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1、10申请公布号CN104164426A43申请公布日20141126CN104164426A21申请号201410348913222申请日20140721C12N15/11200601C12N15/53200601C12N15/10200601C12Q1/6820060171申请人晁志地址510515广东省广州市沙太南路1023号88栋C单元210472发明人晁志74专利代理机构上海麦其知识产权代理事务所普通合伙31257代理人董红曼54发明名称扩增蝰科蛇类物种DNA条形码COI序列的引物及PCR方法和试剂盒57摘要本发明属于蝰科蛇类物种及中药材鉴定技术领域，公开了一种扩增蝰科蛇类物种COI序。
2、列的引物及PCR方法和试剂盒，包括DNA提取、PCR扩增、电泳检测等步骤。本发明具有简便快捷、DNA用量少、通用性好等特点，弥补了现有技术中COI序列通用引物LCO1490和HCO2198在蝰科蛇类基因扩增及药材鉴定中的不足。本发明可用于蝰科蛇类药材COI序列的扩增，为该科蛇类药材的分子鉴定奠定基础。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图1页10申请公布号CN104164426ACN104164426A1/1页21一对扩增蝰科蛇类物种COI序列的引物，其特征在于，所述引物包括DK1CO1和DK1CO2，其序列为。
3、DK1CO15CAACTAACCACAAAGACATCGG3；DK1CO25CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA3。2一种扩增蝰科蛇类物种COI序列的PCR方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1DNA样本的提取；2用权利要求1所述的引物进行PCR反应，获得扩增产物；所述PCR反应参数包括93预变性5MIN，552MIN；93变性30S，55复性45S，70延伸45S，35个循环；70延伸5MIN；3电泳检测前述所得的扩增产物在所述扩增产物的电泳图谱中，如果存在分子量为700BP的单一清晰DNA条带，则确定扩增成功，得到目标扩增产物，即COI基因片段。3一种用于扩增蝰科蛇类物种COI序。
4、列的PCR方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括10M引物DK1CO1；10M引物DK1CO2；2TAQDNA聚合酶混合缓冲液，其包括01U/LTAQDNA聚合酶，DATP、DTTP、DCTP、DGTP各500M，20MTRISHCLPH83，100MKCL，3MMGCL2；灭菌双蒸水。权利要求书CN104164426A1/5页3扩增蝰科蛇类物种DNA条形码COI序列的引物及PCR方法和试剂盒技术领域0001本发明属于蝰科蛇类物种及中药材鉴定技术领域，具体涉及一种能扩增蝰科蛇类物种COI条形码序列的通用引物及PCR方法和试剂盒。背景技术0002蛇类药材在我国使用历史悠久，可追溯至公元前的春秋。
5、战国时期，历代本草特别是李时珍的本草纲目更是广收博蓄，成为古代本草中收载蛇类药物最多的药著。中国药典2010年版收载了蕲蛇五步蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇银环蛇和蛇蜕乌梢蛇、锦蛇、黑眉锦蛇等5个种，4味药材。0003蛇是一个生态相对脆弱的种群，一是本身繁殖能力不强，二是生态环境易遭破坏。由于各种目的的捕捉及蛇类资源面临的较大压力，使得药用蛇类的市售价格居高不下。在这种供不应求的局势及利益最大化的驱使下，一些不法商家以次充好，对药用蛇类进行造假。随着分子生物学的发展，DNA分子技术用于各种蛇类药材鉴定的研究越来越多。0004DNA条形码DNABARCODING是由加拿大动物学家HERBERT首次提出的。
6、，其科学理论是通过使用一段标准DNA片段，对物种进行快速、准确的鉴定。2003年，HERBERT等对动物界中11个门13320个物种对的线粒体细胞色素C氧化酶亚基ICOI基因序列进行分析，发现该序列种间变异能较好地区分除刺胞动物门以外的物种。随后的研究表明，COI序列种间变异大而种内变异小，其DNA序列本身很少存在插入和缺失，被公认为动物界中标准的DNA条形码基因。目前，推荐用于COI序列扩增的通用引物为LCO1490和HCO2198，但本发明人在研究中发现，通用引物LCO1490和HCO2198在蝰科蛇类物种鉴定中不能获得较好的扩增产物。发明内容0005针对现有技术存在的上述情况，本发明人研。
7、究设计了能扩增蝰科蛇类物种COI序列的引物，用于各种蝰科蛇类物种COI序列扩增，弥补COI序列通用引物在蛇类物种鉴定中的不足。本发明提供了蝰科蛇类物种COI序列扩增的PCR引物及其方法。本发明方法简便快捷、通用性好，能快速准确地扩增得到该蝰科蛇类物种的COI序列，为蝰科蛇类物种及来源于本科动物的药材的分子鉴定奠定了基础。0006本发明提出了一对能用于扩增蝰蛇科物种COI基因的引物，所述引物为DK1CO1和DK1CO2，其序列为0007DK1CO15CAACTAACCACAAAGACATCGG3SEQIDNO10008DK1CO25CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA3SEQIDNO20。
8、009本发明还提出了一种扩增蝰蛇科物种COI基因的PCR方法，包括以下步骤00101DNA样本的提取；00112用本发明引物进行PCR反应，PCR反应参数包括93预变性5MIN，552MIN；说明书CN104164426A2/5页493变性30S，55复性45S，70延伸45S，35个循环；70延伸5MIN。所述引物DK1CO1和DK1CO2，其序列为0012DK1CO15CAACTAACCACAAAGACATCGG3SEQIDNO10013DK1CO25CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA3SEQIDNO200143电泳检测前述所得的扩增产物在所述扩增产物的电泳图谱中，如果存在分子量。
9、为700BP的单一清晰DNA条带，则确定扩增成功，所得PCR产物可用于后续分析。0015在本发明鉴定方法的步骤1中，采用现有技术的试剂盒提取DNA的方法，不需要配制任何试剂，使得提取时间大大缩短，样本量只需30MG，可以提取所述蛇体任何组织的DNA。0016本发明还提出一种试剂盒，用于所述扩增蝰蛇科物种COI基因的PCR方法中。该试剂盒包括引物DK1CO110M；引物DK1CO210M；2TAQDNA聚合酶混合缓冲液，其包括TAQDNA聚合酶01U/L，四种脱氧核糖核苷三磷酸DATP、DTTP、DCTP及DGTP各500M，TRISHCL20M、PH83，KCL100M，MGCL23M等；灭菌。
10、双蒸水。0017综上所述，本发明提供了蝰科蛇类物种COI基因扩增的引物及PCR方法和试剂盒，以各蝰科蛇类DNA为模板，能将该蝰科蛇类样本的COI基因高效、准确地扩增出来，为蝰科蛇类药材的分子鉴定奠定了基础。本发明具有简便快捷、DNA用量少、通用性好等特点，弥补了现有技术中COI序列通用引物LCO1490和HCO2198在蝰科蛇类基因扩增及药材鉴定中的不足。附图说明0018图1为COI序列通用引物LCO1490和HCO2198扩增10种蛇类DNA模板电泳结果1尖吻蝮蛇2山烙铁头蛇3圆斑蝰蛇4原矛头蝮蛇5越南烙铁头蛇6白唇竹叶青蛇7福建竹叶青蛇8云南竹叶青蛇9冈氏竹叶青蛇10短尾蝮蛇11阴性对照其。
11、它反应条件不变，水替代模板DNA；MKDNA分子量标准从上到下依次为1000BP、700BP、500BP、400BP、300BP、200BP、100BP。0019图2为按本专利所述的引物及方法扩增10种蛇类DNA模板电泳结果1阴性对照其它反应条件不变，水替代模板DNA2尖吻蝮蛇3山烙铁头蛇4圆斑蝰蛇5原矛头蝮蛇6越南烙铁头蛇7白唇竹叶青蛇8福建竹叶青蛇9云南竹叶青蛇10冈氏竹叶青蛇11短尾蝮蛇；MKDNA分子量标准从上到下依次为1000BP、700BP、500BP、400BP、300BP、200BP、100BP。具体实施方式0020结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的。
12、保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。00211、材料002210份蝰蛇科原动物，其来源详见表1。全部样本均由华南濒危动物研究所张亮说明书CN104164426A3/5页5进行性状鉴定。0023表1蝰科蛇类样本002400252、通用引物设计0026GENBANK搜索并下载蝰科蛇类全线粒体基因序列GENBANK登录号为EU913476、KF311102、FJ752。
13、492及NC011390，DNAMAN软件对上述全线粒体基因序列和用COI通用引物LCO1490和HCO2198扩增出的序列进行对位排列比对，并找出各物种COI序列之间的保守区域。用PRIMER软件在保守区域设计能从各蛇类物种中扩增一定长度片段的通用引物对，即上游引物DK1CO1与下游引物DK1CO2。引物序列如下0027DK1CO15CAACTAACCACAAAGACATCGG3SEQIDNO10028DK1CO25CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA3SEQIDNO200293、DNA提取0030取各样本组织，按照TIANGEN公司TIANAMP基因组DNA提取试剂盒操作手册提取，。
14、具体操作步骤如下00311切取不多于30MG蛇肌肉组织，用液氮研磨，加入200L缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。00322加入20L蛋白酶K溶液，混匀。在56放置，直至组织溶解，简短离心去除管盖内壁的水珠。组织材料新鲜，则裂解时间短，通常需要1小时即可完成。00333加入200L缓冲液GB，充分颠倒混匀，70放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心去除管盖内壁的水珠。加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一股放置70时会消失，如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。00344加入200L无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心去除管盖内壁的水。
15、珠。00355将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中吸附柱放入收集管说明书CN104164426A4/5页6中，12000RPM离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。00366向吸附柱CB3中加入500L缓冲液GD，12000RPM离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。00377向吸附柱CB3中加入600L漂洗液PW，12000RPM离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。00388向吸附柱CB3中加入600L漂洗液PW，12000RPM离心30秒，倒掉废液。00399将吸附柱CB3放回收集管中，12000RPM离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3。
16、置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。004010将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50200L洗脱缓冲液TE，室温放置25分钟，12000RPM离心2分钟，将溶液收集到离心管中。004111为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12000RPM离心2分钟，将溶液收集到离心管中冷冻保存。00424、PCR扩增0043PCR反应在200LPCR反应管中进行，反应总体积25L，包括以下试剂004400450046为防止实验出现假阳性结果，实验设置阴性对照，用无菌双蒸水替代模板DNA，按样品同样的方法进行DNA。
17、提取和PCR扩增。0047PCR反应液配制完后，4000RPM离心10S，将PCR管插入PCR仪中，进行如下反应93预变性5MIN，552MIN；93变性30S，55复性45S，70延伸45S，35个循环；70延伸5MIN，获得扩增产物。0048取5LPCR产物点至12琼脂糖电泳孔中，100V电泳25MIN，紫外凝胶分析检测，成像。0049COI序列通用引物LCO1490和HCO2198扩增10种蛇类DNA模板电泳结果如图1所示，所有蛇类样本及阴性对照均出现引物二聚体，仅1、4、6在700BP处出现较淡条带，表明该对引物对蝰科蛇类物种扩增效率不高。0050按本发明引物及方法扩增10种蛇类DNA。
18、模板电泳结果如图2所示，所有蛇类样本在分子量为700BP处均有清晰单一DNA条带，阴性对照未出现目标条带，表明本发明扩增体系能够成功扩增上述蝰科蛇类物种COI基因。0051试剂盒及其应用0052本发明鉴定方法中所用的试剂盒，包括引物DK1CO110M；引物说明书CN104164426A5/5页7DK1CO210M；2TAQDNA聚合酶混合缓冲液，其包括TAQDNA聚合酶01U/L，四种脱氧核糖核苷三磷酸DATP、DTTP、DCTP及DGTP各500M，TRISHCL20M、PH83，KCL100M，MGCL23M等；灭菌双蒸水。试剂盒使用方法如下00531待测样品DNA模板的提取；00542P。
19、CR扩增PCR反应在200LPCR反应管中进行，反应总体积25L，包括以下试剂00550056PCR反应液配制完后，4000RPM离心10S，将PCR管置入PCR仪中，进行如下反应93预变性5MIN，552MIN；93变性30S，55复性45S，70延伸45S，35个循环；70延伸5MIN。0057PCR扩增所用引物序列为0058DK1CO15CAACTAACCACAAAGACATCGG3，0059DK1CO25CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA3。00603电泳检测取5LPCR产物，点样于12琼脂糖凝胶电泳孔中，100V电泳25MIN，紫外分析检测。在该扩增产物电泳图谱中，如果检测到分子量为700BP的单一DNA条带，则确定所检待测样品扩增成功。说明书CN104164426A1/1页8图1图2说明书附图CN104164426A。