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1、10申请公布号CN104164491A43申请公布日20141126CN104164491A21申请号201410347808722申请日20140721C12Q1/68200601C12Q1/04200601C12N15/11200601C12R1/0120060171申请人北京新基永康生物科技有限公司地址100037北京市海淀区西三环北路105号科原大厦A座1309室72发明人余倩亓岽东胡波74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅54发明名称用于幽门螺杆菌23SRDNA基因突变分型的ARMSQPCR的检测方法及试剂盒57摘要本发明公开了用于幽门螺杆菌23SRDNA基。
2、因突变分型的ARMSQPCR的检测方法及试剂盒。本发明提供了用于鉴定幽门螺杆菌23SRDNA基因型的DNA分子组合物，包括单独使用的DNA分子组合物A和DNA分子组合物B；本发明的实验证明，本发明设计的引物及其构成的试剂盒能快速、准确、高敏感度的检测胃粘膜组织中幽门螺杆菌23SRDNA基因特定位点突变。灵敏度高，不仅可以检测来源于胃粘膜活检组织，还可以检测石蜡包埋组织切片中游离DNA。51INTCL权利要求书3页说明书12页序列表3页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书12页序列表3页附图2页10申请公布号CN104164491ACN104164491A。
3、1/3页21用于鉴定幽门螺杆菌23SRDNA是否含有突变位点ARMSQPCR的引物组，为如下1或21由单独使用的23SRDNA的A2143G突变型的ARMS引物、23SRDNA的A2142G突变型的ARMS引物和23SRDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成；2由23SRDNA的A2143G突变型的ARMS引物、23SRDNA的A2142G突变型的ARMS引物和23SRDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成；所述23SRDNA的A2143G突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列3；所述23SRDNA的A2142G突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列4；所述23SR。
4、DNA的A2142C突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列5。2用于鉴定幽门螺杆菌23SRDNA是否含有突变位点ARMSQPCR的DNA分子组合物，为如下1或21所示的DNA分子组合物包括单独使用的DNA分子组合物A、DNA分子组合物B和DNA分子组合物C；所述DNA分子组合物A由锁核酸阻滞探针、通用TAQMAN探针、PCR通用下游引物和23SRDNA的A2143G突变型的ARMS引物组成；所述DNA分子组合物B由锁核酸阻滞探针、通用TAQMAN探针、PCR通用下游引物和23SRDNA的A2142G突变型的ARMS引物组成；所述DNA分子组合物C由锁核酸阻滞探针、通用TAQMAN探针、。
5、PCR通用下游引物和23SRDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成；2所示的DNA分子组合物由锁核酸阻滞探针、通用TAQMAN探针、PCR通用下游引物、23SRDNA的A2143G突变型的ARMS引物、23SRDNA的A2142G突变型的ARMS引物和23SRDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成；所述锁核酸阻滞探针的核苷酸序列为序列表中序列1；所述通用TAQMAN探针的核苷酸序列为序列表中序列2；所述23SRDNA的A2143G突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列3；所述23SRDNA的A2142G突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列4；所述23SRDNA的A。
6、2142C突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列5；所述PCR通用下游引物的核苷酸序列为序列表中序列7。3根据权利要求2所述的DNA分子组合物，其特征在于所述DNA分子组合物均还包括所述DNA分子组合物D；所述DNA分子组合物D由所述锁核酸阻滞探针、所述通用TAQMAN探针、所述PCR通用下游引物和内控引物组成；所述内控引物的核苷酸序列为序列表中序列6。4根据权利要求2或3所述的DNA分子组合物，其特征在于所述突变位点为A2143G、A2142G或A2142C。5用于鉴定幽门螺杆菌23SRDNA是否含有突变位点ARMSQPCR的PCR试剂，为1或21所示的PCR试剂包括PCR试剂A、P。
7、CR试剂B和PCR试剂C组成；所述PCR试剂A由PCR扩增缓冲液、所述DNA分子组合物A和水组成；权利要求书CN104164491A2/3页3所述PCR试剂B由PCR扩增缓冲液、所述DNA分子组合物B和水组成；所述PCR试剂C由PCR扩增缓冲液、所述DNA分子组合物C和水组成；2所示的PCR试剂为PCR试剂E，其由PCR扩增缓冲液、2所示的DNA分子组合物和水组成。6根据权利要求5所述的PCR试剂，其特征在于所述1所示的PCR试剂或所述2所示的PCR试剂均还包括PCR试剂D；所述PCR试剂D由PCR扩增缓冲液、所述DNA分子组合物D和水组成；所述突变位点为A2143G、A2142G或A2142。
8、C。7用于鉴定幽门螺杆菌23SRDNA是否含有突变位点ARMSQPCR的PCR试剂盒，包括权利要求1所述的引物组、权利要求24中任一所述的DNA分子组合物或权利要求5或6所述的PCR试剂。8根据权利要求24中任一所述的DNA分子组合物或权利要求5或6所述的PCR试剂或权利要求7所述的PCR试剂盒，其特征在于所述突变位点为A2143G、A2142G或A2142C。9权利要求1所述的引物组、权利要求24中任一所述的DNA分子组合物或权利要求5或6所述的PCR试剂或权利要求7所述的PCR试剂盒在鉴定或辅助鉴定幽门螺杆菌23SRDNA是否含有突变为位点中的应用或在制备鉴定或辅助鉴定幽门螺杆菌23SRD。
9、NA是否含有突变位点产品中的应用；或权利要求1所述的引物组、权利要求24中任一所述的DNA分子组合物或权利要求5或6所述的PCR试剂或权利要求7所述的PCR试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测样本中含有的幽门螺杆菌23SRDNA是否含有突变位点中的应用或在制备鉴定或辅助鉴定待测样本中含有的幽门螺杆菌23SRDNA是否含有突变位点的产品中的应用；或权利要求1所述的引物组、权利要求24中任一所述的DNA分子组合物或权利要求5或6所述的PCR试剂或权利要求7所述的PCR试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定含有幽门螺杆菌的待测样本是否耐克拉霉素中的产品中的应用；或权利要求1所述的引物组、权利要求24中任一所述的DNA分子。
10、组合物或权利要求5或6所述的PCR试剂或权利要求7所述的PCR试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测幽门螺杆菌是否耐克拉霉素中的产品中的应用；所述突变位点具体为A2143G、A2142G或A2142C。10一种鉴定或辅助鉴定待测样本含有的幽门螺杆菌23SRDNA是否含有突变位点ARMSQPCR的方法，为如下1或21所示的方法包括如下步骤用所述PCR试剂A、所述PCR试剂B、所述PCR试剂C和所述PCR试剂D分别对待测样本进行ARMSQPCR，检测扩增产物；若DNA分子组合物D扩增S型曲线且CT32，且DNA分子组合物A扩增S型曲线且其与DNA分子组合物D扩增曲线CT7，则待测样本中幽门螺杆菌23SRD。
11、NA含有或候选含有A2143G突变位点；若DNA分子组合物D扩增S型曲线且CT32，且DNA分子组合物B扩增S型曲线且其与DNA分子组合物D扩增曲线CT7，则待测样本中幽门螺杆菌23SRDNA含有或候选含有A2142G突变位点；权利要求书CN104164491A3/3页4若DNA分子组合物D扩增S型曲线且CT32，且DNA分子组合物C扩增S型曲线且其与DNA分子组合物D的扩增曲线CT7，则待测样本中幽门螺杆菌23SRDNA含有或候选含有A2142C突变位点；若DNA分子组合物D扩增S型曲线且CT32，且DNA分子组合物A、B和C均无扩增曲线；或DNA分子组合物D扩增S型曲线且CT32，且DNA。
12、分子组合物A、B和C的扩增曲线与DNA分子组合物D扩增曲线CT7；则待测样本中幽门螺杆菌23SRDNA不含有或候选不含有突变位点；2所示的方法包括如下步骤用所述PCR试剂E和所述PCR试剂D分别对待测样本进行ARMSQPCR，检测扩增产物；若DNA分子组合物D扩增S型曲线且CT32，且DNA分子组合物E有S型扩增曲线且其与DNA分子组合物D的扩增曲线CT7，则待测样本中幽门螺杆菌23SRDNA含有或候选含有23SRDNA突变位点；若DNA分子组合物D扩增S型曲线且CT32，且DNA分子组合物E无S型扩增曲线与DNA分子组合物D的扩增曲线CT7，则待测样本中幽门螺杆菌23SRDNA不含有或候选不。
13、含有23SRDNA突变位点；所述突变位点为A2143G、A2142G或A2142C。权利要求书CN104164491A1/12页5用于幽门螺杆菌23SRDNA基因突变分型的ARMSQPCR的检测方法及试剂盒技术领域0001本发明属于生物技术领域，尤其涉及用于幽门螺杆菌23SRDNA基因突变分型的ARMSQPCR的检测方法及试剂盒。背景技术0002幽门螺杆菌HELICOBAETERPYLORI，HP是一种常见的可长期定植于人类胃黏膜的革兰阴性微需氧杆菌，与许多上消化道疾病有着紧密的联系。全世界有超过半数的人感染HP，而在我国的感染率为55。HP的感染给患者造成极大的痛苦，加重医疗负担。WHO把H。
14、P列为同乙型、丙型肝炎一样，都是生物致癌物。以质子泵抑制剂PROTONPUMPINHIBITOR，PPI结合阿莫西林和克拉霉素或者甲硝唑的三联疗法，是国内外公认的一线抗HP感染治疗组合。克拉霉素属于大环内酯类抗生素，在体外有强大的杀菌作用，口服生物利用度高，对酸稳定。克拉霉素的抗菌机制是药物穿入菌体细胞内，与核糖体紧密结合，作用于23SRDNAV功能区的多肽转移环，抑制多肽转移酶，影响核糖体的位移过程，阻止肽链延长，从而抑制细菌的蛋白质合成。然而，由于克拉素的耐药的不断上升，一线疗法的成功率正在逐渐的下降。0003细菌的耐药可分为原发性耐药和继发性耐药。原发性耐药是由于细菌缺少对药物敏感的靶位。
15、，或细菌具有天然屏障使药物无法进入菌体，继发性耐药是指由于抗生素的广泛使用，细菌获得耐药基因，从敏感菌株变成耐药菌株。一般认为幽门螺杆菌的耐药多为继发性耐药。幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药机制有以下几种1、RDNA甲基化酶引起克拉霉素失活；2、细胞膜渗透性下降使进入细菌的药物减少；3、克拉霉素排出增加；4、基因突变主要为幽门螺杆菌23SRDNA的V区发生点突变，导致核糖体变构，克拉霉素的结合位点发生改变，使幽门螺杆菌与克拉霉素的亲合力减弱，不能阻止细菌的蛋白合成产生耐药。综合以上几点，国内外学者普遍认为幽门螺杆菌对克拉霉素耐药的主要机制是23SRDNA基因突变所致，其余的机制相对作用较弱。1997。
16、年TAYLOR等人研究证实位于在23SRDNA基因的结构域V中编码的肽基转移酶区的第2142位其中腺嘌呤核苷酸被胞嘧啶或被鸟嘌呤取代，或第2143位其中腺嘌呤被鸟嘌呤取代的3个点突变，这些突变在此微生物中与克拉霉素抗性机理密切相关。各国学者也一致发现克拉霉素耐药的幽门螺杆菌菌株的23SRDNA基因的突变最常出现为A2143G、A2142G、A2142C的突变，也有报道发现G2115A、T2182C突变。RAYMOND等对法国138株克拉霉素耐药株研究发现A2143G、A2142G和A2142C的突变率分别占819、145和36。另外，LIU等对北京65株克拉霉素耐药株研究显示A2143G、A2。
17、142G和A2142C的突变率分别占846、62和15。因此，检测HP23SRDNA中A2143G、A2142G和A2142C突变，可以检测到中国90以上的克拉霉素耐药HP株。所以，HP菌株23RDNA中的A2143G、A2142G和A2142C型突变可以作为国内检测HP克拉霉素耐药的靶点。0004用于克拉霉素耐药检测的方法很多，包括如药物敏感性试验、DNA直接测序、限制说明书CN104164491A2/12页6性片段长度多态性分析RFLPPCR、荧光定量PCR法等。其中药敏实验为耐药检测的金标准，但此类方法是建立在细菌培养基础上，其缺点为细菌培养时间长，培养要求较高，临床上比较难做到。近年来。
18、，荧光定量PCR以其快速简便、特异性好、灵敏度高、可定量、有效解决PCR污染问题及自动化程度高等优点，在医学领域、微生物、动植物疾病检疫方面得到了广泛的应用。0005扩增阻碍突变系统AMPLICATIONREFRACTORYMUTATIONSYSTEMARMS于1989年建立，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计突变ARMS引物，其3末端碱基与待检测突变型的突变碱基匹配，用于特异性扩增突变模板。ARMS的检测灵敏度依赖于ARMS引物的特异性和反应条件如酶，镁离子浓度等的优化。为了增加引物的特异性，减少引物与靶DNA有错配时的错配延伸，可通过在引物3端的第23个碱基引入另外一个或者两个错配碱。
19、基，使之与模板之间形成多重错配以阻止错误延伸。0006ARMSQPCR技术基于REALTIMEPCR平台，结合ARMS突变富集和TAQMAN特异性荧光检测两种技术。利用ARMS引物对突变靶序列进行PCR扩增，TAQMAN探针对扩增产物进行特异性位点检测，在REALTIMEPCR基础上鉴定特定突变。0007锁核酸LOCKEDNUCLEICACID，LNA是一种新型的寡核酸衍生物，结构中BD呋喃核糖的20，4C位通过缩水作用形成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，呋喃糖的结构锁定在C3内型的N构型，形成了刚性的缩合结构。LNA作为一种新的反义核酸，具有与DNA/RNA强大的杂交亲和力、反义活。
20、性、抗核酸酶能力、水溶性好及体内无毒性等优点。其能够与DNA和RNA特异性地结合从而可以制备LNA探针，与DNA探针相比，其杂交的稳定性和特异性增加，可大大提高基因诊断的效率和灵敏度。发明内容0008本发明的一个目的是提供用于鉴定幽门螺杆菌23SRDNA是否含有突变位点ARMSQPCR的引物组。0009本发明提供的引物组，为如下1或200101由单独使用的23SRDNA的A2143G突变型的ARMS引物、23SRDNA的A2142G突变型的ARMS引物和23SRDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成；00112由23SRDNA的A2143G突变型的ARMS引物、23SRDNA的A2142。
21、G突变型的ARMS引物和23SRDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成；0012所述23SRDNA的A2143G突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列3；0013所述23SRDNA的A2142G突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列4；0014所述23SRDNA的A2142C突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列5。0015本发明的一个目的是提供用于鉴定幽门螺杆菌23SRDNA是否含有突变位点ARMSQPCR的DNA分子组合物。0016本发明提供的DNA分子组合物，为如下1或200171所示的DNA分子组合物包括单独使用的DNA分子组合物A、DNA分子组合物B和D。
22、NA分子组合物C；0018所述DNA分子组合物A由锁核酸阻滞探针、通用TAQMAN探针、PCR通用下游引物和23SRDNA的A2143G突变型的ARMS引物组成；说明书CN104164491A3/12页70019所述DNA分子组合物B由锁核酸阻滞探针、通用TAQMAN探针、PCR通用下游引物和23SRDNA的A2142G突变型的ARMS引物组成；0020所述DNA分子组合物C由锁核酸阻滞探针、通用TAQMAN探针、PCR通用下游引物和23SRDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成；00212所示的DNA分子组合物E由锁核酸阻滞探针、通用TAQMAN探针、PCR通用下游引物、23SRDNA。
23、的A2143G突变型的ARMS引物、23SRDNA的A2142G突变型的ARMS引物和23SRDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成；0022所述锁核酸阻滞探针的核苷酸序列为序列表中序列1；0023所述通用TAQMAN探针的核苷酸序列为序列表中序列2；0024所述23SRDNA的A2143G突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列3；0025所述23SRDNA的A2142G突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列4；0026所述23SRDNA的A2142C突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列5；0027所述PCR通用下游引物的核苷酸序列为序列表中序列7。0028上述。
24、的DNA分子组合物还包括所述DNA分子组合物D；0029所述DNA分子组合物D由所述锁核酸阻滞探针、所述通用TAQMAN探针、所述PCR通用下游引物和内控引物组成；0030所述内控引物的核苷酸序列为序列表中序列6。0031所述突变位点为A2143G、A2142G或A2142C。0032幽门螺杆菌23SRDNA野生型基因的核苷酸序列为序列表中的序列8；0033幽门螺杆菌23SRDNA的A2143G突变位点为序列表中的序列8自5末端第97位的A突变为G；0034幽门螺杆菌23SRDNA的A2142G突变位点为序列表中的序列8自5末端第96位的A突变为G；0035幽门螺杆菌23SRDNA的A2142。
25、C突变位点为序列表中的序列8自5末端第96位的A突变为C；0036上述的DNA分子组合物中，所述DNA分子组合物A中，所述锁核酸阻滞探针、所述通用TAQMAN探针、所述PCR通用下游引物、所述23SRDNA的A2143G突变型的ARMS引物的摩尔比为4255；0037所述DNA分子组合物B中，所述锁核酸阻滞探针、所述通用TAQMAN探针、所述PCR通用下游引物、所述23SRDNA的A2142G突变型的ARMS引物的摩尔比为4255；0038所述DNA分子组合物C中，所述锁核酸阻滞探针、所述通用TAQMAN探针、所述PCR通用下游引物、所述23SRDNA的A2142C突变型的ARMS引物的摩尔比。
26、为4255；0039所述DNA分子组合物D中，所述锁核酸阻滞探针、所述通用TAQMAN探针、所述PCR通用下游引物、所述内控引物的摩尔比为4255。0040本发明的第二个目的是提供用于鉴定幽门螺杆菌23SRDNA基因型的ARMSQPCR的PCR试剂。0041本发明提供的PCR试剂，为1或200421所示的PCR试剂包括PCR试剂A、PCR试剂B和PCR试剂C组成；0043所述PCR试剂A由PCR扩增反应液、所述DNA分子组合物A和水组成；说明书CN104164491A4/12页80044所述PCR试剂B由PCR扩增反应液、所述DNA分子组合物B和水组成；0045所述PCR试剂C由PCR扩增反应。
27、液、所述DNA分子组合物C和水组成；0046所述锁核酸阻滞探针、所述通用TAQMAN探针、所述PCR通用下游引物、所述23SRDNA的A2143G突变型的ARMS引物在所述PCR试剂A中的终浓度分别依次为04M、02M、05M、05M；0047所述锁核酸阻滞探针、所述通用TAQMAN探针、所述PCR通用下游引物、所述23SRDNA的A2142G突变型的ARMS引物在所述PCR试剂B中的终浓度分别依次为04M、02M、05M、05M；0048所述锁核酸阻滞探针、所述通用TAQMAN探针、所述PCR通用下游引物、所述23SRDNA的A2142C突变型的ARMS引物在所述PCR试剂C中的终浓度分别依。
28、次为04M、02M、05M、05M。00492所示的PCR试剂为PCR试剂E，其由PCR扩增缓冲液、2所示的DNA分子组合物和水组成。0050上述所述1所示的PCR试剂或所述2所示的PCR试剂均还包括PCR试剂D；0051所述PCR试剂D由PCR扩增缓冲液、所述DNA分子组合物D和水组成；0052所述锁核酸阻滞探针、所述通用TAQMAN探针、所述PCR通用下游引物、所述内控引物在所述PCR试剂D中的终浓度分别依次为04M、02M、05M、05M。0053所述突变位点为A2143G、A2142G或A2142C。0054在反应体系中，上述23SRDNA的A2143G突变型的ARMS引物、23SRD。
29、NA的A2142G突变型的ARMS引物23SRDNA的A2142C突变型的ARMS引物为等摩尔比；在本发明的实施例中其终浓度均为025M。0055本发明的第三个目的是提供用于鉴定幽门螺杆菌23SRDNA基因型的ARMSQPCR的PCR试剂盒。0056本发明提供的PCR试剂盒，包括是上述的DNA分子组合物或上述的PCR试剂。0057上述的DNA分子组合物或上述的PCR试剂或上述的PCR试剂盒中，所述突变位点为A2143G、A2142G或A2142C。0058上述的DNA分子组合物或上述的PCR试剂或上述的PCR试剂盒在鉴定或辅助鉴定幽门螺杆菌23SRDNA是否含有突变为位点中的应用或在制备鉴定或。
30、辅助鉴定幽门螺杆菌23SRDNA是否含有突变位点产品中的应用也是本发明保护的范围；0059或上述的DNA分子组合物或上述的PCR试剂或上述的PCR试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测样本中含有的幽门螺杆菌23SRDNA是否含有突变位点中的应用或在制备鉴定或辅助鉴定待测样本中含有的幽门螺杆菌23SRDNA是否含有突变位点的产品中的应用；0060或上述的DNA分子组合物或上述的PCR试剂或上述的PCR试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定含有幽门螺杆菌的待测样本是否耐克拉霉素中的产品中的应用；0061或上述的DNA分子组合物或上述的PCR试剂或上述的PCR试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测幽门螺杆菌是否耐克拉霉素中的产品中。
31、的应用。0062上述应用中，所述突变位点为A2143G、A2142G或A2142C。0063本发明第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测样本含有的幽门螺杆菌23SRDNA是否含有突变位点ARMSQPCR的方法。说明书CN104164491A5/12页90064本发明提供的方法，包括如下步骤00651所示的方法包括如下步骤0066用所述PCR试剂A、所述PCR试剂B、所述PCR试剂C和所述PCR试剂D分别对待测样本进行ARMSQPCR，检测扩增产物；0067若DNA分子组合物D扩增S型曲线且CT32，且DNA分子组合物A扩增S型曲线且其与DNA分子组合物D扩增曲线CT7，则待测样本中幽门螺杆菌2。
32、3SRDNA含有或候选含有A2143G突变位点；0068若DNA分子组合物D扩增S型曲线且CT32，且DNA分子组合物B扩增S型曲线且其与DNA分子组合物D扩增曲线CT7，则待测样本中幽门螺杆菌23SRDNA含有或候选含有A2142G突变位点；0069若DNA分子组合物D扩增S型曲线且CT32，且DNA分子组合物C扩增S型曲线且其与DNA分子组合物D的扩增曲线CT7，则待测样本中幽门螺杆菌23SRDNA含有或候选含有A2142C突变位点；0070若DNA分子组合物D扩增S型曲线且CT32，且DNA分子组合物A、B和C均无扩增曲线；或DNA分子组合物D扩增S型曲线且CT32，且DNA分子组合物A。
33、、B和C的扩增曲线与DNA分子组合物D扩增曲线CT7；则待测样本中幽门螺杆菌23SRDNA不含有或候选不含有突变位点；00712所示的方法包括如下步骤0072用所述PCR试剂E和所述PCR试剂D分别对待测样本进行ARMSQPCR，检测扩增产物；0073若DNA分子组合物D扩增S型曲线且CT32，且DNA分子组合物E有S型扩增曲线且其与DNA分子组合物D的扩增曲线CT7，则待测样本中幽门螺杆菌23SRDNA含有或候选含有23SRDNA突变位点；0074若DNA分子组合物D扩增S型曲线且CT32，且DNA分子组合物E无S型扩增曲线与DNA分子组合物D的扩增曲线CT7，则待测样本中幽门螺杆菌23SR。
34、DNA不含有或候选不含有23SRDNA突变位点；0075所述突变位点为A2143G、A2142G或A2142C。本发明所使用的探针两端分别标记荧光报告基团R和荧光淬灭基团Q的寡核苷酸，为5端FAM标记的TAQMAN探针。在探针完整时，即随机状态和无PCR产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。在ARMSQPCR扩增过程中，当特异的PCR产物与TAQMAN探针发生杂交反应时TAQ酶的5端外切酶活性同时也把探针裂解，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的。
35、拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。0076锁核酸阻滞探针标记3段P04。0077所述待测样本为离体幽门螺杆菌患者胃粘膜组织标本。0078本发明的实验证明，本发明设计的引物及其构成的试剂盒能快速、准确、高敏感度的检测胃粘膜组织中幽门螺杆菌23SRDNA基因特定位点突变，灵敏度高，可以进一步预测其对克拉霉素耐药性。说明书CN104164491A6/12页100079本发明采用的锁核酸阻滞探针，其序列与幽门螺杆菌23SRDNA基因野生模板完全匹配，部分碱基锁核酸化，用于特异性结合模板DNA中的HP23SRDNA野生型DNA，因其末端磷酸化，无法延伸从而。
36、抑制突变区野生型DNA的扩增，大大增加突变检测的灵敏度与特异性。0080因此，本发明用于检测23SRDNA基因突变具有以下优势00811、特异性强设计的ARMS引物分别针对包括23SRDNA基因的A2143G、A2142G和A2142C的三种突变位点序列，能特异性扩增相应突变模板DNA；在ARMS引物的3末端倒数23位增加一个或者两个碱基错配，可以增加ARMS引物的特异性；本发明技术在PCR反应体系中加入野生型23SRDNA基因特异性的锁核酸阻滞探针，通过抑制野生型基因组DNA扩增从而富集突变型DNA的扩增，进一步提高了检测的特异性。00822、敏感性高本发明技术在PCR反应液中加入野生型23。
37、SRDNA基因LNA阻滞探针，通过特异性地抑制野生型模板的扩增，从而达到对微量突变模板的富集作用，提高检测敏感性。本技术检测23SRDNA基因突变敏感度达011即突变基因组DNA达到基因总DNA的011即可检出；而直接测序法检测23SRDNA突变的敏感度约为10即突变基因组DNA达到基因总DNA的10才能检出。00833、检测过程为闭管反应，大大降低了污染及结果偏差的可能性。00844、操作简单快速，从标本送检到得出结果可在3个小时以内完成。而直接测序法检测步骤繁琐送检标本提取DNAPCR扩增验证PCR产物电泳纯化PCR产物直接测序，且其经历两个PCR产物的电泳过程，污染机会大，不适合在医院大。
38、规模开展。00855、结果判读明确、客观；可以快速对不同突变类型进行准确分型，若需要亦可对结果进行定量分析。00866、高通量，一次最多可检测48例。00877、安全整个体系中不包含有毒有害物质，无需PCR产物的后处理，对操作员和环境都无危害。附图说明0088图1为用ARMSQPCR检测试剂盒分型检测幽门螺杆菌阳性样本1的23SRDNAA2143G基因突变型的扩增曲线图0089图2为用ARMSQPCR检测试剂盒分型检测幽门螺杆菌阳性样本2的23SRDNAA2142G基因突变型的扩增曲线图0090图3为用ARMSQPCR检测试剂盒分型检测幽门螺杆菌阳性样本3的23SRDNAA2142C基因突变型。
39、的扩增曲线图0091图4为用ARMSQPCR检测试剂盒分型检测幽门螺杆菌阳性样本4的23SRDNA基因野生型的扩增曲线图0092图5为用ARMSQPCR检测试剂盒混合检测幽门螺杆菌阳性样本13的23SRDNA基因突变型的扩增曲线图0093图6为用ARMSQPCR检测试剂盒混合检测幽门螺杆菌阳性样本4的23SRDNA基因野生型的扩增曲线图说明书CN104164491A107/12页11具体实施方式0094下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。0095下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。0096实施例1、ARMSQPCR检测试剂盒及其专用引物和探针的。
40、设计0097幽门螺杆菌23SRDNA野生型基因的核苷酸序列为序列表中的序列8；0098幽门螺杆菌23SRDNA的A2143G突变位点为序列表中的序列8自5末端第97位的A突变为G；0099幽门螺杆菌23SRDNA的A2142G突变位点为序列表中的序列8自5末端第96位的A突变为G；0100幽门螺杆菌23SRDNA的A2142C突变位点为序列表中的序列8自5末端第96位的A突变为C；0101一、引物及探针0102使用PRIMEREXPRESSVERSION3软件在两个突变的序列区域设计探针及引物。设计并筛选能特异性检测第2143和第2142两个位点的三种A2143G、A2142G、A2142C碱。
41、基置换突变的ARMS引物各一条及内控引物一条，设计通用下游引物一条，设计并筛选通用TAQMAN探针一条，设计并筛选锁核酸阻滞探针一条，各探针、引物序列分别具体如下0103锁核酸阻滞探针的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其3端标记PO4；0104通用TAQMAN探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示，其5端标记FAM，3端标记BHQ1；0105用于检测23SRDNA的突变型ARMS引物由用于检测23SRDNA的A2143G突变型的ARMS引物、用于检测23SRDNA的A2142G突变型的ARMS引物和用于检测23SRDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成，其中，0106用于检测23SRDNA。
42、的A2143G突变型的ARMS引物的核苷酸如序列3所示；0107用于检测23SRDNA的A2142G突变型的ARMS引物的核苷酸如序列4所示；0108用于检测23SRDNA的A2142C突变型的ARMS引物的核苷酸如序列5所示；0109内控引物为一条能够同时扩增23SRDNA野生型及突变型基因组DNA的上游引物，其核苷酸如序列6所示；0110PCR通用下游引物的核苷酸如序列7所示。0111将设计好的引物及探针序列交由合成公司合成，一般采用仪器自动化学合成，需提供合成检验合格报告。0112二、幽门螺杆菌荧光定量PCR的试剂或试剂盒配制01131、反应体系的优化01141引物浓度的优化在反应体系其。
43、它条件相同的情况下，将引物浓度分别从01M至10M作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳引物浓度是05M。01152探针浓度的优化在反应体系其他条件相同的情况下，将探针浓度分别从005M至05M作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳探针浓度是02M。01163酶的优化在反应体系中加入各种酶，通过对试验结果的分析比较，确定最佳说明书CN104164491A118/12页12酶是EXTAQ酶。01174镁离子浓度的优化在反应体系其它条件相同的情况下，将QPCR反应液组分镁离子浓度分别从05MM至40MM作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳镁离子浓度是2MM。0。
44、1185退火温度的优化在反应体系其它条件相同的情况下，进行梯度PCR5662退火温度，通过对试验结果的分析比较，确定最佳退火温度是58。0119经优化，用于检测待测样本中的23SRDNA是否突变的PCR试剂为1或201201由PCR试剂AD组成0121PCR试剂A为A2143G检测管反应体系20L，由QPCR混合反应液10L、通用下游引物1L终浓度05M、A2143G的ARMS引物1L终浓度05M、通用TAQMAN探针04L终浓度02M、锁核酸阻滞探针08L终浓度04M、模板DNA5L终浓度1300NG/L和水组成。0122PCR试剂B为A2142G检测管反应体系20L，由QPCR混合反应液1。
45、0L、通用下游引物1L终浓度05M、A2142G的ARMS引物1L终浓度05M、通用TAQMAN探针04L终浓度02M、锁核酸阻滞探针08L终浓度04M、模板DNA5L终浓度1300NG/L和水组成。0123PCR试剂C为A2142C检测管反应体系20L，由QPCR混合反应液10L、通用下游引物1L终浓度05M、A2142C的ARMS引物1L终浓度05M、通用TAQMAN探针04L终浓度02M、锁核酸阻滞探针08L终浓度04M、模板DNA5L终浓度1300NG/L和水组成。0124PCR试剂D为内控管的反应体系，与检测管相同，不同的是将ARMS引物替换为内控引物。01252由PCR试剂E和D组。
46、成0126用于检测待测样本23SRDNA是否突变的PCR试剂包括PCR试剂E和PCR试剂D；0127PCR试剂E为检测管的反应体系为20L，由QPCR混合反应液10L、通用下游引物1L终浓度05M、A2143G的ARMS引物、A2142G的ARMS引物和A2142C的ARMS引物各05L终浓度均为、通用TAQMAN探针04L终浓度02M、锁核酸阻滞探针08L终浓度04M、模板DNA5L终浓度1300NG/L和水组成。0128上述QPCR混合反应液组分及其终浓度见表1。0129表1为QPCR反应液组分0130组分终浓度MGCL22MMTAQDNA聚合酶5U/LDNTPS25MM反应缓冲液1001。
47、312、试剂盒组成0132可以将上述的锁核酸阻滞探针、通用TAQMAN探针、针对23SRDNA的A2143G的ARMS引物或针对23SRDNA的A2142G的ARMS引物或针对23SRDNA的A2142C的ARMS引物、内控引物、PCR通用下游引物以及水作为试剂盒的主要组成，构建获得试剂盒；说明书CN104164491A129/12页130133试剂盒中具体含有下列试剂和材料01341引物溶液A、锁核酸阻滞探针序列1；B、通用TAQMAN探针序列2，；C、ARMS引物序列3或序列4或序列5或序列3序列4序列5；D、内控引物序列6；E、PCR通用下游引物序列7。01352QPCR反应液包括10P。
48、CR缓冲液；DNTPS；MGCL2溶液；EXTAQ酶。01363阳性质控为人工合成的23SRDNA基因A2143G、A2142G和A2142C三种突变型的混合质粒基因组DNA。01374阴性质控无菌双蒸水01385无菌双蒸水0139实施例2、幽门螺杆菌23SRDNA基因型的ARMSQPCR突变检测方法0140一、检测01411、样本制备0142从离体人胃粘膜组织标本中获取DNA，推荐使用商业化的试剂盒提取基因组DNA作为样本14；0143测定DNA浓度和纯度，要求浓度大于10NG/L；OD260NM/OD280NM1820。01442、荧光PCR检测01451ARMS引物分型检测0146对于样。
49、本14中每个样本均在四个管AD分别进行反应，四个管分别对应A2143G检测管EP管A、A2142G检测管EP管B、A2142C检测管EP管C、内控管EP管D。检测管AC内反应加入QPCR反应液、LNA阻滞探针、通用TAQMAN探针、通用下游引物、模板DNA及相应的ARMS引物；内控管D基本相同，所不同的是加入内控引物替代ARMS引物，具体如下0147EP管APCR试剂A20L反应体系，由QPCR混合反应液10L、通用下游引物1L终浓度05M、A2143G的ARMS引物1L终浓度05M、通用TAQMAN探针04L终浓度02M、锁核酸阻滞探针08L终浓度04M、模板DNA5L终浓度1300NG/L和水组成；0148EP管BPCR试剂B20L反应体系，由QPCR混合反应液10L、通用下游引物1L终浓度05M、A2142G的ARMS引物1L终浓度05M、通用TAQMAN探针04L终浓度02M、锁核酸阻滞探针08L终浓度04M、模板DNA5L终浓度1300N。