一种从植物中提纯苦马豆素的新工艺 技术领域 本发明属于天然产物化学研究领域， 具体涉及一种从豆科棘豆属、 黄芪属或苦马 豆属， 旋花科番薯属， 锦葵科黄花稔属植物中提纯苦马豆素的新工艺。
背景技术 ( 一 ) 苦马豆素的发现及药理活性
疯草 (Locoweed) 是豆科棘豆属 (Oxytopis) 和黄芪属 (Astragalus) 有毒植物的 总称， 是世界范围内危害草原畜牧业最严重的毒草。在俄罗斯、 加拿大、 摩洛哥、 澳大利亚、 墨西哥、 西班牙、 巴西、 埃及、 冰岛等国家均有分布。在我国， 疯草类植物有 44 种， 主要分布 于内蒙古、 宁夏、 甘肃、 青海、 新疆、 西藏、 陕西、 四川等省区， 分布面积超过 400 万公顷， 每年 因疯草中毒所造成的经济损失就高达 12 亿元以上。
1979 年， 澳 大 利 亚 学 者 Colegate 等 利 用 甘 露 糖 甙 酶 为 工 具 首 次 从 灰 苦 马 豆 (swainsonina galegifolia) 中分离出甘露糖甙酶的抑制剂吲哚里西啶生物碱， 并以原 植物名命名， 为苦马豆素 (Swainsonine)。1982 年， 美国学者 Molyneux 等从分布于美国 西部草地的豆科棘豆属绢毛棘豆 (Oxytopis.sericea) 和黄芪属斑荚黄芪 (Astragalus. lentiginosus) 中分离出苦马豆素， 其含量比灰苦马豆高 10 倍， 由此开启了人们对苦马豆 素的药理活性研究。肿瘤细胞表面的低聚糖在恶性肿瘤表型的表达方面起重要作用， 已经 证实糖蛋白上天冬酰胺 - 低聚糖数量的增加与肿瘤的转移存在一定的因果关系。苦马豆素 可抑制糖基化作用或抑制天冬酰胺 - 低聚糖的合成， 从而阻抑了肿瘤细胞的转移 ； 且苦马 豆素能够激活动物腹腔吞噬细胞的细胞结合活性从而抑制肿瘤细胞。 晚期恶性肿瘤的治疗 效果与化疗药剂量之间有直接关系， 化疗或放疗的剂量受到严重的骨髓以致及随后发生的 嗜中性白细胞减少症的限制， 而苦马豆素恰能缓解这些副作用的发生。当苦马豆素与放疗 或化疗药物同时应用时， 可避免骨髓抑制和白细胞减少等副作用。由于在杀伤肿瘤细胞和 免疫调节方面的优异表现， 苦马豆素作为一种崭新的抗肿瘤药物而倍受关注。
国 内 对 苦 马 豆 素 的 研 究 起 步 较 晚。1989 年 曹 光 荣 等 首 次 从 我 国 黄 花 棘 豆 (O.ochrocephala) 中分离鉴定出苦马豆素， 并证明其为主要有毒成分。随后赵宝玉等也陆 续从我国西部草地广泛分布的小花棘豆、 甘肃棘豆、 镰形棘豆、 宽苞棘豆、 冰川棘豆、 茎直黄 芪、 变异黄芪等植物中分离并鉴定出苦马豆素。苦马豆素的出现引起了植物学、 毒理学、 病 理学、 化学、 生物化学、 免疫学和医学界的极大兴趣， 随着研究的深入和扩展， 人们发现苦马 豆素可作为免疫调节剂、 肿瘤转移及扩散抑制剂、 抗病毒和细胞保护剂等药物使用， 苦马豆 素还可以促进骨髓增殖， 能有效传递致死性辐照或高剂量化疗所造成的骨髓抑制及随后发 生的嗜中性白细胞减少症， 并证明苦马豆素对人的恶性肿瘤有治疗作用。特别是近几十年 来， 人们发现苦马豆素可作为免疫调节剂、 抗 HIV 及扩散抑制剂、 抗病毒和细胞保护剂等药 物使用， 并作为一种崭新的抗癌药物， 受到了国内外的极大关注。国内， 对抗肿瘤药 - 苦马 豆素的药物研究方面， 仅处于起步阶段， 而国外， 已进入 III 期临床试验阶段。
( 二 ) 苦马豆素的来源
制约国内苦马豆素抗肿瘤药物研发进程的主要问题是苦马豆素来源十分困难， 远 远不能满足苦马豆素药理活性研究和药物研发的需要。因此， 探索和优化苦马豆素的提取 工艺就显得十分迫切。目前， 关于苦马豆素的来源， 文献资料报道有三种途径。
1 从植物中提取分离
目前已知的含苦马豆素的植物主要是豆科黄芪属和棘豆属植物， 这些植物广泛分 布于世界各地， 尤其是北美和我国西部草原， 资源十分丰富 ； 其次是豆科苦马豆属植物， 该 属植物仅局限于澳大利亚和中国 ； 再次从旋花科和锦葵科一些植物中也发现了苦马豆素， 含苦马豆素的植物见表 1。
表 1 含有苦马豆素的植物科属分布
2 从真菌菌丝体及其培养液中提取分离
Schneider B 等 (1984) 从 美 国 标 准 库 保 存 的 豆 类 丝 核 菌 (Rhizoctonia Legaminicola) 中 分 离 出 苦 马 豆 素。Sim K L 等 (1997) 报 道 绿 僵 菌 (Metarrhizium anisopliae) 中也含有苦马豆素。Braun K 等 (2003) 从中毒疯草密柔毛黄芪， 兰伯氏棘豆， 绢毛棘豆的 8 个类群的叶、 茎、 种子和花中分离出产苦马豆素的植物内生真菌。我国学者童
德文等 (2002) 从豆类丝核菌 7-3 培养液， 赵宝玉等 (2006、 2007) 从绿僵菌和白僵菌的培养 液， 王建华等 (2009) 从棘豆埃里格胞菌 FEL5-AS1、 FEL5-AS2 的培养液中都分离鉴定出苦马 豆素。
3 人工合成途径
由于苦马豆素优异的生物活性及天然来源含量小， 引起科学家对其合成的极大兴 趣。从表面上看， 苦马豆素结构式相对简单， 但由于 4 个手性碳原子的存在， 使得其手性全 合成难度较大。所以， 尽管从 1984 年对苦马豆素进行首次全合成以来， 20 余年时间里文献 共报道了多达 30 余条全合成路线， 但几乎所有的方法步骤繁琐， 而且合成条件苛刻， 产率 较低， 分离难度大， 使得苦马豆素难以工业化生产。即便如此， 目前仍有大量有机化学工作 者以合成苦马豆素极其衍生物为目标， 每年不断有新的有关苦马豆素合成方面的新文章发 表， 高产率、 温和的合成路线仍然有待进一步研究。有关苦马豆素合成的关键问题， 如其手 性的控制、 合成条件、 分离技术、 产率的提高因素优化， 及更简单的适合工业化生产的合成 途径等等仍然迫切需要解决。
( 三 ) 植物中提纯苦马豆素现有技术及专利存在的不足
目前， 国内苦马豆素纯品的来源主要是从植物中提取， 现申请的从植物中提取苦 马豆素的专利有 5 项， 分别是 ： 2002 年杨凌大农生物技术有限公司申请的 “疯草中苦马豆 素的提取工艺” ( 专利申请号为 02114590.3) ； 2006 年中国科学院兰州化学物理研究所申 请的 “从甘肃棘豆中分离提取苦马豆素的工艺方法” ( 专利申请号为 200610104918) ； 2007 年贺武利等申请的 “连续柱层析法提纯苦马豆素的工艺” ( 专利申请号为 200710017542) ； 2007 年西北农林科技大学申请的 “一种从疯草中提取苦马豆素的新方法” ( 专利申请号为 200710017844.7) ； 2008 年杨凌天力生物技术有限公司申请的 “一种从豆科棘豆属或黄芪 属植物中提纯苦马豆素的工艺” ( 申请号 200810018178)。综合分析上述 5 项苦马豆素提取 专利技术， 存在以下不足 ：
1 采用硅胶柱层析和升华技术获得苦马豆素纯品， 提取过程损耗大， 产率低
纵观以上 5 项苦马豆素的提取工艺， 其过程之中都不可避免的使用硅胶柱层析和 升华的手段。 硅胶柱层析是上世纪发展起来的一种分离手段， 由于其良好的安全性、 分离性 能被广泛应用于多种成分的分离， 但硅胶本身的分离原理使得分离过程之中需用大量的有 机溶剂。苦马豆素分离时常常采用的是氯仿 / 甲醇 / 氨水 / 水的混合体系， 这些溶剂的使 用使得苦马豆素分离的环境安全性和性价比大大降低， 再加上硅胶具有酸性的性质， 使得 部分苦马豆素牢固的吸附于硅胶柱上， 其产率必然偏低且成本增加。
苦马豆素具有升华的特性， 因此可以在纯度不高的情况下直接进行升华而得到苦 马豆素纯品。以上 5 项苦马豆素提取工艺技术专利， 在获得苦马豆素纯品 ( 纯度≥ 96％ ) 的关键纯化技术上都是采用减压升华技术， 没有各自的特有技术。采用升华技术可以获得 某些纯品， 但这种技术往往适合微量化学物质的分离， 不适于大批量和产业化生产。 在升华 过程中存在的明显缺陷是， 由于负压的环境和冷凝效果的限制导致形成气态的苦马豆素不 可能完全变成固态苦马豆素， 部分气态苦马豆素被真空抽走， 造成损失。由此可见， 采用硅 胶柱层析和升华技术分离提纯苦马豆素， 提取过程损耗大， 是造成苦马豆素提取率偏低的 关键原因。本专利技术完全抛弃过去常使用的分离方法， 有利于保证苦马豆素提取率和经 济效益。2 提取成本高
现有的专利提取技术， 提取成本都较高。 “从甘肃棘豆中分离提取苦马豆素的 工艺方法” (200610104918) 和 “一种从豆科棘豆属或黄芪属植物中提纯苦马豆素的工 艺” (200810018178) 虽然在最后能得到高纯度的苦马豆素， 但其过程中分别用到了价格较 昂贵的逆流色谱仪和高效液相色谱仪， 提取成本较高， 只适用于微量苦马豆素的分离纯化， 不适合工业化生产。 “一种从疯草中提取苦马豆素的新方法” (200710017844.7) 苦马豆素 的提取率虽然比 “疯草中苦马豆素的提取工艺” (02114590.3) 高， 但获得的苦马豆素纯度确 偏低， 仅为 70％～ 80％， 没有超过 90％， 无形之中增加其成本。
3 提取过程涉及的提取溶剂及化学试剂种类较多， 容易对环境造成污染
现 有 的 3 项 苦 马 豆 素 提 取 专 利 技 术 (200710017844.7， 02114590.3， 200710017542.X)， 提取过程中涉及的有机溶剂及化学试剂有工业甲醇、 乙醇、 氯仿、 二氯甲 烷、 正丁醇、 氨水、 盐酸、 醋酸、 氢氧化钠等种类较多。 甲醇和氯仿具有一定的毒性， 如果直接 排入大气会对环境造成污染。酸碱的大量排放也会对水源、 土壤造成污染。
因此， “一种植物中提纯苦马豆素的新工艺” ， 在现有从豆科棘豆属和黄芪属植物 中提取苦马豆素专利技术的基础上， 进行提取技术改进和优化。不仅可使苦马豆素的提取 步骤简化， 提取周期缩短， 苦马豆素的提取率提高， 提取成本显著降低， 而且可使提取过程 涉及的提取溶剂及化学试剂种类显著减少， 降低溶剂对环境的污染， 有利于保护环境， 有利 于产业化生产。 发明内容 主要针对现有技术中存在的缺陷和不足， 本发明的目的在于提供一种从植物中提 纯苦马豆素的新工艺。 该工艺提取步骤简便、 提取周期缩短、 提取率提高、 提取成本降低、 提 取涉及的试剂种类少， 保护环境， 适宜大批量工厂化生产。 最终对加速苦马豆素在抗肿瘤药 物及免疫增强剂等方面的研发进程具有十分重要的实用价值。
为了实现上述发明目的， 本发明的技术方案是一种从植物中提纯苦马豆素的新工 艺。该工艺根据苦马豆素的基本理化特性， 首先采用纯水提取法从我国西部草地广泛生长 的豆科棘豆属、 黄芪属或苦马豆属植物， 以及我国大部分地区生长的旋花科番薯属和锦葵 科黄花稔属植物中提取出大极性的有机成分 ； 在此基础上， 采用本专利核心技术进行只针 对苦马豆素的丙酮叉反应及水解反应， 除去其他杂质 ； 最后将苦马豆素部分用碱性氯仿萃 取、 氯仿 - 甲醇重结晶得到苦马豆素纯品。
本发明提纯苦马豆素的新工艺， 具体操作步骤分三个阶段完成。
1 第一步采用纯水热回流提取技术， 获得大极性有机成分水提取液
称取一定量的豆科棘豆属或黄芪属植物 ( 或其它含苦马豆素的植物 ) 干草粉， 按 1 ∶ 6 ～ 10( 重量 / 体积 ) 的比例加入纯水， 于 80℃回流提取， 每次 0.5 ～ 1 小时， 合并水 提取液， 浓缩水提取液至密度为 1.2 ～ 1.5。取水提取浓缩液， 按 1 ∶ 3( 体积 / 体积 ) 的比 例加入工业酒精进行醇沉淀， 过滤除去不溶部分。
2 第二步苦马豆素的丙酮叉反应及水解
将上述溶液， 加入一定量丙酮和浓 HCl 反应， 然后调反应液酸碱度为 pH9-10， 减压 回收丙酮， 水溶液用 CH2Cl2 萃取， 回收 CH2Cl2 得到 CH2Cl2 层， 将 CH2Cl2 萃取层溶解于 10 ％
HCl 乙醇中加热进行水解。
3 第三步苦马豆素的纯化
将上述得到的溶液调碱 pH 9-10， CH2Cl2 萃取， 水溶液蒸干用乙醇研溶， 碱性氯仿 萃取， 甲醇 - 氯仿重结晶得到苦马豆素纯品。
( 一 ) 苦马豆素的理化特性及本发明的提取原理
苦马豆素属多羟基吲哚里西啶类生物碱， 分子量小， 极性大， 易溶于水、 甲醇、 乙 醇、 丁醇、 石油醚、 乙醚、 丙酮、 氯仿、 碱性氯仿等有机溶剂， 水溶性极强， 纯品遇到水分极易 吸潮， 且具有升华特性。本技术工艺是根据苦马豆素化学结构中特有的邻二醇羟基易发生 丙酮叉反应的基本化学特性而实现。 由于该技术从一开始就只是针对苦马豆素化学结构来 设计， 其工艺的先进性和对象性都是其他现有的专利技术无法比拟的。
图： 苦马豆素丙酮叉反应原理( 二 ) 本发明的苦马豆素提取工艺路线
1 第一步采用纯水热回流提取技术， 获得大极性有机成分水提取液
称取一定量的豆科棘豆属和黄芪属植物 ( 或其它含苦马豆素的植物 ) 干草粉， 按 1 ∶ 6 ～ 10( 重量 / 体积 ) 的比例加入纯水， 于 80℃回流提取， 每次 0.5 ～ 1 小时， 重复提 取 4 次， 合并水提取液， 浓缩水提取液至密度为 1.2 ～ 1.5。取水提取浓缩液， 按 1 ∶ 3( 体 积 / 体积 ) 的比例加入工业酒精进行醇沉淀， 过滤除去不溶部分。
2 第二步苦马豆素的丙酮叉反应及水解
将上述溶液， 加入丙酮， 加入 1％ HCl 反应， 然后调碱 pH 9-10， 减压回收丙酮， 水溶 液用 CH2Cl2 萃取， 回收 CH2Cl2 得到 CH2Cl2 层， 将 CH2Cl2 萃取层溶解于 10％ HCl 乙醇中加热 进行水解。
3 第三步苦马豆素的纯化
将上述得到的溶液调碱 pH 9-10， CH2Cl2 萃取， 水溶液蒸干用乙醇研溶， 碱性氯仿 萃取， 甲醇 - 氯仿重结晶得到苦马豆素纯品。
( 三 ) 本发明工艺提取的苦马豆素纯品光谱数据及技术指标
1 苦马豆素的理化性质
苦马豆素为白色针状结晶， 熔点 144 ～ 145℃， 分子量 173， 纯度≥ 98％。 经氯仿∶ 甲醇∶氨水∶水 (70 ∶ 26 ∶ 2 ∶ 2， 体积 / 体积 ) 展开， H2O2 10％醋酐乙醇 Ehrlich’ s试 剂显色呈现紫红色斑点， Rf 值为 0.47。
2 苦马豆素紫外 (UV) 光谱数据
UVλmax ： 289(log4.67)， 249(log3.83)。
3 苦马豆素红外 (IR) 光谱数据
IRmax(KBr， cm-1) ： 3423(O-H)， 2943， 2891(C-H)， 2828 ～ 2724(Bohlmann 带 )， 1072(C-O) 吸收峰。
4 苦马豆素气相色谱 (GC) 数据苦 马 豆 素 分 子 结 构 中 含 有 羟 基， 与 单 糖 结 构 相 似， GC 直 接 进 样 不 出 峰， 所 以 要 进 行 GC 分 析 必 须 首 先 制 备 成 硅 醚 衍 生 物。 苦 马 豆 素 用 100μl 吡 啶 溶 解， 用 100μlBSTFA+TMCS(99 ∶ 1) 室温处理 30min， 形成 TMS 衍生物。0.32mm×30mSE-30 毛细管 柱， 柱温从 120℃逐渐升高至 300℃， 5℃ /min， 13.77min 出峰。
5 苦马豆素质谱 (MS) 光谱数据
EI-MSm/e ： 173(M+)， 155(M-H2O)， 138(M-H2O-OH)， 116(M-2H2O-OH)， 115， 113( 基 峰 )， 96， 84， 72， 43( 母核裂解碎片峰 )。 13 1
6 苦马豆素 1H-NMR(500MHz， C5D5N)， C-DMPT(125MHz， C5D5N)， H-1HCOSY 和 HMBC 数 据
见表 3。 13 1
表 3 苦马豆素 1H-NMR， C DMPT， H-1H COSY 和 HMBC 数据
( 四 ) 本发明工艺从植物中提纯苦马豆素的稳定性试验
由于提取批次的不同， 可能对植物体中苦马豆素的提取率和提取量产生影响。为 了证实本发明工艺的稳定性， 采用本发明技术对同一植物样品进行了不同批次的放大提取 试验， 提取结果见表 4。
表 4 变异黄芪中苦马豆素提取结果
与现有专利技术相比， 本发明专利 “一种从植物中提纯苦马豆素的新工艺” 具有以 下优点 ：
(1) 提取率提高， 产品纯度≥ 98％， 提取成本降低。
(2) 提取步骤简化， 提取周期显著缩短， 有利于大批量生产。
本发明的技术工艺， 不需要经过硅胶柱层析和升华的处理方式， 只是通过简单的 反应和一般的萃取处理就能得到苦马豆素粗品， 后经重结晶得到苦马豆素纯品。整个操作 过程简单易行， 省时、 省力、 省溶剂， 使工业生产苦马豆素成为了可能。
(3) 提取所用溶剂及化学试剂种类显著减少， 降低了对环境的污染， 提纯工艺环 保。
本发明专利所用的提取溶剂主要是纯水和工业乙醇及二氯甲烷， 且二氯甲烷可反 复使用降低了其毒性和生产成本。盐酸、 NaOH 虽然具有一定的腐蚀性， 但用量很少几乎不 会对环境产生污染。见表 2
表 2“一种从豆科棘豆属和黄芪属植物中提纯苦马豆素的新工艺” 与现有技术对 比性试验
具体实施方式
下面通过发明人给出的具体实验实例来进一步说明本发明的提取工艺。
实施例 1 ： 变异黄芪中苦马豆素的提取
1 第一步采用纯水热回流提取技术， 获得大极性有机成分水提取液
称取变异黄芪植物干草粉 1kg， 按 1 ∶ 6 ～ 10( 重量 / 体积 ) 的比例加入纯水 6000mL， 于 80 ℃回流提取， 每次 0.5 小时， 重复 4 次， 收集水提取液。合并水提取液， 浓缩 水提取液至密度为 1.2， 得到大极性有机成分水提取浓缩液 200mL。取水提取浓缩液， 按 1 ∶ 3( 体积 / 体积 ) 的比例加入工业酒精进行醇沉淀， 过滤除去不溶部分。溶液部分浓缩 至 100mL 备用。
2 第二步苦马豆素的丙酮叉反应及水解
将第一步得到的 100mL 浓缩液， 加入 100mL 丙酮， 加入 6mL 浓盐酸反应。待反应完 毕后， 然后调碱 pH 9-10， 减压回收丙酮， 水溶液用 CH2Cl2 萃取， 回收 CH2Cl2 得到 CH2Cl2 层， 将 CH2Cl2 萃取层溶解于 10％ HCl 乙醇中加热进行水解。
3 第三步苦马豆素的纯化
将第二步得到的溶液调碱 pH 9-10， CH2Cl2 萃取， 水溶液蒸干用乙醇研溶， 碱性氯 仿萃取， 甲醇 - 氯仿重结晶得到苦马豆素纯品 56.7mg。
实施例 2 ： 变异黄芪中苦马豆素的提取
1 第一步采用纯水热回流提取技术， 获得大极性有机成分水提取液
称取变异黄芪植物干草粉 2kg， 按 1 ∶ 6 ～ 10( 重量 / 体积 ) 的比例加入纯水 12000mL， 于 80℃回流提取， 每次 0.5 小时， 重复 4 次， 收集水提取液。合并水提取液， 浓缩 水提取液至密度为 1.2， 得到大极性有机成分水提取浓缩液 400mL。取水提取浓缩液， 按 1 ∶ 3( 体积 / 体积 ) 的比例加入工业酒精进行醇沉淀， 过滤除去不溶部分。溶液部分浓缩 至 200mL 备用。
2 第二步苦马豆素的丙酮叉及水解反应
将第一步得到的 200mL 浓缩液， 加入 200mL 丙酮， 加入 12mL 浓盐酸反应。待反应 完毕后， 然后调碱 pH 9-10， 减压回收丙酮， 水溶液用 CH2Cl2 萃取， 回收 CH2Cl2 得到 CH2Cl2 层， 将 CH2Cl2 萃取层溶解于 10％ HCl 乙醇中加热进行水解。3 第三步苦马豆素的纯化
将第二步得到的溶液调碱 pH 9-10， CH2Cl2 萃取， 水溶液蒸干用乙醇研溶， 碱性氯 仿萃取， 甲醇 - 氯仿重结晶得到苦马豆素纯品 110.3mg。
实施例 3 ： 甘肃棘豆中苦马豆素的提取
1 第一步采用纯水热回流提取技术， 获得大极性有机成分水提取液
称取甘肃棘豆植物干草粉 2kg， 按 1 ∶ 6 ～ 10( 重量 / 体积 ) 的比例加入纯水 12000mL， 于 80℃回流提取， 每次 0.5 小时， 重复 4 次， 收集水提取液。合并水提取液， 浓缩 水提取液至密度为 1.2， 得到大极性有机成分水提取浓缩液 400mL。取水提取浓缩液， 按 1 ∶ 3( 体积 / 体积 ) 的比例加入工业酒精进行醇沉淀， 过滤除去不溶部分。溶液部分浓缩 至 200mL 备用。
2 第二步苦马豆素的丙酮叉及水解反应
将第一步得到的 200mL 浓缩液， 加入 200mL 丙酮， 加入 12mL 浓盐酸反应。待反应 完毕后， 然后调碱 pH 9-10， 减压回收丙酮， 水溶液用 CH2Cl2 萃取， 回收 CH2Cl2 得到 CH2Cl2 层， 将 CH2Cl2 萃取层溶解于 10％ HCl 乙醇中加热进行水解。
3 第三步苦马豆素的纯化
将第二步得到的溶液调碱 pH 9-10， CH2Cl2 萃取， 水溶液蒸干用乙醇研溶， 碱性氯 仿萃取， 甲醇 - 氯仿重结晶得到苦马豆素纯品 112.4mg。
实施例 4 ： 冰川棘豆中苦马豆素的提取
1 第一步采用纯水热回流提取技术， 获得大极性有机成分水提取液
称取冰川棘豆植物干草粉 2kg， 按 1 ∶ 6 ～ 10( 重量 / 体积 ) 的比例加入纯水 12000mL， 于 80℃回流提取， 每次 0.5 小时， 收集水提取液。合并水提取液， 浓缩水提取液至 密度为 1.2， 得到大极性有机成分水提取浓缩液 400mL。取水提取浓缩液， 按 1 ∶ 3( 体积 / 体积 ) 的比例加入工业酒精进行醇沉淀， 过滤除去不溶部分。溶液部分浓缩至 200mL 备用。
2 第二步苦马豆素的丙酮叉及水解反应
将第一步得到的 200mL 浓缩液， 加入 200mL 丙酮， 加入 12mL 浓盐酸反应。待反应 完毕后， 然后调碱 pH 9-10， 减压回收丙酮， 水溶液用 CH2Cl2 萃取， 回收 CH2Cl2 得到 CH2Cl2 层， 将 CH2Cl2 萃取层溶解于 10％ HCl 乙醇中加热进行水解。
3 第三步苦马豆素的纯化
将第二步得到的溶液调碱 pH 9-10， CH2Cl2 萃取， 水溶液蒸干用乙醇研溶， 碱性氯 仿萃取， 甲醇 - 氯仿重结晶得到苦马豆素纯品 116.8mg。13