一种从凤仙花中提取分离山奈酚的方法 【技术领域】
本发明是关于中药有效成分的提取分离方法， 具体涉及一种山奈酚的提取分离方法。 背景技术 山奈酚为一种黄酮醇类化合物。 该化合物具有多种药理活性， 如抗氧化作用、 抗炎 作用等， 存在于多种中药及其相关制剂中， 如银杏及其提取物和制剂、 桑叶、 白蕊草、 石韦、 菟丝子、 罗汉果、 金钱通淋颗粒等。山奈酚的含量是上述中药和制剂质量的重要检测指标， 因此， 在实际工作中需要提取分离纯度高的山奈酚作为对照品。 同时， 山奈酚作为一种具有 多种药理活性的成分， 在对于其活性进行深入研究的过程中， 如何简化山奈酚的提取制备 工艺、 提高分离纯度， 是制剂工艺研究过程的关键环节之一。
目前， 报道的山奈酚的制备方法有如下方法 ：
1) 国际专利 WO2006/093368A1“MANUFACTURING METHOD OFKAEMPFEROL” ， 公开了 从茶叶的种子和叶子中提取山奈酚的方法， 该方法主要公开了主要采用酸、 碱或酶对茶叶 种子和叶子中含量较高的两种山奈酚的糖苷， 即 camelliaside A、 camelliaside B， 进行水 解得到山奈酚的方法。
2) 文献报道以银杏为原料制备山奈酚的方法 ( 苏静、 谈锋、 谢峻等， 循环高速逆 流色谱从银杏叶提取物中制备异鼠李素和山奈酚， 西南大学学报 ( 自然科学版 )， 2009， 31(10) ： 96-100)。 该方法的主要过程是银杏叶超声提取、 提取液氯仿净化、 树脂富集黄酮成 分、 总黄酮用甲醇 -25％盐酸 (4 ∶ 1) 混合液水解、 3 次 HSCCC( 高速逆流色谱 ) 分离， 得到 山奈酚。
3) 文献报道的另外一种以银杏为原料制备山奈酚的方法 ( 徐涛、 潘见、 袁传勋等， 液相色谱法制备山柰酚单体， 安徽化工， 2005， (2) ： 54-55)。 该方法取银杏提取物， 正丁醇萃 取、 正丁醇萃取液浓缩、 浓缩物用 3M 的盐酸水解、 水解液离心、 上清液用树脂富集、 得到山 奈酚的粗品、 粗品再用制备高效液相色谱法进行分离、 冷冻干燥得到山奈酚。
可见， 上述山奈酚的制备方法较为繁琐， 具体体现在 ： 1) 需要采用水解方法使山 奈酚的糖苷转变为山奈酚 ； 2) 山奈酚的制备中对设备的要求严格， 使山奈酚的制备成本上 升。
因此， 需要寻找一种更为方便快捷的制备山奈酚的方法。
凤仙花为凤仙花属植物凤仙花 Impatiens balsamina L. 的干燥花瓣， 具有活血 通经、 利尿止痛的作用， 其中含有多种黄酮类化合物， 文献显示山奈酚为其中含量较高的 黄酮类成分 ( 胡喜兰、 韩照祥、 刘玉芬等， 凤仙花不同提取物中山奈酚的测定， 分析实验室， 2007， 26(5) ： 33-35)。因此以凤仙花的干燥花瓣为原料分离制备山奈酚， 相对于上述采用 水解的方法， 方法简便。基于此， 文献报道了相应的从凤仙花中制备山奈酚的方法 ( 胡喜 兰、 程青芳、 尹福军等， 凤仙花中山萘酚的提取、 分离与纯化， 时珍国医国药， 2010， 21(4) ： 932-933)。
该方法的具体步骤是 ： 1) 取凤仙花的干燥花瓣， 置于索式提取器中， 石油醚浸泡过夜， 后回流至提取液无 2) 再将提取过的花瓣， 置于索式提取器中， 乙酸乙酯浸泡过夜， 后回流至提取液无色；
色； 3) 乙酸乙酯提取液回收溶剂， 得山奈酚的粗提物 ；
4) 采用葡聚糖凝胶 (LH-20) 进行分离， 收集含山奈酚的流分， 并浓缩得相应山奈 酚精提物 ；
5) 采用制备高效液相色谱对山奈酚精提物进行分离制备山奈酚。
该方法山奈酚制备成本较高， 不合适大规模工业化生产。原因有 ： 1) 葡聚糖凝胶 (LH-20) 价格较贵 ； 2) 制备高效液相仪器昂贵， 同时制备山奈酚的量有限。另外， 该方法步 骤较多， 过程较为复杂。
发明内容 本发明的目的在于针对现有技术的不足， 提供一种以凤仙花为原料， 提取分离山 奈酚的方法。该方法相对于已有方法更为简便， 适合工业化生产。
本发明的目的是通过如下技术方案来实现 ：
A： 取干燥的凤仙花花瓣， 适当粉碎， 加入 10 ～ 100％乙醇或甲醇进行提取， 提取液 浓缩回收溶剂， 得总提取物 ；
B： 总提取物加水适当分散， 上大孔树脂吸附柱， 先用水溶液洗脱除杂， 再用 10 ～ 40％乙醇洗脱除杂， 最后用 40 ～ 100％的乙醇洗脱并收集该部分洗脱液， 浓缩回收溶剂， 得 山奈酚粗品 ；
C： 取聚酰胺湿法装柱， 将 30 ～ 100 ％乙醇溶解的山奈酚粗品溶液加入柱顶， 用 30 ～ 100％乙醇洗脱， 收集洗脱液， 薄层检识， 合并含有山奈酚的流份， 回收溶剂， 得山奈酚 的精品 ；
D： 取山奈酚的精品， 于甲醇或乙醇与水组成的混合溶剂中重结晶， 过滤， 干燥， 得 山奈酚纯品。
上述方法中步骤 A 中的提取方式为煎煮、 加热回流、 超声提取、 微波提取、 高压提 取中的任意一种。
上述方法中步骤 A 的方法为 ： 取干燥的凤仙花花瓣 25 重量份， 加入浓度为 40 ～ 100％的乙醇或甲醇 400 ～ 900 体积份， 加热回流提取 0.5 ～ 2 小时， 过滤， 药渣以同样的方 法先后提取 2 ～ 5 次， 合并提取液， 药渣弃去 ； 提取液回收乙醇， 得稠膏， 即总提取物。
上述方法中步骤 A 的优选方法为 ： 取干燥的凤仙花花瓣 25 重量份， 加入浓度为 80％的乙醇 750 体积份， 加热回流提取 1 小时， 过滤， 药渣以同样的方法先后提取 3 次， 合并 提取液， 药渣弃去， 提取液回收乙醇， 得稠膏， 即总提取物， 6.8 重量份。
上述方法中步骤 B 中大孔吸附树脂为非极性、 弱极性或中等极性中的任意一种。
上述方法中步骤 B 的方法为 ： 取总提取物， 加药材量 5 ～ 9 倍体积份的水稀释， 上 非极性、 弱极性或中等极性中的任意一种大孔吸附树脂柱， 树脂量为药材量的 6 ～ 10 倍体 积份， 径高比为 1 ∶ 5 ～ 8， 吸附流速 2 ～ 4BV/h ； 先用水洗脱 5 ～ 13BV， 流速 2 ～ 5BV/h， 再
用 10 ～ 40％的乙醇洗脱 5 ～ 10BV， 流速 2 ～ 5BV/h ； 最后用 40 ～ 100 ％的乙醇洗脱 2 ～ 5BV， 流速 2 ～ 5BV/h， 收集 40 ～ 100％的乙醇洗脱液， 回收溶剂， 得山奈酚粗品。
上述方法中步骤 B 的优选方法为 ： 取上述总提取物 6.8 重量份， 加药材量 6 倍体积 份的水稀释， 上 D101 型大孔吸附树脂柱， 树脂量为药材量的 8 倍体积份， 径高比为 1 ∶ 6， 吸附流速 3BV/h， 先用水洗脱 9BV， 流速 3BV/h， 再用 30％的乙醇洗脱 9BV， 流速 3BV/h， 最后 用 50％的乙醇洗脱 4BV， 流速 2BV/h， 收集 50％的乙醇洗脱液， 回收溶剂， 得 0.55 重量份山 奈酚粗品。
上述方法中步骤 C 的方法为 ： 取山奈酚粗品， 用药材量 0.1 ～ 1 倍体积份 50 ～ 90 ％的乙醇充分溶解， 得上样液， 另取聚酰胺湿法装柱， 将上样液加入柱顶， 径高比为 1 ∶ 8 ～ 15， 以 50 ～ 100％的乙醇水溶液洗脱， 收集洗脱液， 薄层检识， 合并含有山奈酚的流 份， 回收溶剂得山奈酚的精品。
上述方法中步骤 C 优选的方法为 ： 取山奈酚粗品 0.55 重量份， 用药材量 0.2 倍体 积份 70％的乙醇充分溶解， 得上样液， 另取药材量 0.4 倍重量份的 80 ～ 100 目聚酰胺， 用 70％乙醇湿法装柱， 径高比为 1 ∶ 10， 将上样液加入柱顶， 以 70％的乙醇水溶液洗脱， 收集 洗脱液， 薄层检识， 合并含有山奈酚的流份， 回收溶剂得 0.25 重量份山奈酚的精品。 上述方法中步骤 D 的方法为 ： 取山奈酚的精品， 于 2 ～ 8 ∶ 4 ～ 9 甲醇 - 水或 2 ～ 8 ∶ 4 ～ 9 乙醇 - 水的混合溶剂中进行重结晶， 过滤， 干燥得山奈酚纯品。
上述方法中步骤 D 优选的方法为 ： 取 0.25 重量份山奈酚的精品， 于 3 ∶ 7 乙醇 - 水 混合溶剂中重结晶， 过滤， 干燥得 0.15 重量份山奈酚纯品。
采用本方法提取制备山奈酚， 提取工艺路线简单， 适合于工业化大规模生产。
具体实施方式
下面实验例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例 1 ： 山奈酚的纯度检查
用高效液相色谱法检查纯度。 仪器 ： Waters 600 高效液相色谱仪。 色谱柱 ： YWG-C18 色谱柱， 250mm×4.6mm， 5μm。流动相 ： 甲醇 -0.1 ％磷酸水溶液 (50 ～ 70 ∶ 50 ～ 30) ； 流 速： 0.8 ～ 1.2mL/min ； 柱温 ： 室温 ； 检测波长 ： 367nm ； 进样量 ： 10μl ； 保留时间 (RT) ： 山奈 酚为 5 ～ 30min ； 色谱图纪录时间 ： 60min。面积归一化法测纯度， 山奈酚的纯度为 98.8％。
实验例 2 ： 山奈酚的结构测定
熔点用 X-4 型数字显示显微熔点测定仪 ； 紫外 (UV) 光谱用日本岛津 UV-260 型 紫外可见分光光度计 ； 红外 (IR) 光谱用 Perkin-Elmer 983G 型仪器测定， KBr 压片 ； 核 1 13 磁 共 振 氢 谱 和 碳 谱 ( HNMR 和 CNMR) 用 MERCURY-400 核 磁 共 振 仪 测 定 ； 质 谱 (MS) 用 DECA Finnigan-LCQ 型质谱仪测定。
上述精制方法所得的山奈酚纯品为 ： 黄 色 颗 粒 状 结 晶， 熔 点 276 ～ 278 ℃。 -1 UV λ max(nm) ： 226 ， 267 ， 349 。 IR υ max(KBr ，cm ) ： 3324(OH) ， 1662(C ＝ O) 。 MS(m/ 1 z) ： 309(M+Na) 。 H NMR( δ，DMSO-d 6 ) ： 12.47(5-OH) ， 10.85(7-OH) ， 10.12(3-OH) ， 9.43(4 ′ -OH)， 8.03(2H， d， J ＝ 9.0Hz， C2 ′ -H， C6 ′ -H)， 6.91(2H， d， J ＝ 9.0Hz， C3 ′ -H， 13 C5 ′ -H)， 6.43(1H， d， J ＝ 1.8Hz， C8-H)， 6.18(1H， d， J ＝ 1.8Hz， C6-H)。 C NMR(δ， DMSO-d6) ： 175.9(C-4)， 163.9(C-7)， 160.7(C-5)， 159.2(C-4 ′ )， 156.2(C-9)， 146.8(C-2)，135.6(C-3)， 129.5(C-2′ )， 129.5(C-6′ )， 121.7(C-1′ )， 115.4(C-3′ )， 115.4(C-5′ )， 103.1(C-10)， 98.2(C-6)， 93.5(C-8)。
以上波谱数据与文献报道一致， 结构如下 ：
实验例 3 大孔吸附树脂富集山奈酚粗品的实验
取干燥的凤仙花花瓣 2.5kg， 加入浓度为 80％的乙醇 75L， 加热回流提取 1 小时， 过 滤， 药渣以同样的方法先后提取 3 次， 合并提取液， 药渣弃去 ； 提取液回收乙醇， 得稠膏即总 提取物 0.68kg。
取上述总提取物 0.68kg， 加 15L 水稀释， 用 D101 型大孔吸附树脂柱， 树脂量为 20L( 水中体积 )， 径高比为 1 ∶ 6， 吸附流速 3BV/h ； 先用水洗脱 9BV， 流速 3BV/h， 再用 30％ 的乙醇洗脱 9BV， 流速 3BV/h ； 最后用 50％的乙醇洗脱 4BV， 流速 2BV/h， 收集该部分洗脱液， 回收溶剂， 得 0.055kg 山奈酚粗品。实验例 4 聚酰胺柱层析方法与重结晶方法联用制备山奈酚纯品的实验
山奈酚纯品的制备采用聚酰胺柱层析和重结晶联用的方法制备。 柱层析时使用的 吸附剂为聚酰胺 80 ～ 100 目 ( 台州市路桥四甲生化塑料厂生产， 1kg)。取上述山奈酚粗品 0.055kg， 用 0.5L 70％的乙醇充分溶解， 得上样液， 湿法上样 ( 聚酰胺层析柱用 70％乙醇水 溶液湿法装柱， 层析柱的直径高比为 1 ∶ 10)。以 70％乙醇水溶液为洗脱剂洗脱， 收集洗脱 液， 每份 400ml， 共收集 60 份， 每份减压浓缩至小体积后， 用聚酰胺薄层检测。薄层条件 ： 聚 酰胺薄膜预制 ； 展开剂 ： 氯仿 - 甲醇 - 甲酸 (10 ∶ 2 ∶ 0.05) ； 显色条件 ： 1％ AlCl3 乙醇溶 液显色， 紫外灯 365nm 波长下观察。其中第 25 ～ 40 份中山奈酚的含量较高， 将其合并， 减 压抽干溶剂得黄色山奈酚精品 0.025kg。
取山奈酚精品 0.025kg， 于 3 ∶ 7 乙醇 - 水混合溶剂中重结晶， 过滤， 干燥， 得 0.015kg 的山奈酚纯品， 为黄色颗粒状结晶。
实施例 1
取干燥的凤仙花花瓣 2.5kg， 加入浓度为 90％的甲醇 60L， 加热回流提取 1 小时， 过 滤， 药渣以同样的方法先后提取 2 次， 合并提取液， 药渣弃去 ； 提取液回收乙醇， 得稠膏即总 提取物 0.55kg。
取上述总提取物 0.55kg， 加 12.5L 水稀释， 用 AB-8 型大孔吸附树脂柱， 树脂量为 15L( 水中体积 )， 径高比为 1 ∶ 5， 吸附流速 2BV/h ； 先用水洗脱 5BV， 流速 2BV/h， 再用 20％ 的乙醇洗脱 6BV， 流速 2BV/h ； 最后用 50％的乙醇洗脱 5BV， 流速 2BV/h， 收集该部分洗脱液， 回收溶剂， 得 0.043kg 山奈酚粗品。
山奈酚纯品的制备采用聚酰胺柱层析和重结晶联用的方法制备。 柱层析时使用的
吸附剂为聚酰胺 80 ～ 100 目 ( 台州市路桥四甲生化塑料厂生产， 1kg)。取上述山奈酚粗品 0.043kg， 用 0.5L 70％的乙醇充分溶解， 得上样液， 湿法上样 ( 聚酰胺层析柱用 80％乙醇水 溶液湿法装柱， 层析柱的直径高比为 1 ∶ 10)。以 80％乙醇水溶液为洗脱剂洗脱， 收集洗脱 液， 每份 200ml， 共收集 80 份， 每份减压浓缩至小体积后， 用聚酰胺薄层检测。薄层条件 ： 聚 酰胺薄膜预制 ； 展开剂 ： 氯仿 - 甲醇 - 甲酸 (10 ∶ 2 ∶ 0.05) ； 显色条件 ： 1％ AlCl3 乙醇溶 液显色， 紫外灯 365nm 波长观察。其中第 20 ～ 30 份中山奈酚的含量较高， 将其合并， 减压 抽干溶剂得黄色山奈酚精品 0.015kg。
取山奈酚精品 0.015kg， 于 5 ∶ 5 甲醇 - 水混合溶剂中重结晶， 过滤， 干燥， 得 0.008kg 的山奈酚纯品， 为黄色颗粒状结晶。
实施例 2
取干燥的凤仙花花瓣 2.5kg， 加入浓度为 80％的乙醇 70L， 加热回流提取 1.5 小时， 过滤， 药渣以同样的方法先后提取 3 次， 合并提取液， 药渣弃去 ； 提取液回收乙醇， 得稠膏即 总提取物 0.65kg。
取上述总提取物 0.65kg， 加 15L 水稀释， 用 D101 型大孔吸附树脂柱， 树脂量为 20L( 水中体积 )， 径高比为 1 ∶ 7， 吸附流速 3BV/h ； 先用水洗脱 9BV， 流速 3BV/h， 再用 30％ 的乙醇洗脱 7BV， 流速 2BV/h ； 最后用 70％的乙醇洗脱 4BV， 流速 2BV/h， 收集该部分洗脱液， 回收溶剂， 得 0.05kg 山奈酚粗品。 山奈酚纯品的制备采用聚酰胺柱层析和重结晶联用的方法制备。 柱层析时使用的 吸附剂为聚酰胺 120 ～ 200 目 ( 台州市路桥四甲生化塑料厂生产， 1kg)。取上述山奈酚粗 品 0.05kg， 用 0.7L 70％的乙醇充分溶解， 得上样液， 湿法上样 ( 聚酰胺层析柱用 70％乙醇 水溶液湿法装柱， 层析柱的直径高比为 1 ∶ 12)。以 70％乙醇水溶液为洗脱剂洗脱， 收集 洗脱液， 每份 400ml， 共收集 60 份， 每份减压浓缩至小体积后， 用硅胶薄层检测， 展开剂 ： 氯 仿 - 甲醇 - 甲酸 (10 ∶ 1 ∶ 0.05) ； 显色条件 ： 1％ AlCl3 乙醇溶液显色， 紫外灯 365nm 波长 观察。其中第 25 ～ 40 份中山奈酚的含量较高， 将其合并， 减压抽干溶剂得黄色山奈酚精品 0.023kg。
取山奈酚精品 0.023kg， 于 3 ∶ 7 乙醇 - 水混合溶剂中重结晶， 过滤， 干燥， 得 0.014kg 的山奈酚纯品， 为黄色颗粒状结晶。
实施例 3
取干燥的凤仙花花瓣 2.5kg， 加入浓度为 70％的乙醇 80L， 加热回流提取 1 小时， 过 滤， 药渣以同样的方法先后提取 3 次， 合并提取液， 药渣弃去 ； 提取液回收乙醇， 得稠膏即总 提取物 0.70kg。
取上述总提取物 0.70kg， 加 20L 水稀释， 用 HPD100 型大孔吸附树脂柱， 树脂量为 22L( 水中体积 )， 径高比为 1 ∶ 7， 吸附流速 3BV/h ； 先用水洗脱 12BV， 流速 3BV/h， 再用 30％ 的乙醇洗脱 10BV， 流速 4BV/h ； 最后用 80 ％的乙醇洗脱 4BV， 流速 2BV/h， 收集该部分洗脱 液， 回收溶剂， 得 0.074kg 山奈酚粗品。
山奈酚纯品的制备采用聚酰胺柱层析和重结晶联用的方法制备。 柱层析时使用的 吸附剂为聚酰胺 80 ～ 100 目 ( 台州市路桥四甲生化塑料厂生产， 1.3kg)。取上述山奈酚 粗品 0.074kg， 用 1L 75％的乙醇充分溶解， 得上样液， 湿法上样 ( 聚酰胺层析柱用 75％乙 醇水溶液湿法装柱， 层析柱的直径高比为 1 ∶ 10)。以 75％乙醇水溶液为洗脱剂洗脱， 收
集洗脱液， 每份 400ml， 共收集 70 份， 每份减压浓缩至小体积后， 用硅胶薄层检测， 展开剂 ： 氯仿 - 甲醇 (7 ∶ 3) ； 显色条件 ： 1％ AlCl3 乙醇溶液显色， 紫外灯 365nm 波长观察。其中第 20 ～ 35 份中山奈酚的含量较高， 将其合并， 减压抽干溶剂得黄色山奈酚精品 0.022kg。
取山奈酚精品 0.022kg， 于 4 ∶ 6 乙醇 - 水混合溶剂中重结晶， 过滤， 干燥， 得 0.013kg 的山奈酚纯品， 为黄色颗粒状结晶。
实施例 4
取干燥的凤仙花花瓣 2.5kg， 加入浓度为 60％的甲醇 80L， 加热回流提取 2 小时， 过 滤， 药渣以同样的方法先后提取 4 次， 合并提取液， 药渣弃去 ； 提取液回收乙醇， 得稠膏即总 提取物 0.75kg。
取上述总提取物 0.75kg， 加 20L 水稀释， 用 D4020 型大孔吸附树脂柱， 树脂量为 25L( 水中体积 )， 径高比为 1 ∶ 8， 吸附流速 4BV/h ； 先用水洗脱 13BV， 流速 4BV/h， 再用 30％ 的乙醇洗脱 10BV， 流速 5BV/h ； 最后用 90 ％的乙醇洗脱 3BV， 流速 2BV/h， 收集该部分洗脱 液， 回收溶剂， 得 0.087kg 山奈酚粗品。
山奈酚纯品的制备采用聚酰胺柱层析和重结晶联用的方法制备。 柱层析时使用的 吸附剂为聚酰胺 80 ～ 100 目 ( 台州市路桥四甲生化塑料厂生产， 1.3kg)。取上述山奈酚粗 品 0.087kg， 用 1.5L 60％的乙醇充分溶解， 得上样液， 湿法上样 ( 聚酰胺层析柱用 60％乙 醇水溶液湿法装柱， 层析柱的直径高比为 1 ∶ 13)。以 60％乙醇水溶液为洗脱剂洗脱， 收集 洗脱液， 每份 400ml， 共收集 120 份， 每份减压浓缩至小体积后， 用聚酰胺薄层检测。薄层条 件： 聚酰胺薄膜预制 ； 展开剂 ： 氯仿 - 甲醇 - 甲酸 (10 ∶ 2 ∶ 0.05) ； 显色条件 ： 1％ AlCl3 乙 醇溶液显色， 紫外灯 365nm 波长观察。其中第 55 ～ 73 份中山奈酚的含量较高， 将其合并， 减压抽干溶剂得黄色山奈酚精品 0.02kg。
取 山 奈 酚 精 品 0.02kg， 于 3 ∶ 7 甲 醇 - 水 混 合 溶 剂 中 重 结 晶， 过 滤， 干 燥， 得 0.011kg 的山奈酚纯品， 为黄色颗粒状结晶。9