硅颗粒， 购自 Daiso Co.， Ltd。每个二氧化硅颗粒 的弹性和塑性变形性质按 “应用原子力显微镜测量纳米尺度的理论模型和仪器的弹性模 量” Journal of Physics ： Conference Series 61， 第 1303-07 页， 2007 中所述方法进行 测量。对于塑性变形， 用购自威尔仪器公司 (Veeco Instruments) 的、 具有嵌金刚石探针 的 Nanoman II SPM 系统在 30μN 压力下实施 AFM。硬度由公式 “硬度＝压力 / 面积” 测 定， 其中面积是指由探针造成的压痕面积。对于弹性变形， 用购自威尔仪器公司 (Veeco Instruments) 的、 具备嵌金刚石探针的 Nanoman II SPM 系统在 3.297μN 压力下实施 AFM。 杨氏模量由 Oliver 与 Pharr 分析测定， 如 “改良应用负载和移位传感压痕仪器测定硬度和 弹性模量的技术” J.Mater.Res.， Vol.7， 第 1564-83 页， 1992 中所述。如表 1 所示， 本发明 二氧化硅颗粒的塑性变形远高于常规的或市售二氧化硅的塑性变形， 本发明二氧化硅颗粒 的弹性变形远低于常规的二氧化硅的弹性变形。
表1 变形 塑性 弹性 本发明二氧化硅颗粒 Daiso 二氧化硅颗粒 420MPa 0.539GPa 78MPa 4.7GPa实施例 5
在色谱柱中填充二氧化硅颗粒
在该实施例中， 在色谱柱中测量包含 10μm 球形多孔颗粒的本发明二氧化硅颗粒 以测定介质填充效率。所述二氧化硅包括使得 C18 甲硅烷层共价结合至二氧化硅表面的表 面处理， 其为颗粒提供了疏水性。 比较该介质的肽分辨率与其它介质的肽分辨率， 所述介质 包括 ： Kromasil ， 其具有 10μm 球形多孔二氧化硅颗粒， 并且 C18 甲硅烷层共价结合至二 氧化硅表面， 购自 Akzo Nobel AB ； 和 DaisoSP-120-ODS， 其具有 10μm 球形多孔二氧化硅 颗粒， 并且 C18 甲硅烷层共价结合至二氧化硅表面， 购自 Daiso Co.， Ltd。将上述介质填充 TM 到 25mm x 400mm 的、 购自 Alltech Associates， Inc. 的 Spring 柱中。每 60g 介质使用 150ml 异丙醇以 1500psi 将上述介质填充到柱中。最终柱床长度为 250mm。如图 3 所示， 填 充后产生的小颗粒或细屑的数量远低于常规的二氧化硅。 例如， 在填充后， 本发明产生的细 屑 ( 粒度小于 5μm) 量小于 Kromasil 产生的细屑量的一半。
利用反相色谱法作为评价各色谱柱柱效的分离技术。在相同条件下， 向各色谱柱 中注入苯、 萘和联苯的混合物， 应用由 70％体积的乙腈和 30％体积的水组成的流动相。流 速为 10ml/min。色谱柱在 25℃的室温下运行。用 Super Prep 流动池和 Rainin 检测器 ( 购 自 Varian， Inc.) 在 254nm 波长下进行检测。在分析中还用到了 Varian SD-1 制备泵 ( 购 自 Varian， Inc.)、 Valco prep 手动进样器 ( 购自 Valco InstrumentsCompany Inc.) 和 EZ TM Chrom ( 购自 Scientific Software， Inc.)。
结果见图 5， 其证实与常规介质相比， 应用本发明二氧化硅颗粒获得提高的柱效。
实施例 6
应用二氧化硅颗粒作为色谱介质
在该实施例中， 在色谱柱中测量包含 5μm 球形多孔颗粒的本发明二氧化硅颗粒 以测定其分离例如肽类的不同生物物质的能力。所述二氧化硅包括使得 C18 甲硅烷层共价 结合至二氧化硅表面的表面处理， 其为颗粒提供了疏水性。比较该介质的肽分辨率与购自 Phenomenex， Inc 的另一介质的肽分辨率， 所述另一介质用 Luna 作为商品名， 其具有 5μm 球形多孔二氧化硅颗粒， 并且 C18 甲硅烷层共价结合至二氧化硅表面。
利用反相色谱法作为评价各色谱柱的分离技术。在如下条件下 ： 流动相包括 A 溶 剂： 含 0.1％ v/vTFA 的水和 B 溶剂 ： 含 0.085％ v/v TFA 的乙腈， 将表 1 中所列的肽的混合物 (GY(238Da)， VYV(379Da)， 甲硫氨酸 - 脑啡肽 (YGGFM， 573Da)， 血管紧张肽 II(Anglotensin II)(DRVYIHPF， 1045Da) 和 亮 氨 酸 - 脑 啡 肽 (YGGFL， 555Da)) 注 入 到 各 色 谱 柱 (4.6mm x 250mm) 中。 采用梯度方法， 其中， 先用 10％的 B 溶剂和 90％的 A 溶剂平衡柱 30 分钟 ； 接下来 将 B 溶剂从 10％提高到 40％ (60％的 A 溶剂 ) ； 维持含 40％ B 溶剂的液流 5 分钟 ； 接下来将 B 溶剂从 40％提高到 90％ (10％的 A 溶剂 ) ； 维持含 90％ B 溶剂的液流 5 分钟。 流速为 1.0ml/ min。色谱柱在 25℃的室温下运行。用 UVD 170S 检测器 ( 购自 Dionex Corp.， Sunnyvale， CA) 在 225nm 波长下进行检测。在分析中还用到了 Dionex HPLC 系统 (P580HPG 高压梯度， 二元泵， 购自 Dionex Corp.)、 Rheodyne 手动进样器 ( 购自 IDEX Corp.) 和 CHROMELEON 数 据系统 ( 购自 Dionex Corp.)。结果见图 6 和表 2， 其证实与常规介质相比， 应用本发明二 氧化硅颗粒获得提高的各肽峰的分辨率。
表2
Phenomenex Luna 肽峰 本发明介质分辨率 * 介质分辨率 * 1 2 3 4
42.0 32.2 6.0 7.435.7 28.3 2.3 11.3* 分辨率基于下个相邻峰 .实施例 7
应用二氧化硅颗粒作为色谱介质
在该实施例中， 在色谱柱中测量包含 5μm 球形多孔颗粒的本发明二氧化硅颗粒 以测定其分离例如肽类的不同生物物质的能力。所述二氧化硅包括使得 C18 甲硅烷层共 价结合至二氧化硅表面的表面处理， 为颗粒提供了疏水性。比较该介质的肽分辨率与购自 Akzo Nobel AB 的另一介质的肽分辨率， 所述另一介质用 Kromasil 作为商品名， 其具有 5μm 球形多孔二氧化硅颗粒， 并且 C18 甲硅烷层共价结合至二氧化硅表面。
利 用 反 相 色 谱 法 作 为 各 色 谱 柱 的 分 离 技 术。 在 下 述 条 件 下 ： 流动相包含 A 溶剂 ： 含 0.1 ％ v/v TFA 的 水 和 B 溶 剂 ： 含 0.085 ％ v/v TFA 的 乙 腈， 将肽的混合物 (Ac-RGGGGLGLGK- 酰 胺 (911Da)， RGAGGLGLGK- 酰 胺 (883Da)， Ac-RGAGGLGLGK- 酰 胺 (926Da)， Ac-RGVGGLGLGK- 酰胺 (954Da) 和 Ac-RGVVGLGLGK- 酰胺 (996Da)) 注入到各色谱 柱 (4.6mm x 250mm) 中。采用梯度方法， 其中， 先用 10％的 B 溶剂和 90％的 A 溶剂平衡柱 30 分钟 ； 接下来将 B 溶剂从 10％提高到 40％ (60％的 A 溶剂 ) ； 维持含 40％ B 溶剂的液流 5 分钟 ； 接下来将 B 溶剂从 40％提高到 90％ (10％的 A 溶剂 ) ； 维持含 90％ B 溶剂的液流 5 分钟。流速为 1.0ml/min。色谱柱在 25℃的室温下运行。用 UVD170S 检测器 ( 购自 Dionex Corp.， Sunnyvale， CA) 在 225nm 波长下进行检测。在分析中也用到了 Dionex HPLC 系统 (P580HPG 高压梯度， 二元泵， 购自 Dionex Corp.)、 Rheodyne 手动进样器 ( 购自 IDEX Corp.) 和 CHROMELEON 数据系统 ( 购自 Dionex Corp.)。结果见图 7， 其证实与常规介质相比， 应 用本发明二氧化硅颗粒提高对各肽峰的分辨率。
实施例 8
使用二氧化硅颗粒作为色谱介质
在该实施例中， 在色谱柱中测量包含 5μm 球形多孔颗粒的本发明二氧化硅颗粒 以测定其从杂质中分离诸如肽的目标生物物质的能力。所述二氧化硅包括使得 C18 甲硅烷 层共价结合至二氧化硅表面的表面处理， 其为颗粒提供了疏水性。将该介质的肽分辨率与 购自 AkzoNobel AB 的另一介质的肽分辨率相比， 所述另一介质用 Kromasil 作为商品名， 其具有 5μm 球形多孔二氧化硅颗粒， 并且 C18 甲硅烷层共价结合至二氧化硅表面。
利用反相色谱法作为各色谱柱的分离技术。在下述条件下 ： 流动相包含 A 溶剂 ： 含 0.1％ v/v TFA 的水和 B 溶剂 ： 含 0.1％ v/v TFA 的乙腈， 将购自 Bachem， Inc. 的粗肽和 两种杂质的混合物注入到各色谱柱 (4.6mm x 150mm) 中。采用梯度方法， 其中， 先用 15％ 的 B 溶剂和 85％的 A 溶剂平衡色谱柱 30 分钟 ； 接下来将 B 溶剂从 15％提高到 50％ (50％ 的 A 溶剂 ) ； 维持含 50％ B 溶剂的液流 1 分钟 ； 接下来将 B 溶剂从 50％提高到 80％ (20％ 的 A 溶剂 ) ； 维持含 80％ B 溶剂的液流 5 分钟。流速为 0.8ml/min。色谱柱在 22℃的室温 下运行。用 UVD 170S 检测器 ( 购自 Dionex Corp.， Sunnyvale， CA) 在 220nm 波长下进行检 测。 在分析中也用到了 Dionex HPLC 系统 (P580HPG 高压梯度， 二元泵， 购自 Dionex Corp.)、 Rheodyne 手动进样器 ( 购自 IDEX Corp.) 和 CHROMELEON 数据系统 ( 购自 Dionex Corp.)。 结果见图 8 和表 3， 其证实与常规介质相比， 应用本发明二氧化硅颗粒提高在接近的洗出杂 质中的肽峰的分辨率。
表3
14CN 101918312 A说肽峰明书Kromasil12/14 页本发明介质分辨率 介质分辨率杂质 #1 杂质 #2
0.84 0.500.73 0.32实施例 9
使用二氧化硅颗粒作为色谱介质
在该实施例中， 在色谱柱中测量包含 5μm 球形多孔颗粒的本发明二氧化硅颗粒 以测定其从杂质中分离诸如肽的目标生物物质的能力。所述二氧化硅包括使得 C18 甲硅烷 层共价结合至二氧化硅表面的表面处理， 其为颗粒提供了疏水性。将该介质的肽分辨率与 购自 Phenomenex， Inc 的另一介质的肽分辨率相比， 所述另一介质用 Jupiter 作为商品 名， 其具有 4μm 球形多孔二氧化硅颗粒， 并且 C18 甲硅烷层共价结合至二氧化硅表面。
利用反相色谱法作为各色谱柱的分离技术。在下述条件下 ： 流动相包含 A 溶剂 ： 含 0.1％ v/v TFA 的水和 B 溶剂 ： 含 0.1％ v/v TFA 的乙腈， 将购自 Biopeptide Co.， Inc. 的粗肽混合物注入到各色谱柱 (4.6mm x 250mm) 中。采用梯度方法， 其中， 先用 20％的 B 溶剂和 80 ％的 A 溶剂平衡柱 20 分钟 ； 接下来将 B 溶剂从 20 ％提高到 40 ％ (60 ％的 A 溶 剂 )。流速为 1.0ml/min。色谱柱在 25℃的室温下运行。用 UVD170S 检测器 ( 购自 Dionex Corp.， Sunnyvale， CA) 在 220nm 波长下进行检测。在分析中还用到了 Dionex HPLC 系统 (P580HPG 高压梯度， 二元泵， 购自 Dionex Corp.)、 Rheodyne 手动进样器 ( 购自 IDEX Corp.) 和 CHROMELEON 数据系统 ( 购自 Dionex Corp.)。结果见图 9， 其证实与常规介质相比， 应 用本发明二氧化硅颗粒提高在接近的洗出杂质中的肽峰的分辨率。
实施例 10
使用二氧化硅颗粒作为色谱介质
在该实施例中， 在色谱柱中测量包含 5μm 球形多孔颗粒的本发明二氧化硅颗粒 以测定其从杂质中分离诸如肽的目标生物物质的能力。所述二氧化硅包括使得 C18 甲硅烷 层共价结合至二氧化硅表面的表面处理， 其为颗粒提供了疏水性。比较该介质的肽分辨率 与其它介质的肽分辨率， 所述介质包括 ： Kromasil ， 其具有 5μm 球形多孔二氧化硅颗粒， 并且 C18 甲硅烷层共价结合至二氧化硅表面， 购自 Akzo NobelAB ； 和 Luna ， 其具有 5μm 球 形多孔二氧化硅颗粒， 并且 C18 甲硅烷层共价结合至二氧化硅表面， 购自 Phenomenex， Inc。
利 用 反 相 色 谱 法 作 为 各 色 谱 柱 的 分 离 技 术。 在 下 述 条 件 下 ： 流动相包 含 A 溶 剂： 含 0.1 ％ v/v TFA 的 水 和 B 溶 剂 ： 含 0.085 ％ v/v TFA 的 乙 腈，将 购 自 Karolinska Institutet(Stockholm， Sweden) 的 血 管 活 性 肠 肽 (28- 氨 基 酸 肽， HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN- 酰胺， MW 3325.8) 和两种杂质的混合物注入到各色谱柱 (4.6mm x 250mm) 中。采用梯度方法， 其中， 先用 20％的 B 溶剂和 80％的 A 溶剂平衡柱 30 分钟 ； 接下来将 B 溶剂从 20％提高到 40％ (60％的 A 溶剂 ) ； 维持含 B 溶剂为 40％的液流 5 分钟 ； 接下来将 B 溶剂从 40％提高到 90％ (10％的 A 溶剂 ) ； 维持含 B 溶剂为 90％的液流 5 分钟。流速为 1.0ml/min。色谱柱在 25℃的室温下运行。用 UVD 170S 检测器 ( 购自 Dionex Corp.， Sunnyvale， CA) 在 225nm 波长下进行检测。在分析中还用到了 Dionex HPLC 系统 (P580HPG 高压梯度， 二元泵， 购自 DionexCorp.)、 Rheodyne 手动进样器 ( 购自 IDEX Corp.) 和 CHROMELEON 数据系统 ( 购自 Dionex Corp.)。结果见图 10 和表 4， 其证实与常 规介质相比， 应用本发明二氧化硅颗粒提高在接近的洗出杂质中的肽峰的分辨率。
表4
本发明介质 肽峰 分辨率 杂质 #1 杂质 #2
Kromasil 介质分辨率 1.59 2.66Phenomenex Luna 介质分辨率 1.48 2.271.71 2.93实施例 11
使用二氧化硅颗粒作为色谱介质
在该实施例中， 在色谱柱中测量包含 5μm 球形多孔颗粒的本发明二氧化硅颗粒 以测定其对胰岛素的正面负载容量 (frontal loadingcapacity)。所述二氧化硅包括使 得 C8 甲硅烷层共价结合至二氧化硅表面的表面处理， 其为颗粒提供了疏水性。比较该介 质的胰岛素负载容量与其它介质的胰岛素负载容量， 包括 ： Kromasil ， 其具有 5μm 球形 多孔二氧化硅颗粒， 并且 C8 甲硅烷层共价结合至二氧化硅表面， 购自 Akzo Nobel AB ； 和 Hydrosphere， 其具有 5μm 球形多孔二氧化硅颗粒， 并且 C8 甲硅烷层共价结合至二氧化硅 表面， 购自 YMC Co.， Ltd。
在下述条件下 ： 流动相包含 A 溶剂 ： 含 0.1％ v/v TFA 的水和 B 溶剂 ： 包含 250mg 胰岛素的 5ml 乙腈溶液、 2ml 50％冰醋酸和 43ml DI 水， 利用反相色谱法作为各色谱柱的分 离技术。将 B 溶剂用含 0.1％ TFA 的 DI 水以 1 ∶ 5 的比例稀释， 以制成 1mg/ml 胰岛素溶 液。采用梯度方法， 其中， 先用 100％的 A 溶剂平衡柱 ； 接下来用 1 分钟的时间将 B 溶剂从 0％提高到 100％； 维持含 B 溶剂为 100％的液流 200 分钟 ； 接下来用 1 分钟的时间将 A 溶剂 从 0％提高到 100％ (0％ B 溶剂 )。流速为 0.2ml/min。色谱柱在 25℃的室温下运行。用 UVD 170S 检测器 ( 购自 Dionex Corp.， Sunnyvale， CA) 在 276nm 波长下进行检测。在分析 中还用到了 Dionex HPLC 系统 (P580HPG 高压梯度， 二元泵， 购自 Dionex Corp.)、 Rheodyne 手动进样器 ( 购自 IDEX Corp.) 和 CHROMELEON 数据系统 ( 购自 Dionex Corp.)。通过下 述公式可以计算出每种物质的容量 ：
T(50％处 ) ＝测量于 50％峰高的正面通过时间减去 1 分钟 C 胰岛素＝ 1mg/ml V 柱＝ 0.173mlF( 流速 ) ＝ 0.2ml/min
t0 尿嘧啶来自采用 0.2ml/min 的流动相 A 的尿嘧啶的注入。
结果见图 11， 其证实与常规介质相比， 应用本发明二氧化硅颗粒提高胰岛素 的负载容量。例如， 应用本发明二氧化硅的色谱柱的胰岛素负载容量为 154mg/ml， 而 Hydrosphere 和 Kromasil 介质分别提供 133mg/ml 和 14mg/ml 的胰岛素负载容量， 这相当于 约 10％ - 约 1000％的更高的回收率。
尽管用了有限数量的实施方案对本发明进行叙述， 但是这些特殊的实施方案并不 意欲限制本文所另行说明和要求保护的本发明范围。本领域的普通技术人员可理解 ： 通过 研究本文的示例性实施方案， 可能进行进一步的修饰和变更。除非另有说明， 实施例以及 说明书的其余部分中， 所有的份 (parts) 和百分数都以质量计。此外， 意欲通过引用或其 他方式使在说明书和权利要求中所列举的任何数值范围， 诸如代表特定的一组性质、 测量 单位、 条件、 物理状态或百分数的那些， 完全包含任何此范围内的数值 ( 包括所列举的任何 范围内的任何数值子集 )。例如， 只要一个以 RL 为下限、 RU 为上限的数值范围被公开， 任何 落入该范围的数值 R 也被明确的公开。特别地， 下列在范围内的数值 R 被明确的公开 ： R＝ RL+k(RU-RL)， 其中 k 是从 1％ -100％的伴有 1％的增量的变量范围， 例如， k 是 1％、 2％、 3％、 4％、 5％ ....50％、 51％、 52％ ....95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％。 此外， 如上文所计 算的由任何两数值 R 所代表的任何数值范围也被明确公开。除本文所显示和描述的之外， 通过前文说明和附带的附图， 本发明的任何修改对本领域的技术人员都变得显而易见。意 欲使这些修改落入本发明的权利要求范围内。